DE1233358B

DE1233358B - Verfahren zur Herstellung von Cellulase durch aerobe submerse Zuechtung von Pilzen

Info

Publication number: DE1233358B
Application number: DEM55049A
Authority: DE
Inventors: Shohei Kawaji; Tetsuo Ishikawa; Kazuo Saito; Takeo Inohara; Akiko Kubo; Eizo Tejima
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1961-12-12
Filing date: 1962-12-07
Publication date: 1967-02-02

Description

Verfahren zur Herstellung von Cellulase durch aerobe submerse Züchtung von Pilzen Bisher ist für die Herstellung von Cellulase durch Pilze ausschließlich die Methode der Festkultur reit Kleie als Nährmedium infolge ihrer Einfachheit und der hohen Ausbeute an Enzym als für einen technischen Prozeß geeignet betrachtet worden.
Die Cellulase kann auch durch Züchten von Pilzen in flüssigen Nährmedien hergestellt werden. Die submerse Züchtung erfordert jedoch eine sehr scharfe Auswahl der Kohlenstoffquelle. So können für die Bildung ,des Enzyms praktisch keine gewöhnlichen Monosaccharide und Polysaccharide mit @x-Bindungen, wie Stärke, Maltose oder Rohrzucker, verwendet werden. Im Fall der Disaccharide, wie Cellubiose, wird Lactose als Kohlenstoffquelle benutzt, und es kann eine schnelle Bildung des Enzyms bei hoher Ausbeute festgestellt werden. Das bedeutet, daß der Angriff der Pilze auf die Kohlenstoffquelle bei Vorliegen von ß-Bindungen schneller und intensiver erfolgt als bei Verbindungen mit tt-Bindungen.
Die Verwendung von Cellobiose oder Lactose als Kohlenstoffquelie für die submerse Züchtung ist jedoch technisch unbefriedigend, wenn man die Kosten des Rohmaterials und die geringere Ausbeute im Vergleich zu der festen Züchtung in Betracht zieht. Bei Verwendung der Faser als solcher, d. h. eines unlöslichen festen Stoffes, als Kohlenstoffquelle in der flüssigen Kultur, würde das Wachstum der Pilze beträchtlich verzögert und die Züchtung zur Bildung des Enzyms viel Zeit erfordern, so daß es für eine technische Produktion nicht geeignet ist.
Dberraschenderweise hat sich nun gezeigt, daß die submerse Züchtung doch im industriellen Rahmen möglich ist, wenn ein in bestimmter Weise vorbehandeltes Pflanzenmaterial eingesetzt wird, wobei entgegen dem bisherigen Stand der Technik auch sonst wertlose Abfallstoffe mit Erfolg verwertet werden können, z. B. Pflanzenschalen und Stroh. Diese sonst praktisch unverwertbaren Stoffe lassen sich. erfindungsgemäß in guter Ausbeute in hochwertige Cellulase überführen, während z. B. Cellobiose gar nicht frei in der Natur vorkommt, sondern erst durch einen Abbau von Cellulose gewonnen werden muß. Durch die erfindungsgemäße Arbeitsweise wird das Wachstum der Pilze beträchtlich beschleunigt und die Produktion an Enzym außerdem noch erhöht.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Cellulase durch aerobe submerse Züchtung von Pilzen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Nähzmedium einsetzt, das ein aus an sich für die mikrobiologische Herstellung von Cellulase bekannten Ceilulose, Hemicellulose und Pektin enthaltenden Pflanzenstoffen durch Alkalibehandlung und anschließende Neutralisation gewonnenes Produkt in Mengen von 10 bis 600/, enthält.
