JP5902803B2 - 関節炎治療用のキナンクム属植物抽出物およびそれに含まれる有効成分 - Google Patents
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(i)植物の粉末を第1溶媒と混合して第1混合物を形成する工程;
(ii)前記第1混合物を加熱および濾過して第1抽出物を得る工程;
(iii)前記第1抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程;
(iv)前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程;
(v)前記透明溶液を第2溶媒で抽出して第2抽出物を得る工程;および
(vi)前記第2抽出物を濃縮および精製する工程。
(i)植物の粉末を第1溶媒と混合して第1混合物を形成する工程;
(ii)前記第1混合物を加熱および濾過して第1抽出物を得る工程;
(iii)前記第1抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程;
(iv)前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程;
(v)前記透明溶液を第2溶媒で抽出して第2抽出物を得る工程;および
(vi)前記第2抽出物を濃縮および精製する工程。
(i)植物の粉末を第1溶媒と混合して第1混合物を形成する工程;
(ii)前記第1混合物を加熱および濾過して第1抽出物を得る工程;
(iii)前記第1抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程;
(iv)前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程;
(v)前記透明溶液を第2溶媒で抽出して第2抽出物を得る工程;および
(vi)前記第2抽出物を濃縮および精製する工程。
キナンクム・ハンコキアヌムの粉末1kgを容量22Lの三ツ口フラスコに加えた。次いで、95%エタノール水溶液10Lを加えた。このフラスコを加熱還流し、その温度で2時間保持した。濾液を採取して、次の工程に供した。残渣について、同じ加熱工程を1回繰り返し、濾液を採取して、先に得られた濾液と混合した。この混合物をロータリーエバポレーター(EYELA、N-1000型)で全体積の1/20まで濃縮した。次いで、3倍体積の0.5N HCl水溶液を加えると、粘着物質が生じた。この粘着物質をセライト(R)545で濾去し、透明溶液を採取した。同体積のCH2Cl2を加え、この溶液を3回抽出した。CH2Cl2画分を採取し、濃縮すると、粘度が高くなった。次いで、少量のシリカゲル60(Merck)を加え、均一に混合した。次いで、この混合物を、シリカゲル60(Merck)を詰めたカラムに加え、酢酸エチルおよびメタノール(EA:MeOH=2:5)で溶離した。濾液をCH2Cl2で再結晶した。淡黄色結晶400mgを得た。
13C NMR(500MHz, CDCl3)δ21.63, 31.33, 33.74, 53.88, 55.09, 55.56, 55.92, 56.06, 60.28, 103.97, 104.09, 104.75, 114.91, 123.59, 124.18, 124.29, 125.60, 126.73, 127.15, 130.22, 148.42, 149.47, 157.53;
MS(EI)(m/z)363;
([M+H]+)364.1912。
キナンクム属植物のエタノール抽出物
キナンクム・ハンコキアヌムの粉末0.5gを95%エタノール水溶液25mLに加えた。このエタノール混合物を室温で一晩振盪した。乾燥および濃縮した後、エタノール抽出物を得た。次いで、このエタノール抽出物を0.4%DMSOで希釈して、19μg/mL、56μg/mL、167μg/mLおよび500μg/mLのキナンクム・ハンコキアヌムの各エタノール抽出物を得た。これらの抽出物は、次の工程のために保存した。これらの抽出物は、0.15%アントフィンを含むことが判明した。
