DE2103772A1 - Verfahren zur Herstellung eines Peptidase Inhibitor Präparates - Google Patents

Description

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"PENTAPHARM A.G., Basel

Verfahren zur Herstellung eines ·

Peptidase-Inhibitor-Präparates

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptidase-Inhibitor-Präparates aus einem Peptidase-Inhibitor enthaltenden Ausgangsmaterial.

Peptidase-Inhibitor ist ein basisches Polypeptid, das von M. KUNITZ & J.H. NORTHROP CS. Gen. Physiol. 19, 991-1007 (1936)7 aus Pankreasdrüsen isoliert wurde und die Eigenschaft besitzt, verschiedene Peptidasen, Proteasen und andere Wirkstoffe, z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Plasmin, plasminaktivierende Fermente, Blutgerinnumgsfaktoren und Leukozytenpeptidasen, irreversibel zu hemmen oder zu inaktivieren. Peptidase-Inhibitor -Präparate v/erden als Heilmittel, z.B. in der Therapie der Pankr^atitis, verwendet. In der Literatur

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werden anstelle des Ausdruckes "Peptidase-Inhibitor" auch andere Bezeichnungen verwendet, z.B. Kallikrein-Inaktivator, Protease-Inhibitor, etc.

Der Peptidase-Inhibitor kommt in verschiedenen tierischen Organen und Körperflüssigkeiten, wie z.B. Leber, Milz, Parotis, Lunge, Lymphdrüsen, Ohrspeicheldrüsen, Darm, Pankreas oder Blut, insbesondere von Säugetieren, z.B. von Wiederkäuern, vor und kann durch Extraktionsmethoden aus diesen tierischen Materialien gewonnen werden.

Mehrere Verfahren zur Herstellung von Peptidase-Inhibitor- bzw. Kallikrein-Inaktivator-Präparaten sind bereits bekannt. Nach der deutschen Patentschrift 950.959 wird Kallikrein-Inaktivator nach einem Verfahren hergestellt, bei welchem man frische tierische Organe, z.B. Lymph- oder Ohrspeicheldrüsen, Pankreas oder Blut, zweimal mit dem fünffachen Volumen Aceton entfettet, mit angesäuertem 70-Jiigem Alkohol in der Wärme extrahiert, die Extrakte unter vermindertem Druck einengt und mit Aether ausschüttelt, den Kallikrein-Inaktivator aus der wässrigen Phase mit Alkohol, Aceton oder einem anderen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel ausfällt, den Niederschlag in verdünnter Essigsäure löst, die Lösung schwach alkalisch stellt, um Begleitstoffe zu entfernen, und den Kallikrein-Inaktivator mit Alkohol, Aceton oder einem anderen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel ausfällt.

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In der deutschen Patentschrift 954.284 ist ein Verfahren zur Herstellung von Kallikrein-Inaktivator beschrieben, gemäss welchem man aus wässrigen oder essigsauren Extrakten entfetteter und getrockneter tierischer Organe, z.B. Lymph- oder Ohrspeicheldrüsen von Wiederkäuern, die Eiweisskörper mittels Trichloressigsäure ausfällt, die den Kallikrein-Inaktivator enthaltenden Lösungen schwach alkalisch stellt und mit dem gleichen Volumen Alkohol versetzt, um Begleitstoffe auszufällen, das PiItrat auf p„ 6 einstellt, unter vermindertem Druck einengt, ausäthert und den Kallikrein-Inaktivator mit der zehnfachen Menge Alkohol ausfällt. Die Herstellung von Kallikrein-Inaktivator aus Leber, Milz oder Colostrum nach ähnlichen Methoden ist in der deutschen Patentschrift 956.097 beschrieben.

Gemäss der deutschen Patentschrift 1.011,576 wird Kallikrein-Inaktivator dadurch erhalten, dass man Rinderleber homogenisiert und mit verdünnter wässriger Trichloressigsäure extrahiert, die Trichloressigsäure durch kontinuierliche Extraktion mit Aether entfernt und den Kallikrein-Inaktivator mittels Aceton ausfällt. Gemäss der deutschen Patentschrift 1.014.288 erfolgt die Ausfällung des Kallikrein-Inaktivators dadurch, dass man der von Trichloressigsäure befreiten Lösung gesättigte Ammoniumsulfatlösung zusetzt, den Niederschlag in Wasser löst und den Kallikrein-Inaktivator mittels Pikrinsäure ausfällt. Zur Freisetzung des Kallikrein-Inaktivators