Als billige und leicht zur Verfügung stehende Pflanzen und ihre Abfallstoffe, welche eine große Menge Cellulose, Hemicellulose oder Pektin enthalten, können pflanzliche Stengel, Stiele und Blätter, Überzüge von Samen und Früchten, insbesondere Kleie, Reisstroh, Getreidestroh, Maisstengel und -blätter, Orangenschalen, Bohnenschoten, Ölpreßkuchen, ausgepreßte Rübenzuckerpülpe, verwendet werden. Diese pflanzlichen Stoffe werden mit einer geeigneten Menge Alkalilösung versetzt und mehrere Stunden bei Zimmertemperatur oder unter Erhitzen gerührt, um die pflanzliche Struktur zu zersetzen und in eine Form umzuwandeln, die in dem flüssigen Nährmedium leicht dispergierbar ist und durch Pilze leicht verwertet werden kann. Die erhaltene viskose Flüssigkeit wird mit Säure neutralisiert und zu dem flüssigen Nährmedium in einer Menge von 10 bis 60 % als hauptsächliche Kohlenstoffquelle zugesetzt. Die Pilze werden in diesem flüssigen Nährmedium unter Schütteln oder Belüftung gezüchtet. Nach 3 bis 7 Tagen kann die Cellulase in dem Medium angereichert sein.
Als Alkalilösung kann 1- bis 10 °/oige Natronlauge, Kalilauge, Natriumcarbonatlösung oder Ammoniakwasser verwendet werden. Wenn die Alkalilösung in 5- bis 10facher Menge, berechnet auf die Pflanzensubstanz, zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur oder unter Erhitzen gerührt wird, kann die Behandlung innerhalb weniger Stunden beendet sein. Zum Neutralisieren können neben anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure, auch organische Säuren, wie Essigsäure, verwendet werden. Die Neutralisation bis zu einem pH-Wert von 5 bis 8 wird bevorzugt, allerdings muß der pH-Wert der Art der Pilze angepaßt werden.
Die vorerwähnte, mit Alkali behandelte Flüssigkeit enthält auch eine organische Stickstoffquelle und Mineralien, so daß sie ohne weiteres als Züchtungsmedium verwendet werden kann. Die Herstellung des Enzyms kann außerdem noch durch zusätzliche Zugabe anderer Kohlenstoff und Stickstoffquellen verbessert werden.
An Stelle der neutralisierten, mit Alkali behandelten Flüssigkeit kann auch das Filtrat der genannten Flüssigkeit nach dem Neutralisieren bis zum Neutralpunkt oder zum sauren Zustand angewandt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Die Aktivität der Cellulase wurde nach der folgenden Methode bestimmt. Bestimmung der Cellulase Die Züchtungslösung aus dem Fermentationsgefäß wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit in geeignetem Maße verdünnt. 5 cm3 der verdünnten Lösung werden in ein Reagenzglas gebracht und mit 5 cmß einer 0,1 Mol enthaltenden Acetatpufferlösung (pH = 5,0) und einigen Tropfen Toluol versetzt. Mit diesem Gemisch wird ein Stück Toyo-Filtrierpapier Nr. 2 (1 - 5 cm) getränkt. Nach 22 bis 24 Stunden bei 45°C wird durch Schütteln der gemischten Lösung die für eine vollständige Zersetzung des Filtrierpapiers erforderliche Zeit in Sekunden gemessen. Die Aktivität der Cellulase ergibt sich als das umgekehrte Verhältnis zur Zersetzungszeit.