ヒト骨髄性白血病細胞株U937(Rockville, MD)をATCCから入手した。この細胞株を、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI 1640培地中、37℃、5%CO2で培養した。この細胞株は、急速に増殖し続けた。分化を誘導するために、初期濃度4×105個/mLの細胞を、50ng/mL PMA(Sigma)を含有するT15中で24時間培養した。次いで、細胞をPMA非含有の新鮮な培地に移し、48時間培養した。細胞は、次の工程のために、ゴム製ポリスマン(Bellco Glass, Vineland, NJ)で培地ボトルを優しく擦ることにより採取した。
活性化U937細胞を96ウェルプレートに濃度1.6×105細胞/ウェルとなるように播種した。様々な濃度のキナンクム・ハンコキアヌムのエタノール抽出物を96ウェルプレートに10μLずつ加えた。各ウェルの最終体積は、190μLであった。このプレートを37℃、5%CO2で30分間培養した。次いで、各ウェルにPBS 10μL中の2μg/mLリポ多糖類(LPS)を加え、37℃で4時間培養した。上澄みを解析キット(R&Dシステム、ミネアポリス、MN)で採取した。TNF−αの量は、ELISA(TNF−αデュオセット、R&D、ミネアポリス、MN)で解析した。細胞生存率は、MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム、シグマ)で試験した。キナンクム・ハンコキアヌムのエタノール抽出物およびLPSを加えない対照試験を行った。その結果を表1および図3に示す。IC50は、17μg/mLであった。
実施例2で得られた活性化U937細胞を96ウェルプレートに濃度1.6×105細胞/ウェルとなるように播種した。実施例1で単離したアントフィンを0.4%DMSOで1.52ng/mL、4.57ng/mL、13.7ng/mLおよび40.0ng/mLとなるように希釈し、10μLずつプレートに加えた。各ウェルの最終容積は、190μLであった。このプレートを37℃、5%CO2で30分間培養した。次いで、各ウェルにPBS 10μL中のリポ多糖類(LPS)2μg/mLを加え、37℃で4時間培養した。上澄みを解析キット(R&Dシステム、ミネアポリス、MN)で採取した。TNF−αの量は、ELISAで解析し、細胞生存率は、MTTで試験した。その結果を図4に示す。IC50は、7ng/mLであった。
キナンクム属植物抽出物
キナンクム・アトラツムの粉末1.2kgを50%エタノール水溶液6.0Lに加え、室温で一晩振盪した。乾燥および濃縮した後、キナンクム・アトラツム抽出物137gを得た。
雄BALB/cマウスを6匹ずつグループ分けし、キナンクム・アトラツム抽出物250mg/kgおよび担体(30%クレモフォア・エー・エル(CrEL)(BASF)中の5%エタノール)を与えた。抽出物を与えず担体を与えた1つのマウスグループを対照グループとした。2時間後、マウスに1mg/kgのLPSを腹腔内注射した。注射してから1.5時間後に採血した。TNF−αおよびIL−6の血中濃度をELISA(R&Dシステム)で分析した。その結果を表2および図5、6に示す。
キナンクム属植物抽出物
キナンクム・アトラツム(選別くず(tailings))、キナンクム・スタウントニイ、キナンクム・パニクラツムおよびキナンクム・アトラツム(選別品(erects))の各粉末1.2kgを50%エタノール水溶液6.0Lに加え、室温で一晩振盪した。乾燥および濃縮した後、各キナンクム属植物抽出物を得た。
雄BALB/cマウスを4匹ずつグループ分けし、各キナンクム属植物抽出物500mg/kgおよび担体(30%CrEL(BASF)中の5%エタノール)を与えた。抽出物を与えず担体を与えた1つのグループを対照グループとした。2時間後、マウスに1mg/kgのLPSを腹腔内注射した。注射してから1.5時間後に採血した。TNF−αおよびIL−6の血中濃度をELISA(R&Dシステム)で分析した。その結果を表3および図7、8に示す。
キナンクム属植物抽出物
キナンクム・ハンコキアヌムおよびキナンクム・アトラツムの各粉末50gを40%エタノール水溶液500mLに加え、1時間加熱還流した。乾燥および濃縮した後、各抽出物を濃度15±2g、固形分25±2%で得た。
