CN102755320B - 治疗关节炎之药物组合物及保健食品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗关节炎之药物组合物及保健食品。以安托芬或白前属植物萃取物为活性成分之医药组合物及保健食品，用以治疗关节炎或作为日常饮食的补给。本发明还提供由植物体大量生产安托芬的方法。
Description
技术领域
本发明系关于关节炎的治疗，特别是关于以植物萃取物中的活性成分治疗关节炎的用途。
现有技术
关节炎为近代人类疾病中很常见的疾病，罹患率也随着文明发展而有增加的趋势。
关节炎的治疗包括类固醇药物(corticosteroids)以降低发炎症状及抑制免疫系统，或者非类固醇药物(NSAIDs)，例如COX-1抑制剂、COX-2抑制剂、希乐葆(celebrex)、或布洛芬(ibuprofen)，以减少疼痛及发炎。然而，严重的副作用及有限的药效表现，促使新一代的药物问世。
新一代的关节炎治疗药物着眼于细胞激素TNF-α在关节炎中扮演的角色，发展出一系列生物制剂以降低关节炎患者体中TNF-α的分泌量，例如抗TNF-α抗体的埃达里美(adalimumab)、因福利美(infliximab)，TNF-α拮抗物的恩博(etanercept)。后续并有研究组合免疫抑制剂-胺基甲基叶酸(methotrexate)及上述TNF-α拮抗物可提高治疗效果(Tracey D，et al.，Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action：acomprehensive review，Pharmacology & Therapeutics 117(2008)244-279.)。其它细胞激素的活性抑制如IL-6抗体与IL-1b-ra亦可使用，然而，有限的药效、无法合并使用及伴随的副作用，仍有开发新药物的必要。
发明内容
本发明人为了研发新颖的关节炎之医药，进行多种测试及试验，进而完成本发明。
本发明一实施例，提供一种治疗关节炎之药物组合物，包括安托芬(antofine)为活性成分及医药上可接受载体。
本发明另一实施例，提供一种治疗关节炎之药物组合物，包括白前属植物(Cynanchum sp.)萃取物为活性成分。
本发明又一实施例提供一种量产安托芬(antofine)的制造方法，包括下列步骤：(i)混合选自下列之植物粉末与一第一溶剂，形成一第一混合物；(ii)加热该第一混合物及过滤，获得第一萃取液；(iii)浓缩上述第一萃取液后，加入酸，形成含有黏稠物的悬浮液；(iv)过滤上述悬浮液，取得一澄清液；(v)使上述澄清液与第二溶剂形成第二混合物；(vi)利用第二溶剂进行萃取，获得第二萃取物；及(vii)浓缩及纯化上述第二萃取物，以获得安托芬；上述之植物粉末为选自合欢(Albizzia julibrissin)、Antitoxicum funebre、樟叶木防己(Cocculus laurifolius)、Cocculus pendulus、细叶黄堇(Corydalis meifolia)、Croton sparsiflours、Cryptocarya oubatchensis、Cryptocarya phyllostemon、厚壳桂(Cryptocarya chinensis)、华北白前(Cynanchum hancockianum)、竹灵消(Cynanchuminamoenum)、老瓜头(Cynanchum komarovii)、徐长卿(Cynanchum paniculatum)、催吐白前(Cynanchum vincetoxicum)、水同木(Ficus fistulosa)、棱果榕(Ficus septica)、紫荆梦崖(Pergularia daemia)、西藏地不容(Stephania glabra)、七层楼(Tylophorafloribunda)、印度娃儿藤(Tylophora indica)、Tylophora tanakae、Vincetoxicumhirundinaria、Vincetoxicum nigrum、Vincetoxicum officinale、Vincetoxicum pumilu及Vincetoxicum rossicum之至少一种。
本发明之再一实施例进一步提供一种保健食品，包括安托芬为活性成分及食品添加剂。
本发明另一实施例提供一种保健食品，包括白前属植物萃取物为活性成分。
本发明之再一实施例进一步提供一种调控TNF-α或IL-6的组合物，包括对一个体投予有效量的白前属植物(Cynanchum sp.)萃取物为活性成分，其中该活性成份包含安托芬。
本发明另一实施例提供一种调控TNF-α或IL-6的方法，包括对一个体投予有效量的白前属植物(Cynanchum sp.)萃取物为活性成分，其中该活性成份包含安托芬。
本发明还提供安托芬在制备治疗关节炎之药物组合物中的用途。
附图说明
图1、2显示萃取自华北白前的结晶物之NMR数据，根据此数据鉴定华北白前的结晶物为Antofine；
图3显示华北白前酒精萃取物对U937细胞株的TNF-α抑制作用及细胞存活率；
图4显示安托芬对U937细胞株的TNF-α抑制作用及细胞存活率；