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löst man das Pikrat in verdünnter Säure und chromatography ert die Lösung über einen schwach basischen und anschliessend über einen schwach sauren Ionenaustauscher, aus welchem der Kallikrein-Inaktivator mit Säure eluiert wird. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Kallikrein-Inaktivator ist in der deutschen Patentschrift 1.08²1.433 beschrieben. Dieses Verfahren besteht darin, dass man zerkleinerte, den Kallikrein-Inaktivator enthaltende tierische Organe, vorzugsweise Parotis, Leber oder Lunge, mit wässrigen, zweckmässig wassermischbare organische Lösungsmittel vorzugsweise Methanol - enthaltenden Lösungen von Salzen oder Hydroxyden der Erdalkalimetalle oder von Alkalisalzen extrahiert, den Extrakt mit einem Keton, vorzugsweise mit Aceton und in Gegenwart einer feinverteilten inerten Trägersubstanz, fällt, den abgetrennten Niederschlag, vorzugsweise nach Trocknung, mit Wasser extrahiert, das restliche Eiweiss aus der Lösung mit einem Eiweissfällungsmittel, vorzugsweise mit SuIf©salicylsäure, quantitativ fällt und nach Abtrennung des Niederschlags aus der verbleibenden Lösung das überschüssige Eiweissfällungsmittel mit Hilfe von Ionenaustauschern entfernt. Nach der deutschen Patentschrift 1.146.616 fällt man den Kallikrein-Inaktivator aus einer salzfreien wässrigen Lösung mittels Metaphosphorsäure aus. Man erhält dabei allerdings den Kallikrein-Inaktivator nicht in freier Form,

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sondern als schwerlösliches Derivat. Eine Variante dieses Verfahrens ist in der deutschen Patentschrift 1.155.503 beschrieben, gemäss welcher das schwerlösliche Metaphosphorsäurede^ivat des Kallikrein-Inaktivators durch Auflösen in Laugen oder Salzlösungen zerlegt und die Lösung von Salzen befreit wird. Ferner ist in der deutschen Patentschrift 1.179.333 ein Verfahren beschrieben, das darin besteht, dass man den Kallikrein-Inaktivator aus seinen Lösungen mit Gerbsäure im p„-Bereich zwischen 2,0 und 10,0, vorzugsweise

A ¹I₉O und 8,0 ausfällt, den Niederschlag abtrennt, durch ^

Auflösen in Säure aufspaltet und den Inaktivator durch wassermischbare organische Lösungsmittel ausfällt. Ein weiteres Fällungsverfahren ist in der deutschen Patentschrift I.I8I.37I beschrieben. Als Fällungsmittel werden Polyphosphorsäuren oder deren wasserlösliche Salze vorgeschlagen. Bei diesem Verfahren ist die Verwendung eines Oberschusses an Fällungsmittel zu vermeiden. Kallikrein-Inaktivator-Präparate von höherem Reinheitsgrad sollen laut deutscher Patentschrift 1.193.200 dadurch erhalten werden, dass man ™ den Kallikrein-Inaktivator aus seinen Lösungen mit wasserlöslichen Salzen der Metaphosphorsäure unter Vermeidung eines Oberschusses des Fällungsmittels ausfällt, den Niederschlag abtrennt, durch Auflösen in Ammoniak, Laugen oder Salzlösungen zerlegt und die Lösung nach an sich bekannten Methoden von den Salzen befreit. In der deutschen Patentschrift 1.251.911 wird als Fällungsmittel Elastin vorgeschlagen. Bei diesem Verfahren wird der Kallikrein-Inaktivator in wässriger Lösung

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bei p„ 7 bis 10 mit Elastin behandelt, der entstandene Komplex abgetrennt, durch Behandlung mit wässrigen Medien vom p_H 1 bis 6 zerlegt und die Lösung von Salzen befreit. Kallikrein-Inaktivator in kristallisierter Form wird nach der deutschen Patentschrift 1.252.36¹I dadurch erhalten, dass man as ine wässrige Losung entweder durch Zusatz von Basen oder durch Austausch der Anionen durch OH-Ionen

auf einen p„-Wert von mindestens 9 einstellt, gegebenenfalls η

einengt und bei einer Konzentration von mindestens 5000 KIE/ ecm den Inaktivator auskristallisieren lässt.

Im französischen Heilmittelpatent Nr. 620 M ist eine Methode beschrieben, nach welcher Peptidase-Inhibitor aus schwefelsauren wässrigen Pankreasextrakten durch 15 aufeinanderfolgende Fällungen mit Ammoniumsulfat und Magnesiumsulfat bei verschiedenen p„-Werten gewonnen wird.

