DE2114300A1 - Octadekapeptide und Arzneipraeparate - Google Patents

Description

¹¹ Oetadekapeptide und Arzneipräparate "

Priorität: 24. März 1970, Japan, Nr. 25 541/70

Die Erfindung betrifft neue Octadekapeptide mit einem ß-Alaninrest als aminoendständige Aminosäure und einem L-Ornithinrest
in der 15-Stellung anstelle des Serinrestes bzw. des lysinrestes im nativen Corticotropin, deren Derivate, pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze und Komplexe. Die Octadekapeptide sind somit /1-ß-Alanin, 15~ornithin7-octadekapeptide, die abgekürzt auch als /ß-Ala ,Orn v-oc^adekapeptide bezeichnet werden. Die Octadekapeptide der Erfindung sind wertvolle Arzneistoffe, da sie eine ausgeprägte Corticotropinaktivität, j z.B. eine stimulierende Wirkung auf die Nebennieren-

sowie eine/ · aufweiSeIi₁/

rinde, /lipolytische und melanocytenstimulierende V/irkung/" Liese Wirkungen sind von besonders langer Dauer.

In der Zeitschrift J. Biochem. (Tokyo), Bd. 58 (1965), Seite
512, ist die Herstellung der Octadekapeptide ACTK(l-18)-0H und
ACTH(1-18)-NH₂» die den ersten 18 Aminosäurcresten des Cortico-

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tropins (ACTH) entsprechen, beschrieben. Ferner- isx in Bull. Chera. Soc. Japan, Bd. 43 (1970), Seite 196, die Herstellung des 1-Glycinanalcgen, d.h. GIy -ACTH(l-18)-IiH₂ beschrieben. Biologische Untersuchungen an- Corticotropinpeptiden haben ergeben, dass die aminoendständigen 18 Reste die Mindesterfordernisse für eine hohe stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde erfüllen. ACTH(1-18 )-NH₂ und GIy¹-ACTH(1-18)-NH₂ sind jedoch wesentlich weniger aktiv als das native Hormon, insbesondere wenn sie zur Prüfung subcutan oder intravenös verabfolgt werden. Schliesslich ist in Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 43 (1970), Seite 1163) ein ausgezeichnet wirkendes Corticotropinpeptid beschrieben, nämlich ß-Ala -ACTH(1-18)-NH₂. Dieses Peptid besitzt eine wesentlich verbesserte Aktivität, da es gegen die intrazelluläre Aminopeptidase sehr beständig ist. Die aminoendständige Substitution durch ß-Alanin verbessert die Stabilität des Peptids im Gewebe, jedoch nicht im Blut. Die Wirkung des 1-ß-Alaninanalogen im Blut ist tatsächlich von geringerer Dauer als die des nativen Corticotropins. Dies ist ein Anzeichen dafür, „ci33 es unter der Einwirkung von Endopeptidase in Blut rascher desaktiviert wird als natives Corticotropin, wenn es intravenös verabfolgt wird.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein kurzkettiges Peptid zu entwickeln, das der Wirkung des nativen Corticotropins nahekommt, und das sich in einfacher Weise herstellen lässt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung sind somit Octadekapeptide der allgemeinen Formel

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ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-Y-L-hiQtidyl-L-plienylalanyl-L-arginyl-L-tryptopnyl-glycyl-l-lysyl-L-prolyl-l-valylglycyl-X-ornithyl-Ii-lysyl-L-arginyl-Z "

in der X ein !-Methionin-, 1-Norvalin-, L-Korleucin-, L-Leucin- oder <X-Aminobuttersäurerest, Y ein L-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest und Z ein L-Arginin-, L-Argininester- oder L-Argininamidrest ist, ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

Die" erfindungsgemässen Octadekapeptide haben eine verbesserte Wirkungsdauer und sie tesitzen die gleiche stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, wie natürliches Corticotropin. Es wurde festgestellt, dass die verbesserten Eigenschaften dieser Octadekapeptide auf ihrer geringeren Empfindlichkeit gegenüber der Endopeptidase im Blut und der Aminopeptidase in den Geweben beruht.

Die Octadekapeptide. der Erfindung können durch Kondensation der Aminosäuren oder durch Kondensation kleinerer Peptide in üblicher Weise hergestellt werden. Insbesondere können die Octadekapeptide der Erfindung hergestellt werden

(a) durch Umsetzung eines Aminosäureesters oder Peptidesters mit einer freien. ABrinogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptidester mit geschützter Aminogruppe bzw. geschützten Aminogruppen in Gegenv/art 'eines Kondensationsmittels oder

(b) durch Umsetzung einer Aminosäure odei eines Peptids mit freier Anirsopruppe un-2 geschützter oder ungeschützter Carboxylgruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem

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anderen Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe oder
(c) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines I-'eptids mit freier Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe mit anderen Aminosäurtai oder einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe und geschützter Carboxylgruppe und anschliessender Abspaltung der Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Peptid durch Hydrogenolyse, Acidolyse, alkalische Verseifung, Hydrazinolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak.

Die Kondensation zur Ausbildung von Peptidbindungen kann nach üblichen Methoden erfolgen. Beispiele für diese Methoden sind die Azid-, Dicyclohexy.lcarbodiimid- oder Carbonyldiimidazolmethode, die gemischte Anhydridmethode, die aktivierte Estermethode, z.B. die p-ilitrophenylestermethode, N-Hydroxysuccinimidestermethode, Pentachlorphenylestermethode, Cyanmethylestermethode und p-Nitrophenylthiolestermethode, die Isoxazolium-, ΪΓ-Carboxyanhydrid-, Tetraathylpyrophosph.it- oder Ä'thylchlorphosphitmethode oder eine Kombination dieser Methoden. Die Octadekapeptide der Erfindung können auch nach der sogenannten Peptidsynthese in fester Phase hergestellt werden. Es können zwar sämtliche vorgenannten Methoden zur Ausbildung von Peptidbindungen für die Herstellung der Octedekapeptide der Erfindung angewendet werden, die besonders bevorzugten Methoden sind jedoch die aktivierte Estermethode, die Dicyclohexylcarbodiimidmethode, die Azidmethode und die gemischte Anhydridmethodo.

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Zur Herstellung der Octadekapeptide werden vorzugsweise freie funktioneile Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, geschützt, insbesondere durch solche Gruppen, die sich leicht durch Hydrogenolyse, Acidolyse, alkalische Verseifung, Hydrazine» Iy se oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak abspalten lassen. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isobutanol oder tert.-Butanol,

durch
oder/einen Arylalkylalkohol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Diese Carboxylschutzgruppen werden in üblicher V/eise eingeführt.

Die Aminogruppe wird vorzugsweise z.B. durch eine tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Formyl- oder Tritylgruppe in üblicher Weise geschützt. Zum Schutz der Guanidylgruppe des Arginins wird vorzugsweise die Nitrogruppe, Tosylgruppe oder Adamantyloxycarbonylgruppe verwendet. Der Schutz der Guanidylgruppe ist jedoch nicht immer erforderlich. Die jf-Carboxylgruppe der Glutaminsäure wird vorzugsweise durch eine der vorgenannten Schutzgruppen für Carboxylgruppen geschützt. Die endständige Aminogruppe des Lysins oder Ornithins wird vorzugsweise durch eine der vorgenannten Schutzgruppen für Aminogruppen geschützt. Die Imidazolgruppe des Histidins kann durch eine Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Benzylgruppe geschützt werden. Perner kann die Hydroxylgruppe des Serins oder Tyrosins z.B. durch eine Acetyl-, Benzyl- oder tert.-Butylgruppe geschützt

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werden. Ihr Schutz ist jedoch nicht immer erforderlich.

