DE112012000221T5

DE112012000221T5 - Extrakte aus Cynanchum sp. und darin enthaltene Wirkstoffe zur Behandlung von Arthritis

Info

Publication number: DE112012000221T5
Application number: DE112012000221T
Authority: DE
Inventors: Jennline Sheu; Lain-tze Lee; Tien-Soung Tong; Jui-Hung Yen; Kuo-Kuei Huang; Ying-Fei Tsai; Ying-Chu Shih; Cheng-Yu Lee; Yi-Ching Lee; Jir-mehng Lo
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-08-22
Also published as: TWI504394B; JP5902803B2; WO2012146194A1; GB2498677A; GB201307973D0; US20140134280A1; US9549958B2; TW201242599A; JP2014512400A

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt einen Extrakt von Cynanchum sp. zur Verwendung in der Behandlung von Arthritis bereit. Der Extrakt von Cynanchum sp. und ein darin enthaltender Wirkstoff, Antofin, sind anwendbar in einem Verfahren, einer pharmazeutischen Zusammensetzung und einem Nahrungsergänzungsmittel zur Behandlung von Arthritis. Ein Verfahren zur Massenproduktion von Antofin aus Pflanzenextrakten wird auch bereit gestellt.

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der chinesischen Patentanmeldung Nr. 20121028430.2 , angemeldet am 27. April 2012, welche die Priorität der US Provisional-Anmeldung Nr. 61/480,550, eingereicht am 29. April 2011, beansprucht, welche hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Technisches Gebiet
Das technische Gebiet betrifft die Behandlung von Arthritis.
Hintergrund
Arthritis ist überwiegend eine Erkrankung älterer Menschen und die Morbidität hat sich mit der Zivilisierung erhöht. Die Behandlung der Arthritis schließt die Verabreichung von Corticosteroiden ein, um entzündliche Symptome zu beseitigen und das Immunsystem zu hemmen, oder die Verabreichung von nicht-steroidalen entzündungshemmenden Medikamenten (NSAIDs), wie COX-1-Inhibitoren, COX-2-Inhibitoren, Celebrex oder Ibuprofen, um Schmerzen und Entzündungen zu lindern. Allerdings führen schwere Nebenwirkungen und begrenzte Wirkungen dieser Arzneimittel dazu, dass neue Generationen von Arzneimitteln entwickelt werden.
Die neuen Generationen von Medikamenten für die Behandlung von Arthritis konzentrieren sich auf die Rolle des Zytokins TNF-α in der Entwicklung von Arthritis. Eine Reihe von biologischen Wirkstoffen wurde entwickelt, um die Sekretion von TNF-α bei Arthritispatienten zu verringern, wie der anti-TNF-α Antikörper, Infliximab und Adalimumab oder TNF-α Antagonist, Etanercept. Studien zeigen, dass eine Kombination aus einem immunhemmenden Wirkstoff, Methotrexat, und dem TNF-α Antagonisten Etanercept den Behandlungseffekt von Arthritis erhöhen kann (Tracey D, et al., Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review, Pharmacology & Therapeutics 117 (2008) 244–279.). Die Wirkstoffe für die Hemmung anderer Zytokine, wie IL-6 Antikörper und IL-1β-ra, waren auch für die Behandlung von Arthritis bekannt. Allerdings haben die begrenzte Wirksamkeit, die Nebenwirkungen und die einmalige Verabreichung dieser Wirkstoffe zu einem dringenden Bedarf an der Entwicklung neuer Medikamente geführt.
Überblick
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Arthritis bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Extrakts von Cynanchum sp. an ein Subjekt umfasst, das dessen bedarf.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis bereitgestellt, umfassend einen Extrakt aus Cynanchum sp. als Wirkstoff oder als pharmazeutisch verträglichen Träger.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Arthritis bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge Antofin an ein Subjekt umfasst, das dessen bedarf.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis bereitgestellt, umfassend Antofin als Wirkstoff und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Antofin bereitgestellt, umfassend die Schritte: (i) Mischen eines Pflanzenpulvers mit einem ersten Lösungsmittel, um eine erste Mischung zu bilden, (ii) Erwärmen und Filtrieren der ersten Mischung, um einen ersten Extrakt zu erhalten, (iii) Konzentrieren des ersten Extrakts und substantielle Zugabe einer Säure, um eine Suspension mit einem klebrigen Material zu bilden, (iv) Filtrieren der Suspension, um das klebrige Material zu entfernen und eine klare Lösung zu erhalten, (v) Extraktion der klaren Lösung mit einem zweiten Lösungsmittel, um einen zweiten Extrakt zu erhalten, (vi) Konzentrierung und Reinigung der zweiten Extraktionslösung, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus mindestens einer von Albizzia julibrissin, Antitoxicum funebre, Cocculus laurifolius, Cocculus pendulus, Corydalis meifolia, Croton sparsiflours, Cryptocarya oubatchensis, Cryptocarya phyllostemon, Cryptocarya chinensis, Cynanchum hancockianum, Cynanchum inamoenum, Cynanchum komarovi, Cynanchum paniculatum, Cynanchum vincetoxicum, Ficus fistulosa, Ficus septica, Pergularia daemia, Stephania glabra, Tylophora floribunda, Tylophora indica, Tylophora tanakae, Vincetoxicum hirundinaria, Vincetoxicum nigrum, Vincetoxicum officinale, Vincetoxicum pumilu und Vincetoxicum rossicum.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Nahrungsergänzungsmittel bereitgestellt, umfassend Antofin als einen Wirkstoff und einen Lebensmittelzusatzstoff.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Nahrungsergänzungsmittel bereitgestellt, umfassend einen Extrakt aus Cynanchum sp. als einen Wirkstoff und einen Lebensmittelzusatzstoff.
Zeichnungen
Die Offenbarung kann besser verstanden werden durch Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung und Beispiele, die Bezug nehmen auf die beigefügten Zeichnungen, wobei:
1 und 2 zeigen die NMR-Daten von Kristallen extrahiert aus Cynanchum hancockianum, wobei der Kristall von Cynanchum hancockianum als Antofin identifiziert wurde;
3 zeigt die Wirkung des Ethanol-Extrakts von Cynanchum hancockianum auf TNF-α-Hemmung und die Lebensfähigkeit der Zellen in einer U937-Zelllinie gemäß einem Ausführungsbeispiel;
4 zeigt die Wirkung von Antofin auf TNF-α-Hemmung und die Lebensfähigkeit der Zellen in einer U937-Zelllinie gemäß einem Ausführungsbeispiel;
5 zeigt die Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf TNF-α-Hemmung in einem LPS-induzierten Modell gemäß einer Ausführungsform;
6 zeigt die Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf die IL-6-Hemmung in einem LPS-induzierten Modell gemäß einer Ausführungsform;
7 zeigt die Wirkung verschiedener Extrakte aus Cynanchum sp. auf TNF-α-Hemmung in einem LPS-induzierten Modell gemäß einer Ausführungsform;
8 zeigt die Wirkung verschiedener Extrakte aus Cynanchum sp. auf die IL-6-Hemmung in einem LPS-induzierten Modell gemäß einer Ausführungsform;
9 zeigt die Wirkung verschiedener Extrakte aus Cynanchum sp. auf TNF-α-Hemmung in einem LPS-induzierten Modell gemäß einer Ausführungsform;
10 zeigt die Wirkung verschiedener Extrakte aus Cynanchum sp. auf die IL-6-Hemmung in einem LPS-induzierten Modell gemäß einer Ausführungsform;
11 zeigt die Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf das Hinterpfotenvolumen in einem Carrageen-induzierten Ratten-Modell gemäß einer Ausführungsform;
12 zeigt Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf die Arthritis-Kennzahlen in einem Adjuvans-induzierten Arthritis-Modell gemäß einer Ausführungsform;
13 zeigt die Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf das Hinterpfotenvolumen in einem Adjuvans-induzierten Arthritis-Modell gemäß einer Ausführungsform;
14 zeigt die Wirkung von Antofin-Regimen auf die Arthritis-Inzidenz in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell gemäß einer Ausführungsform;
15 zeigt die Wirkung von Antofin-Regimen auf Gewichtsveränderungen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell gemäß einer Ausführungsform;
16 zeigt die Wirkung von Antofin-Regimen auf das Hinterpfotenvolumen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell gemäß einer Ausführungsform, und
17 zeigt die Wirkung von Antofin-Regimen auf die Arthritis-Kennzahlen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell gemäß einer Ausführungsform.
Detaillierte Beschreibung
In der folgenden detaillierten Beschreibung werden zum Zwecke der Erläuterung zahlreiche spezifische Details dargelegt, um ein gründliches Verständnis der offenbarten Ausführungsformen zu ermöglichen. Es wird jedoch offensichtlich sein, dass eine oder mehrere Ausführungsformen ohne diese spezifischen Details ausgeführt werden können. In anderen Fällen sind gut bekannte Strukturen und Vorrichtungen schematisch dargestellt, um die Zeichnung zu vereinfachen.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Arthritis bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Extrakts von Cynanchum sp. an einen Patienten, der dessen bedarf. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis bereit, umfassend einen Extrakt aus Cynanchum sp. als einen Wirkstoff und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Cynanchum sp. umfasst hierin Cynanchum hancockianum, Cynanchum inamoenum, Cynanchum komarovii, Cynanchum paniculatum, Cynanchum vincetoxicum, Cynanchum atratum oder Cynanchum stauntonii, wobei Cynanchum hancockianum bevorzugt ist.
Die Extraktion von Cynanchum sp. gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann in geeigneter Weise eingestellt werden, abhängig von der Pflanzenart, den Geweben für die Extraktion oder dergleichen. In einer Ausführungsform der Erfindung, kann die Extraktion von Cynanchum sp. die folgenden Schritte umfassen:

(i) Mischen eines Pflanzenpulvers mit einem ersten Lösungsmittel, um eine erste Mischung zu bilden;
(ii) Erwärmen und Filtrieren der ersten Mischung, um einen ersten Extrakt zu erhalten;
(iii) Konzentrieren des ersten Extrakts und substantielle Zugabe einer Säure, um eine Suspension mit einem klebrigen Material zu bilden;
(iv) Filtrieren der Suspension, um das klebrige Material zu entfernen und eine klare Lösung zu erhalten;
(v) Extraktion der klaren Lösung mit einem zweiten Lösungsmittel, um einen zweiten Extrakt zu erhalten, und
(vi) Konzentrieren und Reinigen der zweiten Extraktionslösung.

Genauer gesagt umfasst das erste Lösungsmittel Wasser, Alkohole, Ester, Ether, Ketone oder eine Kombination davon. Die Alkohole des ersten Lösungsmittels können Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-Propanol, 2-Methyl-Propan-2-ol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol oder eine Kombination davon umfassen. Die Ester des ersten Lösungsmittels können Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Pentylacetat, Hexylacetat oder eine Kombination davon umfassen. Die Ketone des ersten Lösungsmittels können Aceton, Methylethylketon, 2-Pentanon, 3-Pentanon oder eine Kombination davon umfassen. Die Ether des ersten Lösungsmittels können Ether, Propylether, Isopropylether oder eine Kombination davon umfassen.
In einem Beispiel der Erfindung ist das erste Lösungsmittel ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus 80 bis 100 Gew.-% Butylacetat und 0 bis 20 Gew.-% Ethanol. In einem weiteren Beispiel der Erfindung ist das erste Lösungsmittel 50 bis 100 Gew.-% einer wässrigen Isopropanol-Lösung oder 90 bis 100 Gew.-% einer wässrigen Isopropanol-Lösung.
Erfindungsgemäß ist die Säure, die in den ersten Extrakt gegeben wird, nicht speziell beschränkt, aber Salzsäure ist bevorzugt. In einem Beispiel der Erfindung wird 0,1 bis 2N Salzsäure verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Heiztemperatur in Schritt (ii) von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur der Mischung. Die Heizdauer kann 2 Stunden oder mehr betragen. In einem Beispiel ist die Heiztemperatur 25 bis 75°C, und 70 bis 75°C ist bevorzugt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das zweite Lösungsmittel Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon, vorzugsweise Dichlormethan umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Extraktion mit dem zweiten Lösungsmittel kann mindestens ein Mal für eine Erhöhung der Reinheit durchgeführt werden. Vorzugsweise kann die Extraktion mit dem zweiten Lösungsmittel ein- bis dreimal durchgeführt werden, ist aber nicht darauf beschränkt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann die Reinigung in Schritt (vi) Säulenchromatographie oder Rekristallisation umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Rekristallisation kann die Schritte des Mischens des konzentrierten oder getrockneten Extrakts mit einem polaren Lösungsmittel, und nach dem Erhitzen und Lösen, die Abkühlung der Lösung zur Kristallisation umfassen. Das polare Lösungsmittel kann Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon umfassen. In einem Beispiel wird Dichlormethan verwendet.
Die Säulenchromatographie bezieht sich hierin auf ein Verfahren zum Abtrennen einer Komponente in einer Mischung, wobei ein Eluent die Mischung durch eine Säule treibt, die mit absorptionsfähigen festen Füllstoffen gefüllt ist. Da die Komponenten in der Mischung unterschiedliche Affinitäten zu den Füllstoffen der Säule haben und unterschiedliche Löslichkeit im Eluenten, gelangen die Komponenten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule und werden somit voneinander getrennt. Der Eluent kann Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Butylacetat, oder eine Kombination davon umfassen. Ein Beispiel der Erfindung verwendet Kieselgel-Säulenchromatographie mit einem Eluenten bestehend aus Ethylacetat und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:5.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann die Filtrierung in Schritt (iv) Celite, Ton oder dergleichen verwenden, um das klebrige Material nach der Zugabe der Säure zu entfernen.
In dem Extrakt aus Cynanchum sp. identifizieren die Erfinder ferner einen Wirkstoff zur Behandlung von Arthritis, Antofin, in einer Ausführungsform der Erfindung. Somit stellt die Erfindung ferner ein Verfahren zur Behandlung von Arthritis bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge Antofin an einen Patienten, der dessen bedarf, und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis, umfassend Antofin als einen Wirkstoff und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer Ausführungsform.
Das Antofin bezieht sich gemäß einer Ausführungsform der Erfindung auf das Phenanthroindolizidin-Alkaloid wie in der folgenden Formel (1) dargestellt, Enantiomere oder Salze davon.
Formel (1).
Das hierin angeführte Enantiomer umfasst (+)-Antofin und (–)-Antofin, aber (–)-Antofin, das natürlicherweise, wie in der folgenden Formel (2) dargestellt, vorkommt, ist bevorzugt.
Formel (2)
Die Salze von Antofin, die hierin angeführt werden, können Salze von Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium, Kalium, Ammonium, Carbonaten, Nitraten, Hydrogencarbonaten, Hydrochloriden, Sulfaten, Phosphaten oder Silikaten umfassen. Jedoch ist die Erfindung nicht darauf beschränkt und umfasst die Salze, die keinen Einfluss auf die Aktivität von Antofin für die Behandlung von Arthritis haben.
In einer Ausgestaltung der Erfindung kann Antofin erhalten werden aus der Extraktion der Pflanzen Albizzia julibrissin, Antitoxicum funebre, Cocculus laurifolius, Cocculus pendulus, Corydalis meifolia, Croton sparsiflours, Cryptocarya oubatchensis, Cryptocarya phyllostemon, Cryptocarya chinensis, Cynanchum hancockianum, Cynanchum inamoenum, Cynanchum komarovi, Cynanchum paniculatum, Cynanchum vincetoxicum, Ficus fistulosa, Ficus septica, Pergularia daemia, Stephania glabra, Tylophora floribunda, Tylophora indica, Tylophora tanakae, Vincetoxicum hirundinaria, Vincetoxicum nigrum, Vincetoxicum officinale, Vincetoxicum pumilu, Vincetoxicum rossicum oder einer Kombination davon.
Die Extraktion zur Gewinnung von Antofin kann in geeigneter Weise eingestellt werden, abhängig von der Pflanzenart, den Geweben für die Extraktion oder dergleichen. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Extraktion zur Gewinnung von Antofin die Schritte:

Genauer gesagt, umfasst das erste Lösungsmittel Wasser, Alkohole, Ester, Ether, Ketone oder eine Kombination davon. Die Alkohole des ersten Lösungsmittels können Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-Propanol, 2-Methyl-Propan-2-ol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol oder eine Kombination davon umfassen. Die Ester des ersten Lösungsmittels können Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Pentylacetat, Hexylacetat oder eine Kombination davon umfassen. Die Ketone des ersten Lösungsmittels können Aceton, Methylethylketon, 2-Pentanon, 3-Pentanon oder eine Kombination davon umfassen. Die Ether des ersten Lösungsmittels können Ether, Propylether, Isopropylether oder eine Kombination davon umfassen.
In einem Beispiel der Erfindung ist das erste Lösungsmittel ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus 80 bis 100 Gew.-% Butylacetat und 0 bis 20 Gew.-% Ethanol.
In einem weiteren Beispiel der Erfindung ist das erste Lösungsmittel 50 bis 100 Gew.-% einer wässrigen Isopropanol-Lösung oder 90 bis 100 Gew.-% einer wässrigen Isopropanol-Lösung.
Erfindungsgemäß ist die Säure, die in den ersten Extrakt gegeben wird, nicht speziell beschränkt, aber Salzsäure ist bevorzugt. In einem Beispiel der Erfindung wird 0,1 bis 2N Salzsäure verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Heiztemperatur in Schritt (ii) von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur der Mischung. Die Heizdauer kann 2 Stunden oder mehr betragen. In einem Beispiel ist die Heiztemperatur 25 bis 75°C, und 70 bis 75°C ist bevorzugt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das zweite Lösungsmittel Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon, vorzugsweise Dichlormethan umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Extraktion mit dem zweiten Lösungsmittel kann mindestens ein Mal für eine Erhöhung der Reinheit durchgeführt werden. Vorzugsweise kann die Extraktion mit dem zweiten Lösungsmittel ein- bis dreimal durchgeführt werden, ist aber nicht darauf beschränkt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann die Reinigung in Schritt (vi) Säulenchromatographie oder Rekristallisation umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Rekristallisation kann die Schritte des Mischens des konzentrierten oder getrockneten Extrakts mit einem polaren Lösungsmittel, und nach dem Erhitzen und Lösen, die Abkühlung der Lösung zur Kristallisation umfassen. Das polare Lösungsmittel kann Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon umfassen. In einem Beispiel wird Dichlormethan verwendet.
Die Säulenchromatographie bezieht sich hierin auf ein Verfahren zum Abtrennen einer Komponente in einer Mischung, wobei ein Eluent die Mischung durch eine Säule treibt, die mit absorptionsfähigen festen Füllstoffen gefüllt ist. Da die Komponenten in der Mischung unterschiedliche Affinitäten zu den Füllstoffen der Säule haben und unterschiedliche Löslichkeit im Eluenten, gelangen die Komponenten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule und werden somit voneinander getrennt. Der Eluent kann Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Butylacetat, oder eine Kombination davon umfassen. Ein Beispiel der Erfindung verwendet Kieselgel-Säulenchromatographie mit einem Eluenten bestehend aus Ethylacetat und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:5.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann die Filtrierung in Schritt (iv) Celite, Ton oder dergleichen verwenden, um das klebrige Material nach der Zugabe der Säure zu entfernen.
Demgemäß stellt eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Antofin bereit, umfassend die Schritte:

(i) Mischen eines Pflanzenpulvers mit einem ersten Lösungsmittel, um eine erste Mischung zu bilden;
(ii) Erwärmen und Filtrieren der ersten Mischung, um einen ersten Extrakt zu erhalten;
(iii) Konzentrieren des ersten Extrakts und substantielle Zugabe einer Säure, um eine Suspension mit einem klebrigen Material zu bilden;
(iv) Filtrieren der Suspension, um das klebrige Material zu entfernen und eine klare Lösung zu erhalten;
(v) Extraktion der klaren Lösung mit einem zweiten Lösungsmittel, um einen zweiten Extrakt zu erhalten, und
(vi) Konzentrieren und Reinigen der zweiten Extraktionslösung,