Gemäss der französischen Patentschrift 1.483.866 wird Protease-Inhibitor dadurch erhalten, dass man eine ^ wässrige Lösung, die den Inhibitor in einem Reinheitszustand von 80-140 Antitrypsineinheiten pro mg enthält, während 1-16 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, mit 8-10 Vol.-?, vorzugsweise 5 Vol.-?, Magnesiumoxyd bei 10-50° C, vorzugsweise bei 25° C, rührt, die Lösung von dem mit den Verunreinigungen behafteten Magnesiumoxyd befreit und gegebenenfalls die Kationen mit einem Kationenausbauscher entfernt, den Wirkstoff durch Zugabe von 2-6 Volumina, vorzugsweise H Volumina, eines

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niederen aliphatischen Alkohols, vorzugsweise Aethanol, oder Aceton aus dem Filtrat ausfällt und mit Wasser, das frei von Pyrogenen Stoffen ist, oder mit physiologischer Kochsalzlösung aufnimmt.

Schliesslich ist in der britischen Patentschrift 1.070.870 ein Verfahren zur Herstellung von kallikrein- und trypsininaktivierenden Polypeptiden beschrieben, gemäss welchem man Kallikrein- und Trypsin-Inhibitoren enthaltende tierische Organe zerkleinert, das zerkleinerte Material mit A einer Phosphor-, Schwefel- oder Oxalsäure enthaltenden wässrigen Lösung extrahiert, den Organextrakt mit einem Metalloxyd und/oder -hydroxyd, dessen Kation mit der für die Extraktion verwendeten Säure bei Raumtemperatur ein Salz mit einem Loslichkeitsprodukt von nicht mehr als IO" bei 25°C bildet, behandelt, den Niederschlag von dem Organextrakt abtrennt, die aktiven Polypeptide durch Adsorption an Aluminosilikate natürlicher oder synthetischer Herkunft bei einem p„ von 5-7 aus dem Organextrakt isoliert, das Adsorbens abtrennt und A mit angesäuertem Wasser wäscht, die aktiven Polypeptide mittels eines polaren Lösungsmittels verdünnt, mit Wasser, welches mittels einer Mineralsäure oder starken organischen Säure auf ein p„ von nicht mehr als drei angesäuert ist, eluiert und die erhaltene Lösung der gewünschten Substanz einer weiteren Reinigung unterwirft.

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Die oben aufgezählten Verfahren sind alle zum ausschliesslichen Zweck der Gewinnung von Peptidase-Inhibitor aus Extrakten von tierischen Organen ohne Berücksichtigung der anderen in diesen Organextrakten enthaltenen wertvollen Stoffe, wie z.B. Aminosäuren, Peptide, Eiweisskörper, Purine, Nucleoside, Nucleotide, Kohlehydrate (Glycogen) Heparin u.a., entwickelt worden. Bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von Peptidase-Inhibitor werden die meisten dieser anderen Stoffe grösstenteils oder vollständig zerstört, so dass die Fabrikationsrückstände keine weitere Verwertung erfahren können und demnach wertlose Abfallprodukte sind. Bei Salzfällungen wird die Mutterlauge für eine weitere Verwendung unbrauchbar; ausserdem werden zusammen mit dem Peptidase-Inhibitor Begleitsubstanzen ausgesalzt, so dass komplizierte Reinigungsoperationen mit mehreren Arbeitsstufen erforderlich werden. Fällungen mit organischen Lösungsmitteln sind unspezifisch, indem die verschiedensten Peptide, Proteine, Polysaccharide, Nucleotide und anorganische Salze zusammen mit dem Peptidase-Inhibitor ausgefällt werden. Bei Ausfällungen mit Lösungsmitteln muss ferner meist mit grossen Volumina gearbeitet werden, so dass zur Rückgewinnung der meist feuergefährlichen Lösungsmittel grosstechnische, explosionssichere Destillieranlagen erforderlich sind. Bei 'Ausfällungen mittels Pikrinsäure oder Gerbsäure kann das überschüssige Fällungsmittel nur unter unwirtschaftlichen Aufwand aus den Extrakten entfernt werden. Einige der

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erwähnten Verfahren, wie z.B. die Kristallisation des Peptidase-Inhibitors durch Zusatz von Basen, die Fällung mit Elastin, Metaphosphorsäure oder Polyphosphorsäure, sind nur mit Konzentraten, in welchen der Peptidase-Inhibitor bereits stark angereichert ist, durchführbar. Zur Kristallisation eignen sich nur Lösungen mit mindestens 5000 Kallikrein-Inaktivator-Einheiten (KIE) per ml. Die Fällung mit Meta- oder Polyphosphorsäuren und deren Salzen ist nur aus salzarmen Lösungen möglich, denn bereits ein Salzgehalt von 1% ' oder mehr verhindert die Entstehung des wasserunlöslichen Komplexes. Eine l#-ige Lösung von Ammoniumchlorid oder Natriumchlorid spaltet den in salzarmer Lösung gebildeten Meta- oder Polyphosphatkomplex quantitativ; die Fällungsprodukte sind zudem in überschüssigem Fällungsmittel löslich. Eine Fällung des Peptidase-Inhibitors aus Extrakten mittels Elastin ist unwirtschaftlich. Die Verwendung dieses teuren Fällungsmittels kommt nur zur weiteren Reinigung bereits

