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Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von zellulosehaltigen Ausgangsmaterialien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von zellulosehaltigen
Ausgangsmaterialien, insbesondere für die Gewinnung mikrobiell verwertbarer kohlenhydrathaltiger
Spaltprodukte.
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Es ist bekannt, daß Zellulose als Gerüstsubstanz den Hauptbestandteil
pflanzlicher Zellwandungen bildet und das in der Natur mengenmäßig bedeutendste
Kohlenhydrat darstellt.
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Alle bisher industriell genutzten oder in der Literatur beschriebenen
Verfahren (E, Rieche: Grundriß der technischen organischen Chemie, 1956, Hirzel-Verlag,
Leipzig) zur Hydrolyse von Zellulose mit dem Ziel, reduzierende Substanzen, speziell
Zucker, für mikrobielle und andere Syntheseprozesse zu gewinnen, erwiesen sich als
unpkonomilch.
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Entsprechende Verfahren sind in beachtlichem Umfang nur in Kopplung
mit anderen Produktionsprozessen Sulfitablaugenverhefung bei der Zellstoff- und
rapierherstel lung u.a.) in industrieller Nutzung. Das gilt insbesondere für die-bekannten
Hydrolysemethoden bei Verwendung von Druck und/oder Temperatur oder vermittels Anwendung
von Chemikalien.
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Die enzymatische Hydrolyse pflanzlicher Gerüstsubstanzen gestaltete
sich bisher äußerst schwierig und erwies sich ebenfalls als nicht lohnend. Uber
die kombinierte meohanisch-enzymatische Hydrolyse von Holz berichteten Katz und
Rees, Applied Microbiology 16, 419 (1968), ohne jedoch Zellulose anderer pflanzlicher
Herkünfte zu berüoksichtigen.
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Als billige und in ausreichenden Mengen zur Verfügung stehende Pflanzenprodukte,
die größere Mengen von Zellulose, Hemizellulose, Lignin, Pektin und andere GerUstsubstanzen
enthalten, erden pflanzliche Stengel, Stiele, Blätter, Blüten, Spelzen, Samen, Samenschalen,
wie sie bei allen Gramineen, Coniferen und anderen Dikotylen Holzgewächsen vorkommen,
angesehen. Erfindungsgemäß waren hier zellulosehaltige Ausgangsmaterialien verschiedener
eflanzlicher Herkunft, wie u.a. das Stroh, Treber, Samenschalen und Spelzen als
billige Rohstoffe von besonderem Interesse.
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Das Stroh enthält etwa 35 % Hemizellulose (85 % Pentosane und 15 %
Hexosane), etwa 35 % Zellulose, ca. 20 % Lignin
und ca. 15 % organische
Säuren, Salze und biologisch nicht verwertbare Restbestandteile.
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Zweck der Erfindung ist en, ein rentables Verfahren zur enzymatischn
Hydrolyse pflanzlicher Ausgangsmaterialien monooctyler und diootyler Pflanzen zur
Herstellung mikrobiell verwertbarer Kohlenhydratspaltprodukte zu entwickeln.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch eine geeignete Vorbehandlung
des Zellulosematerials die Empfindlich keit der nativen Zellulose gegenüber der
nachfolgenden speziellen Enzymbehandlung zu erhöhen.
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Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß man sich sur Hydrolyse
den zellulosehaltigen Materials vornehmlich eines sauren und/oder alkalischen Aufschlusses
mit oder ohne Temperatur und/oder Druck bedient.
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Durch die erwähnten Aufschlußverfahren gelingt es, die Zellulose teilweise
von ihren Begleitstoffen zu befreien.
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Zu diesem Zweck werden die zerkleinerten pflanzlichen Stoffe lit einer
geeigneten Menge Alkalilösung und/oder Säure versetzt und mehrere Stunden bei Zimmertemperatur
oder in der Wärme uiit oder ohne Druck gerührt. Dadurch wird die pflanzliche Struktur
auigelockert und in eine Form umgewandelt, die dem folgenden enzymatischen Angriff
leichter zugänglich ist.