Ausser den Aminosäureresten der ami η ο end ständig en Aminosäure-. denen in/

und/eier stellung 15 können noch andere Reste der Aminosäuren-^ sequenz des Corticotropinpeptids durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die Corticotropinaktivität wesentlich zu verschlechtern. Beispielsweise kann die 4·· Aminosäure Methionin durch Norvalin, Norleucin, leucin oder tf-Aminobuttersäure und bzw. oder die 5. Aminosäure Glutaminsäure durch Glutamin ersetzt werden.

Die letzte Kupplungsreaktion zur Herstellung der Octadekapeptide der allgemeinen Formel I erfolgt z.B. durch Kondensation eines geschützten Dekapeptids der allgemeinen Formel

R-_L-ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-/^R₂-L-glutamyl-L-histidyl-I-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

; in der R-, eine Aminoschutzgruppe ist, X der L-Methionin,

L-Norvalin-, L-Norleucin-, L-Leuein- oder (χ-Aminobuttersäurerest und Rp eine Carboxylschutzgruppe ist, mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen Formel

N^-R₅-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-R^-L-ornithyl-N*- R^-L-lysyl-L-arginyl-fc

in der R-*, R, und R^ jeweils eine Aminoschutzgruppe und Z einen L-Arginin-, L-Argininester- oder L-Argininamidrest bedeutet, nach der aktivierten Estermethode, der Dicyclohexylcarbodiimidmethode, der Azidmethode, der gemischten Anhydridmethode oder einer Kombination dieser Methoden in einem inerten. Lösungsmittel bei Temperaturen von -20 bis 6O⁰C während etwa 2 Stunden

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bis 7 Tagen. Anschliessend werden die Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Octadelcapeptid der allgemeinen Formel

R-j_-ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-^R₂-l-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N^£-R^-L-Iysyl-L-prolyl-Ir-valyl-glycyl-K^-R^-L-ornithyl-lJ^-Rj-Ii-lysyl-I-arginyl-Z

in der R₁, X, R₂, R-*, R^, Rc und Z die obige Bedeutung haben, durch Hydrogenolyse, Acidolyse, alkalische Verseifung, Hydrazinolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak bei Temperaturen von etwa -20 bis 60⁰G während 30 Minuten bis
24 Stunden. Als inerte Lösungsmittel werden vorzugsweise Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Hexamethylphosphortriamid und deren Gemische mit V/asser verwendet.

Die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Octadekapeptide der allgemeinen Formel I sind in den Tabellen I bis IV zusammen gestellt.

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Cbo-3-AIa-OH + H-Tyr-OMe IDCC

Cbo-ß-Ala.Tyr-OJTe Cbo-ß-Ala.Tyr-NHNH₂

Cbo-ß-Ala.Tyr-N, + H-Ser-ΟΚβ

Cbo-ß-Ala.Tyr.Ser-OMe ic? !π j. Nri -

Cbo-ß-Ala.Tyr.Ser-NHSBL Cbo-ß-Ala.Tyr.Ser-N-

BzI j lHi

Tabelle I

_0Bal

BOC-GIu-ONP + H-His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH

OBzI j
BOC-GIu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH

03,1
BOC-Met-ONP + H-GIu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH

OBaI BOC-MeI; .GIu. His. Phe. Arg. Trp. Gly-OH

.CF₅COOH

BOC .1 BOC

BOC

OBzI

E-Met.GIu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH Cbo-Iys.Pro.Val.GIy.0rn-N₅ + H-Xye.Arg.ATg-A(H=QH,HH₃₁OdE₃)

BOC BOG

Cbo-ß-Ala.Tyr.Ser.Kot.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH Cbo-Lys.Pro.Val.Gly.Orn.Lys.Arg.Arg-R

OBzI

HOSu, ECC

BOC

BOC BOC
J

Cbo-ß-Ala.Tyr. Ser.Ket.GIu.His.Ph-J. Arg.Trp.Gly-OSu + H-Lys.Pro.Val.Gly.Om.Xys.Arg.Arg-R

- 03zl 3OC J, BOC BOC

\ I Il

Cbo-ß-Ala.Tyr.Sof.Pet.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Om.Lys.Arg.Arg-R

HF
H-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.Hia.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Om.Iys.Arg.Arg-R

Tabelle II

BOC-ß-AIa-OE + H-Tyr-OMe BOC-Ser-OH + H-Met-OMe DCC I DCC

BOC-ß-Ala.Tyr-OKe BOC-Ser.Met-OMe

BOC-ß-AIa.Tyr-XHNHg

HCl

BOC-S-AIa. Tyr-N- + H-Ser.Ket-OMe

BOC-ß-Ala.Syr.Ser.Ket-ΟΜθ

BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Ket-KHHHg

KNO

OH

BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Ket-K- + H-G'lu.Hia.Plie.Ars.Trp.Gly-OH

ψ.

BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Ket.GIu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH

HOSu, DCC

BOC BOC BOC

BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Gl'i.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OSu + H-Lys.rro.Val.Gly.Om.Lys.Arg-R (H=OH,

03U* BOG I BOC BOG

\ ι Ψ Il

BOC-ß-Ala.^yr.Ssr.Met.Glu.Hie.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Om.Iys.Arg.Arg-R

CP₅COOH
H-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.KiB.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Om.Lys.Arg.Arg-a

OCE₃)

Tabelle III

Cbo-ß -Ala. Ty r-

HKO,

Cbo-ß-AIa.Tyr-N, + H-Ser.Met-OMe Cbo-ß-AIa.Tyr.Ser.Ket-OMo

Cbo-ß-Ala.Tyr.Ser.l

Cbo-ß-Ala.Tyr.Ser.Ket-N_ + H-GIu. His. Phe. Arg. Trt>. GIy-CH

CBzI

03

slj,

Gbo»fü »Ala. Tyr.Ser. Met. GIu. KIs. Rie. Arg. Trp. GIy-OH

HCSu, Ti OEzI

BOS BOS '
,1 ,1

Qbö-ß-Ala.Syr.Ssr.Met.Giu.HIa.?he.Arg.Trp.GIy-OSu + H-Lys.Pre.Val.Gly.Om.Iys.Arg.Arg-R (R»0H, SEg, OCH-)

03al N

BOC I

300 BOG Il

N I Il

Cbo-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.Hio.Phe.Arg.Irp.Sly.Iys.Pro.Val.Gly.Orn.I.ys.Ars.Arg-R

H-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.HlB.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Orn.Itys.Arg.Arg-R

Ca) O O

Tabelle IV

OO

CD -J

■3CC-3-.Alft.iryr. Ser-NHHH., IHNO₂

BCC-3-Ala.Tyr.Sör-.lT- + H-^Iet.Glu.Hie.Phe.Arg.Trp.Gly-OH

O^Bzl

3OC-3-Ala.Tyr.Ser.Met'.Glu.His.Phe. Arg. Trp.GIy-OH

IHOSu, DCO BCC-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Giu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OSu + H-Lya.Pro.Val.Gly.Orn.Ly3.Arg.Arg-X (R=OH, KHg, OCH-)

'Bsi

BOC

BOC BOC

O₁Bs:

SCC BOC BOC

I Il

EOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Ket.GIu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.IyD.Pro.7al.GIy.Ora.Lys.Arg.Arg-R

HP

H-S -Ala. Tyr. Ser * Met. GIu. His. Phe. Ars. Trp. Gly. Lys. Pro. VaI. Gly. Orn. Iy s. Arg. Arg-R

In den Tabellen werden folgende Abkürzungen verwendet:

ß-Ala - ß-Alaninrest, Tyr = L-Tyrosinrest, Ser -- L-Serinrest, Met - L-Methioninrest, GIu = Glutaminsäurerest, His - L-Histi-

dinrest, Phe = L-Phenylalaninrest, Arg = L-Argininrest,

Trp = L-Tryptophanrest, GIy = Glycinrest, Lys = L-Lysinrest, Pro = L-Prolinrest, UaI = L_TValinrest, Orn = L-Ornithinrest,

Cbo = Benzyloxycarbonyl, BOC = tert.-Butyloxycarbonyl,

BzI = Benzyl, OBu = tert.-Butoxy, DCC = Dicyclohexylcarbodiimid, HOSu = li-Hydroxysuccinimid, und ONP = p-Nitrophenoxy-

Wie aus den Tabellen hervorgeht, besteht das bevorzugte Verfahren in der Kupplung des Tripeptids, das die ersten 3 Aminosäuren enthält, nämlich ß-Alanyl-L-tyrosyl-l-serin, oder das Tetrapeptid ß-Alanyl-l-tyrosyl-Lr-seryl-l-methionin mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid entsprechend der Stellung 4 bis 10 bzw. 5 bis IC^ vorzugsweise nach der Azidmethode. Hierauf wird das erhaltene Dekapeptid mit dem Peptid entsprechend dem Rest des Moleküls (Stellungen 11 - 18) vorzugsweise nach der aktivierten Estermethode kondensiert.