angereicherter Inaktivatorpraparate in Frage. Die Adsorption an Bentonite ist unspezifisch, indem neben dem Peptidase-Inhibitor die verschiedensten Polypeptide mitadsorbiert werden. Ausserdem wird der Adsorptionsvorgang durch die Anwesenheit von Salzen gestört. Ein Verfahren zur Gewinnung von Peptidase-Inhibitor aus denselben und andere wertvolle Wirkstoffe enthaltenden rohen oder lediglich enteiweissten Extrakten von tierischen Organen oder Körper-

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flüssigkeiten, bei welchem die Zerstörung oder der Verlust der anderen Wirkstoffe vermieden werden könnte, war bis jetzt nicht bekannt.

Es wurde nun gefunden, dass der polyvalente Peptidase· Inhibitor leicht und z.B. auch in Gegenwart von anderen Wirkstoffen, die zusammen mit dem ersteren in tierischen Organextrakten enthalten sind, mit sauren Orthophosphorsäureestern spezifisch reagiert unter Bildung eines in Wasser unlöslichen, in niederen Alkanolen jedoch löslichen Komplexes. Dieser Komplex lässt sich leicht zersetzen und liefert bei der Zersetzung den Peptidase-Inhibitor im Zustand hoher Reinheit.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung eines Peptidase-Inhibitor-Präparates aus Peptidase-Inhibitor enthaltenden Ausgangsmaterialien, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den im Ausgangsmaterial enthaltenen Peptidase-Inhibitor durch Umsetzung mit einem sauren Orthophosphorsäureester der Formel

OH
0=p OR₁ I

OR₂

in welcher R, einen mindestens 2 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest und Rp Wasserstoff oder einen mindestens 2 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest bezeichnen, in einen in Wasser unlöslichen, in niederen Alkanolen jedoch loslichen Komplex überführt und den letzteren durch

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Umsetzung mit einer anorganischen Base, einer Mineralsäure oder einem in einem niederen Alkanol löslichen Erdalkalimetallsalz zerlegt, um den Peptidase-Inhibitor zu gewinnen. Als Ausgangsmaterxalien für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind wässrige Lösungen des Peptidase-Inhibitors verwendbar, z.B. rohe wässrige Extrakte, die nach an sich bekannten Methoden durch Extraktion von Peptidase-Inhibitor enthaltenden tierischen Organen oder Körperflüssigkeiten von Säugetieren, insbesondere Wiederkäuern, mittels gegebenenfalls angesäuerten wässrigen Medien erhalten werden. Als Ausgangsmaterialien eignen sich auch solche wässrige Organextrakte, aus denen gewisse Begleitstoffe, z.B. Eiweissstoffe, bereits entfernt worden sind. Es können sowohl wässrige Lösungen, die den Peptidase-Inhibitor nur in geringer Konzentration enthalten, als auch bereits höher konzentrierte Lösungen verwendet werden. Als Ausgangsmaterialien kommen ferner wässrige Lösungen von ungenügend reinen Peptidase-Inhibitor-Präparaten, die einer weiteren Reinigung bedürfen, in Frage. Die überführung des gelösten Peptidase-Inhibitors in einen in Wasser unlöslichen, jedoch in niederen Alkanolen löslichen Komplex lässt sich leicht und einfach durchführen, indem man den wässrigen Peptidase-Inhibitor-Lösungen bzw. -Extrakten den sauren Phosphorsäureester als solchen oder in Form einer wässrigen Suspension oder einer konzentrierten Lösung in einem organischen Lösungsmittel,

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z.B. Chloroform oder Aethanol, bei Temperaturen von etwa 0-60° C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, und vorzugsweise unter Rühren zusetzt. Die Ausfällung des durch Umsetzung des Peptidase-Inhibitors mit dem sauren Phosphorsäureester entstehenden Komplexes erfolgt augenblicklich und vollständig. Die Umsetzung und Ausfällung des Peptidase-Inhibitors mit dem sauren Phosphorsäureester ist spezifisch und wird durch die Anwesenheit von anderen Wirkstoffen und Begleitsubstanzen, z.B. Salzen, nicht gestört. Ein überschuss an Fällungsmittel wirkt sich ebenfalls nicht störend auf die Umsetzung und Fällung des Peptidase-Inhibitors aus und lässt sich gegebenenfalls leicht durch Anionenaustausch oder mittels eines Erdalkalimetallsalzes oder -hydroxyds entfernen. Um die Spezifität der Ausfällung zu erhöhen, ist es ratsam, im Falle von stark sauren wässrigen Lösungen bzw. Extrakten die Acidität zu vermindern. Wenn die als Ausgangsmaterialien verwendeten wässrigen Lösungen bzw. Extrakte alkalisch sind, müssen grössere Mengen an Fällungsmittel verwendet v/erden. Der p„-Wert der wässrigen Lösungen bzw. Extrakte, aus welchen der Peptidase-Inhibitor mit dem sauren Phosphorsäureester ausgefällt werden soll, wird vorzugsweise auf 5 bis 7 eingestellt. Der ausgefällte Peptidase-Inhibitor-Phosphorsäureester-Komplex kann nach kurzer Zeit durch Filtration oder Zentrifugation von der flüssigen Phase abgetrennt werden.

