CN1156475C - 牛心朴子草提取液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及牛心朴子草(Cynanchum komarovii Al.Iljinski)粗提取物及抗植物病毒活性。牛心朴子草的地上部分的乙醇浸膏中抗烟草花叶病毒病的活性组份为菲骈吲哚里西定(phenanthroindolizidine)类生物碱，其中7-脱甲氧基娃儿藤碱(antofine)为其主要活性组份，其活性比目前市场上广泛使用的抗烟草花叶病的制剂高1～2个数量级。本发明可应用于植物病毒病的防治，特别是烟草花叶病的防治。
Description
技术领域
本发明属生物控制剂中的天然抗植物病毒病制剂。
背景技术
近年来杀虫剂、杀菌剂及除草剂等生物控制剂都取得了迅速的发展，许多农业生产中的病虫草害都得到了有效地控制。然而由于植物病毒的结构及生理、生化方面的特殊性，目前人类还没有找到高效、安全的抗植物病毒病的制剂，从而植物病毒对农业的危害及所造成的损失也就愈来愈大，因此目前对高效、安全抗植物病毒病的制剂的需要极为迫切(朱水方，世界农业，1989，1，40-42；Sunsun Kubo，日植病报，1990，65，481-487)。
牛心朴子草(Cynanchum komarovii Al.Iljinski)已有人进行了植物化学研究，并分离出相应的生物碱(方圣鼎，张瑞，陈燕等，植物学报，1989，31(2)，934-938；1991，33(11)，870-875)，但却没有报道过该植物有抗植物病毒病活性，更没有提及7-脱甲氧基娃儿藤碱的抗植物病毒的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛心朴子草提取液的应用，本发明是一个高效、安全的抗植物病毒病的制剂，对烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)有较强的抑制活性，菲骈吲哚里西定类生物碱(phenanthroindolizidine alkaloids)是其活性部位。
本发明是采自内蒙古西部沙生的牛心朴子草(Cynanchum komarovii Al.Iljinski)的地上部分的乙醇提取物，其主要成分是下述生物碱化合物，7-脱甲氧基娃儿藤碱(antofine)为其主要有效活性成分，它用于植物病毒病的抑制，特别是烟草花叶病毒或马铃薯Y病毒的抑制，使用浓度是1-1000ppm。
X＝H、OCH3；Y＝O、电子对；7-脱甲氧基娃儿藤碱
7-脱甲氧基娃儿藤碱的CA登录号为054781-87-2。(Ralph C.Bick and WanneeSinchai：The Alkaloids XIX，Academic Press，Inc.1981.Chapter 3，Phenanthroindolizidine and Phenanthroquinolizidine Alkaloids，pp191)
本发明实施方法描述如下：
将盛花期收割的牛心朴子草的地上部分自然风干、切碎，用重蒸工业乙醇提取三至四次，提取液脱溶后得黑色的乙醇浸膏。然后按常规方法将其分为中性、酸性及碱性部位。生物活性测定表明只有碱性部位有明显的上述生物活性。碱性部位经Saphadex LH-20凝胶柱、硅胶柱分离出化合物1，2，3。经重结晶进一步纯化后进行物理常数及光谱数据测定，最后确定其结构。
1，7-脱甲氧基娃儿藤碱 2，N-氧化7-脱甲氧基娃儿藤碱 3，娃儿藤碱
antofine N-oxide antofine tylophorine
其中1的含量最大，允许进行较细致的生物活性测定，
本发明有很高抗烟草花叶病毒(TMV)活性，在500ppm浓度枯斑抑制率达70～90％，超过对照药病毒A、病毒唑、DADHT和DHT(DADHT和DHT均为国外已商品化植物病毒防治药物)，对马铃薯病毒Y的防治效果也好于DADHT。进一步采用生物活性跟踪方法确定活性部位为生物碱，该生物碱(总碱)在50ppm浓度枯斑抑制率达到70～80％。对该生物碱(总碱)进一步分离和结构、生物活性鉴定，证明活性组份为7-脱甲氧基娃儿藤碱，1ppm浓度下对烟草花叶病的抑制率仍达60％，比目前最常用的抗烟草花叶病制剂的活性高出1～2个数量级。很明显本发明所发现的这个活性物质将可作为一个高效的抗植物病毒病，特别是抗烟草花叶病的制剂。不仅如此，本发明所涉及到的牛心朴子草的粗提物以及分离出来的总生物碱都可用作抗植物病毒病，特别是烟草花叶病的制剂。
