DE2003732A1

DE2003732A1 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von glukonsaeure

Info

Publication number: DE2003732A1
Application number: DE19702003732
Authority: DE
Inventors: Walon Raoul Guillaume Philippe
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1969-01-29
Filing date: 1970-01-28
Publication date: 1970-08-27
Also published as: BE745110A; FR2029645A1; DE2003732B2; US3619396A; IT1025002B; NL7000662A; GB1276245A; FR2029645B1

Description

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U.S 795 024

CPC International Inc.

International Plaza, Englewood Cliffs, New Jersey, USA.

Verfahren zur enzymatisehen Herstellung von Glukonsäure Priorität: 29.Januar 1969, USA. 795 024

Die Erfindung bezieht sich auf die enzymatisehe Herstellung von Grlukonsäure und insbesondere betrifft sie ein Verfahren, worin ein glukosehaltiges Material in Gegenwart eines Enzyms zur Erzeugung von Glukonsäure/ oxydiert wird.

"Glukoseoxyda.se", wie hier gebraucht, bedeutet beta-d-Glukose: Og Oxidoreduktase (E.C. 1.1.3.4.)· Glukoseoxidase überträgt zwei Wasserstoffatome aus der CHOH-Gruppe von Glukose auf Og unter Bildung von C=O und HpOg.

Bisher hat Glukoseoxidase industrielle Verwendung gefunden zur Entfernung von Glukosespuren und zur Entfernung von Sauerstoff aus Nahrungsmitteln. Beispielsweise wurde Glukoseoxidase in der Technik benutzt, um restliche Spuren reduzierender Zucker aus Trockeneiweiss und Trockenganzei zu entfernen· Sie wurde auch zu Nahrungsmitteln, beispielsweise zu Bier, Wein, Fruchtsäften, Mayonnaise u.dgl.,zugesetzt, welche oxidativer Verschlechterung unterworfen sind, wenn sie der stetigen Anwesenheit kleiner Sauerstoffmengen ausgesetzt sind. Zusätzlich zu diesen technischen Anwendungen wurde Glukoseoxidase als analytisches Mittel zur Bestimmung von Glukose eingesetzt.

Jedoch wurde bisher Glukoseoxidase nicht für die technische

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Gewinnung von Glukonsäure angewendet. Ein wesentlicher Grund für diese NichtVerwendung ist der hohe Preis des Enzyms.

Es ist Zweck der Erfindung, ein praktisches kontinuierliches Verfahren für die enzymatische Gewinnung von Glukonsäure zu schaffen, wobei Glukoseoxidase wiedergewonnen und wieder benutzt werden kann, 6hne in irreversibler V/eise inaktiviert zu werden. Es wurde nämlich festgestellt, dass dieses Ziel mittels der Erfindung verwirklicht werden kann. Kurz gesagt umfasst die Erfindung ein Verfahren, worin eine Elektrodialysestafe angewendet wird.

Bei dem crfindungsgemässen Verfahren wird ein glukosehaltigef Material, im allgemeinen in der Form einer konzentrierten wässrigen lösung oder flüssigkeit, einer enzyriatischen konvertierung unter Verwendung von Glukoseoxidase unterworfen. Danach wird die Konvertierunesflüssigkeit einer Blektrodialy-

abzutrennen se unterworfen, um Glukonsäure iauugeaffinneacund aktives Enzym wiederzugewinnen.

Die Anfangsstufe (enzymatische Konvertierung) des erfindungsgemässen Verfahrens ist an sich bekannt und bildet daher für sich keinen Teil der Erfindung. Kurz gesagt umfasst die enzymatische Konvertierung von Glukose zu Glukonsäure die Behandlung eines glukosehalti^en Materials, im allgemeinen in der Form einer wässrigen lösung,mit einer Enzymzubereitung, welche eine Glukoseoxidase- und Katalaseaktivität besitzt, in Gegenwart einer Quelle freien Sauerstoffs, z.B. von Wasserstoffperoxid. Während dieser Enzymkonvertierungsstufe wird das Reaktionsmedium so geregelt, dass die gewünsct te Reaktion begünstigt wird. Weil die meisten Enzymzubereitungen am wirksamsten innerhalb eines bestimmten pH-rBereichs xliut sich betätigen und weil bei der Glukoseoxidasekonvertierung von Glukose Srure (Glukonsäure) in stetiger Weise sich bildet, ist es notwendig, in stetiger V/eise das pH des Reaktionsmediums während der ganzen Dauer der enzymatischen Konvertierung zu regeln. Im allgemeinen, wenn das pH zwischer etwa 4»2 und etwa 7, vorzugsweise zwischen etwa 5 und etwa 6 gehalten wird, schreitet die Konvertierung in zufriedenstelle