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Beim Arbeiten im grosstechnischen Massstab ist es jedoch zweckmässig, die Mischung einige Zeit, z.B. während einer Nacht, stehen zu lassen. Die klare überstehende Mutterlauge kann dann durch Abhebern grösstenteils entfernt werden, wodurch die Filtration oder Zentrifugation grosser Flüssigkeitsvolumina vermieden werden kann.

Die Zersetzung des Komplexes zwecks Freilegung des Peptidase-Tnhibitors kann nach verschiedenen Arbeitsweisen durchgeführt werden. Gemäss einer ersten Arbeitsweise löst _# * man den Peptidase-Inhibitor-Phosphorsäureester-Komplex in einem niederen Alkanol, vorzugsweise in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methanol, Aethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol oder Isobutanol. Unlösliche Begleitstoffe, z.B. allfällig ausgefällte Proteine, können durch Filtration der alkanolischen Lösung entfernt werden. Der gelöste Komplex kann durch Behandlung der alkanolischen Lösung mit einer in niederen Alkanolen löslichen anorganischen Base, z.B. einem Alkalxmetallhydroxyd, wie Natrium - oder ^j

Kaliumhydroxyd, oder Ammoniak, oder einer quaternären Ammoniumbase, bei Raumtemperatur, zersetzt werden. Der Peptidase-Inhibitor scheidet sich von der alkanolischen Lösung ab und kann durch Filtration oder Zentrifugation isoliert werden. Die Phosphorsäureesterkomponente bleibt im Alkane} gelöst. Anstelle von anorganischen Basen kann man für die Zersetzung des Komplexes und Abscheidung des Pentidase-Inhibitorr

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auch alkanollSsliche Erdalkalimetallsalze, z.B. Chloride, wie Calcium-, Magnesium-, Strontium- oder Bariumchlorid, verwenden. Die Zersetzung des Komplexes und Abscheidung des Peptidase-Inhibitors können ferner durch Behandlung der alkanolischen Losung des Komplexes mit einer Mineralsaure, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure, durchgeführt werden.

Gemäss einer anderen Arbeitsweise wird der ausgefällte Peptidase-Inhibitor-Phosphorsäureester-Komplex mittels einer Lösung einer Mineralsäure in Aceton zersetzt. Die Phosphorsäureesterkomponente bleibt im Aceton gelost. Der ausgeschiedene unlösliche Rückstand kann in Wasser aufgenommen werden. Durch Neutralisierung der Lösung, Ausfällung von Ballaststoffen mittels eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, z.B. eines Alkanols, wie Aethanol, oder eines Ketons, wie Aceton, Filtration und Entfernung des organischen Lösungsmittels durch Destillation unter vermindertem Druck kann man eine konzentrierte wässrige Lösung des Peptidase-Inhibitors herstellen. Der Reinheitsgrad des erhaltenen Peptidase-Inhibitor-Präparates kann durch eine erneute Umfällung mit einem sauren Phosphorsäureester noch erhöht werden.

Eine andere Ausführungsform des erfindungspemässen Verfahrens besteht darin, dass man Peptidase-Inhibitor enthaltende tierische Organe oder Körperflüssigkeiten direkt mit

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einer Lösung des sauren Orthophosphorsäureesters in einem niederen Alkanol, der vorzugsweise 1 bis H Kohlenstoffatome enthält, .extrahiert. Als tierisches Ausgangsmaterial können z.B. Lunge, Leber, Milz, Hirn, Herz, Bauchspeicheldrüsen, Lymphdrüsen, Ohrspeicheldrüsen, Darm, Blut, Muskelgewebe, Nieren und Schilddrüsen von Säugetieren, insbesondere Wiederkäuern, in frischem oder gefrorenem Zustand oder in Form von z.B. durch Vakuumtrockung oder Gefriertrocknung hergestellten Trockenpräparaten verwendet werden. Bei der Extraktion dieser tierischen Materialien mit der alkanolischen Lösung des sauren Orthophosphorsäureesters reagiert der Peptidase-Inhibitor mit dem genannten Ester unter Bildung eines Komplexes, der sich im alkanolischen Extraktionsmittel löst. Die Zersetzung des gelösten Komplexes und die Abscheidung des Peptidase-Inhibitors können nach den oben beschriebenen Methoden durchgeführt werden.