Das vorgenannte Verfahren ist zwar das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Octadekapeptide der Erfindung, doch ist es möglich, die Schutzgruppen, die Kupplungsmethoden oder die Abspaltung der Schutzgruppen auch nach äquivalenten Methoden durchzuführen und die Wahl der Ausgangspeptide und der Reihenfolge der Kupplungsreaktionen entsprechend zu ändern»

Die Schutzgruppen können durch-Hydrqgenolyse_t alkalische Verseifung, Hydrazinoüyse, Reduktion mit Natrium in flüssigem

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BAQ ORiQJNAL

-13- 21U300

Ammoniak oder durch Behandlung mit einer Säure, wie Triil.uoressigsäure, Ameisensäure, einem Halogenv/asserstoff, wie Fluorwasserstoff, Bromv/asserstoff, Chlorv/asserstoff, einer Halogenv/asserstof fsäure, wie Flussäure, Bromwasserstoffsäure oder Salzsäure, oder deren Gemischen in üblicher Weise und je· nach der Art der Gruppe abgespalten werden.

Die verfahrensgemäss hergestellten /ß-Ala ,Orn _7-oetadekapeptide der Erfindung können nach üblichen Methoden gereinigt werden, z.B. durch Säulenchromatographie mit Ionenaustauscherharzen, Ionenaustauscher-Cellulose oder -Sephadex oder durch Gegenstromverteilung.

Je nach den verwendeten Reaktionsbedingungen erhält man die Octadekapeptide der Erfindung in Form der freien Basen oder ihrer pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze. Diese Salze können durch Umsetzung der Octadekapeptide mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffen, z.B. Fluorwasserstoff, Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff, Halogenwasserstoff säuren, wie Flussäure, Salzsäure oder Bromv/asserstoff säure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolaulfonsäure oder Toluolsulfonsäure, hergestellt werden. Zur Salzbildung kann die Säure in äquimolarer Menge oder im Überschuss eingesetzt werden.

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■■'"■■. - ^u - 21U300

Die Octadekapeptide der Erfindung haben eine hohe corticürkra^e ■■ Aktivität und eine ausgezeichnete Wirkungsdauer. Ihre Halbwertszeit im Plasma ist langer als die von nativem Corticotropin. Die Ergebnisse von Untersuchungen über die biologischen Eigenschaften der Octadekapeptide der Erfindung v/erden nachstehend erläutert. Als Testsubstanz wird /ß-Ala¹, ACTH(I-IS)-NH₂ verwendet.

Die biologische Halbwertszeit des /13V NH₂ wird anhand der in vitro-lipolytisehen Aktivität nach A. Tanaka, B.T. Pickering und CH. Li, Arch. Biochem. Biophys., Bd. 99 (1962), Seite 294 als Parameter bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt und mit den Werten für natürliches Corticotropin (Schaff (/„-ACTH), B-AIa¹^-ACm(1-18)-NH₂ und GIy^3--ACTH(I-Ie)-KH₂ verglichen.

Tabelle V

Peptid	a) in vivo ' i.v.	in vitro ' inkubiert mit Plasma
/ß-Ala^Orn15/- ACTH(1-18)-NH2	4,5 min	76,1 min
tf -ACTH ß-Ala1-ACTH(1-18)-NH2 G^-ACTHi t-18 )-NH2	4,4 min 3,1 min 2,0 min	59,2 min 35,4 min 30,0 min *

Anmerkungen; _ ·

a) Eine Probe des Peptids wird Ratten in die Vena cava inferior injiziert. Aus der; abdominalen Aorta v/erden in Zeitabständen Blutproben entnommen, angesäuert und auf die in vitro-lipo-

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BAD ORIGINAL

tx-opc Aktivität untersucht.

b) Eine Probe wird in frischem Plasma aus anästhetisierten Ratten gelöst, und das Gemisch wird bei 37 C inkubiert. In bestimmten Zeitabständen werden Proben entnommen und auf in vitre—lipctrope Aktivität untersucht.

Aus den vorstehenden V/er ten ist ersichtlich, dass die Halbwertszeit des /ß-Ala\ Orn¹⁵Z-ACTH(1-18)-NH₂ nahezu die gleiche ist wie die von natürlichem Corticotropin und länger ist als die ähnlicher Peptide bei intravenöser Injektion. Ferner ist die Halbwertszeit des genannten Octapeptids der Erfindung wesentlich länger als die von natürlichem Corticotropin und verwandten Octadekapeptiden bei der Inkubation mit Plasma in vitro. Die längere Wirkungsdauer der Octadekapeptide der Erfindung beruht auf einer höheren Beständigkeit der Peptide gegenüber der Wirkung von Endopeptidase' im Blut.

Die stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde der Octadekapeptide der Erfindung wurde nach vier verschiedenen Methoden bestimmt, und sie wurde mit der von nativeni Schafcorticotropin (rf -ACTH) verglichen. Die in vivo-steroidbildende Aktivität bei intravenöser Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten wurde nach dem Verfahren von Lipscomb und Nelson, Endocrinol., Bd. 71 (1962), Seite 13, mit einer kleineren Modifikation nach A. Tanaka und CH. Li, Endocrinol. Japonica, Bd. 13 (1966), Seite 180, bestimmt. Die in vivo-steroidbildende Aktivität wurde auch an der mit Dexamethason-pentobarbital betäubten Maus bestimmt 1 vergl. A. kanaka und H. Nakarnura, "Integrative mechanism of neuroendocrine system", Hokkaido University Medical

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BAD ORIGINAL

Library Series, Vol. 1 (1968), Seite 49. Zusätzlich wurde die steroidbildende Aktivität bei intramuskulärer Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten bestimmt, wobei die Testsubstanz in den Rattenschenkelmuskel injiziert und -30 Minuten nach der Injektion eine Blutprobe aus der abdominalen Aorta entnommen wurde, Schliesslich wurde die. steroidbildende Aktivität bei intravenöser Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten derart bestimmt, dass die Te st verbindung in die fernorale Vene injiziert und eine Blutprobe- 30 Minuten nach der Injektion aus der abdominalen Aorta entnommen wurde. Pur alle Versuche wurde der "Third USP Corticotropin-Referenee Standard" als Standard verwendet und die Bildung von 11-Hydroxycorticosteroiden (11-OHCS) nach dem fluorophotometrischen Verfahren von Peterson, J. Biol. Chem. Bd. 225 (1957), Seite 25, bestimmt. Bei jedem Bestimmungsverfah-

ren wurden gewöhnlich mehrere Messungen durchgeführt und die unabhängig voneinander erhaltenen Werte wurden nach dem statistischen Verfahren von Sheps und Moore, J. Pharmacol. Extl. Therap., Bd. 128 (I960), Seite 99, ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen mit /ΪΒ-Ala¹, Orn¹⁵_/-ACTH( 3-IS)-NH₂ sind in Tabelle VI zusammen mit den Werten für natürliches Corticotropin (q£ -ACTH) angegeben.