本发明发现牛心朴子草的地上部分的乙醇提取液总生物碱对植物病毒病，特别是对烟草花叶病有明显的抑制作用；该植物提取液中的生物碱部位是抑制植物病毒病的主要部位；该生物碱部位中主要活性组份为菲骈吲哚里西定类生物碱；该生物碱中主要活性组份1为7-脱甲氧基娃儿藤碱(antofine)；7-脱甲氧基娃儿藤碱对植物病毒病，特别是对烟草花叶病有很强的抑制作用；
本发明突出的实质性特点和显著效果可以从下述的实施例得以体现，但它们不是对本发明作任何限制。
具体实施方式
实施例：
将盛花期收割的内蒙古西部沙生的牛心朴子草的地上部分自然风干、切碎，取10kg用重蒸的工业乙醇(盖住植物材料为度)常温浸取三次，合并提取液，真空脱溶(40℃)得1185g黑色粘稠浸膏。此浸膏对烟草花叶病毒病的抑制率为70％(1000ppm)。
将所得的浸膏150g与500mL 5％的柠檬酸水溶液搅拌溶解，用250mL乙酸乙酯提取三次，合并提取液并用250mL 5％的氢氧化钠溶液提取三次，分出有机相，用无水硫酸钠干燥，真空脱溶，得黑色的粘稠物35g，即为中性部位；合并氢氧化钠提取液，用10％的盐酸酸化到pH＝3～4后再用250mL乙酸乙酯提取三次，合并乙酸乙酯提取液，无水硫酸钠干燥，真空脱溶，得酸性部位21g。柠檬酸的水溶液经抽滤除去不溶性杂质后，用25％的氨水中和到pH＝10后，用三氯甲烷250mL提取三次，合并提取液，用无水硫酸钠干燥，真空脱溶得0.8g碱性物质，即碱性部位。生物活性测定表明只有碱性部位有明显的抑制植物病毒活性。
所得的碱性物质首先进行凝胶色谱(Sephadex LH-20，CHCl3∶CH3OH＝1∶1)以除掉含糖类的物质。然后进行硅胶柱层析(山东海洋化工厂快速柱层析用硅胶，150g，洗脱液为三氯甲烷∶甲醇∶水三元混合物的下层，10∶1∶1，5∶1∶1，5∶2∶1)，用薄层色谱检测洗脱液中的生物碱(显色剂为Dragendorf试剂)，将含有同一物质的馏份合并，脱溶，然后用三氯甲烷与甲醇的混合物重结晶得到化合物145mg，216mg，38mg。
1：浅黄色的晶体，m.p.205～208℃，[α]D 25＝-195°。MS：直接进样，M+363(79％)，294(100％)。1H NMR，13C NMR均与已知化合物7-脱甲氧基娃儿藤碱(antofine)一致。
2：无色针状晶体，m.p.197～198℃，[α]D 25＝-65°。MS：直接进样，M 379(3％)，363(25％)，294(100％)。1H NMR，13C NMR均与N-氧化7-脱甲氧基娃儿藤碱一致。
3：浅黄色晶体，m.p.289-291℃，MS：393(35％)，324(100％)。
化合物1、2和3的部分核磁数据见表1。
表1化合物1，2和3的核磁数据(CDCl3，TMS＝0ppm)1 X＝H；2 X＝H，Y＝O；3 X＝OCH3
| 化合物 | 1 | 2 | 3 | ||
| 位置 | δ13C | δ1H(J＝Hz) | δ13C | δ1H(J＝Hz) | δ1H(J＝Hz) |
| 1 | 103.6 | 7.24(s) | 103.6 | 7.16(s) | 7.34(s) |
| 2 | 149.1 | 149.4 | |||
| 3 | 148.1 | 148.8 | |||
| 4 | 103.6 | 7.84(s) | 104.0 | 7.77(s) | 7.84(s) |
| 4a | 123.3 | 120.9 | |||
| 4b | 129.9 | 130.4 | |||
| 5 | 104.3 | 7.84(s) | 104.7 | 7.77(s) | 7.84(s) |
| 6 | 157.3 | 157.7 | |||
| 7 | 114.7 | 7.15(dd，J＝8.8Hz)J＝2.0Hz | 115.0 | 7.07(dd，J＝8.8Hz)J＝1.5Hz | |
| 8 | 125.1 | 7.33(d，J＝8.8Hz) | 123.6 | 7.48(d，J＝8.8Hz) | 7.16(s) |
| 8a | 125.1 | 123.4 | |||
| 8b | 126.7 | 123.8 | |||
| 9 | 53.3 | Hβ4.05(d，J＝15Hz)Hα3.65(d，J＝15Hz) | 69.54 | Hβ5.09(d，J＝15Hz)Hα4.47(d，J＝15Hz) | Hβ4.63(d，J＝15Hz)Hα3.70(d，J＝15Hz) |