雄BALB/cマウスを5匹ずつグループ分けし、各キナンクム属植物抽出物500mg/kgおよび担体(30%CrEL(BASF)中の5%エタノール)を与えた。抽出物を与えず担体を与えた1つのグループを対照グループとした。2時間後、マウスに1mg/kgのLPSを腹腔内注射した。注射してから1.5時間後に採血した。TNF−αおよびIL−6の血中濃度をELISA(R&Dシステム)で分析した。その結果を表4および図9、10に示す。
ロング−エヴァン(Long-Evan)ラットを5匹ずつグループ分けした。各ラットの左後肢足首を試験開始時に後肢体積の基準として測定した。各実験グループには、キナンクム・アトラツム250mg/kg、500mg/kgおよび1000mg/kgを与えた。担体対照グループには、1%CMC(カルボキシメチルセルロース)を与えた。陽性対照グループには、インドメタシン3mg/kgを与えた。1時間後、全ラットの左後肢に1%カラギーナン−食塩水0.1mLを注射した。カラギーナンを注射してから0、1、2および3時間後に、左後肢の体積をプレシスモメーター(PV-01、ディ・アール・インスツルメンツ(DR instrument)、台湾)で測定した。
阻害率(%)=(Nt−Nv)/Nv×100
Nt:実験グループの左後肢体積の純変化
Nv:担体対照の左後肢体積の純変化。
各ルイスラットの足首を試験開始時に後肢体積の基準として測定した。スクアレン50μLに懸濁したマイコバクテリウム・ブチリクム(Mycobacterium butyricum)20mg/mLを尾の基部に近い3点に皮下注射した。注射の日から研究が終了するまで、実験グループには、1日あたりキナンクム・アトラツム100mg/kgおよび200mg/kgを与え、担体対照グループには、1日あたり1%CMC中の5%エタノールおよび0.025%ツイーン(Tween)20を与え、陽性対照グループには、1日あたりインドメタシン3mg/kgを与えた。各グループの関節炎の症状を下記スコアに従って評価した:
0:肢が赤く腫れていなかった;
1:肢がわずかに赤く腫れているか、つま先の関節が1箇所赤く腫れていた;
2:肢が明らかに赤く腫れているか、つま先の関節が2箇所以上赤く腫れていた;
3:後肢が歩くように機能することができなかった;
4:足首の関節を動かすことができなかった。
各ルイスラットの足首を試験開始時に後肢体積の基準として測定した。スクアレン50μLに懸濁したマイコバクテリウム・ブチリクム20mg/mLを尾の基部に近い3点に皮下注射した。注射の日から研究が終了するまで、実験グループには、1日あたりキナンクム・アトラツム抽出物(実施例5で得た50%エタノール抽出物)16.7mg/kgおよび50mg/kg、ならびに、キナンクム・アトラツム抽出物(95%エタノール抽出物)50mg/kgおよび100mg/kgを与え、担体対照グループには、1日あたり1%CMC中の5%エタノールおよび0.025%ツイーン20を与えた。陰性対照グループを設定した。各グループの関節炎の症状を下記スコアに従って評価した:
0:肢が赤く腫れていなかった;
1:肢がわずかに赤く腫れているか、つま先の関節が1箇所赤く腫れていた;
2:肢が明らかに赤く腫れているか、つま先の関節が2箇所以上赤く腫れていた;
3:後肢が歩くように機能することができなかった;
4:足首の関節を動かすことができなかった。
胎児ウシII型コラーゲン(CII, Chondrex)50μgを完全フロイントアジュバント(CFA, Sigma)に乳化した。足首体積を後肢体積の基準として測定した。初回免疫の8日後に、IFA(Sigma)に乳化したコラーゲン100μgを各ラットに注射して関節炎を誘発した。担体対照グループには、21日目まで2日毎に0.5%CMC2mL/kgを腹腔内注射した。実験グループには、実施例1で単離したアントフィンを下記投与法に従って与えた:
グループ1には、20日まで2日毎にアントフィン3mg/kgを腹腔内注射した後、21〜23日目に1日あたりアントフィン3mg/kgを腹腔内注射した;
グループ2には、20日まで3日毎にアントフィン3mg/kgを腹腔内注射した後、21〜23日目に1日あたりアントフィン3mg/kgを腹腔内注射した;
グループ3には、20日まで2日毎にアントフィン2mg/kgを腹腔内注射した後、21〜23日目に1日あたりアントフィン3mg/kgを腹腔内注射した;
グループ4には、5日間1日あたりアントフィン3mg/kgを腹腔内注射した後、続く9日間投与を中止し、21〜23日目に1日あたりアントフィン3mg/kgを腹腔内注射した;および