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Tabelle VI

21H300

.Adrenocorticotrope Aktivität von Schafcortieotropin und /ß-Ala¹,Orn¹⁵V-ACTH(1-18)-NH_?

Verfahren	Verabrei chung s art	Peptid	100 I 180
In vivo-Steroidbildung bei: adrenaler Cannulierung mit Dexamethason-nembu- tal betäubter Maus peripheres Blut peripheres Blut	i.V. i.v. i.V. i.v.	/B-AIa1^m15J- - »™H ACTH(1-18)-NH2 ' ' Ä s~^iri
145 16 2 160 86

Anmerkung:

Die Aktivitäten werden ausgedrückt in USP-Einheiten/mg, in Bezug

auf den "Third USP Corticotropin-Reference Standard".

V/ie aus Tabelle VI hervorgeht, ist die stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde bei dem Octadekapeptid der Erfindung nahezu die gleiche wie die von Schafcortieotropin.

Das /ß-AIa¹,Orn¹⁵/-ACTH(1-18)-NH₂ weist auch eine hohe lipo-Iytische Aktivität auf, die in Tabelle VII mit der Aktivität von Sehafcorticotropin verglichen wird.

BAD

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Tabelle VII

Versuchstier	Minimal e v/i rks ame L!ο si s , 10"" rn^/50 mg Gewebe	oc O-ACTH
Adipöses Rattengewebe Adipöses Kaninchengewebe	/ß-Ala1, Gm-1-V- AGTH(I-Ie)-HH2	6,0 7,1
0,35 0,10

Anmerkung:

Die lipolytische Aktivität wurde nach dem von Tanaka et al. "beschriebenen Verfahren, Arch. Biochem. Biopnys. Bd. 99 (1962), Seite 294 beschriebenen Verfahren mix Rattenepididymal- und Kaninchenperirenalfettgewebe bestimmt. Das Ansteigen der Konzentration von freien Fettsäuren im Medium und im Gewebe dient als Parameter. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die minimale wirksame Dosis pro 50 mg Gewebe.

Die Bestimmung der in vitro-melanocytenstimulierenden Wirkung von /ß-Ala¹, Orn¹⁵7-ACTH(1-18)-NH₂ v/urde nach der Methode von K. Shizume, A.B. lerner und T.B. Fitzpatrick, Endocrinol., Bd. 54.(1954), Seite 553, an isolierten Hautfragmenten von Rana pipiens bestimmt. Die in vitro-melanocytenstimulierende Aktivität des Octadekapeptids der Erfindung beträgt 0,7 χ 10¹⁰, die von GIy¹-ACTH(1-18)-NH₂ 6,7 x 10⁸ und die von

fr?) . «Einheiten/g./ ACTH(l-24)-0H (Syna ethen ^) 2,1 χ 10 / 3Js~~öe zug swept wurde natürliches reines ly-melanocytenstimulierendes Hormon ( «(-MSH) verwendet.

Die Octadekapeptide der Erfindung können in die entsprechenden

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SAD ORIGINAL

-ig- 21U300

Schwermetallkomplexe. z.B. die Komplexe von Zink, Kupfer, Eisen. Nickel oder Kobalt, oder in Komplexe mjt Polyaminosäuren, wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Ccpolyglutanyltyrosiη oder Copolyasparagylglutarninsäure überführt werden. Diese Komplexe haben eine längere Wirkung als die einfachen Polypeptide. Die Schwermetallkomplexe können durch Umsetzung des Octadekapeptids mit einem♦Schwermetallhalogenid, wie Zinkchlorid, Kupferchlorid, Eisenchlorid, Kobaltchlorid oder Kickelchlorid, einem Acetat, wie Zinkacetat, Sulfat, wie Zinksulfat,oder Hydroxid, wie Zinkhydroxid, im Gewichtsverhältnis 1 : Op. bis 100 unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei p., 6,5 bis 7,0, in üblicher Weise hergestellt werden. Der Zinkkomplex ist besonders bevorzugt. Die Polyaminosäurekomplexe können durch Umsetzung der Octadekapeptide der Erfindung mit einer PoIyaminosäure im Mengenverhältnis von etwa 1 : 0,1 bis 100 unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei p~ 6,5 bis 7,0 in üblicher Weise hergestellt werden. Als Polyaminosäuren können die Homopolymerisate oder Copolymerisate verwendet werden, die die L-ι D- oder DL-Konfiguration aufweisen. Beispiele für bevorzugte Polyaminosäuren sind Poly-L-glutaminsäure, PoIy-D-glutaminsäure, Poly-DL-glutaminsäure, Poly-L-asparaginsäure, Poly-D-asparaginsäure, Pbly-DL-asparaginsäure, Copoly-L-glutamyl-L-tyrosin und Copoly-L-asparagyl-L-glutaminsäure. Die Polyaminosäure hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 1000 bis 100 000, insbesondere von 2000 bis 6000. Vorzugsweise wird die Polyaminesäure vorher mit einer Base, wie Natriumhydroxid, neutralisiert. Bei der Herstellung der Komplexe können gegebenenfalls Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol und Phenol, Puf-

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fer, wie Phosphat-, Carbonat- oder Citratpuffer, oder !Botanisierende Verbindungen, wie Natriumchlorid, zugesetzt v/erden.

Die vorgenannten Werte für /ß-Ala , Orn¹ "^-ACTH(I-IS)-OiH₂ dienen nur als Beispiele. Die anderen Octadekapeptide der Erfindung haben praktisch die gleichen Eigenschaften und Vorteile. Die Verbindungen der Erfindung sind wertvolle Arzneimittel, z.B. zur Behandlung von. akutem oder chronischem Gelenkrheumatismus, allergischen Krankheiten und Erkrankungen der Nebennieren bei

Menschen und Haustieren, und sie können zur Bestimmung der Punktion der Nebennierenrinde dienen«

Die Ö'ctadekapeptide der Erfindung,, ihre Säureadditionssalze und Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z.B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen, Aerosole oder Tabletten, im Gemisch mit Trägern, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmitteln,. Puffern, isotonisierenden Verbindungen und bzw. oder letzmitteln. ·

Die wirksame Dosis kann, vom Arst leicht unter Zugrundelegung der vorgenannten Werte bestimmt werden. Z.B. beträgt eine typische klinische Dosis der Verbindungen der Erfindung ungefähr 0,2 bis 0₉8 Einheiten/kg für eine normale erwachsene Person. Die Octadekapeptide dw-r Erfindung werden vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates verabreicht. .

Die Beispiele erXäuts.ivi di-ώ Erfindung«

8AD ORIGINAL

H <j t. ^ ί'J 1% ff ¹J

~2i- 2-1U300

Beispiel 1

(a) Benzyloxycarbonyl-fi-alanyl-L-tyrosinniethylester Eine Lösung von 8,9 g Benzyloxycarbonyl-ß-alanin und 7,8 g L-Tyrosinmethylester in Acetonitril wird zu einer Lösung von 8,3 g DiGyclohexylcarbodiimid in Dichlorinethan bei O⁰G gegeben. Das Gemisch v/ird 16 bis 18 Stunden bei O⁰C stehengelassen und danach vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Fiitrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, die Äthylacetatlösung mit 1 η Salzsäure und 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Nach nochmaliger Umkristallisation werden 13,2 g Produkt vom P. 114 bis 116⁰C ernalten. [v]²^ + 6,2 + 0,4° (c=l,040, Methanol).