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Die saure oder alkalische Aufschlußlösung enthält auch organische
Stickstoffverbindungen und Mineralien, die neben den Zuckern beim Verbefungsprozeß
und bei diversen mikrobiellen Fermentattionsprozessen verwertet werden können.
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Bei der enzymatischen Hydrolyse pflanzlicher Zellwandungen kommt es
in entscheidendem Maße darauf an, die Enzyme im Reaktionsgemisch voll ur Wirkung
zu bringen und die Empfindlichkeit der nativen Zellulose gegenüber dem entymatischen
Angriff zu erhöhen. Das Hauptproblem besteht in der Steigerung der Empfindlichkeit,
der zellulosehaltigen pflanzlichen Zellwände gegenüber einer enzymatischen Hydrolyse
durch Anwendung besonderer Säuren-, Alkali- und/ oder Wärme-Druck-Behandlung. Auch
eine Erhitzung während der Zerkleinerung der Ausgangsmaterialien (durch Mahlung)
kann, wie Katz und Resse, Appl. Mikrobiol. 16, Nr. 2, 419 (1968) mitteilten, die
Empfindlichkeit der Zellulose gegen-Itber Zellulose steigern.
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Das erfindungagemäße Verfahren gestaltet sich folgender maßen: a)
Das Hydrolyzematerial (siche oben) mit einem geeigneten Zerkleinerungsgrad (Durchmesser
der Partikel 0,1 - 3 mm) wird nach den Vermischen mit 0,2 - 3 %iger H2SO4 unter
Einwirkung von Druck und/oder Temperatur aufgeschlossen.
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Danach werden die festen Bestandteile mittels bekannter Methoden
aus der sauren Lösung abgetrennt. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen, auf
einen pH-Wert von pH 4,5 eingestellt und anschließend bei optimaler Temperatur unter
Rühren mit einem Enzymmischpräparat hydrolysiert.
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Das Enzympräparat wird in Mengen von 0,1 - 2 %, bezogen auf lufttrockenes
Ausgangsmaterial, eingesetzt und stellt
ein Mischpräparat folgender
Zusammensetzung dar: etwa 30 - 80 Einheiten Cx-Zellulase/mg und etwa 10 - 40 " C1-Zellulase/mg
und/oder etwa 5 - 20 " B-Gluoosidase und/oder Zellobiose u/o etwa 5 - 25 't Hemizellulase/mg.
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Das Präparat wurde aus einem spezifischen Aspergillus niger-Stamm
gewonnen. Die analytisohe Bestimmung der Zellulaseaktivität erfolgte mit Carboxy-Methyl-Zellulose
bzw. mit Filterpapier als Substrat. Als Substrat zur Ermittlung des Gehaltes an
ß-Glucosidase wurde eine Salicin-Lösung (Saligenin ß-D-Glucosid) verwendet. Die
Ermittlung der Aktivität der einzelnen Enzyme erfolgte nach den Angaben von Amano
pharmaceutical Co. Ltd.Nagoya - Japan.
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Das in der sauren Aufschlußlösung enthaltene Furfurol wird in bekannter
Weise durch thermische Behandlung der Lösung gesondert gewonnen.
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Nach Vereinigung der sauren und enzymatischen Hydrolyseanteile enthält
das Gesamthydrolysat, bezogen auf das lufttrockene Ausgangsmaterial, 20 - 30 % reduzierende
Substanz - als Glucose berechnet - und wird für die Hefeproduktion und andere mikrobielle
Syntheseprozesse benutzt.
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b) Das Hydrolysematerial (siehe oben) eines geeigneten Zerkleinerungsgrades
wird nach Vermischen mit 0,5 - 5 %iger wässriger Alkalilösung (beispielsweise Natronlauge,
Ealilauge, Natriumhydrogenoarbonat, Ammoniak oder Kalkmilch) unter ständigem Rühren
mit oder ohne Einwirkung von Temperaturen und/oder Druck aufgeschlossen.