图5显示白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中的TNF-α抑制作用；
图6显示白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中的IL-6抑制作用；
图7显示数种白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中的TNF-α抑制作用；
图8显示数种白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中的IL-6抑制作用；
图9显示数种白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中的TNF-α抑制作用；
图10显示数种白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中的IL-6抑制作用；
图11显示白前属植物萃取物在鹿角胶诱导的大鼠后掌肿胀之动物模式的脚掌体积变化；
图12显示白前属植物萃取物在佐剂诱导的关节炎动物模式中的关节炎评分(score)；
图13显示白前属植物萃取物在佐剂诱导的关节炎动物模式中的脚掌体积变化；
图14显示安托芬的给药方案对胶原蛋白诱导的关节炎动物模式的发病率的影响；
图15显示安托芬的给药方案对胶原蛋白诱导的关节炎动物模式的动物体重的影响；
图16显示安托芬的给药方案在胶原蛋白诱导的关节炎动物模式中脚掌体积的变化；以及
图17显示安托芬的给药方案对胶原蛋白诱导的关节炎动物模式中的关节炎评分(score)。
发明的具体实施方式
本发明所述之安托芬(antofine)系指具有下式(1)所示之啡并吲嗪啶生物碱(phenanthroindolizidine alkaloid)、其镜像异构物、或其盐。
式(1)
此述之镜像异构物包括(+)-安托芬及(-)-安托芬，但以自然界存在的下式(2)之(-)-安托芬为佳。
式(2)
本发明所述之盐类，可例如钠盐、钾盐、锂盐、镁盐、钙盐、铵盐、碳酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐或硅酸盐等之盐类，只要不改变安托芬在关节炎治疗上的生理活性者，皆包含于本发明范围。
再者，本发明所述之安托芬可为化学合成或从植物体中萃取。
安托芬的化学合成，可例如透过脯胺酸-催化的系列α-胺氧基化反应及醛的霍纳尔-沃兹沃思-埃蒙斯烯烃化而合成(Mingbo Cui，et al.Asymmetric synthesis of(R)-antofine and(R)-cryptoleurine via praline-catalyzed sequential α-aminoxylation and Horner-Wadsworth-Emmons olefination ofaldehyde.J.Org.Chem.，2010，75(20)，p.7018-7021)。
安托芬也可从植物体中萃取、纯化而得。可萃取的植物包括合欢(Albizziajulibrissin)、Antitoxicum funebre、樟叶木防己(Cocculus laurifolius)、Cocculuspendulus、细叶黄堇(Corydalis meifolia)、Croton sparsiflours、Cryptocaryaoubatchensis、Cryptocarya phyllostemon、厚壳桂(Cryptocarya chinensis)、华北白前(Cynanchum hancockianum)、竹灵消(Cynanchum inamoenum)、老瓜头(Cynanchumkomarovii)、徐长卿(Cynanchum paniculatum)、催吐白前(Cynanchum vincetoxicum)、水同木(Ficus fistulosa)、棱果榕(Ficus septica)、紫荆梦崖(Pergularia daemia)、西藏地不容(Stephania glabra)、七层楼(Tylophora floribunda)、印度娃儿藤(Tylophoraindica)、Tylophora tanakae、Vincetoxicum hirundinaria、Vincetoxicum nigrum、Vincetoxicum officinale、Vincetoxicum pumilu或Vincetoxicum rossicum。
萃取的方法可依植物品种、萃取的组织部位等选用适当的方法。本发明所述之安托芬(antofine)的制造方法，可包括下列步骤：
(i)混合上述之植物的粉末与一第一溶剂，形成一第一混合物；
(ii)加热该第一混合物及过滤，获得第一萃取液；
(iii)浓缩上述第一萃取液后，加入酸，形成含有黏稠物的悬浮液；
(iv)过滤上述悬浮液，取得一澄清液；
(v)使上述澄清液与第二溶剂形成第二混合物；
(vi)利用第二溶剂进行萃取，获得第二萃取物；及
(vii)浓缩及纯化上述第二萃取物，以获得安托芬。
具体地说，上述第一溶剂可包括水、醇类、酯类、醚类、酮类或其组合。