Diese Variante des erfindungsgemässen Verfahrens eignet sich besonders zur Verarbeitung vcn durch Gefriertrockung oder Vakuumtrockung erhaltenen tierischen Organmaterialien. Besonders gut eignet sich Rinderlunge, die im Vakuum bei etwa 60°C getrocknet worden ist.

Als saure Orthophosphorsaureester der Formel I können beispielsweise solche verwendet werden, in welchen die mit R, und Rp bezeichneten Kohlenwasserstoffreste Alkylreste mit mindestens 2 und vorzugsweise bis zu 20 Kohlenstoffatomen,

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Cycloalkylreste, Cycloalkyl-alkylreste, Arylreste oder Arylalkylreste sind. Vorzugsweise verwendet man Orthophosphorsäure-mono- oder -dialkylester oder Gemische von Mono*· und Dialkylestern, z.B. Orthophosphorsäure-mono- oder -dibutylester, Orthophosphorsäure-mono- oder dioctylester, Orthophosphorsäure-mono- oder- didodecylester, Orthophosphorsäure-mono- oder-distearylester u.a., oder technicsche Gemische der genannten Mono- und Diester.

Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt gegenüber den bekannten Verfahren zur Gewinnung von Peptidase-Inhibitör-Präparaten verschiedene wesentliche Vorteile. Die Spezifität der Reaktion zwischen dem Peptidase-Inhibitor und dem sauren Orthophosphorsäureester gestattet es, die Zerstörung oder den Verlust von anderen Wirkstoffen bei der Extraktion von tierischen Organen oder Körperflüssigkeiten und bei der Verarbeitung der Extrakte weitgehend zu vermeiden. Die Rückstände des erfindungsgemässen Verfahrens sind als Ausgangsmaterialien für die Gewinnung von anderen therapeutisch wertvollen Wirkstoffen brauchbar. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass man die Rückstände, die bei Herstellung von Wirkstoffen aus tierischen Organen, z.B. bei der Herstellung von antianämisch wirksamen Präparaten aus Rinderleber, als wertlose Abfallprodukte anfallen, als Ausgangsmaterialien .für die Gewinnung von Peptidase-Inhibitor-Präparaten nach den erfindungsgemässen Verfahren verwenden kann, selbst wenn diese Rückstände nur einen geringen Gehalt an Peptidase-Inhibitor

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aufweisen- Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet eine starke Anreicherung und weitgehende Reinigung des Peptidase-Inhibitors, selbst bei Verwendung von rohen Extrakten mit verhältnismässig geringem Gehalt an Peptidase-Inhibitor, in wenigen grosstechnisch einfach durchzuführenden Arbeitsgängen.

Beispiel 1

10 Liter Leberextrakt hergestellt nach der in "National Formulary", Ausgabe IX, 1950, Seite 298-299 beschriebenen Methode; dort als "Liver Fraction No. 1" ' bezeichnet^ mit einem Trockensubstanzgehalt von 10 Vol.-5? wurden unter Rühren mit 50 ml Dibutylphosphat versetzt und während 1 Stunde gerührt. Der gebildete flockige Niederschlag wurde abfiltriert, mit 250 ml destilliertem Wasser verrührt und erneut filtriert. Der gewaschene Niederschlag wurde zwecks Zersetzung mit 500 ml einer Mischung von 5 Teilen 10£- iger HCl und 95 Teilen Aceton gerrührt. Der den Peptidase-Inhibitor enthaltende Rückstand wurde in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, der ρ -Wert der Lösung wurde mittels Natron-

lauge auf 8,0 eingestellt, und ungelöste Substanzen wurden durch Zentrifugation abgetrennt. Das Zentrifugat wurde mit 5 ml Dibutylphosphat versetzt und der p_R-Wert auf 5,5 eingestellt. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 50 ml absolutem Alkohol aufgenommen. Die Lösung wurde \ Stunde gerührt und hierauf filtriert. Das Filtrat wurde mit 10 . ml einer 10£-igen Lösung von CaCl₂ in Aethanol versetzt und während 2 Tagen im Kühlraum sich selbst überlassen. Der

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in Form feinster Tröpfchen abgeschiedene Peptidase-Inhibitor wurde durch Zentrifugation abgetrennt, zweimal mit je 10 ml absolutem Aethanol gewaschen und hierauf im Vakuum getrocknet. Man erhielt 154 mg einer weissen Substanz, die insgesamt 77¹JOOO KIE enthielt. Der Reinheitsgrad betruß somit 0,2 meg/ KIE. (KIE = Kallikrein-Inaktivator-Einheit = Inaktivatormenge, die in 1 Stunde bei p„ 8 und 37°C zwei Kallikrein-