Genauer gesagt, umfasst das erste Lösungsmittel Wasser, Alkohole, Ester, Ether, Ketone oder eine Kombination davon. Die Alkohole des ersten Lösungsmittels können Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-Propanol, 2-Methyl-Propan-2-ol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol oder eine Kombination davon umfassen. Die Ester des ersten Lösungsmittels können Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Pentylacetat, Hexylacetat oder eine Kombination davon umfassen. Die Ketone des ersten Lösungsmittels können Aceton, Methylethylketon, 2-Pentanon, 3-Pentanon oder eine Kombination davon umfassen. Die Ether des ersten Lösungsmittels können Ether, Propylether, Isopropylether oder eine Kombination davon umfassen.
In einem Beispiel der Erfindung ist das erste Lösungsmittel ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus 80 bis 100 Gew.-% Butylacetat und 0 bis 20 Gew.-% Ethanol.
In einem weiteren Beispiel der Erfindung ist das erste Lösungsmittel 50 bis 100 Gew.-% einer wässrigen Isopropanol-Lösung oder 90 bis 100 Gew.-% einer wässrigen Isopropanol-Lösung.
Erfindungsgemäß ist die Säure, die in den ersten Extrakt gegeben wird, nicht speziell beschränkt, aber Salzsäure ist bevorzugt. In einem Beispiel der Erfindung wird 0,1 bis 2N Salzsäure verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Heiztemperatur in Schritt (ii) von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur der Mischung. Die Heizdauer kann 2 Stunden oder mehr betragen. In einem Beispiel ist die Heiztemperatur 25 bis 75°C und 70 bis 75°C ist bevorzugt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das zweite Lösungsmittel Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether; Aceton oder eine Kombination davon, vorzugsweise Dichlormethan umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Extraktion mit dem zweiten Lösungsmittel kann mindestens ein Mal für eine Erhöhung der Reinheit durchgeführt werden. Vorzugsweise kann die Extraktion mit dem zweiten Lösungsmittel ein- bis dreimal durchgeführt werden, ist aber nicht darauf beschränkt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann die Reinigung in Schritt (vi) Säulenchromatographie oder Rekristallisation umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Rekristallisation kann die Schritte des Mischens des konzentrierten oder getrockneten Extrakts mit einem polaren Lösungsmittel, und nach dem Erhitzen und Lösen, die Abkühlung der Lösung zur Kristallisation umfassen. Das polare Lösungsmittel kann Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon umfassen. In einem Beispiel wird Dichlormethan verwendet.
Die Säulenchromatographie bezieht sich hierin auf ein Verfahren zum Abtrennen einer Komponente in einer Mischung, wobei ein Eluent die Mischung durch eine Säule treibt, die mit absorptionsfähigen festen Füllstoffen gefüllt ist. Da die Komponenten in der Mischung unterschiedliche Affinitäten zu den Füllstoffen der Säule haben und unterschiedliche Löslichkeit im Eluenten, gelangen die Komponenten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule und werden somit voneinander getrennt. Der Eluent kann Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Butylacetat, oder eine Kombination davon umfassen. Ein Beispiel der Erfindung verwendet Kieselgel-Säulenchromatographie mit einem Eluenten bestehend aus Ethylacetat und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:5.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann die Filtrierung in Schritt (iv) Celite, Ton oder dergleichen verwenden, um das klebrige Material nach der Zugabe der Säure zu entfernen.
In einer Ausführungsform kann Antofin durch die folgenden Schritte erhalten werden: Mischen von Pulvern von Cynanchum hancockianum mit 50 bis 95 Gew.-% einer wässrigen Ethanollösung, um eine Mischung zu bilden; Erhitzen der Mischung unter Rückfluss für 2 Stunden und dann Herausfiltern der Reste; Konzentrierung der Filter und Zugabe des 3-fachen Volumens von 0,1 bis 2N Salzsäure; Extrahieren der sauren Lösung mit Dichlormethan, um einen Dichlormethan-Extrakt zu erhalten; und Konzentrierung und Reinigung des Extraktes durch Säulenchromatographie, um Antofin zu isolieren. Zur Erhöhung der Effizienz der Extraktion kann der Schritt der Dichlormethan-Extraktion zweimal oder mehrmals wiederholt werden. In einem Beispiel wird der Schritt der Dichlormethan-Extraktion 2 bis 3 mal wiederholt. Der konzentrierte Extrakt kann weiter rekristallisiert werden, wenn nötig.
In einem Beispiel wird Antofin aus dem Extrakt aus Cynanchum hancockianum gewonnen, da es eine größere Menge an Antofin enthält und leicht verfügbar ist. Allerdings kann Antofin auch aus den Pflanzen nach dem Verfahren der Extraktion, wie hierin beschrieben, isoliert werden.
Gemäß dem Verfahren zur Herstellung von Antofin in einer Ausführungsform der Erfindung ist die Lösungsmittelextraktion in der Lage, Antofin außerordentlich rein darzustellen und die Zeit der Wiederholung der Säulenchromatographie zu reduzieren. Eine mehr als 90%ige Ausbeute von Antofin kann daher erhalten werden. So zeigt die Herstellung von Antofin gemäß der Erfindung eine hohe Effizienz der Extraktion und hat eine hohe industrielle Anwendbarkeit.
Gemäß der Erfindung kann Antofin nicht nur durch Pflanzenextraktion sondern auch durch chemische Synthesen erhalten werden. Es ist bekannt, dass Antofin chemisch synthetisiert werden kann über eine Prolin-katalysierte sequentielle α-Aminoxylierung und Horner-Wadsworth-Emmons-Olefinierung des Aldehyds (Mingbo Cui, et al. Asymmetric synthesis of (R)-antofine and (R)-cryptoleurine via praline-catalyzed sequential α-aminoxylation and Horner-Wadsworth-Emmons olefination of aldehyde. J. Org. Chem., 2010, 75(20), S. 7018–7021).
Die Wirkung des Extraktes von Cynanchum sp. und Antofin auf Arthritis kann weiter in Tiermodellen bestimmt werden. Das Tiermodell für Arthritis wurde in mehreren Studien etabliert, wie: das Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) Modell (Thorbecke G. J., et al., Involvement of endogenous tumor necrosis factor alpha and transforming growth factor beta during induction of collagen type II arthritis in mice. Proc Natl Acad Sci USA 89, (1992) 7375–7379.);. das Adjuvans-induzierte Arthritis-Modell (Barnes D. A., et al., Polyclonal antibody directed against human RANTES ameliorates disease in the Lewis rat adjuvant-induced arthritis model. J Clin Invest 101, (1998) 2910–2919.); oder das Carrageen-induzierte Pfotenödem-Modell (Mazzon E., et al., Effect of tumour necrosis factor-α receptor 1 genetic deletion an carrageenan-induced acute inflammation: a comparison with etanercept. British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology, 153(2008): 136–149.). Das Tiermodell wurde allgemein verwendet und akzeptiert zur Abschätzung der medikamentösen Effizienz für die Behandlung von Arthritis. Die Erfinder haben die Effizienz von Antofin und dem Extrakt aus Cynanchum sp. basierend auf den vom Stand der Technik etablierten Tiermodellen abgeschätzt und haben die Wirkung von Antofin und dem Extrakt aus Cynanchum sp. auf die Hemmung von TNF-α und IL-6 in Zellen getestet und dabei festgestellt, dass Antofin und der Extrakt aus Cynanchum sp. wirksame Wirkstoffe zur Behandlung von Arthritis sind.
Die Arthritis gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf die Krankheit mit Gelenkentzündungen und schließt auch die auftretenden entzündlichen Symptome ein, die an Sehnen, Bändern, Knochen, Knorpel oder Muskelgeweben auftreten. Die hierin genannte Arthritis kann infektiöse Arthritis, rheumatoide Arthritis, juvenile idiopathische Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Arthrose, Fibromyalgie, Sklerodermie, Spondylarthropathien, Gicht, Rheuma polymyalgia, Polymyositis, Psoriasis-Arthritis, Bursitis oder Sehnenentzündung umfassen. Der Patient kann hierin Säugetiere wie Mäuse, Ratten, Katzen, Hunde, Ziegen, Kaninchen, Kühe, Affen, Gorillas, Schimpansen oder Menschen umfassen.
Der pharmazeutisch annehmbare Träger, der hierin angegeben ist, bezieht sich auf pharmazeutisch akzeptable Additive, die die Aktivität des Wirkstoffs nicht verändern, wie Trägerstoffe, Antioxidantien, Emulgatoren, Dispersionen, septische Agentien, Aromastoffe, Pigmente, Puffer, Lösungsmittel, pH-einstellende Agentien, Tenside oder dergleichen. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann in einer Darreichungsform, wie Tabletten, Kapseln, Filmtabletten, Treibmittel, Granulaten, Pulvern, Suspensionen, Sirupen oder dergleichen, zur Verabreichung und Lagerung formuliert werden. Darüber hinaus kann die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Ausführungsform der Erfindung einzeln oder mit anderen Mitteln zusammen verabreicht werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung stellt auch ein Nahrungsergänzungsmittel bereit, umfassend Antofin oder den Extrakt von Cynanchum sp. als Wirkstoffe für Nahrungsergänzungsmittel. Das hierin genannte Nahrungsergänzungsmittel kann direkt gegessen oder getrunken werden. Alternativ kann das Nahrungsergänzungsmittel für den Verzehr zu Lebensmitteln, wie Getränken, Suppen oder dergleichen zugegeben werden.
Das hierin genannte Nahrungsergänzungsmittel kann Lebensmittelzusatzstoffe, wie Antioxidantien, Konservierungsmittel, Treibmittel, Aromen, essbare Pigmente, Verdickungsmittel, Verfestigungsmittel, Dispersionen, Hilfsstoffe oder dergleichen umfassen, falls gewünscht. Das hierin genannte Nahrungsergänzungsmittel kann formuliert werden zu Granulat, Pellets, Tabletten, Kapseln oder Pulvern oder zugegeben werden zu Getränken oder Sirupen für Verzehr und Lagerung.
[Beispiel 1] Isolierung von Antofin
1 kg Pulver von Cynanchum hancockianum wurde in einen 22L-Dreihalskolben gegeben. Von einer 95%-igen wässrigen Ethanollösung wurden dann 10 L zugegeben. Der Kolben wurde unter Rückfluss erhitzt und bei einer Temperatur über 2 Stunden gehalten. Der Filter wurde für die nächsten Schritte gesammelt. Der gleiche Erwärmungsschritt wurde für den Rückstand einmal wiederholt und der Filter wurde gesammelt und mit dem oben erhaltenen Filter gemischt. Das Gemisch wurde auf 1/20 des Gesamtvolumens mit einem Rotationsverdampfer (EVELA, Typ N-1000) konzentriert. Dreimal das Volumen der 0,5N HCl wässrigen Lösung wurde dann zugegeben, um die klebrigen Materialien zu bilden. Das klebrige Material wurde durch Celite^® 545 herausgefiltert und die klare Lösung wurde gesammelt. Das gleiche Volumen CH₂Cl₂ wurde zugegeben und die Lösung wurde dreimal extrahiert. Die CH₂Cl₂ Fraktion wurde gesammelt und konzentriert, um dickflüssiger zu werden. Eine geringe Menge Kieselgel 60 (Merck) wurde dann zugegeben und gleichmäßig gemischt. Die Mischung wurde dann in eine mit Kieselgel 60 (Merck) gefüllte Säule gegeben und mit Ethylacetat und Methanol (EA:MeOH = 2:5) eluiert. Der Filter wurde mit CH₂Cl₂ rekristallisiert. 400 mg eines hellgelben Kristalls wurden erhalten.
Der hellgelbe Kristall wurde dann analysiert durch ¹H NMR und ¹³C NMR Spektroskopie (1 und 2).
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 1.83 (m, 1H), δ 1.96 (m, 1H), δ 2.09 (m, 1H), δ 2.29 (m, 1H), 2.50 (td, 1H), δ 2.54 (m, 1H), δ 2.95 (dm, 1H), δ 3.40 (m, 1H), δ 3.51 (q, 1H), δ 3.75 (d, 1H), 4.06 (s, 1H), δ 4.10 (s, 1H), δ 4.15 (s, 1H), δ 4.74 (d, 1H), δ 7.25 (dd, 1H), δ 7.36 (s, 1H), 7.86 (d, 1H), δ 7.95 (d, 1H), δ 7.96 (s, 1H).
¹³C NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 21.63, 31.33, 33.74, 53.88, 55.09, 55.56, 55.92, 56.06, 60.28, 103.97, 104.09, 104.75, 114.91, 123.59, 124.18, 124.29, 125.60, 126.73, 127.15, 130.22, 148.42, 149.47, 157.53.
MS (EI) (m/z) 363.
([M + H]⁺) 364.1912.
Der Kristall wurde identifiziert als (–)-Antofin mit einem Molekulargewicht von 363,45 und der Summenformel C₂₃H₂₅NO₃ wie dargestellt in der folgenden Formel.
[Beispiel 2] Wirkung von Ethanol-Extrakten von Cynanchum sp. auf TNF-α Hemmung
Ethanol-Extrakt aus Cynanchum hancockianum
0,5 g Pulver von Cynanchum hancockianum wurde in 25 ml einer 95%igen wässrigen Ethanollösung gegeben. Das Ethanolmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach dem Trocknen und Konzentrieren wurde der Ethanol-Extrakt erhalten. Der Ethanol-Extrakt wurde dann mit 0,4% DMSO verdünnt, um 19 μg/ml, 56 μg/ml, 167 μg/ml and 500 μg/ml Ethanol-Extrakte aus Cynanchum hancockianum zu bilden. Die Extrakte wurden für den nächsten Schritt aufbewahrt.
U937 Zelllinie
Eine menschliche myeloische Leukämie-Zelllinie U937 (Rockville, MD) wurde von ATCC erhalten. Die Zelllinie wurde in einem RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) bei 37°C, 5% CO₂ kultiviert. Die Zelllinie wurde in der exponentiellen Wachstumsphase gehalten. Zur Induktion der Differenzierung wurden die Zellen mit einer Anfangs-Konzentration von 4 × 10⁵ Zellen/ml kultiviert in T150 enthaltend 50 ng/ml PMA (Sigma) für 24 Stunden. Anschließend wurden die Zellen in ein frisches Medium ohne PMA überführt und für 48 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden mit Gummiwischern (Bellco Glas, Vineland, NJ) gesammelt durch sanftes Abkratzen der Medium-Flasche für den nächsten Schritt.
TNFα Hemmung