上述第一溶剂之醇类可包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、2-丁醇、2-甲基丙醇、2-甲基丙-2-醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇或前述之组合。
上述第一溶剂之酯类可包括乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸己酯或前述之组合。
上述第一溶剂之酮类可包括丙酮、甲基乙基酮、2-戊酮、3-戊酮或前述之组合。
上述第一溶剂之醚类包括乙醚、丙醚、异丙醚或前述之组合。
本发明一实施例中，使用80～100重量％乙酸丁酯及0～20重量％乙醇之混合溶液作为第一溶剂。
本发明另一实施例中，使用50～100重量％异丙醇水溶液、或90～100重量％异丙醇水溶液作为第一溶剂。
本发明所述之安托芬的制造方法中，在第一萃取液加入的酸没有特别限制，但较佳为盐酸。本发明一实施例中，使用0.1～2N盐酸溶液。
根据本发明所述之安托芬的制造方法，步骤(ii)的加热步骤，其加热温度可为室温至溶液沸腾的温度，例如25～75℃，较佳为70～75℃，但不限于此。加热时间可为2小时以上。
本发明所述之安托芬的制造方法中，第二溶剂可使用二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮或其组合之极性溶剂，较佳为二氯甲烷，但不限于此。
本发明所述之安托芬的制造方法中，步骤(vii)中的纯化可例如再结晶或管柱层析法，但不限于此。
上述再结晶步骤可包括将浓缩或干燥的萃取液与极性溶剂混合，经加热溶解后，冷却至结晶析出的步骤。该极性溶剂可例如二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮等，于一实施例中为二氯甲烷。
上述“管柱层析法”系指在填充吸附性固体填充物的管柱中，藉由冲提剂(elute)的流动相，使欲分离的混合物通过管柱，分离混合物中物质之方法。由于混合物中的各物质对管柱中的填充物之吸附性不同以及与冲提剂的溶解度差异，使各物质的通过速度不一，因此达到分离的效果。可使用的冲提剂例如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、或其混合溶液等。本发明一实施例使用填充硅胶的管柱层析法，使用体积比2∶5的乙酸乙酯及甲醇的混合溶液冲提。
本发明所述之安托芬的制造方法中，步骤(iv)中的过滤步骤可使用硅藻土、黏土等，较佳使用硅藻土去除在加入酸后所形成的黏稠物。
本发明一具体实施例从植物体萃取安托芬的量产方法，包括：混合华北白前(Cynanchum hancockianum)粉末及50～95重量％酒精水溶液，形成混合物，将该混合物加热至回流2小时后，过滤掉药渣取出滤液，并在浓缩后之滤液中加入3倍体积的0.1～2N盐酸，接着以等体积的二氯甲烷溶液萃取该酸液，获得二氯甲烷萃取液，最后浓缩该萃取物液，以管柱层析法纯化，分离安托芬。为了提高萃取效率，上述二氯甲烷溶液的萃取步骤可重复2次以上，于一实施例为2～3次，亦可视情形使浓缩的萃取物进行上述再结晶步骤。
由于华北白前的安托芬含量较高及容易取得，被选为大量生产安托芬的萃取对象，然而上述各植物体皆可透过相同的萃取方法分离出安托芬。
根据本发明所提供的量产方法，溶剂的萃取步骤可大量分离纯化安托芬以及减少重复进行管柱层析法所浪费的时间，获得纯度90％以上的安托芬，具有高萃取效率及产业上利用的价值。
本发明还提供以白前属植物萃取物为活性成分之治疗关节炎之药物组合物。
此述白前属植物包括华北白前(Cynanchum hancockianum)、竹灵消(Cynanchuminamoenum)、老瓜头(Cynanchum komarovii)、徐长卿(Cynanchum paniculatum)、催吐白前(Cynanchum vincetoxicum)、白薇(Cynanchum atratum)及柳叶白前(Cynanchumstauntonii)，较佳使用华北白前。
本发明所述之白前属植物萃取物系指根据上述安托芬的制造方法之步骤(i)～(vii)进行萃取，所得到的第二萃取物。此第二萃取物可视需要重复相同的萃取步骤1次以上，或视需要将各次萃取所得的萃取物混合，之后进行浓缩、干燥或再结晶的步骤而获得。
本发明还提供以白前属植物萃取物为活性成分之调控TNF-α或IL-6的组合物和方法。
此述白前属植物包括华北白前(Cynanchum hancockianum)、竹灵消(Cynanchuminamoenum)、老瓜头(Cynanchum komarovii)、徐长卿(Cynanchum paniculatum)、催吐白前(Cynanchum vincetoxicum)、白薇(Cynanchum atratum)及柳叶白前(Cynanchumstauntonii)，较佳使用华北白前。
本发明所述之白前属植物萃取物系指根据上述安托芬的制造方法之步骤(i)～(vii)进行萃取，所得到的第二萃取物。此第二萃取物可视需要重复相同的萃取步骤1次以上，或视需要将各次萃取所得的萃取物混合，之后进行浓缩、干燥或再结晶的步骤而获得。