(b) Benzyloxycarbonyl-fi-alanyl-L-tyrosinhydrazid

4,81 g Benzyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosinmethylester werden in 50 ml Äthanol gelöst und mit 2,9 ml Hydrazin-hydrat versetzt. Das Gemisch wird 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur und 16 bis 18 Stunden bei 4°C stehengelassen. Das auskristallisierte Hydrazid wird abfiltriert, mi*t kaltem Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 4,72 g. Nach Umkristallisation au3 Äthanol schmilzt die Verbindung bei' 125 his 128⁰C. A7n + 3,9 + 0,4° (c=l,032, 50prozentige Essigsäure).

(c) Benzyloxyearbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-serinmethylester 2,40 g Benzyloxycarbonyl-S-alanyl-L-tyrosinhydrazid werden in 7 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird mit 15 ml

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1 η Salzsäure versetzt. Die Lösung wird mit Eis abgekühlt und sodann mit 3,6 ml eiskalter 2 molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach 4minütigem Stehen bei O⁰C wird das auskristallisierte Azid mit zwei Portionen von jeweils 25 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Athylacetatextrakte werden mit eiskalter 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird die Lösung zu einer Lösung von 0,93 g L-Serinmethylester-hydrochlorid und 0,84 ml Triäthylamin in 20 ml 90prozentigem Tetrahydrofuran gegeben, und das Gemisch wird 48 Stunden bei 4 C gerührt. Die gelatinöse Fällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,58 g. Nach Behandlung mit heissemν Äthanol schmilzt die Verbindung bei 195 bis 196⁰C.[yj²^ - 2,1 + 0,4° (c=l,091, Methanol).

(d) Benzyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-serin-hydrazid Eine Lösung von 1,46 g Benzyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-serinmethylester in 5 ml Dimethylformamid wird mit 0,73 ml Hydrazinhydrat versetzt und 24 Stunden bei 4°C stehengelassen. Das Heaktionsgemisch wird mit Äthancl versetzt, die ausgeschiedenen Kristalle des Hydrazids werden abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,40 g. Nach Behandlung mit heissem Äthanol werden 1,32 g Produkt vom P. 220 bis 224°C (Zersetzung) erhalten. ⁷D^{5 + 15}'⁷ - ^0>5° (^c=1»⁰⁴²> Eisessig).

BADORiQJNAL

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- 23 - 21ΊΑ300

(ο ) tert .-Butyl oxy carbonyl-r-bgn?;yl~I-rlut amyl-L-hl 5 tidy 1~L-

phenylalanyl-L-arrinyl-L-tryptephyl-^lycin

Eine Losung von 1,20 g 1-Histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycinacetat (hergestellt gemäss Bull. Chera. Soe.
Japan, Bd. 43 (1970), Seite 196) in 10 ml 50prozentigem dimethyl formamid wird mit 1,03 g tert.-Butyloxycarbonyl-/^-benzyl-L-glutaminsäure-p-nitrophenyleßter und 25 ml Dimethylformamid versetzt, und das Gemisch wird 3 Tage bei 4 C stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 200 ml eines Gemisches
gleicher Teile Äthylacetat und 1)3äthyläther eingetropft. Die
ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacetat und
Ither gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,86g. Das Produkt wird erneut· in 10 ml 50prozentiger
Essigsäure gelöst und mit IOC ml Äthanol versetzt. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1*37 g. £4J ^² - 23,9 + 0,6° (c=l,020,
50prozentige Essigsäure).

(f) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl"j--benr.yl-L-glutamy.l-L-

histidyl-L-nhenylalanyl-L-arglnyl-L-try^tophyl-glycii!.
1,2 g tert.-Butyloxycarbonyl-^'-benzyl-L-glutarayl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin wer'lcn in 6 ml
Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird die Lösung in einem Eisbad abgekühlt und mit Diätliyläther versetzt» Das ausgeschiedene, von Endgruppen teilweise befreit- Hexapoptid (1,34 g)
wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit ü_$46 ml Triethylamin sowie 0,74 g tert.--3utyloxycarbor.y1 -".—iaat"^viiünin--p-ni^rophenylester versetzt, 2Λ Stunden bei 4 C stehengelassen und so-

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OWQlHAU INSPSCTED

-'τ

21U300

dann in 250 ml eines Gemisches aus Athylacetat und Äther (1:4) eingegossen. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,56 g. Die Fällung wird in 15 ml Äther suspendiert, erwärmt und abgekühlt. Die ausgeschiedene Fällung v/ird abfiltriert,, mit kaltem Äthanol und Äther gewaschen und aus Äthylacetat_ lyophilisiart«. Ausbeute 1,16 g. faj-n - 18,5 + 0,5 (c= 1,072, Dimethylformamid)ο

(g) Benzyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-sery1-L-methionyl- ^benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-1 ryp t ο phy1-glycin

1,09 g tert. -Butyloxycarbonyl-L-aiethionyl-]f=-benzyl-Ii-glutamyl-L-histidy1-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin werden unter Eiskühlung in 6 ml Trifluoressigsäure gelöst, die einen Tropfen Wasser- enthält_o Das Reaktionsgemiseh wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und danach v/ird das gebildete Heptapeptid-trifluoraoetat &«re>i Zusatz von Äther ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriex*t_: ait Äther gründlieh gewaschen und unter verminderte-ai Druck getrocknet. Ausbeute 1,21 g. - -

Sin Gemisch aus 0_P86 g Benzyloxycarbonyl-S-alanyl-L-tyrosyl-L» serinhydrazidp 4 nil 1 21 "Salssäure und 5 ml Dimethylformamid wird in einem Eisbad abgekühlt 'and tropfem-jsise mit 0.96 ml eislcaltsr 2 molarer Matriuranitritlösang versetzt. lach 4minütigera Rühren bei 0 0 werasn IC aal aiskaltss Dimethylformamid sugegeben_D

daa aiL8geschied'3rä--3 Azid, ia l-,.1g?»ng zu bg

O₉56 n>i Triäthyl.S'sän ^Irtt ^Uo -srlialters ■ Löäuji*; zuv o©3«. Qaii neö, Lösnsig dsa ^Γΐ9ρΐ·^⁷,)?ρΐ-·.-'^-■■"."""/:.-i'liio^-:^©tats '--'-Λ 0,49 EaX S^

INSPECTS

21U3Q0

äthylamin in 20 ml eiskaltem Dimethylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei 0°G stehengelassen und sodamm mit 1 ml Essigsäure versetzt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45⁰C abdestilliert. Der sirupöse Rückstand wird mit 20 ml Äthanol versetzt, die ausgeschiedene gelatinöse Masse abfiltriert, gründlich mit Äthanol, Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 0,88 g. Das Piltrat und die Waschlösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und die unlöslichen Fällungen werden abfiltriert. Diese Fällungen werden in Äthanol bis zum Siedepunkt erhitzt, sodann wird das Gemisch abgekühlt und filtriert. Hierbei werden nochmals 0,27 g Fällung erhalten. Die Gesamtausbeute beträgt 1,15 g. Die vereinigten Fällungen werden mit heissem Äthanol gereinigt. M²^ - 18,5.+ 0,5°/ (C=I,067, Dimethylformamid)..^ = 0,75 (Silikagel-Dünnschichtchroraatographie im Lösungsmi-btelsystem n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser =30 : 6 : 20 : 24). R = 0,80 (PapierChromatographie im Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wa3ser =4:1:2).