Die aktivierten U937 Zellen wurden in einer 96-Well-Platte ausgesät, um eine Konzentration von 1,6 × 10⁵ Zellen/Well zu bilden. 10 μl der Ethanol-Extrakte aus Cynanchum hancockianum in verschiedenen Konzentrationen wurden zu der 96-Well-Platte gegeben. Das endgültige Volumen in jedem Well betrug 190 μl. Die Platte wurde bei 37°C, 5% CO₂ für 30 Minuten kultiviert. Dann wurde zu jedem Well 2 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS) in 10 μl PBS gegeben und bei 37°C für 4 Stunden kultiviert. Der Überstand wurde gesammelt durch Analyses Kit (R&D System, Minneapolis, MN). Die Menge an TNF-α wurde durch einen ELISA analysiert (TNF-α duoset, R&D, Minneapolis, MN). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)2,5-diphenyltrazolium, Sigma) getestet. Der Blindtest ohne Zugabe des Ethanol-Extrakts von Cynanchum hancockianum und LPS wurde eingestellt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 und 3 gezeigt. Die IC₅₀ betrug 17 μg/ml. [Tabelle 1]

		TNF-α (%)	Lebensfähigkeit der Zellen (%)
Blindtest		0	100
LPS (kein Ethanol-Extrakt wurde zugegeben)		100	95
Ethanol-Extrakte	19 μg/ml	45	86
	56 μg/ml	35	86
	167 μg/ml	15	83
	500 μg/ml	4	83