已知有多篇研究建立关节炎的动物模式，例如胶原蛋白诱导的关节炎(collagen-induced arthritis；CIA)动物模式(Thorbecke G.J.，et al.，Involvement ofendogenous tumor necrosis factor alpha and transforming growth factor betaduring induction of collagen type II arthritis in mice.Proc Natl Acad Sci U SA89，(1992)7375-7379.)；佐剂诱导的关节炎(adjuvant-induced arthritis)动物模式(Barnes D.A.，et al.，Polyclonal antibody directed against human RANTESameliorates disease in the lewis rat adjuvant-induced arthritis model.J ClinInvest101，(1998)2910-2919.)；或鹿角胶诱导的掌肿胀(carrageenan-induced pawedema)模式(Mazzon E.，et al.，Effect of tumour necrosis factor-α receptor1genetic deletion on carrageenan-induced acute inflammation：a comparison withetanercept.British Society for Immunology，Clinical and ExperimentalImmunology，153(2008)：136-149.)。这些动物模式广泛被接受用于评估医药品之关节炎疗效。本发明根据先前文献建立之关节炎动物模式评估安托芬及白前属植物萃取物的功效，并透过细胞株检测安托芬及白前属植物萃取物对TNF-α及IL-6的抑制效果，判断安托芬及白前属植物萃取物具有作为治疗关节炎之活性成分的潜力。
本发明所述之药物组合物可单独给药或与其它药剂共同给药，依药学上例行方法实施给药疗程(regime)。
本发明所述之关节炎系指关节发炎的病症，也包括发生在肌腱、韧带、硬骨、软骨、或肌肉组织的发炎症状。此述之关节炎包括，例如感染性关节炎(infectious arthritis)、风湿性关节炎、儿童期特异性关节炎(juvenile idiopathic arthritis)、红斑性狼疮(systemic lupus erythematosus)、退化性关节炎(osteoarthritis)、纤维肌痛症(fibromyalgia)、硬皮症(scleroderma)、脊椎关节炎(spondyloarthropathies)、痛风(gout)、风湿性多发性肌痛症(polymyalgia rheumatica)、多发性肌痛症(polymyositis)、干癣性关节炎(psoriatic arthritis)、滑液囊炎(bursitis)、或肌腱炎(tendonitis)等。
本发明所述之调控TNF-α或IL-6的组合物和方法可用於例如感染性关节炎(infectious arthritis)、风湿性关节炎、儿童期特异性关节炎(juvenile idiopathicarthritis)、红斑性狼疮(systemic lupus erythematosus)、退化性关节炎(osteoarthritis)、纤维肌痛症(fibromyalgia)、硬皮症(scleroderma)、脊椎关节炎(spondyloarthropathies)、痛风(gout)、风湿性多发性肌痛症(polymyalgiarheumatica)、多发性肌痛症(polymyositis)、干癣性关节炎(psoriatic arthritis)、滑液囊炎(bursitis)、或肌腱炎(tendonitis)等的治疗。
本发明所述之医药上可接受之载剂，系指除活性成分外医药上可容许的添加剂，例如赋形剂、抗氧化剂、乳化剂、分散剂、制菌剂、矫味剂、着色剂、缓冲剂、溶剂、pH调整剂、界面活性剂等。又本发明所述之药物组合物可制为锭剂、胶囊剂、膜衣锭、发泡剂、颗粒、粉末、悬浮液、糖浆等剂型给药及保存。
本发明还提供以安托芬及白前属植物萃取物为活性成分之保健食品，作为日常饮食的补充。本发明所述之保健食品可直接食用或添加于饮食品中食用，例如添加于饮料、汤品等。
本发明所述之保健食品可包括食品添加剂，例如抗氧化剂、防腐剂、矫味剂、膨松剂、增稠剂、凝固剂、分散剂、赋形剂、食用色素、香精、香料等，可视需要添加。又本发明所述之保健食品可制为颗粒状、锭状、胶囊状、膜衣状、粉状等或添加于溶液、糖浆等，以供食用及保存。
本发明之具体实施详细说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步揭露本发明之技术内容，不应藉以限制本发明的发明范畴。
[实施例1]分离安托芬