(h) N^-Benzyloxycarbonyl-N -tert.-butyloxycarbonyl-L-Iysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-tcrt.-butyloxycarbonyl-L-ornithinmethylester

1,20 g N^-Benzyloxycarbonyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithin-methylester /J. 69 bis 70⁰C, /^⁸ - 10,6 + 0,5° (c=l,092, Methanol^ wird in Methanol mit 10 ^cJo Essigsäure 2 Stunden an Palladiuraschv/arz als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrierön des Katalysators wird das Filtrat unter ver-

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minderten! Druck eingedampft. Es hinterbleibt iK-tert-.-Butyloxycarbonyl-L-ornithinmethyleGter-acetat als sirupöser Rückstand, der bei 0 C mit 50prozentiger wässriger Kaliumoarbonatlösung in Dichlormethan behandelt wird. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 20⁰G eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wird mit 1,83 g N^-Benzyloxycarbonyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin versetzt, das gemäss Bull. Ghem. Soc. Japan, Bd. 37 (1964), Seite 1471, hergestellt wurde. Danach wird die Lösung mit einer Lösung von 0,60 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei O C versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4 C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und. das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, mit eiskalter 1 η Salzsäure und 1 molarer Natriumbiearbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird erneut in 30 ml Äthylacetat gelöst und mit 30 ml Äther versetzt. Hierbei fällt der Pentapeptidmethylester in reiner Form an. Ausbeute 2,24 g; M^ - 55,9 + 0,9° (c=l,O62, Methanol).

(i) N^-Benzyloxycarbonyl-N^'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithinhydrazid

2,2 g des oben erhaltenen Pentapeptidmethylesters werden in 30 ml Methanol gelöst und mit 0,26 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Geraisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen und

danach wird das Hydrazid durch Zusatz von Wasser ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriert und das wässrige Methanol umkristallisiert. Ausbeute 2,1 g, F. 175 bis 18O⁰C. ßYj^> - 35,8 + 0,7° (c=l, 040, Dimethylformamid).

( 2 ) N^-Benzyloxycarbcnyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysy";-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N -tort. -butyluxycarbonyl-L-c^ni thyl· N ~tert.-butyloxycarbony1-L-Iysyl-L-arginyl-L-argininamid-diacetat

Eine eiskalte Lösung von 0,95 g des oben erhaltenen Pentapeptidhydrazids in IO ml 90prozentigem Tetrahydrofuran wird mit 2,75 ml eiskalter 1 η Salzsäure und 0,61 ml 2 molarer Natriurnnitritlösung versetzt, 5 Minuten bei 0 C stehengelassen und hierauf mit 0,38 ml Triäthylamin auf p_H 7,4 bis 7,6 eingestellt. Danach wird die lösung mit einer eiskalten Lösung von N -tert.-Butyloxycarbünyl-L-lysyl-L-arginyl.-L-arginiiic'miätriacetat und 0,^-2 ml Triathylamin in 7,5 ml SOproaeiitigem Tetrahydrofuran versetzt. Das Triacetat wurde aus C,92 mMnj.

f/ c. C

N'-Benzyloxycarbonyl-N -tert.-butylcxyoarbonyl-L-lysyl-N ~ nitro-L-arginyl-N -nitro-L-argininamil durch katalyti-oiie Hydrierung nach der in Bull. Ghem. Soc«. «lapan, Bd„ 3^ [V^b ^ Seite 882 beschriebenen Methode erhalten,

Das Gemisch wird 3 Tage bei A C Stehergelassen und sodann unter vermindertem Druck eingedampft, Der Kückstand v/ird i.iit 10 ml Äthylacetat und IC ml 1 η Essi^.-iiur» yernetst line gründlich durchgeschüttelt. Die wässrige Vfrhee wifa drei·.,? s. mit Äthylacetat extrahiert, und :lie vereinig tv.ii Xshylaet ■>:■:■. leAi^vakte werden unter vornjlndartem Druck av ·'_ atw.₄ 1.": ^jnl j^n_f yaa»">f t»

1 0 ^c 3 i 2 / 1 3 ^r- ■:■

ORIGINAL fNSPECTED

Das Konzentrat wird mit wassergesättigteni N-Butanol erschöpfend extrahiert. Der Extrakt wird über natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampfte Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,85 g; fäjγ. ~ 43,1 + 1,5° (c=O,540, 50pro2entige Essigsäure).

(k) ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-sefyl-I-methionyl-L-glutamyl-L-

hi s t idy l-'L-pheny la 1 any 1-L-arginyl—L-tryptophyl-glycyl—L-

arginyl-L-arginlnamia

Eine Lösung von O₉405 f Besisylöxycarbonyl-iS-alanyl-L-jyrosyl-L-seryi=-l-methion.yl"/-bansyl-L~glutamyl~l-histidyl-L-ph.enyl-= alanyl-L-arginyl-L-tryptoph.yl~glycin in 5 ml Essigsäure wird mit 0_s5 ml einer 1 a Lösung τοπ Chlorwasserstoff in Essigsäure versetzt und sofort gefriergetrocknet«, Danach wird der Rückst © über MatriumhydrQxidplä'ssehen getrocknet. Das erhaltene Dekapeptid=laydro"c3alos?id wird ±*i 4 al Mmethylf ormamid " zusammen mit 0,104 g H-HydroxysUu^IiUaIcT gelost und alt einer "Lösung ύο 0₉Ι8β g Dicyclohezjlca^bodAimid in 2 ml DiinethylforniaEiiä yersetsto Das Geiaisali wird 16 3is IS Stnaien "bei 4* C steäengelas-

filtriert und dae ?11ΐτ:ΐ"% ί,π, 100 ml sisss eiskalteji Scsßiscäes gl siehst '2SlZ-S- £v: j";.^c ;■:; - '- -^/C Iwiar -liis'Sgo-'j^i* Die erhalte 21S Fällung wird abfilt-iei-j , ?.ιίΐ ,üthy!acetal und Xtlia.»? gev?a<= ache« νΐ::ΐίί imi-ss- -jw.^s?is:"a:¹'-^;- ΐ·ϊ·υ.5ΐε g-3'-';γο-ο!ώ2£"";-■. Bs wer;l'3Ji

'j'i? r.inin

_₂₉_ 21H300

O,230 g N*-Benzyloxycarbonyl~N^fc-tert.-butrAoxyGarbonyl-L-lysyl-Ii-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-tert.-butyloxycarbünyl-L-ornithyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid v/erden in 90prozentigem Methanol, das 0,1 ml Essigsäure enthält, 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupö'se Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,262 g eines Pulvers. Das Produkt wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,2 ml Triäthylamin versetzt. Hierauf wird die Lösung mit einer Lösung von 0,435 g des oben erhaltenen aktiven Esters des Dekapeptids in 1,5 ml Dimethylformamid versetzt und 45 Stunden bei 4°G stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 100 ml eiskaltes Äthylacetat eingegossen und die ausgeschiedene Fällung abfiltriert. Die Fällung wird mit Äthylacetat und Äther gewaschen, aus Essigsäure lyophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Es werden 0,662 g geschütztes Octadekapeptid als Rohprodukt erhalten.