Einheiten fKEj zur Hälfte inaktiviert. Kallikrein-Einheit = Kallikrein-Menge, die bei intravenöser Injektion an der Carotis-Druckkurve des Hundes dieselbe Wirkung hervorruft wie 5 ml Menschenharn, die einer Sammelprobe von 50 Liter entnommen und gegen fliessendes Wasser dialysiert wurden. Bestimmungsmethoden für Kallikrein und Kallikrein-Inhibitor sind in "Methoden der enzymatischen Analyse" von H.U. BERGMEYER, Weinheim 1962, Seiten 880-884, beschrieben.)

Beispiel 2

50 kg gefrorene Rinderlunge wurden im Fleischwolf zerkleinert, mit 80 Liter demineralisiertem Wasser und 500 ml 37£-iger HCl vermischt und dann unter Rühren zuerst während 1 Stunde auf 6O⁰C und hierauf kurz auf 90⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 60°C wurde die Mischung durch eine Filterpresse filtriert und das erhaltene Filtrat im Vakuum auf 100 Liter eingeengt. Dem Konzentrat wurden 500 g saures Isooctylorthophosphat (handelsübliche, etwa Squimolare Mischung von Mono- und Diester) zugesetzt, worauf das Gemisch

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während 1 Stunde intensiv gerührt und anschliessend während 24 Stunden stehen gelassen wurde. Der klare Überstand wurde grösstenteils abgehebert. Aus dem Niederschlag wurde die restliche Flüssigkeit durch Zentrifugation entfernt. Der erhaltene wasserunlösliche Komplex wurde mit 1 Liter destilliertem Wasser verrührt und erneut zentrifugiert. Dann wurde der Rückstand in 1 Liter Isopropylalkohol aufgenommen. Die Lösung wurde | Stunde gerührt und hierauf filtriert. Das Filtrat wurde zur Asufällung des Peptidase-Inhibitors mit 5 ml 25£-iger Ammoniaklösung versetzt. Zur vollständigen Ausfällung des Peptidase-Inhibitors als freie Base wurde das Gemisch während 2 Tagen bei 0 C gehalten und dann zentrifugiert. Der Rückstand wurde zweimal mit kaltem Isopropanol gewaschen und schliesslich im Vakuum getrocknet. Man erhielt 10.300.000 KIE mit einem Reinheitsgrad von 0,4 mcg/KIE.

Die als Folge der Fallung mit dem sauren Isooctylorthophosphat anfallende Mutterlauge kann zur Gewinnung von Heparin verwendet werden.

Beispiel 3

100 kg Rindermilz wurden im Fleischwolf zerkleinert, mit 50 Liter demineralisxertem Wasser und 4 Liter Eisessig intensiv vermischt und nach Zugabe von 150 Liter 9555-igein Aetfianol während 2 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde während 24 Stunden stehen gelassen, dann kurz aufgerührt und anschliesserri

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durch eine Filterpresse filtriert. Das Piltrat vmrde im Vakuum destilliert, um den Alkohol zu entfernen, und auf 50 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde mit einem Gemisch von 200 ml saurem Dodeeylorthophosphat (handelsübliches, etwa äquimolares Gemisch von Mono- und Diester) und 800 ml Chloroform vermengt und während'1 Stunde intensiv gerührt. Der Niederschlag wurde nach 2k Stunden durch Abhebern der Flüssigkeit und Zentrifugation abgetrennt und mit 1 Liter destilliertem Wasser verrührt. Nach Entfernen des Wassers durch Zentrifugation wurde der Rückstand in 1 Liter absolutem Aethanol" aufgenommen. Die Lösung wurde ί Stunde gerührt und hierauf filtriert. Aus dem Filtrat wurde der Peptidase-Inhibitor durch Zusatz von 100 ml einer lOjS-igen Lösung von MgCl₂ in Aethanol ausgefällt. Zur vollständigen Ausfällung liess man das Gemisch während 48 Stunden bei 0⁰C stehen. Der feste Rückstand wurde durch Zentrifugation abgetrennt, mit wenig gekühltem Aethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurden auf diese Weise 19,5 Millionen KIE in Form von 11,7 g fester Substanz erhalten. Der erzielte Reinheitsgrad betrug somit 0,6 mcg/KIE.

Die als Folge der Fällung mit saurem Dodecylortaophosphat anfallende Mutterlauge kann zur Gewinnung von Splenin verwendet werden.