秤取1kg华北白前(Cynanchum hancockianum)的粉末放入22L开盖式三颈瓶中，加入10L的95％乙醇水溶液加热至回流(reflux)，维持该温度2小时后取出滤液。残余物重复上述加热萃取步骤一次，之后将两次萃取的滤液混合，利用回旋浓缩机(EYELA，N-1000型)浓缩至萃取溶液总体积之1/20，加入3倍体积的0.5N HCl水溶液。利用545过滤掉黏稠物收集澄清液。之后加入相同体积的二氯甲烷(CH2Cl2)进行三次萃取。接着收集二氯甲烷层的溶液，将此溶液浓缩至呈黏稠状后放入少量Silica gel 60(Merck)使其混合均匀后将其放入已利用Silica gel 60(Merck)装填好之管柱，经以乙酸乙酯与甲醇冲提液(EA∶MeOH＝2∶5)冲提，分离纯化，所得之滤液经CH2Cl2再结晶，得到400mg的淡黄色结晶。
该淡黄色结晶进行1H NMR、13C NMR分析(如第一、二图所示)；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ1.83(m，1H)，δ1.96(m，1H)，δ2.09(m，1H)，δ2.29(m，1H)，δ2.50(td，1H)，δ2.54(m，1H)，δ2.95(dm，1H)，δ3.40(m，1H)，δ3.51(q，1H)，δ3.75(d，1H)，δ4.06(s，1H)，δ4.10(s，1H)，δ4.15(s，1H)，δ4.74(d，1H)，δ7.25(dd，1H)，δ7.36(s，1H)，δ7.86(d，1H)，δ7.95(d，1H)，δ7.96(s，1H)，；13C NMR(500MHz，CDCl3)δ21.63，31.33，33.74，53.88，55.09，55.56，55.92，56.06，60.28，103.97，104.09，104.75，114.91，123.59，124.18，124.29，125.60，126.73，127.15，130.22，148.42，149.47，157.53。
MS及MS/MS分析：
MS(EI)(m/z)363
([M+H]+)364.1912
确认该淡黄色结晶为分子量363.45、分子式C23H25NO3之下式所示之(-)-安托芬。
[实施例2]白前属植物的酒精萃取物的TNF-α抑制活性
华北白前酒精萃取物
将0.5g的华北白前(Cynanchum hancockianum)粉末加入25ml的95％乙醇水溶液在室温下振荡过夜后，经过干燥浓缩后，以0.4％DMSO稀释至浓度分别为19μg/ml、56μg/ml、167μg/ml、500μg/ml的华北白前酒精萃取物，以进行后续的细胞活性试验。
U937细胞株
使用来自美国菌种保藏中心(ATCC)的人体骨髓白血球(myeloid leukemia)细胞株U937(Rockville，MD)。将该细胞株培养于37℃、5％ CO2、含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基中，维持在指数生长(exponential growth)状态。为了进行分化诱导，将该细胞株以起始浓度为4x105个细胞/ml，培养于含有50ng/ml PMA(Sigma)的T150培养瓶中24小时。之后移到未含PMA的相同培养基中，再培养48小时。之后以橡胶刮勺(rubberpoliceman)(Bellco Glass，Vineland，NJ)轻微刮除该培养瓶，收集细胞，用于下列步骤。
TNF-α抑制作用
在96孔盘植入如上述活化的U937细胞1.6x105细胞/孔同时加入10μl上述各浓度的华北白前酒精萃取物，使每孔的体积为190μl，于37℃、5％CO2下培养30分钟。之后每孔加入10μl的2μg/ml的脂多醣体溶液(lipopolysaccharide；LPS)(于磷酸缓冲生理食盐水(PBS)中)，37℃培养4小时。该培养基经分析套组(R&D system，Minneapolis，MN)收集细胞上清液，以ELISA(TNF-α duoset，R&D，Minneapolis，MN)分析TNF-α含量，以及MTT(3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)2，5-diphenyltrazolium，Sigma)检测细胞存活率。同时培养相同之细胞株，但培养过程不加入华北白前酒精萃取物及LPS作为空白试验。结果如表1及图3所示，IC50为17μg/ml。
表1
| 测试物 | TNF-α含量(％) | 细胞存活率(％) |
| 空白试验 | 0 | 100 |
| LPS | 100 | 95 |
| 19μg/ml华北白前酒精萃取物 | 45 | 86 |
| 56μg/ml华北白前酒精萃取物 | 35 | 86 |
| 167μg/ml华北白前酒精萃取物 | 15 | 83 |
| 500μg/ml华北白前酒精萃取物 | 4 | 83 |
[实施例3]安托芬的TNF-α抑制活性
在96孔盘植入如实施例2活化的U937细胞1.6x105细胞/孔，同时加入实施例1中最后分离纯化所得之安托芬10μl，浓度为1.52ng/ml、4.57ng/ml、13.7ng/ml及40.0ng/ml(溶于0.4％DMSO)，使每孔的体积为190μl，于37℃、5％CO2下培养30分钟。之后每孔加入10μl的2μg/ml的脂多醣体溶液(lipopolysaccharide；LPS)(于磷酸缓冲生理食盐水(PBS)中)，37℃培养4小时。该培养基经分析套组(R&D system，Minneapolis，MN)收集细胞上清液，以ELISA分析TNF-α含量，以及MTT检测细胞存活率。结果如图4所示，IC50为7ng/ml。