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ORIGINAL INSPECTED

■ ■at

der Weise voran· Ein übliches Verfahren zur Regelung des pH "besteht in dem kontinuierlichen Zusatz eines Alkali, z.B. Natriumhydroxid. Bas Alkali wirkt naturgemäss neutralisierend auf die Glukonsäure unter Bildung eines entsprechenden Glukonats, z.B. Matriumglukonat. Bisher haben Versuche,das pH durch Verwendung von Alkali zu regeln, zusätzliche Probleme geschaffen. Beispielsweise Itann der Alkalizusatz zur irreversiblen Inaktivierung des Enzyms führen, was die Verwendung zusätzlicher 3nzymmengen erfordert. Die US-Patentschrift 2 651 592 offenbart eine Arbeitsweise für die GlukoseoxidasekonvertierungVon Glukose zu Glukonsäure, offenbart aber nicht ein praktisches Verfahren für das Abtrennen der Glukonsäure und Wiedergewinnen aktiver Glukoseoxidase.

Während der Stand der Sechnik die enzyinatische Konvertierung von Glukose zu Glukonsäure offenbart, lehrt er aber nicht ein Verfahren zur Ausführung einer solchen konvertierung in einer brauchbaren «eise, welche zur Abtrennung von Glukonsäure und Wiedergewinnung eines in dem Verfahren wiederverwendbaren Eiisvns führt·

Demgegenüber schafft die zweite ötufe (Elektrodialyse) des erfindungsgemässen Verfahrens ein Mittel für die praktische Abtrennung von G-lukonsäure und "Wiedergewinnung aktiven Enzyms.

In der Elektrodialysestufe wird die Konvertierungsflüssigkeit aus der vorhergehenden Stufe einer Elektrodialyse in Mehrmembran-Jilefctrodielyseapparaten unterworfen.

Für die Erfindung brauchbare Elektrtdialyseapparate können von üblicher Art sein. Gewöhnlich wird die Elektrodialyseapparatur eine grosse 2,ahl, vielleicht mehrere hundert, abwechselnd voneinander getrennte für Anionen und für Kationen aureülässige Membranen mit Abstandshaltern dazwischen umfassen. Die Abstandshalter, s chaff en Abteile, durch welche Verfcnrentströme über die Oberflächen der Kern "Ordner umlaufen, J/Le Lntikv.mmern der Apparatur trxth- 1 -,,

ton !-.loiitro'jeri zum imrchlH±ten eine:? Gleichstronn (lurch

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BAD ORIGINAL

Abteile. Ein Strom Komvertierungsflücsigkeit aus der ersten Stufe des Verfahrens und ein Abwasserstrom werden durch abwechselnde Kammern mittels geeigneter Verteiler geleitet. Beide Ströme werden hinsichtlich Fliessgeschwindigkeit, Druck, Temperatur u.dgl. geregelt. Wenn eine Gleichstromspannung an die Elektroden der Apparatur angelegt wird, bewegen sich in dem Strom der Konvertierungsflüssigkeit anwesende Glukonatanionen durch die benachbarte für Anionen durchlässige Membran in den Abwasserstrom, worin sie sich mit :/asserstoffionen unter Bildung vo ι Glukonsäure vereinigen. Das Enzym bleibt in dem abfliessenden Konvertierungsflüssigkeitsstrom zurück, welcher in die erste Verfahrensstufe zurückgeführt wird. Eine Erörterung der Elektrodialyse als Einheitsbehandlung kann in Encyclopedia of Chemical Technology,Eirk-Othmer, 2.Auflage, Band 7,Seiten 846-865 gefunden werden.

Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemässe Verfahren noch weiterhin, in diesem Beispiel wie in der ganzen übrigen Beschreibung und den Ansprüchen beziehen sich alle Angaben von Teilen oder Prozentsätzen auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel

Das in diesem Beispiel verwendete & glukosehaltige Ausgangsmaterial besteht auf 3 1 eines wässrigen Sirups, welcher 688 g Trockensubstanz an Glukose enthält. Dieser Sirup mit einer Temperatur von 25 C, einem anfänglichen pH von 5,5 und einem D.Ä. von 100 und 0,688 g einer handelsüblichen Glukoseoxidasezubereitung mit dem Handelsnamen "Ovazyme" (geliefert von Permco Laboratories),wurden in ein Reaktionsgefäss gegeben.

50 Volumteile Wasserstoffperoxyd wurden mit einer Pliessgeschwindigi\eit von 45 cm pro Stunde in das Gefäss gegeben. Nach etwa 18 Stunden in dem HerktionsgefPRS war da» D.Ä. des Sirups auf etwa 65»9 gefallen, 'während dieser Zeit war das pH des Heaktionnmediume zwischen etwa 5,0 und 6,0 durch Lusatz von 1N Natriumhydroxyd gehalten worden.

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Die Konvertierungsf !Lässigkeit mit einem D.A', von 65,9 wurde dann einer Elektrodialyse unterworfen. Diese Stufe bestand aus neun Durchgängen durch eine Fünfzellen-Elektrodialyseeinheit, welche mit 50 Volt und 1,76 kg/cm betrieben wurde„ S)XB

Die Elektrodialyseapparatur enthielt 7 für Anionen durchlässige und 5 für Kationen durchlässige Membramen. Der otrom der Komvertierungsflüssigkeit wurde zu dem Gerät mit einer Fliessgeschwindigkeit von etwa 400 cm /Minute,

einem -^ruck von etwa 1,75 kg/cm und einer Temperatur von

etwa 25 bis 30⁰C geschickt. Der Abwasserstrom zu dem Gerät umfasste 0,05$ wässriges Natriumglukonat und wurde zu dem Gerät mit einer Fliessgeschwindigkeit von etwa 600 cm /Minute, einem £>ruck von etwa 1,75 kg/cm und einer Temperatur von etwa 25 bis 30 C geschickt. Während der Elektrodialyse gehen Glukonationen aus dem Strom der Konvertierungsflüssigkeit durch die für Anionen durchlässige Membran in den Abwasserstrom. Aktive Enzymzubereitung in dem Strom der Konvertierungsflüssigkeit ging nicht durch irgendeine der Membranen und verblieb somit in dem Abwasserstrom zusammen mit Glukose. Der Abwasserstrom wurde zu dem Reaktionsgefäss für weitere enzymatische Konvertierung zurückgeführt. Der Abwasserstrom enthielt als Produkt Glukonsäure in Form von Natriumglukonat. Die enzymatische Konvertierungsstufe und die Elektrodialysestufe wurden abwechselnd wiederholt während 6 Cyclen, wobei zusätzliche Glukose zu dem Reaktionsfgefäss zu Beginn jeder enzymatischen Konvertierungsstufe zugegeben wurde. Keine zusätzliche Enzymzubereitung wurde zugeführt während der 6 Oyclen. Die Ergebnisse dieses Beispiels folgen in Tabelle I.

Tabelle I zeigt an, dass das erfindungsgemässe Verfahren eine praktische Arbeitsweise für das Abtrennen von Glukonsäure aus der Konvertierungsflüssigkeit und Wiedergewinnung von Glukoseoxidase zwecks ihrer Wiederbenutzung schafft. Die Elektrodialysestufe inaktivierte nicht die Glukoseoxidase.

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	Tabelle	850	-	350	-	I	DoA.
Zeit in	zugesetzte	-	-
Stunden	Glukose(g)	-	100
0	688	-	65,9
18	-	1250	?6,6
20	—	-	92,0
20	1250	—	62,2
43	—	85,3
44	-	91
50	69,0
67	78,0
68	81,5
$0	70,0
90	78,3
91	65,1
118	84,3
120	91,0
120	61,0
154	91,2
157

Zahl der Blektro- Entferntes dialysedurchgS.nge Natriumglukonat(g)