[Beispiel 3] Wirkung von Antofin auf TNF-α Hemmung
Die aktivierten U937 Zellen, die gemäß Beispiel 2 erhalten wurden, wurden in eine 96-Well-Platte gesät, um eine Konzentration von 1,6 × 10⁵ Zellen/Well zu bilden. Antofin, gereinigt gemäß Beispiel 1, wurde mit 0,4% DMSO verdünnt auf 1,52 ng/ml, 4,57 ng/ml, 13,7 ng/ml und 40,0 ng/ml und 10 μl wurden jeweils in die Platte gegeben. Das endgültige Volumen in jedem Well betrug 190 μl. Die Platte wurde bei 37°C, 5% CO₂ für 30 Minuten kultiviert. Dann wurde zu jedem Well 2 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS) in 10 μl PBS gegeben und bei 37°C für 4 Stunden kultiviert. Der Überstand wurde gesammelt durch Analyses Kit (R&D System, Minneapolis, MN). Die Menge an TNF-α wurde durch einen ELISA analysiert und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch MTT getestet. Das Ergebnis ist in 4 gezeigt. Die IC₅₀ betrug 7 ng/ml.
[Beispiel 4] Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf TNF-α und IL-6 Hemmung in einem LPS-induzierten Modell
Extrakte aus Cynanchum sp.
1,2 kg eines Pulvers von Cynanchum atratum wurden zu 6,0 L einer 50%igen wässrigen Ethanol-Lösung gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Nach dem Trocknen und Konzentrieren wurden 137 g des Extrakts von Cynanchum atratum erhalten.
LPS-induziertes Maus-Modell

Sechs männliche BALB/c Mäuse wurden gruppiert und mit 250 mg/kg des Extrakts von Cynanchum atratum und einem Träger (5% Ethanol in 30% Cremophore EL (CrEL) (BASF)) gefüttert. Eine Gruppe der Mäuse, die mit dem Träger ohne Extrakt gefüttert wurde, wurde als Kontrollgruppe bestimmt. Nach 2 Stunden wurden die Mäuse i. p. mit 1 mg/kg LPS injiziert. Das Blut wurde 1,5 Stunden nach der Injektion gesammelt. Die Mengen an TNF-α und IL-6 im Blut wurden mit einem ELISA (R&D Systems) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und in den 5 und 6 gezeigt. [Tabelle 2]

	TNF-α		IL-6
	Durchschnitt (pg/ml)	Hemmung (%)	Durchschnitt (pg/ml)	Hemmung (%)
Negativkontrolle	0	0	0	0
LPS (5% Ethanol in 30% CrEL)	2269	-	11916	-
Extrakt aus Cynanchum atratum	414*	81.76	7149*	40.0

* p < 0,05

[Beispiel 5] Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf TNF-α und IL-6 Hemmung in einem LPS-induzierten Modell
Extrakte aus Cynanchum sp.
1,2 kg Pulver von Cynanchum atratum (abgeschnittene), Cynanchum stauntoni, Cynanchum paniculatum und Cynanchum atratum (aufgerichtete) wurden jeweils zu 6,0 L einer 50%igen wässrigen Ethanol-Lösung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach dem Trocknen und Konzentrieren wurden die Extrakte der einzelnen Cynanchum sp. erhalten.
LPS-induziertes Maus-Modell

Vier männliche BALB/c Mäuse wurden gruppiert und jeweils mit 500 mg/kg der Extrakte aus Cynanchum sp. und einem Träger (5% Ethanol in 30% CrEL (BASF)) gefüttert. Eine Gruppe, die mit dem Träger ohne die Extrakte gefüttert wurde, wurde als Kontrollgruppe bestimmt. Nach 2 Stunden wurden die Mäuse i. p. mit 1 mg/kg LPS injiziert. Das Blut wurde 1,5 Stunden nach der Injektion gesammelt. Die Mengen an TNF-α und IL-6 im Blut wurden mit einem ELISA (R&D Systems) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und den 7 und 8 gezeigt. [Tabelle 3]

	TNF-α		IL-6
	Durchschnitt (pg/ml)	Hemmung (%)	Durchschnitt (pg/ml)	Hemmung (%)
Kontrolle	4743	-	6577	-
Extrakt aus Cynanchum atratum (abgeschnitten)	137*	97.1	269*	95.9
Extrakt aus Cynanchum stauntoni	118*	97.5	263*	96.0
Extrakt aus Cynanchum paniculatum	485*	89.8	2199*	66.6
Extrakt aus Cynanchum atratum (aufgerichtet)	99*	97.9	137*	97.9

* p < 0,05

[Beispiel 6] Wirkung von Extrakten von Cynanchum sp. auf TNF-α und IL-6 Hemmung in einem LPS-induzierten Modell
Extrakte aus Cynanchum sp.
Je 50 g Pulver von Cynanchum hancockianum und Cynanchum atratum wurden zu 500 ml einer 40%igen wässrigen Ethanol-Lösung gegeben und unter Rückfluss für 1 Stunde erhitzt. Nach dem Trocknen und Konzentrieren wurden die Extrakte in einer Konzentration von 15 ± 2 g und 25 ± 2% Feststoffgehalt erhalten.
LPS-induziertes Maus-Modell

Fünf männliche BALB/c-Mäuse wurden gruppiert und jeweils mit 500 mg/kg der Extrakte aus Cynanchum sp. und einem Träger (5% Ethanol in 30% CrEL (BASF)) gefüttert. Eine Gruppe, die mit dem Träger ohne die Extrakte gefüttert wurde, wurde als Kontrollgruppe bestimmt. Nach 2 Stunden wurden die Mäuse i. p. mit 1 mg/kg LPS injiziert. Das Blut wurde 1,5 Stunden nach der Injektion gesammelt. Die Mengen an TNF-α und IL-6 im Blut wurden mit einem ELISA (R&D Systems) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und in den 9 und 10 gezeigt. [Tabelle 4]

	TNF-α		IL-6
	Durchschnitt (pg/ml)	Hemmung (%)	Durchschnitt (pg/ml)	Hemmung (%)
Kontrolle	3377	-	8956	-
Extrakt of Cynanchum atratum	364*	89.2	4016	55.2
Extrakt of Cynanchum hancockianum	470*	86.1	7764	13

* p < 0,05

[Beispiel 7] Wirkung von 50% Ethanol-Extrakt aus Cynanchum atratum auf das Pfotenödem in einem Carrageen-induzierten Rattenmodell
Fünf Lang-Evan Ratten wurden in eine Gruppe gruppiert. Der Knöchel der linken Hinterpfote jeder Ratte wurde gemessen als Grundlage für das Hinterpfotenvolumen zu Beginn des Tests. Die Versuchsgruppen wurden gefüttert mit 250 mg/kg, 500 mg/kg und 1000 mg/kg Cynanchum atratum. Die Träger-Kontrollgruppe wurde mit 1% CMC (Carboxymethylcellulose) gefüttert. Die positive Kontrollgruppe wurde mit 3 mg/kg Indometacin gefüttert. Nach 1 Stunde wurden 0,1 ml einer 1% Carrageen-Kochsalzlösung in die linke Hinterpfote aller Ratten injiziert. Das Volumen der linken Hinterpfote wurde durch ein Plethysmometer (PV-01, DR Instrument, Taiwan) 0, 1, 2 und 3 Stunden nach der Carrageen-Injektion gemessen.
Die Hemmung wurde durch die folgende Formel berechnet: Hemmung (%) = (Nt – Nv)/Nv × 100

Nt:: Nettoveränderung des Volumens der linken Pfote der experimentellen Gruppe.
Nv:: Nettoveränderung des Volumens der linken Pfote der Träger-Kontrolle.