[实施例4]白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中TNF-α及IL-6的抑制作用
白前属植物萃取物
将1.2Kg的白薇(Cynanchum atratum)粉末加入6.0L的50％酒精溶液中，在室温下振荡过夜后，经过干燥浓缩后，获得137g的白薇萃取物。
LPS诱导发炎的小鼠模式
雄BALB/c小鼠以6只一组，灌食上述白薇萃取物250mg/kg及不含萃取物的载剂(5％乙醇在30％Cremophore EL(BASF)(简称CrEL)中)。2小时后，腹腔注射1mg/kg LPS。在LPS注射后1.5小时，收集小鼠血液。以ELISA(R&D Systems)测量该小鼠血液中TNF-α及IL-6的分泌量，结果如表2及第五、六图所示。
表2
*p＜0.05
[实施例5]白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中TNF-α及IL-6的抑制作用
白前属植物萃取物
分别将白薇(Cynanchum atratum)、柳叶白前(Cynanchum stauntonii)、徐长卿(Cynanchum paniculatum)、白薇(Cynanchum atratum)的植物粉末1.2Kg加入6.0L的50％酒精溶液中，在室温下振荡过夜后，经过干燥浓缩后，分别获得各植物萃取物。
LPS诱导发炎的小鼠模式
雄BALB/c小鼠以4只一组，载剂对照组6只一组，灌食上述各植物萃取物500mg/kg及不含萃取物的载剂(5％乙醇在30％CrEL)，在2小时后，腹腔注射1mg/kg LPS。在LPS注射后1.5小时，收集小鼠血液。以ELISA(R&D Systems)测量该小鼠血液中TNF-α及IL-6的分泌量，结果如表3及第七、八图所示。
表3
*p＜0.05
[实施例6]多种白前属植物萃取物在LPS诱导发炎的小鼠模式中TNF-α及IL-6的抑制作用
白前属植物萃取物
分别将华北白前(Cynanchum hancockianum)、白薇(Cynanchum atratum)的植物粉末50g加入500ml的40％酒精溶液中，加热至回流后1小时，经过浓缩干燥后，分别获得浓度15±2g，固含量25±2％的各植物萃取物。
LPS诱导发炎的小鼠模式
雄BALB/c小鼠以5只一组，灌食上述各植物萃取物500mg/kg及不含萃取物的载剂(5％乙醇在30％CrEL中)，在2小时后，腹腔注射1mg/kg LPS。在LPS注射后1.5小时，收集小鼠血液。以ELISA(R&D Systems)测量该小鼠血液中TNF-α及IL-6的分泌量，结果如表4及第九、十图所示。
表4
*p＜0.05
[实施例7]白薇(Cynanchum atratum)50％酒精萃取物在鹿角胶(carrageenan)诱导的大鼠后掌肿胀(paw edema)之动物模式中的抗发炎功效
Long-Evan大鼠5只一组，实验开始前，标记各大鼠左后脚的踝关节，作为足体积测量的基准。测试组分别喂食250mg/kg、500mg/kg及1000mg/kg的白薇；载剂对照组施用1％CMC(Carboxymethyl Cellulose)载剂；正对照组施用3mg/kg吲哚美辛(Indomethacin)。经1小时后，所有大鼠的左后脚掌注射1％鹿角胶-生理食盐水溶液0.1ml。注射鹿角胶后的第0、1、2、3个小时，分别以足体积测量仪(plethysmometer)(PV-01，DR instrument，Taiwan)测量大鼠左后脚的体积变化。
根据下式计算抑制率：
抑制率(％)＝(Nt-Nv)/Nvx100
Nt：测试组的左后脚体积的净变化；
Nv：载剂对照组的左后脚体积的净变化。
当计算出的抑制率为负值时，表示施用物具有抗发炎的效果。结果如图11所示。
[实施例8]在佐剂诱导的关节炎动物模式中白薇(Cynanchum atratum)50％酒精萃取物的抗发炎功效
实验开始前，标记各Lewis大鼠的踝关节，作为足体积测量的基础。之后，将20mg/ml悬浮于角鲨烯(squalene)的酪酸分岐杆菌(Mycobacterium butyricum)50μl以皮下注射方式注射于大鼠尾巴基部附近，共注射三个位点。自注射该天开始，测试组每日分别喂食白薇100mg/kg及200mg/kg，载剂对照组每日喂食5％乙醇及0.025％ Tween 20于1％CMC中的溶液，正控制组喂食3mg/kg吲哚美辛(Indomethacin)，直到实验结束。依发病状况对关节炎进行评分(score)：
0表示脚掌没有红肿现象；
1表示脚掌出现轻微红肿，或有1个趾关节出现红肿；
2表示脚掌出现明显红肿，或有2个以上趾关节出现红肿；
3表示脚掌不能踏地行走；
4表示踝关节固定不能移动。
上述的脚掌体积以足体积测量仪(plethysmometer)，以每一只大鼠的平均体积表示。测量体重使用精确度在0.1g以上的精密天平(METTLLER TOLDEO，PB1501)。结果如图12所示。*表示P＜0.05，具有统计上显著差异。