| 11 | 55.6 | Hβ3.26(m)Hα2.45(m) | 66.05 | Hβ3.39(m)Hα3.28(m) | Hβ2.54(m)Hα3.47(m) |
| 12 | 21.3 | 19.91 | 1.90-2.22(m) | 1.9-2.1(m) | |
| 13 | 30.9 | 1.74-1.80(m)1.97-2.15(m) | 27.07 | 2.30-2.47(m) | 1.78(m)，2.32(m) |
| 13a | 59.9 | 2.45(m) | 69.22 | 2.98(m) | 2.55(m) |
| 14 | 33.1 | Hβ3.44(m)Hα2.89(m) | 27.33 | Hα3.34(m)Hβ3.10(m) | Hβ2.90(m)Hα3.38(m) |
| 14a | 1 | 1 | |||
| 25.5 | 23.7 | ||||
| 14b | 126.7 | 126.0 | |||
| -OCH3(2) | 55.8 | 4.07(s) | 55.90 | 3.98(s) | 4.05(s) |
| -OCH3(3) | 55.6 | 4.10(s) | 55.90 | 4.05(s) | 4.11(s) |
| -OCH3(6) | 55.5 | 3.98(s) | 55.42 | 3.95(s) | 4.11(s) |
| -OCH3(7) | 4.05(s) |
[6]Fumiko Abe，Yukiko Inase，Tatsuo Yamauchi，et al.，Phytochemistry，1995，39(3)，695～699
生测方法：
1、半叶法。
供试毒源：1)、烟草花叶病毒TMV(tobacco mosaic virus)；2)、马铃薯Y病毒PVY(Potato Virus Y)。
供试植物：三生烟(Nicotiana tabacum cv.Samsum，TMV系统寄主，用于繁殖毒源)；珊西烟(N.Tabacum cv.Xanthi-NC，TMV枯叶寄主，用于抗病毒生物活性测定)。
病毒接种：用汁液磨擦接种法。取新鲜典型TMV病毒症状的三生烟病叶，加入磷酸缓冲溶液(0.01M，pH 7.2)，在研钵中研碎，然后用沸水煮过的截头毛笔蘸取汁液，在撒有金刚砂的珊西烟叶面上接种，并用清水快速冲洗，静置片刻后再移动。
样品处理：TMV接种1.5～2小时后，剪下接种叶片，沿着叶片主脉剪成两个相等半叶，一半叶片用不同化合物浸叶处理，另一半叶片浸于清水作对照，72小时后调查统计半叶枯斑数。抑制百分率按下面公式计算：
所提取的混合物及分离的化合物的生物活性测试结果见表2。
表2抗烟草花叶病毒活性
| 试验化合物 | 浓度ppm | 枯斑抑制率％ |
| 1 | 1 | 60 |
| 1 | 10 | 65 |
| 1 | 50 | 80 |
| 2 | 500 | 40 |
| 总碱 | 50 | 70～80 |
| 粗提物 | 500 | 70～90 |
| 病毒A | 500 | 40～50 |
| 病毒唑 | 500 | 40～50 |
| DADHT* | 500 | 50 |
| DHT** | 500 | 50 |
*DADHT：1，5-二乙酰基-2，4-二氧六氢-1，3，5-三嗪
**DHT：2，4-二氧六氢-1，3，5-三嗪
2、植株法：
利用植株法测试了牛心朴子草的粗提物与DADHT的防治TMV和PVY的活性，方法如下：
A先接种后喷药，病毒接种同半叶法，TMV接种1.5～2小时后，喷施不同浓度的有机化合物，另设清水对照，72小时后调查统计叶片枯斑数；
B先喷药后接种，先喷施化合物24小时后，接种TMV病毒(方法同半叶法)，另设清水作对照，72小时后调查统计叶片枯斑数。
试验结果见表3。
表3粗提物盆栽试验结果，500ppm
Claims (3)
1、一种主要成分是下述生物碱化合物的牛心朴子草提取液的应用，其特征在于它用于植物病毒病的抑制：
X＝H、OCH3；Y＝O、电子对。
2、按照权利要求1所说的牛心朴子草提取液的应用，其特征在于它用于烟草花叶病毒或马铃薯Y病毒的抑制。
3、按照权利要求1或2所说的牛心朴子草提取液的应用，其特征在于它的有效活性成分是7-脱甲氧基娃儿藤碱，使用浓度是1-1000ppm。
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