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Nach Einstellen des pH-Wertes auf den Enzym-bedingten optimaiwert
mit organischen bzw. anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure
oder Essigsäure, werden die festen Bestandteile mittels physikalisoh-mechanischer
Methoden aus der Lösung abgetrennt und anschließend mit den unter a) genannten Enzymmischpräparaten
in wässriger Lösung hydrolysiert.
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Zur enzymatischen Hydrolyse wird ein Enzympräparat in Mengen von
0,1 - 2 %, bezogen auf lufttrockenes Ausgangsmaterial, eingesetzt.
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Nach Vereinigung beider Hydrolyseanteile enthält das Gesamthydrolysat,
bezogen auf das eingesetzte Ausgangsmaterial, 20 - 30 % reduzierende Substanz, berechnet
als Glucose.
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Die Erfindung 9011 anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert
werden.
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Beispiel 1 10 kg fein zermahlenes Stroh werden mit 100 1 0,5 %iger
H2SO4 Gewicht in Volumen versetzt und anschließend im Autoklaven bei 30 Minuten
bei 1350 C erhitzt. Anschließend werden die unlöslichen Anteile beispielsweise durch
Filtration oder Separation abgetrennt. Das Filtrat wird mit Alkali auf einen pH-Wert
von etwa 3,8 eingestellt.
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Die verbleibenden Restbestandteile werden mit Wasser gewaschen und
anschließend in 90 1 Leitungswasser aufgenommen. Der pH-Wert wird auf pH 4,5 mit
1 n NaOH eingestellt. Danach erfolgt die Zugabe von 20 g eines Enzympräparates mit
folender Zusammensetzung: 1,5 I ß-Gluaosidase und Zellobiase/mg, 60 IE Ox-Zellulose/mg
30
IE C1 Zellulase/mg und 15 IE Hemizellulase/mg.
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Die Hydrolysetemperatur liegt bei 400 C bei einem pH-Wert von 4,5
und die Hydrolysedauer erstreckt sich über mehrere (5 - 10) Stunden.
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Nach Beendigung der enzymatischen Hydrolyse werden die Festbestandteile
abgetrennt, beide Hydrolysate (saures und enzymatisches) vereinigt und verhoft.
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1 kg Trockenmalzstreber (aus Brauerei) wird mit 4 l 0,4 %-iger H2SO4
Gewicht in Volumen versetzt und im Autoklaven bei 140° C 30 Minuten Aufgeschlossen.
Anschließend werden die unlöslichen Anteile abgetrennt.
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Der Rürckstand wird mit 0,5 % des erwähnten Enzymmischpräparates versetzt
und enzymatisch hydrolysiert (siche Beispiel 1). Beide Filtrate werden vereinigt
und zur Gewinnung von eiweißreicher Hefe oder als Nährstoffquelle für andere fermentative
Prozesse eingesetzt.
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In den vereinigten Filtraten findet man etwa 18- 24 % reduzierende
Substanzen, bereichnet als Glucose, bezogen auf den eingesetzten lufttrockenen Malztreber.
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Beispiel 3 100 g Maferstroh, fein gohäckselt und zerkleinert, werden
mit 1000 11 2,'iger Natronlauge versetzt und bei 90° c 3 Stunden unter Rühren aufgeschlossen.
Die unlöslichen Anteile werden nachfolgend mit 0,5 % H2SO4 30 Minuten im Autoklaven
bei 1300 C erhitzt. Anshließend wird der
Rückstand in Wasser aufgenommen
und mit 0,6 Vo des obenerwähnten Enzymmischpräparates nach den Bedingtrngen des
Beispiel 1 hydrolysiert.
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Das alkalische Filtrat wird mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von
etwa 3,8 eingestellt und mit den Filtraten des sauren und enzymatischen Aufschlusses
vereinigt. Die vereinigten Hydrolysate enthalten etwa 22 - 35 % reduzierende Substanz,
berechnet als Glucose, bezogen auf lufttrockenes Stroh. Das Gesamthydrolysat wird
dem Verhefungsprozeß oder als Nährstoffquelle für andere fermentative Prozesse zugeführt.