6
10

15

102 524 262

293

447

830

Bei der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit, mit welcher die enzymatische Konvertierung voranschreitet, in beträchtlicher Weise verringert wird bei dem Punkt, wobei etwa 5Oj6 der anfänglich vorhandenen Glukose in dem Reaktionsmedium konvertiert worden XXiX*Daher wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die filektrodialysestufe mit der Konvertierungsflussig keit durchgeführt, wenn etwa 50$ der Glukose konvertiert sind*

enzymati Während die Erfindung insbesondere Anwendung findet für die / Gewinnung von Glukonsäure ist offenbar, dass in ihrem breiteren Bereich die Erfindung auch brauchbar ist zur Gewinnung anderer ionisierbarer organischer Säuren, welche sich durch enzymatische Konvertierung gewinnen lassen. So können beispielsweise Aminosäuren, hergestellt durch enzymatische Konvertierung von Proteinen, gemäss der Erfindung gewonnen werden·

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ORIGINAL INSPECTED

Das Verfahren ist aucii anwendbar auf die enzymatische Oxidation von Aldosen und den entsprechenden Aldonsäuren.

Geeignete Enzymzubereitungen zur Ausführung enzymetischer Konvertierungen sind in der Technik bekannt« Eine solche Enzymzubereitung ist geeignet zur Verwendung gemäss der Erfindung, vorausgesetzt sie wird nicht durch den in der Elektrodialysestufe eingesetzten elektrischen Strom inaktiviert.

Bei einer Ausfünrungsform der Erfindung wird die pH-Kontrolle während der enzymatischen konvertierung durch Elektrodialyse bewirkt. Bei einer solchen Ausführungsform wird Glukonsäure (und nicht Hatriumglukonat) gebildet und unverzüglich durch die I-Iembran übertragen·

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Claims

Patentansprüche

I.Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Glukonsäure, wobei ein ^lukosehalti^es Ilaterial der enzymatischen Konvertierung mit Glukoseoxidase unterworfen wird, um eine Konvertierunr:sflüssigkeit zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet , dass diese Konvertierungsflüssigkeit einer rJlektrodialysestuf e unterworfen wird, um hierdurch Glukonsäure abzutrennen und Glukoseoxidase wiederzugewinnen,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeich net, dass die -ülektrodialysestufe durchgeführt wird, wem; etwa 5Cfo der Glukose konvertiert worden sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass das pH während der enzymatischen Kon¹ tierung auf einen v/ert zwischen etv/ε, 4,2 ui d etwa 7 eingestellt wird.
ί. Verführer: nach Anspruch ^, dadurch g e k e η η zeichnet,dass das pH während der enzymatischen i.onvertierun^ auf einen V/ert zwischen etwa 5 und etwa 6 eiy.jestcll*. v/irä.
^. Veri"' · rs;> nac:. eimern der vcrher^eh'vnafen Ansprüche, da-jurch r e k e r: η s -j i c h η e t , das ε die wiedergewonn ne jlukoieo^i^ase in einer nachfolgenden enzymatischen Kor.vertierunrrsstufe v/ieder verwendet v/ird .
6. Verfihrer, nach einen der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichne t , dass das Verfahren kontinuierlich ist υηα Temperatur und pH sxetii* geregelt werden.
7. Verf'-.r.ren nach einem der vorhergehende Ansprüche, daaurch g e > e η π ζ e i c h r. e t , da:;s aie elektrodialyse etufe oie in der ].cnvertierungsflÜ3sig>eit anwesenden i-lukbnatanicner. entfernt, v.-t-hrer.d die Glu.icseoxidase in der i■ cr/vertierun sfler.sigkeit·'xerkeü verl-leitt, dass · zusütziicr.es rlukcseh^lti.;.es K&tferial zur Kcnvertierungsflü.= sirkeit zugesetzt v/ird und in cyclischer '.eise die £ r. ζ; ^r~„: ο η ν e r t i e r u η gs stufe und die -^lektrodialy^estu f e

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BAD ORIGINAL

—y—

wiederholt werden.
8.Verfahren zur enzymatisehen Herstellung einer /ldonsäure, dadurch gekennzeichnet , dfcös ein aldosehaltiges Material einer enzymatischen K.onvertierun; unterworfen wird, um eine Konvertierungsflüssigkeit zu erzeugen,und dann diese Konvertierungsflüssigkeit einer Elelctr odialys es tufe unterworfen wird, um hierdurch eine Aldonsäure abzutrennen.

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ORIGINAL ,INSPECTED