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Beispiel 4

10 kg getrocknete Rinderlunge wurden mit 15 Liter einer 2#-igen Lösung von saurem Dodecylorthophosphat (handelsübliches, etwa äquimolares Gemisch von Mono- und Diester) in Isopropylalkohol versetzt. Die Mischung wurde während 2 Stunden gerührt und hierauf durch eine Nutsche . filtriert. Der Filterrückstand wurde erneut in 10 Liter 2£-iger Lösung von saurem Dodecylorthophosphat in Isopropanol aufgenommen und in'der gleichen Weise extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 40 ml 37#~iger HCl versetzt und während 48 Stunden im Kühlraum zur Ausfällung des Peptidase-Inhibitors stehen gelassen. Der durch Zentrifugation erhaltene feste Rückstand wurde mit kaltem Isopropanol und anschliessend mit wenig Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.' Man erhielt auf diese Weise 8,4 Millionen KIE mit einem Reinheitsgrad von 1,3 mcg/KIE.

Die Extraktionsrückstände können zur Gewinnung von Heparin verwendet werden.

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Claims (9)

1. Patentansprüche

   (!^/Verfahren zur Herstellung eines Peptidase-Inhibitor-Präparates aus einem Peptidase-Inhibitor enthaltenden Ausgangsmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass man den im Ausgangsmaterial enthaltenen Peptidase-Inhibitor durch Umsetzung mit einem sauren Orthophosphorsäureester der Formel

   0=

   in welcher R₁ einen mindestens 2 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest und R₂ Wasserstoff oder einen mindestens 2 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest bezeichnen, in einen in Wasser unlöslichen, in niederen Alkanolen jedoch löslichen Komplex überführt und den letzteren durch Umsetzung mit einer anorganischen Base, einer Mineralsäure oder einem in einem niederen Alkanol löslichen Erdalkalimetallsalz zerlegt, um den Peptidase-Inhibitor zu gewinnen.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   dass man als Ausgangsmaterial eine wässrige Lösung des Peptidase-Inhibitors verwendet.
3. 3, Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einem durch Extraktion von Peptidase-

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   Inhibitor enthaltenden tierischen Organen oder Körperflüssigkeiten mit einem wässrigen Medium erhaltenen wässrigen Extrakt den genannten sauren Orthophosphorsäureester zusetzt, den ausgefällten Komplex isoliert und zersetzt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Peptidase-Inhibitor enthaltende tierische Organe oder Körperflüssigkeiten mit einer Lösung des genannten sauren Orthophosphorsaureesters in einem niederen Alkanol extrahiert und den im Extrakt in gelöster Form enthaltenen λ Komplex zersetzt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den in fester Form erhaltenen Komplex durch Umsetzung mit einer Lösung einer Mineralsäure, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in Aceton zersetzt und den in fester Form abgeschiedenen Peptidase-Inhibitor isoliert.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den in fester Form erhaltenen Komplex durch Lösen in einem niederen Alkanol und Umsetzung mit einer M in niederen Alkanolen löslichen anorganischen Base, z.B.

   einem Alkalimetallhydroxyd, wie Natrium- oder Kaliumhydroxyd, oder Ammoniak, oder einer quaternären Ammoniumbase, oder mit einer Mineralsäure, z.B. Salz- oder Schwefelsäure, oder mit einem in niederen Alkanolen löslichen Erdalkalimetallsalz, z.B. einem Erdalkalimetallchlorid, zersetzt und den in fester Form abgeschiedenen PeDtidase-Inhibitor isoliert.

   109835/1631
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den im alkanolischen Extrakt in gelöster Form enthaltenen Komplex durch Umsetzung mit einer in niederen Alkanolen löslichen anorganischen Base, z.B. einem Alkalimetallhydroxyd,wie Natrium- oder Kaliumhydroxyd, oder Ammoniak, oder einer quaternären Ammoniumbase, oder mit einer Mineralsäure, z.B. Salz- oder Schwefelsäure, oder mit einem in niederen Alkanolen löslichen Erdalkalimetallsalz, z.B. einem Erdalkalimetallchlorid, zersetzt und den in fester Form abgeschiedenen Peptidase-Inhibitor isoliert.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man saure Orthophosphorsaureester der im Anspruch 1 angegebenen Formel verwendet, in welcher die mit R, und R_ bezeichneten Kohlenwasserstoffreste Alkylreste, die mindestens 2 und vorzugsweise bis zu 20 Kohlenstoffatom enthalten, Cycloalkylreste, Cycloalkyl-alkylreste, Arylreste oder Arylalkylreste sind.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1 und 6 oder 1, H und 7, dadurch gekennzeichnet, dass man niedere Alkenole mit 1 bis H Kohlenstoffatomen verwendet.

   XEHXXXHÄRMXlDiSX

   Der Patentanwalt :

   109035/1631