[实施例9]在佐剂诱导的关节炎动物模式中白前属植物萃取物的抗发炎功效
实验开始前，标记各Lewis大鼠的踝关节，作为足体积测量的基准。之后，将20mg/ml悬浮于角鲨烯(squalene)的酪酸分岐杆菌(Mycobacterium butyricum)50μl以皮下注射方式注射于大鼠尾巴基部附近，共注射三个位点。自注射该天开始，测试组每日分别喂食如实施例5萃取之16.7mg/kg及50mg/kg的白薇(Cynanchum atratum)(与实施例5相同之萃取物50％EtOH萃取物)、50mg/kg及100mg/kg的白薇(Cynanchum atratum)(95％EtOH萃取物)，载剂对照组每日喂食5％乙醇及0.025％ Tween 20于1％CMC中的溶液，并设置空白试验组，直到实验结束。
依发病状况对关节炎进行评分(score)：
0表示脚掌没有红肿现象；
1表示脚掌出现轻微红肿，或有1个趾关节出现红肿；
2表示脚掌出现明显红肿，或有2个以上趾关节出现红肿；
3表示脚掌不能踏地行走；
4表示踝关节固定不能移动。
上述的脚掌体积以足体积测量仪(plethysmometer)，以每一只大鼠的平均体积表示。测量体重使用精确度在0.1g以上的精密天平(METTLLER TOLDEO，PB1501)。结果如图13所示。*表示P＜0.05，具有统计上显著差异。
[实施例10]在胶原蛋白(Collagen)诱导的关节炎动物模式中安托芬的给药方案的效应
以皮内(intradermal)注射方式在Lewis大鼠的尾巴基部附近注射50μg的胎牛第II型胶原蛋白(Collagen)(CII，Chondrex)乳化于完全弗氏辅剂(CFA，Sigma)中。同时，标记该大鼠的踝关节，作为脚掌体积测量的基准。在上述的初级免疫后7天，全体大鼠再注射100μg的CII乳化于不完全弗氏辅剂(IFA，Sigma)中。于上述关节炎诱导日开始，载剂对照组以隔日腹腔注射2ml/kg的0.5％CMC连续施用至第21天。测试组以下列给药流程施用实施例1中最后分离纯化所得之安托芬：测试组1以隔日腹腔注射3mg/kg安托芬连续施用，第21-23天每日腹腔注射3mg/kg的安托芬；测试组2以每隔两日腹腔注射3mg/kg的安托芬连续施用，第21-23天每日腹腔注射3mg/kg的安托芬；测试组3以隔日腹腔注射2mg/kg的安托芬连续施用，第21-23天每日腹腔注射3mg/kg的安托芬；测试组4以连续五日腹腔注射3mg/kg的安托芬，之后9天不施用，第21-23天每日腹腔注射3mg/kg的安托芬；正对照组每日口服3mg/kg吲哚美辛(Indomethacin)。至第24天牺牲所有动物。
各组的发病率如图14所示，体重变化如图15所示。结果显示以隔日施用安托芬的测试组1及以连续五日施用安托芬，之后9天不施用的测试组4，发病率明显下降或延迟发病，但测试动物的体重不因安托芬的施用及给药方案不同而有影响。
各组大鼠依发病状况对关节炎进行评分(score)：
0表示脚掌没有红肿现象；
1表示脚掌出现轻微红肿，或有1个趾关节出现红肿；
2表示脚掌出现明显红肿，或有2个以上趾关节出现红肿；
3表示脚掌不能踏地行走；
4表示踝关节固定不能移动。
各组大鼠的关节体积变化如图16所示，对关节炎的评分结果如图17所示。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此项技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
Claims (24)
1.安托芬在制备治疗关节炎之药物组合物中的用途，其中安托芬为该药物组合物中唯一的活性成分。
2.根据权利要求1所述的用途，其中该安托芬为下式所示之化合物、镜像异构物、或其盐
3.根据权利要求1所述的用途，其中该安托芬为化学合成或来自植物萃取物。
4.根据权利要求3所述的用途，其中该植物包括合欢(Albizzia julibrissin)、Antitoxicum funebre、樟叶木防己(Cocculus laurifolius)、Cocculus pendulus、细叶黄堇(Corydalis meifolia)、Croton sparsiflours、Cryptocarya oubatchensis、Cryptocarya phyllostemon、厚壳桂(Cryptocarya chinensis)、华北白前(Cynanchumhancockianum)、竹灵消(Cynanchum inamoenum)、老瓜头(Cynanchum komarovii)、徐长卿(Cynanchum paniculatum)、催吐白前(Cynanchum vincetoxicum)、水同木(Ficusfistulosa)、棱果榕(Ficus septica)、紫荆梦崖(Pergularia daemia)、西藏地不容(Stephania glabra)、七层楼(Tylophora floribunda)、印度娃儿藤(Tylophora indica)、Tylophora tanakae、Vincetoxicum hirundinaria、Vincetoxicum nigrum、Vincetoxicumofficinale、Vincetoxicum pumilu或Vincetoxicum rossicum。