0,646 g des geschützten Octadekapeptids werden mit etwa 10 ml Fluorwasserstoff 60 Minuten bei O⁰C in Gegenwart von 0,6 ml Anisol und 0,12 g L-Meth.ionin zur Umsetzung gebracht. Danach wird der Fluorwasserstoff verdampfen gelassen, der Rückstand in eiskaltem Wasser gelöst und die Lösung mit Äthylacetat gewaschen. Hierauf wird die Lösung auf eine Kolonne mit den Abmessungen 1,7 x 15 cm mit Amberlite CG-4OO in der Acetatform gegeben. Die Kolonne wird mit Wasser eluiert, das Eluat stark ,eingedampft und lyophilisiert. Das erhaltene ₎ von Endgruppen befreite Peptid (O;7O4 g) wird an einer Kolonne mit den Abmes-

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surigen 2,7 x 32 cm an Carboxymethylcellulose (Sorva, 0,56 mÄq/g) mit Ammoniumacetatpuffer (p_H 6,5, 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,025 bis 0,6 molar chromatographiert.. Es werden 10-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Absorption bei 280 nm wird registriert. Die Fraktionen, die einem Absorptionsmaximum (Nr. 153-180) und seiner Schulter (Nr. 181-200). entsprechen, werden gesondert aufgefangen. Der Hauptteil des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 50 bis 55°G verdampft. Die Rückstände werden bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Es werden 228 mg (F-I) bzw.. 62 mg (F-II) eines farblosen flockigen Pulvers der beiden Fraktionen erhalten. Die Fraktion F-I (228 mg) wird erneut an Carboxymethylcellulose in einer Kolonne mit den Abmessungen 2,2 χ 27 cm auf die vorstehend geschilderte Weise chromatographiert. Das gereinigte Peptid (195 mg, F-I-I) wird aus einem einzigen Absorptionsmaximum erhalten. Eine kleine Schulter des Absorptionsmaximums ergibt 20 mg der Fraktion F-I-2. 62 mg der Fraktion F-II und 20 ng der Fraktion F-I-2 werden vereinigt, und die chromatographische Reinigung wird zweimal wiederholt. Es wird eine weitere Menge von 46 mg reinem Peptid erhalten. Die Gesamtausbeute an Octadekapeptid beträgt 241 rag. ,

ⁿⁿ -55,4° (c=0,5, 0,1 η Essigsäure), UV^^{Üfl n}~*^HC1

= 288 mu = 281 mu (E^_m 25,9), 288 mu (E^ 25,0).

Das Aminosäureverhältnis im sauren Hydrolysat hat folgenden Wert: Serin 0,83, Glutaminsäure 0,96, Prolin 1,04,

"^ΐ! "^ι """**' 109842/1977

Glycin 2,09, Valin 1,00, Methionin 1,03, Tyrosin 1,03, Phenylalanin 0,98, ß-Alanin 0,93, Ornithin 1,11, Lysin 1,95, Histidin 0,97, Arginin 3,07. Das Molverhältnis von Tryptophan zu Tyrosin im intakten Peptid beträgt spektrophotometriseh bestimmt 1,15 : 1.

Beispiel 2

(a) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanin

8,91 g ß-Alanin werden in 100 ml 1 η Natronlauge gelöst* ü.ie Lösung wird mit 21,0 g Natriumbioarbonat und 70 ml Dioxan versetzt, auf 50 C erwärmt und unter Rühren tropfenweise iu.it einer !lösung von 17,2 g tert.-Butylaaidformiat in 30 ml Dioxan versetzt·. Das Gemisch wird 41,5 Stunden bei 50 C gerührt und an— schliessend auf etwa 100 ml unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird mit Eis abgekühlt und mit 180 ml 4 η Salzsäure auf p„ 2. eingestellt* Die Lösung wird mit etwa 100 ml eiskaltem Äthylacetat ex"rah.lerx, der Extrakt W er Natriumsulfat getrocknet und unter vermin!ertea Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird aus einer Mischung von ϊ thy Iac·? tat und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 12,66 g vom 3\ 77 bis 78⁰C.

(b) tert. -Butyl oxycarbon?1-ß-alany1 -L-tyr ο sinmo thy le 1t -^t 3,4-8 g L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid werden, in 15 -ul was gelöst. Die Losung wird unter Eis kühlung mit ^!3 ::.-. ^c,>('-pz:vZQn^Jii KaliumcarbpnatlÖBung versetzt und 4'J Minuten ia i^ihl'äcU^ank stehengelassen. Die auageschiedeacn Krist?.J.l3 vo^dc/i abfi.':- triert, gründlich rAt kaltem Wasser gtvzuy:■,■:'-'. ν··:·. unt-r v:rmindert era Drw'ck getrocknet. Aus'τ out» 2,Z5 .-_ Ί,-ί', rcrS.nr-ithyl-

- 1 0 9 8 A ?/ ^ 3.7 7

OWGINAt iNSPECTEO

-32- 21U300

ester.

1,89 g tert.-Butyloxyearbonyl-ß-alanin werden in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird auf -10°C abgekühlt und unter Rühren zunächst mit 2,04 g Tri-n-butylamin und hierauf mit 1,19 g Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten wird eine Suspension von 1,95 g L-Tyrosinmethylester in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -10 C und anschliessend 2 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wird das LÖsungsmittel unter vermindeiten. Druck abdestilliert, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, nacheinander mit 1 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Katriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und über natriumsulfat getrocknet. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2,99 go Nach Umkristallisation aus einer Mischung von Methanol und Äther schmelzen die Kristalle bei 141 und 142 C. ^yf + 8_?2 + 0,5° (c=l, 020, Methanol).

(e) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosinhydragid 2j 56 g tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosinmethylester v/erden in 26 ml wasserfreiem Äthanol gelöst und mit 1,7 ml Hydrasinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und danach 16 bis 18 Stunden in einen Sisstrang verbracht. Die ausgeschiedenen Kristalle werden alifiltriertj wit ÄUiancl unu Äther gewaschen und getrocknete Ausbeute 2„54 g. Nach Umkristallisation aus heissem Was—

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ser schmilzt die Verbindung bei 213,5 bis 215°C.

/iY/p⁵ + 3,6 + 0,6° (c=O,978, 50prozentige Essigsäure).

(d) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-I-

me thi oninme thyles t er

1,10 g tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosinhydrazid werden in 7,5 ml kalter 1 η Salzsäure gelöst. Die Lösung wird auf -1O⁰C abgekühlt und mit 3,6 ml 2 molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach 4-minütigem Stehen wird das gebildete Azid mit Äther extrahiert, der Ätherextrakt mit kalter 1 molarer Natriumbicarbonatlosu^g gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von etwa 10 C eingedampft. Der Rückstand wird in kaltem Acetonitril gelöst und die Lösung mit 0,756 g L-Seryl-L-methioninmethylester versetzt und 48 Stunden stehengelassen. Der L-Seryl-L-methioninmethylester wurde nach Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39,(1966), Seite 1171 hergestellt.

Nach beendeter Unusetzung wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat und einer geringen Menge Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wird nacheinander mit kalter 1 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung und V/asser gewaschen und über Natriurasulfat getrocknet. Sodann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert, die gelatinöse Masse abfiltriert, mit kaltem Äthylacetat und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1,204- g. Day Produkt wird durch Urn fällung aus Äthylacetat gereinigt. P. 121,5 bio 123°C;

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- 13,0 ι 0,6° (c-0,997, Methanol). Rf = 0,53 (Dünnschichtchromatographie an Silikagel im Lösungsmittelgemisch mit Methanol-Essigsäure » 15 : 85).

(e) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L- methioninhydrazid

0,969 g tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninmethylester werden in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 ml Hydrazinhydrat versetzt und 43 Stunden in der Kälte stehengelassen. Danach wird die Lösung mit Äthylacetat versetzt. Hierbei fällt eine ge? at ^:.:iöse Masse aus, die abfiltriert, mit kaltem Äthylacetat gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 1,01 g. Nach Umkristallisation aus V/asser schmilzt die Verbindung bei 186,5 bis 188⁰C. [V^ - 20,1 + 0,5° (c=l,346, 50prozentiges Methanol),

(f) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-aüanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-

me thionyl-/- tert,-butyl-l·—frlutamyl-L-hi st idyl-L-r>henylalany 1-L-arginyl-I—tryptophyl-glycin

0,452 g tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninhydrazid werden in 4,5 ml 90prozentigem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird in einer Kältemischung aus Eis und Kochsalz abgekühlt und unter Rühren mit 2,0 ml eiskalter 1 η Salzsäure sowie 0,825 ml 1 molarer Natriumnitritlösung

versetzt. Nach etwa 4 Minuten werden 20 ml eiskalte gesättigte Natriumchloridlösung zugegeben, und das gebildete tert.-Butyloxycarbonyl-tetrapeptidazid wird mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der !Extrakt wird mit eiskalter 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

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0*496 g 2f*-tert.-2utyl-L-g3utamyl-L-hiatidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-acetat ( hergestellt nach der in Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 38 (1965), Seite 1148 beschriebenen Methode) und 0,21 ml Triethylamin werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung des oben erhaltenen Azids in Ä'thylaeetat' versetzt, und das A'thylacetat wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 10 bis 15 G abdestilliert. Die erhaltene klare Lösung wird 16 bis 18 Stunden im Iiluilschrank stehengelassen. Nach nochmaliger Zugabe von aus O,k26 g Tetrapeptidhydrazid hergestelltem Azid zur Lösung wird das Gemisch im Kühlschrank 16 bis 18 Stunden stehengelassen.