Beispiel l 100g Kleie wurden mit 800 cm1 einer 4°/pigen wäßrigen Natriumcarbonatlösung versetzt und bei 50 bis 60°C 6 Stunden in einem Wasserbad gerührt. Die behandelte Lösung wurde mit 10 °/oiger Salzsäure bis zum pH-Wert 5,0 neutralisiert. 31 der Nährflüssigkeit, die 400/, der genannten neutralisierten Lösung enthielt, 0,10/, Ammoniumsulfat und eine kleine Menge Metallsalz wurden getrennt in ein Gärgefäß von 51 Inhalt gegossen und bei 120°C 40 Minuten sterilisiert. Nach Abkühlen wurde das Medium mit Spuren von Trichoderma viride beimpft, auf 26°C gehalten, belüftet und gerührt. Das Ergebnis der Züchtung wird nachstehend zusammen mit dem Ergebnis eines Kontrollversuches mit nicht behandelter Kleie angegeben.

Wirksamkeit (Einheiten auf cm3)

72 Stunden I 96 Stunden 120 Stunden 140 Stunden

Erfindungsgemäßes Verfahren ............ . ....... 141 334 544 405

Kontrollversuch (nicht behandeltes Kleienährmedium) klein 20 I 15 , 0

Beispiel 2 100g Sojabohnenschalen wurden mit 1000 em3 einer 3 °/oigen wäßrigen Kalilauge versetzt und bei Zimmertemperatur 5 Stunden gerührt. Die behandelte Lösung wurde mit 15 °/oiger Schwefelsäure bis zum pH 6,0 neutralisiert. 100 cm3 Züchtungsmedium, das 50 % der genannten behandelten Lösung enthielt, wurden gesondert in 500 cm3 fassende Sakaguchi-Flaschen abgefüllt und bei 120°C 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Medium mit Sporen von Aspergillus niger, Stamm Nr. 105, beimpft, die bei 26°C unter Schütteln kultiviert werden. Das Ergebnis der Züchtung wird nachstehend angegeben und mit Kontrollzüchtungen verglichen, die mit Lactose-Kulturnährboden und unbehandelten Sojabohnenhülsen durchgeführt wurden.

Wirksamkeit (Einheiten auf cm3)

3. Tag I 4. Tag 5. Tag I 6. Tag

Erfindungsgemäßes Verfahren . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . 89 50 10

7

Kontrollversuch (Lactose-Nährmedium) . . . . . . . . . . . 20 37 45 30

Kontrollversuch (unbehandelte Sojabohnenhülsen) .. klein klein I klein klein

Beispiel 3 Zu 100 g Reisstroh wurden 1000 cm3 einer 2 °/jgen wäßrigen Natronlauge zugesetzt. Das Gemisch wurde im Wasserbad bei 100°C 2 Stunden lang behandelt und dann bei Zimmertemperatur drei weitere Stunden gerührt. Die so behandelte Lösung wurde mit 10 °/Qiger Phosphorsäure bis zum pH-Wert 5,0 neutralisiert. 100 cm3 des Kulturmediums, das 35 % der genannten behandelten Lösung enthielt, und 1,00/, Maisquellflüssigkeit wurden getrennt in Sakaguchi-Flaschen von 500 cm3 Inhalt eingegossen und bei 120°C 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Nährmedium mit Sporen von Trichoderma koningi beimpft, auf 28'C gehalten und geschüttelt. Das Ergebnis der Züchtung ist nachstehend zusammengestellt.

Wirksamkeit (Einheiten auf cm')

3. Tag I 4. Tag I 5. Tag I 6. Tag

Erfindungsgemäßes Verfahren . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 115 I 240 470 405

Kontrollversuch (Lactose-Nährmedium) . . . . . . . . . . . 10 24 46 40

Kontrollversuch (unbehandeltes Reisstroh als Me-

dium) ....................................... klein klein klein klein

Beispiel 4 100g Kakaoschalen wurden zu 700 cm3 einer 10 0%igen wäßrigen Natronlauge zugesetzt und bei Zimmertemperatur 6 Stunden gerührt. Die so behandelte schwarzbraune Lösung wurde mit 15 °/°iger Schwefelsäure bis zum pH 6,0 neutralisiert. 30 cm3 des Nährmediums, das 40 °/° der behandelten Lösung enthielt, sowie 0,10/0 primäres Kaliumphosphat, das 0,3 °/° Magnesiumsulfat enthielt, wurden getrennt in 100 cm3 fassende Erlenmeyer-Flaschen gegossen und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Medium mit Sporen von Penicillium notatum beimpft, auf 26°C gehalten und auf einem rotierenden Schüttelapparat geschüttelt.

Wirksamkeit

(Einheiten auf em3)

4. Tag I 5. Tag I 6. Tag

Erfindungsgemäßes Verfahren ....... klein 20 42

Kontrollversuch

(Lactose-Nährmedium) .......... klein 12 klein

Kontrollversuch

(nicht behandelte Kakaoschalen als

Medium) ...................... klein I klein klein

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung von Cellulase durch aerobe submerse Züchtung von Pilzen, d a d u r c h gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das ein aus an sich für die mikrobiologische Herstellung von Cellulase bekannten Cellulose, Hemicellulose und Pektin enthaltenden Pflanzenstoffen durch Alkalibehandlung und anschließende Neutralisation gewonnenes Produkt in Mengen von 10 bis 60 °/° enthält. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Patentschrift Nr. 745 081; L. F. Fies er-M. Fies er, »Lehrbuch der organischen Chemie«, 1960, S. 455.