Da die Hemmung negativ war, zeigte sie an, dass die Verabreichung entzündungshemmende Wirkungen hatte. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
[Beispiel 8] Wirkung von 50% Ethanol-Extrakten aus Cynanchum atratum in einem Adjuvans-induzierten Arthritis-Modell
Die Knöchel jeder Lewis Ratte wurden gemessen als Grundlage des Hinterpfotenvolumens zu Beginn des Tests. 50 μl von 20 mg/ml Mycobacterium butyricum suspendiert in Squalen wurden subkutan auf drei Punkte in der Nähe der Basis des Schwanzes injiziert. Vom Tag der Injektion an bis die Studie abgeschlossen war, wurde die experimentelle Gruppe gefüttert mit 100 mg/kg und 200 mg/kg von Cynanchum atratum pro Tag, die Träger-Kontrollgruppe wurde gefüttert mit 5% Ethanol und 0,025% Tween 20 in 1% CMC pro Tag und die positive Kontrollgruppe wurde gefüttert mit 3 mg/kg Indometacin pro Tag. Die Symptome der Arthritis in jeder Gruppe wurden nach folgenden Bewertungen geschätzt:

0: Der Fuß war weder rot noch geschwollen;
1: Der Fuß war leicht gerötet und geschwollen oder ein Zehengelenk war rot und geschwollen;
2: Der Fuß war offensichtlich rot und geschwollen oder mehr als zwei Zehengelenke waren rot und geschwollen;
3: Die Hinterpfote war nicht in der Lage ihre Funktion beim Gehen zu erfüllen;
4: Das Sprunggelenk war nicht in der Lage, sich zu bewegen.

Das Hinterpfotenvolumen wurde durch einen Plethysmometer gemessen und als Prozentsatz des durchschnittlichen Gewichts jeder Ratte angegeben. Die Genauigkeit der Messung des Gewichts war genauer als 0,1 g (METTLER TOLDEO, PB1501). Das Ergebnis ist in 12 gezeigt. * steht für p < 0,05, was statistisch signifikante Unterschiede anzeigt.
[Beispiel 9] Wirkung von Cynanchum atratum Extrakt auf Entzündungshemmung in einem Adjuvans-induzierten Arthritis-Modell.
Die Knöchel jeder Lewis-Ratten wurden gemessen als Grundlage des Hinterpfotenvolumen zu Beginn des Tests. 50 μl von 20 mg/ml Mycobacterium butyricum suspendiert in Squalen wurden subkutan in drei Punkten in der Nähe der Basis des Schwanzes injiziert. Vom Tag der Injektion an bis die Studie abgeschlossen war, wurde die experimentelle Gruppe gefüttert mit 16,7 mg/kg und 50 mg/kg Cynanchum atratum Extrakten (50% Ethanol-Extrakte erhalten gemäß Beispiel 5) und 50 mg/kg und 100 mg/kg Cynanchum atratum Extrakten (95% Ethanol-Extrakte) pro Tag, und die Träger-Kontrollgruppe wurde gefüttert mit 5% Ethanol und 0,025% Tween 20 in 1% CMC pro Tag. Eine Negativkontrolle wurde bestimmt. Die Symptome der Arthritis in jeder Gruppe wurden nach den Bewertungen geschätzt:

Das Hinterpfotenvolumen wurde durch einen Plethysmometer gemessen und als Prozentsatz des durchschnittlichen Gewichts jeder Ratte angegeben. Die Genauigkeit der Messung des Gewichts war genauer als 0,1 g (METTLER TOLDEO, PB1501). Das Ergebnis ist in 13 gezeigt. * steht für p < 0,05, was statistisch signifikante Unterschiede anzeigt.
[Beispiel 10] Wirkung des Antofin-Einnahmeregimes in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell
50 μg eines Fötus Rinder-Typ-II-Kollagen (CII, Chondrex) wurden emulgiert in einem kompletten Freund-Adjuvans (CFA, Sigma). Das Knöchelvolumen wurde gemessen als Grundlage des Hinterpfotenvolumens. Am achten Tag nach der primären Immunisierung wurde jede Ratte mit 100 μg des Kollagens emulgiert in IFA (Sigma) injiziert, um Arthritis zu induzieren. Die Träger-Kontrollgruppe wurde i. p. injiziert mit 2 ml/kg von 0,5% CMC alle zwei Tage bis zu Tag 21. Die experimentelle Gruppe wurde gefüttert mit gemäß Beispiel 1 isoliertem Antofin nach den folgenden Regimen:
Gruppe 1 wurde i. p. injiziert mit 3 mg/kg Antofin alle zwei Tage bis zu Tag 20 und wurde dann i. p. injiziert mit 3 mg/kg Antofin pro Tag an den Tagen 21 bis 23;
Gruppe 2 wurde i. p. injiziert mit 3 mg/kg Antofin alle drei Tage bis zu Tag 20 und wurde dann i. p. injiziert mit 3 mg/kg Antofin pro Tag an den Tagen 21 bis 23;
Gruppe 3 wurde i. p. injiziert mit 2 mg/kg Antofin alle zwei Tage bis zu Tag 20 und wurde dann i. p. injiziert mit 3 mg/kg Antofin pro Tag an den Tagen 21 bis 23;
Gruppe 4 wurde i. p. injiziert mit 3 mg/kg Antofin pro Tag für 5 Tage, und dann wurde die Verabreichung an den nächsten neun Tagen unterbrochen, und Gruppe 4 wurde i. p. injiziert mit 3 mg/kg Antofin pro Tag an den Tagen 21 bis 23; und
die positive Kontrollgruppe wurde gefüttert mit 3 mg/kg Indometacin pro Tag.
Alle Ratten wurden an Tag 24 getötet.
Morbiditäten jeder Gruppe sind in 14 gezeigt. Gewichtsänderungen sind in 15 gezeigt. Die Ergebnisse haben ergeben, dass Gruppe 1 und Gruppe 4 verringerte Morbiditäten und verzögerte Krankheitsausbrüche zeigten, dass aber die Gewichte nicht stark verändert waren unter der Behandlung mit verschiedenen Dosen von Antofin und den Regimen.
Die Symptome der Arthritis in jeder Gruppe wurden nach den Bewertungen geschätzt:

Die Veränderung der Hinterpfotenvolumina jeder Ratte ist in 16 gezeigt. Das Ergebnis der Arthritis Bewertungen ist in 17 gezeigt.
Obwohl die Erfindung anhand von Beispielen und in Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsformen beschränkt ist. Im Gegenteil ist es beabsichtigt, verschiedene Modifikationen und ähnliche Anordnungen (wie sie für den Fachmann ersichtlich wären) abzudecken. Daher sollte dem Umfang der beigefügten Ansprüche die breiteste Interpretation eingeräumt werden, so dass alle derartigen Modifikationen und ähnlichen Anordnungen umfasst werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