陽性対照グループには、1日あたりインドメタシン3mg/kgを与えた。
0:肢が赤く腫れていなかった;
1:肢がわずかに赤く腫れているか、つま先の関節が1箇所赤く腫れていた;
2:肢が明らかに赤く腫れているか、つま先の関節が2箇所以上赤く腫れていた;
3:後肢が歩くように機能することができなかった;
4:足首の関節を動かすことができなかった。
Claims (9)
- アントフィンの製造方法であって、
(i)植物の粉末を第1溶媒と混合して第1混合物を形成する工程;
(ii)前記第1混合物を加熱および濾過して第1抽出物を得る工程;
(iii)前記第1抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程;
(iv)前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程;
(v)前記透明溶液を第2溶媒で抽出して第2抽出物を得る工程;および
(vi)前記第2抽出物を濃縮および精製する工程
を含み、前記植物が、アルビジア・ユリブリッシン(Albizzia julibrissin)、アンチトキシクム・フネブレ(Antitoxicum funebre)、コックルス・ラウリフォリウス(Cocculus laurifolius)、コックルス・ペンデュルス(Cocculus pendulus)、コリダリス・メイフォリア(Corydalis meifolia)、クロトン・スパルシフロウルス(Croton sparsiflours)、クリプトカリヤ・オウバチェンシス(Cryptocarya oubatchensis)、クリプトカリヤ・フィロステモン(Cryptocarya phyllostemon)、クリプトカリヤ・キネンシス(Cryptocarya chinensis)、キナンクム・ハンコキアヌム(Cynanchum hancockianum)、キナンクム・イナモエヌム(Cynanchum inamoenum)、キナンクム・カマロヴィ(Cynanchum komarovi)、キナンクム・パニキュラーツム(Cynanchum paniculatum)、キナンクム・ヴィンセトキシクム(Cynanchum vincetoxicum)、フィクス・フィスツローサ(Ficus fistulosa)、フィクス・セプチカ(Ficus septica)、ペルグラリア・ダエミア(Pergularia daemia)、ステファニア・グラブラ(Stephania glabra)、ティロフォラ・フロリブンダ(Tylophora floribunda)、ティロフォラ・インディカ(Tylophora indica)、ティロフォラ・タナカエ(Tylophora tanakae)、ヴィンセトキシクム・ヒルンディナリア(Vincetoxicum hirundinaria)、ヴィンセトキシクム・ニグルム(Vincetoxicum nigrum)、ヴィンセトキシクム・オフィチナーレ(Vincetoxicum officinale)、ヴィンセトキシクム・プミル(Vincetoxicum pumilu)およびヴィンセトキシクム・ロッシクム(Vincetoxicum rossicum)の少なくとも1種よりなる群から選択され、
前記工程(vi)の濃縮および精製が体積比2:5の酢酸エチルおよびメタノールで溶離するカラムクロマトグラフィーを含むことを特徴とする製造方法。 - 前記第1溶媒が水、アルコール、エステル、エーテル、ケトンまたはその組合せを含む請求項1に記載の方法。
- 前記酸が塩酸を含む請求項1に記載の方法。
- 前記第2溶媒がジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せを含む請求項1に記載の方法。
- 前記工程(ii)の加熱温度が室温から前記第1混合物の沸点である請求項1に記載の方法。
- 前記工程(ii)の加熱が2時間またはそれ以上続く請求項1に記載の方法。
- 前記工程(iv)の濾過がセライトまたはクレーを用いる請求項1に記載の方法。
- 前記工程(vi)の精製が再結晶を含む請求項1に記載の方法。
- 前記アントフィンが下記式:
で示される化合物である請求項1に記載の方法。
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