Anschliessend wird das Gemisch tropfenweise in 200 ml eiskaltes Ä'thylacetat unter Rühren gegeben. Die gebildete Fällung wird abfiltriert. Ausbeute 0,691 g rohes Dekapeptid, das aus einer Mischung von Dimethylformamid und Methanol (2 : 5) umgefällt und aus Essigsäure lycphillsiert wird. Ausbeute 0,454 g eines Pulvers. Die Dünnschichtchromatographie des Produktes an Silikagel ergibt einen einzigen Fleck mit einem

^⁵ °

R_f-Wert von 0,54 bis 0,57. W^⁵ - 19,4 + 0,7° (c=0,882, Dimethylformamid).

Gemäss Beispiel 1 (k) wird tert.-Butyloxyearbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-^tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-1-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit K^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycylli-tert.-butyl oxycarboft.v I-L-orr.ithyl-N^e-tert,-buty lüxycarb.i nyl-L-lysyl-L-arginyl-L'-argiainamid konaenaiert, und das er

-03342/1977

haltene geschützte Ccta^okapentid wird mit Fluorwasserstoff

und von den Schutzgruppen Worrell,/ zur Umsetzung gebracht/ Kach cnroiriatugraphia'öTher Reinigung erhält man das ß-Alaiiyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-lglutamyl-L-histidyl-i-phenylalanyl-Ir-arginyl-I-tryptcphyl" glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid« Dieses Produkt ist identisch mit dem in Beispiel 1 (k) erhaltenen Octadekapeptid.

Beispiel 3

0,5 mg /Ϊ3-AIa¹,Orn¹⁵/-ACTH( 1-18)~ffiI₂-acetat werden in 0,25 ml 40 millimolarer Zinkcliioridlösung bei Raumtemperatur gelöst. Die lösung wird mit O₅25 ml einer 40 millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 4,5 mg Katriumchlorid enthält. Man erhält eine Suspension des Zinkkomplexes, die mit 0,1 η Natronlauge auf p„ I₉O eingestellt wird.

Beispiel 4

0,5 mg /ß-Ala¹,Orn¹⁵/-AC0}H( 1-18)-NH₂-acetat werden in 0,15 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 0,1 ml einer Lösung von Poly-L-glutaminsäure versetzt (0,5 mg; Molekulargewicht 15·00 bis 2000). Diese Lösung wurde vorher mit 0,1 η Natronlauge neutralisiert» Das Gemisch wird mehrere Minuten gerührt, danach mit O₅25 ml eines m/'3Q Phosphatpuffers versetzt, der 4,·5 mg Natriumchlorid enthält» Der erhaltene Komplex wird mit 0,1 η Watronlauge auf p_H 7^0 eingestellt.

'Beispiel 5

I₅O mg /JB-Ala¹ βOr^'^'-ÄCTlK 1-IS)-^K₂-ROetat v/erden in 0,2 ml destilliertem V/asser gelöste. Me Traurig wird unter Eühron mit

1 0 8 3 k 2 i 1 311

BkO ORIGINAL

- öl -

einer Lösung von Poly-L-asparaginsäure versetzt (2 mg, Molekulargewicht etwa 3000). Diese Lösung wurde vorher mit 0,3 ml 0,1 η Natronlauge, neutralisiert. Es bildet sich eine weisse Fällung. Diese Fällung wird mit 0,5 ml· einer Lösung von m/15 Dinatriumhydrogenphosphat/Kaliumdihydrogenphosphatpuffer vou

versetzt/

P₁J 6,§^ 'der 9,0 mg Natriumchlorid enthält, und mit 0,1 η Natronlauge auf ρ,, 7,0 eingestellt.

Beispiel 6

°f.5 mg /13-Ala¹,Om¹⁵Z-ACTH(I-IS)-NH₂-acetat werden in 0,15 ml 100 mi11imölarer Zinkchloridlösung gelöst. Andererseits werden 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 2000 bis

5000 mit 0,1 ml 0,1 η Natronlauge neutralisiert. Die Lösung wird mit 4,5 mg Natriumchlorid sowie 0,25 ml 40 milliniolarer Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Die erhaltenen lösungen werden vereinigt und bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension des erhaltenen Komplexes wird mit 0,1 η Natronlauge neutralisiert.

Beispiel?

0,5 mg /ß-Ala¹,Orn¹⁵7-AGTH(1-18)-NH₂-acetat werden in 0,1 ml Wasser bei Raumtemperatur gelöst und mit 0,25 ml eines m/15 Kaliumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphatpuffers versetzt, der 4,5 mg Natriumchlorid enthält. 2>0 mg Gopoly-L-glutamyl-L-tyroßin (Molekulargewicht 21 850) werden mit 0,15 ml 0,1 η Natronlauge neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wird.zur erhaltenen Peptidlösung gegeben und gerührt. Der erhaltene Komplex wird mit 0,1 η Natronlauge auf p^ 7,0 eingestellt.

.-ο-,*■■: 109842/1977

Beispiel 8

0,5 mg /ß-Ala¹,0rn¹⁵7-ACTH(l-18)-liH₂-acetat werden in 0,1 ml V/asser gelöst und mit 0,25 ml m/15 Phosphatpuffer versetzt, der 4,5 mg Natriumchlorid enthält. 7'mg Copoly-I-glutamyl-L-tyrosin (Molekulargewicht etwa 21 850) werden mit 0,1 η Natronlauge neutralisiert. Die- neutralisierte Lösung (0,1 ml) wird zu der lösung des erhaltenen Peptids gegeben. Zunächst bildet sich eine Suspension, die sofort klar wird. Danach wird

/Natriumsalz der Kthylmercurithiosalicylsäure/
die lösung mit 0,1 mg ]/ m υ,υ^ nu. Wasser versetzt una

mit 0,1 η Natronlauge auf p_H 7,0 eingestellt.'

⁸*D ORIGINAL 1098A2/1977

Claims (4)

1. ß-Alanyl-L-tyroijyl-l-seryl-X-I-L-histidyl-L-phenylalanyl-I-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-I-valyl-

   glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z

   in der X ein L-Methionin-, L-Norvalin-, L-Norleucin-, L-Leucin- oder Qi-Aminobuttersäurerest, Y ein L-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest und Z ein L-Arginin-, L-Argininester- oder L-Argininamidrest ist, ihre pharniakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.
2. 2. Octadekapeptide nach Anspruch 1.der allgemeinen Formel

   ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyi-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-

   L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z

   in der Z ein L-Arginin-, L-Argininester- oder L-Argininamidrest ist, ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.
3. 3. Octadekapeptide nach Anspruch 1 der Pcrmel

   ß-Alanyl-L-tyrücyl-L-seryl-L-methiOnyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-

   lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornitbyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid, seine pharmakologisch verträgliehen Säureadditionssalze und Komplexe.

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   21U300
4. 4. Arzneipräparat, enthaltend ein Octadekapcpiid. nach Anspruch 1 bis 5 als Arzneistoff und übliche Träger.-toffe,. Verdünnungmittel und Hilfsstoffe.

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