CN 20121028430 [0001]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Mingbo Cui, et al. Asymmetric synthesis of (R)-antofine and (R)-cryptoleurine via praline-catalyzed sequential α-aminoxylation and Horner-Wadsworth-Emmons olefination of aldehyde. J. Org. Chem., 2010, 75(20), S. 7018–7021 [0069]
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Mazzon E., et al., Effect of tumour necrosis factor-α receptor 1 genetic deletion an carrageenan-induced acute inflammation: a comparison with etanercept. British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology, 153(2008): 136–149 [0070]

Claims

Verfahren zur Behandlung von Arthritis, umfassend Verabreichung einer wirksamen Menge eines Extrakts von Cynanchum sp. an ein Subjekt, das dessen bedarf.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Extrakt von Cynanchum sp. Antofin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Antofin eine Komponente wie in folgender Formel dargestellt, ein Enantiomer oder ein Salz davon ist
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Cynanchum sp. Cynanchum hancockianum, Cynanchum inamoenum, Cynanchum komarovii, Cynanchum paniculatum, Cynanchum vincetoxicum, Cynanchum atratum oder Cynanchum stauntonii umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Cynanchum sp. extrahiert wird durch die Schritte: (i) Mischen des Pflanzenpulvers mit einem ersten Lösungsmittel, um eine erste Mischung zu bilden; (ii) Erwärmen und Filtrieren der ersten Mischung, um einen ersten Extrakt zu erhalten; (iii) Konzentrieren des ersten Extrakts und nachfolgende Zugabe einer Säure, um eine Suspension mit einem klebrigen Material zu bilden; (iv) Filtrieren der Suspension, um das klebrige Material zu entfernen und eine klare Lösung zu erhalten; (v) Extraktion der klaren Lösung mit einem zweiten Lösungsmittel, um einen zweiten Extrakt zu erhalten; (vi) Konzentrieren und Reinigen der zweiten Extraktionslösung.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das erste Lösungsmittel Wasser, Alkohole, Ester, Ether, Ketone oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Säure Salzsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das zweite Lösungsmittel Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Heiztemperatur in Schritt (ii) von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur der ersten Mischung ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Erwärmen in Schritt (ii) 2 Stunden oder mehr andauert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Filtrieren in Schritt (iv) Celite oder Ton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Reinigen in Schritt (vi) Säulenchromatographie oder Rekristallisation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Säulenchromatographie mit Ethylacetat und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:5 eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Arthritis infektiöse Arthritis, rheumatoide Arthritis, juvenile idiopathische Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Arthrose, Fibromyalgie, Sklerodermie, Spondylarthropathien, Gicht, Rheuma polymyalgia, Polymyositis, Psoriasis-Arthritis, Bursitis oder Sehnenentzündung umfasst.
Verfahren zur Behandlung von Arthritis, umfassend Verabreichung einer wirksamen Menge Antofin an ein Subjekt, das dessen bedarf.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Antofin eine Komponente wie in folgender Formel dargestellt, ein Enantiomer oder ein Salz davon ist
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Antofin chemisch synthetisiert oder aus einer Pflanze extrahiert ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Pflanze Albizzia julibrissin, Antitoxicum funebre, Cocculus laurifolius, Cocculus pendulus, Corydalis meifolia, Croton sparsiflours, Cryptocarya oubatchensis, Cryptocarya phyllostemon, Cryptocarya chinensis, Cynanchum hancockianum, Cynanchum inamoenum, Cynanchum komarovi, Cynanchum paniculatum, Cynanchum vncetoxicum, Ficus fistulosa, Ficus septica, Pergularia daemia, Stephania glabra, Tylophora floribunda, Tylophora indica, Tylophora tanakae, Vincetoxicum hirundinaria, Vincetoxicum nigrum, Vincetoxicum officinale, Vincetoxicum pumilu oder Vincetoxicum rossicum umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, wobei die Pflanze extrahiert wird durch die folgenden Schritte: (i) Mischen des Pflanzenpulvers mit einem ersten Lösungsmittel, um eine erste Mischung zu bilden; (ii) Erwärmen und Filtrieren der ersten Mischung, um einen ersten Extrakt zu erhalten; (iii) Konzentrieren des ersten Extrakts und nachfolgende Zugabe einer Säure, um eine Suspension mit einem klebrigen Material zu bilden; (iv) Filtrieren der Suspension, um das klebrige Material zu entfernen und eine klare Lösung zu erhalten; (v) Extraktion der klaren Lösung mit einem zweiten Lösungsmittel, um einen zweiten Extrakt zu erhalten; (vi) Konzentrieren und Reinigen der zweiten Extraktionslösung.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das erste Lösungsmittel Wasser, Alkohole, Ester, Ether, Ketone oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Säure Salzsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das zweite Lösungsmittel Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Heiztemperatur in Schritt (ii) von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur der ersten Mischung ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Erwärmen in Schritt (ii) oder (vi) 2 Stunden oder mehr andauert.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Filtrieren in Schritt (iv) Celite oder Ton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Reinigen in Schritt (vi) Säulenchromatographie oder Rekristallisation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Säulenchromatographie mit Ethylacetat und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:5 eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei Antofin eine Komponente wie dargestellt in folgender Formel ist
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Arthritis infektiöse Arthritis, rheumatoide Arthritis, juvenile idiopathische Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Arthrose, Fibromyalgie, Sklerodermie, Spondylarthropathien, Gicht, Rheuma polymyalgia, Polymyositis, Psoriasis-Arthritis, Bursitis oder Sehnenentzündung umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Antofin, umfassend die Schritte: (i) Mischen des Pflanzenpulvers mit einem ersten Lösungsmittel, um eine erste Mischung zu bilden; (ii) Erwärmen und Filtrieren der ersten Mischung, um einen ersten Extrakt zu erhalten; (iii) Konzentrieren des ersten Extrakts und substantielle Zugabe einer Säure, um eine Suspension mit einem klebrigen Material zu bilden; (iv) Filtrieren der Suspension, um das klebrige Material zu entfernen und eine klare Lösung zu erhalten; (v) Extraktion der klaren Lösung mit einem zweiten Lösungsmittel, um einen zweiten Extrakt zu erhalten; und (vi) Konzentrieren und Reinigen der zweiten Extraktionslösung, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zumindest einer von Albizzia julibrissin, Antitoxicum funebre, Cocculus laurifolius, Cocculus pendulus, Corydalis meifolia, Croton sparsiflours, Cryptocarya oubatchensis, Cryptocarya phyllostemon, Cryptocarya chinensis, Cynanchum hancockianum, Cynanchum inamoenum, Cynanchum komarovi, Cynanchum paniculatum, Cynanchum vincetoxicum, Ficus fistulosa, Ficus septica, Pergularia daemia, Stephania glabra, Tylophora floribunda, Tylophora indica, Tylophora tanakae, Vincetoxicum hirundinaria, Vincetoxicum nigrum, Vincetoxicum officinale, Vincetoxicum pumilu und Vincetoxicum rossicum.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das erste Lösungsmittel Wasser, Alkohole, Ester, Ether, Ketone oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Säure Salzsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das zweite Lösungsmittel Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Ether, Aceton oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Heiztemperatur in Schritt (ii) von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur der ersten Mischung ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Erwärmen in Schritt (ii) 2 Stunden oder mehr andauert.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Filtrieren in Schritt (iv) Celite oder Ton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Reinigen in Schritt (vi) Säulenchromatographie oder Rekristallisation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Säulenchromatographie mit Ethylacetat und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:5 eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei Antofin eine Komponente wie in folgender Formel dargestellt ist