5.根据权利要求3所述的用途，其中该植物系经由下列步骤所萃取:
(i)混合选自该植物的粉末与第一溶剂，形成第一混合物；
(ii)加热该第一混合物及过滤，获得第一萃取液；
(iii)浓缩上述第一萃取液后，加入酸，形成含有黏稠物的悬浮液；
(iv)过滤上述悬浮液，取得一澄清液；
(v)使上述澄清液与第二溶剂形成第二混合物；
(vi)利用第二溶剂进行萃取，获得第二萃取物；及
(vii)浓缩及纯化上述第二萃取物以得安托芬。
6.根据权利要求5所述的用途，其中该第一溶剂为水、醇类、酯类、醚类、酮类或其组合。
7.根据权利要求5所述的用途，其中该酸包括盐酸。
8.根据权利要求5所述的用途，其中该第二溶剂为二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮或其组合。
9.根据权利要求5所述的用途，其中该步骤(ii)中的加热温度为室温至溶液沸腾的温度。
10.根据权利要求5所述的用途，其中该步骤(ii)中的加热时间为2小时以上。
11.根据权利要求5所述的用途，其中该步骤(iv)的过滤包括硅藻土或黏土。
12.根据权利要求5所述的用途，其中该步骤(vii)的纯化包括管柱层析法或再结晶法。
13.根据权利要求12所述的用途，其中该管柱层析法包括以乙酸乙酯及甲醇2:5的体积比之混合溶液冲提。
14.根据权利要求1所述的用途，其中该安托芬为下式所示之化合物
15.根据权利要求1所述的用途，其中该关节炎包括感染性关节炎、风湿性关节炎、儿童期特异性关节炎(juvenile idiopathic arthritis)、红斑性狼疮、退化性关节炎、纤维肌痛症(fibromyalgia)、硬皮症(scleroderma)、脊椎关节炎(spondyloarthropathies)、痛风、风湿性多发性肌痛症(polymyalgia rheumatica)、多发性肌痛症(polymyositis)、干癣性关节炎、滑液囊炎或肌腱炎。
16.一种安托芬(antofine)的制造方法，包括下列步骤:
(i)混合选自下列植物的粉末与第一溶剂，形成第一混合物；
(ii)加热该第一混合物及过滤，获得第一萃取液；
(iii)浓缩上述第一萃取液后，加入酸，形成含有黏稠物的悬浮液；
(iv)过滤上述悬浮液，取得一澄清液；
(v)使上述澄清液与第二溶剂形成第二混合物；
(vi)利用第二溶剂进行萃取，获得第二萃取物；及
(vii)浓缩及纯化上述第二萃取物，以获得安托芬；
其中，上述之植物粉末为选自合欢(Albizzia julibrissin)、Antitoxicum funebre、樟叶木防己(Cocculus laurifolius)、Cocculus pendulus、细叶黄堇(Corydalismeifolia)、Croton sparsiflours、Cryptocarya oubatchensis、Cryptocaryaphyllostemon、厚壳桂(Cryptocarya chinensis)、华北白前(Cynanchum hancockianum)、竹灵消(Cynanchum inamoenum)、老瓜头(Cynanchum komarovii)、徐长卿(Cynanchumpaniculatum)、催吐白前(Cynanchum vincetoxicum)、水同木(Ficus fistulosa)、棱果榕(Ficus septica)、紫荆梦崖(Pergularia daemia)、西藏地不容(Stephania glabra)、七层楼(Tylophora floribunda)、印度娃儿藤(Tylophora indica)、Tylophora tanakae、Vincetoxicum hirundinaria、Vincetoxicum nigrum、Vincetoxicum officinale、Vincetoxicum pumilu及Vincetoxicum rossicum之至少一种，其中该步骤(vii)的纯化包括管柱层析法，且该管柱层析法包括以乙酸乙酯及甲醇2:5的体积比之混合溶液冲提。
17.根据权利要求16所述的制造方法，其中该第一溶剂为水、醇类、酯类、醚类、酮类或其组合。
18.根据权利要求16所述的制造方法，其中该酸包括盐酸。
19.根据权利要求16所述的制造方法，其中该第二溶剂为二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮或其组合。
20.根据权利要求16所述的制造方法，其中该步骤(ii)中的加热温度为室温至溶液沸腾的温度。
21.根据权利要求16所述的制造方法，其中该步骤(ii)中的加热时间为2小时以上。
22.根据权利要求16所述的制造方法，其中该步骤(iv)的过滤包括硅藻土或黏土。
23.根据权利要求16所述的制造方法，其中该步骤(vii)的纯化包括再结晶法。
24.根据权利要求16所述的制造方法，其中该安托芬为下式所示之化合物
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