CN108409539A - 一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法与用途 - Google Patents

一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，条斑紫菜干粉末加无水甲醇浸提，减压蒸干得浸膏；浸膏加甲醇醇沉得上清；上清液乙酸乙酯萃取得抑藻组份B、C和D，采用硅胶柱层析进行分离得抑藻组份B2、B4、C1、C2、D3和D4，硅胶柱层析再次分离得抑藻组份B21、B23、B41、B42、C11和C12，除组份B21继续进行硅胶柱层析分离外，其余组份采用硅胶薄层层析进行制备；再分离得5个薄层纯抑藻倍半萜类化合物。本发明采用活性追踪法，通过甲醇浸提、液液萃取、硅胶柱层析和薄层层析制备等方法，从条斑紫菜中纯化制备具有抑制赤潮微藻活性的倍半萜类化合物。其方法设计合理，可操作性强，制得的化合物的抑微活性好。

Description

一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法与用途
技术领域
本发明及一种抑藻活性化合物的制备方法，特别是一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，本发明还涉及前述制得的化合物的用途，属于海洋生化工程领域。
背景技术
倍半萜是一类由15个碳组成骨架的萜类化合物，在自然界中分布广泛，具有较强的抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗疟等生理活性。然而，从海藻中分离得到的倍半萜类化合物，活性报道较少，仅见凹顶藻属（Laurencia sp.）中的倍半萜类化合物具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒等活性的报道。例如，三列凹顶藻（Laurencia tristicha）、冈村凹顶藻（Laurencia okamurai Yamada）、L. Claviformis、L. Majuscula、L. yonaguniensis Masuda et Abe、L. obtusa (Hudson) Lamouroux和L. obtusa (Hudson) Lamouroux等凹顶藻，未见倍半萜类化合物的抑藻活性研究。条斑紫菜（Porphyra yezoensis）是我国北方分布广泛的一种经济海藻，其研究主要集中在种质鉴定、培育、生长，以及多糖和藻胆蛋白等生化成分的分离及其活性方面。目前，国内外尚未见条斑紫菜倍半萜类化合物的纯化制备。
研究表明，开放海域大规模养殖条斑紫菜，能够有效缓解海水富营养化，控制赤潮微藻爆发性繁殖。在前期工作中，我们发现条斑紫菜中含有能明显抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻等赤潮微藻生长的抑藻活性物质。然而，目前，国内外尚未见条斑紫菜抑藻活性物质的分离纯化和结构鉴定。因此，条斑紫菜中是否存在具有抑藻活性的倍半萜类化合物尚未可知。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，可以制得多种有抑藻活性的化合物。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供前述抑藻活性化合物的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其特点是，其步骤如下：
（1）条斑紫菜干粉末加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，获得浸提液；反复浸提3次，合并浸提液；经过滤和减压蒸干，制备到条斑紫菜浸膏；浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液；上清液进行抑藻活性检测具有抑制米氏凯伦藻的生长的活性；
（2）将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次；上层减压蒸干，获得组份A；下层减压蒸发出乙酸乙酯后，调节其pH为7，加入乙酸乙酯萃取3次，上层减压蒸干，获得组份B；下层pH调节到2，乙酸乙酯萃取3次，上层和下层分别减压蒸干，获得组份C和组份D；组份B、C和D进行抑藻活性检测具有抑制米氏凯伦藻的生长的活性；
（3）组份B、C和D采用硅胶柱层析进行分离，组份B获得4个再分组份，B1、B2、B3和B4；组份C获得2个再分组份，C1和C2；组份D获得9个再分组份，D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9；分别进行抑藻活性检测，其中6个再分组份B2、B4、C1、C2、D3和D4具有明显的抑制米氏凯伦藻活性，此6个活性组份采用硅胶柱层析进行再次分离，依次得到组份B21、B22、B23、B41、B42，B43，C11、C12和C21；D31和D41共11个组份，其中组份B21、B23、B41、B42、C11和C12具有显著抑制米氏凯伦藻的生长的活性，除组份B21继续进行硅胶柱层析分离外，其余组份采用硅胶薄层层析进行制备；B21经硅胶柱层析分离，得到B211和B212；B23、B41、B42、C11和C12经薄层层析制备，得到B231、B411、B421、C112和C121；其中B211、B212、B231、C112和C121共5个组份具有抑制米氏凯伦藻的生长的活性，且其纯度已达薄层纯；经结构鉴定，B211、B212、B231、C112和C121分别为Gossonorol、7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol、cyclonerodiol、杜松醇和4-杜松烯-1-醇，均为倍半萜类化合物。各化合物的结构如下：
本发明所述的条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其进一步优选的技术方案是，步骤（3）中：组份B、C和D采用硅胶柱层析进行分离，洗脱液分别为体积比是6:1二氯甲烷/甲醇、4:1的二氯甲烷/甲醇和4:1的甲醇/水，流速为1.0 mL/min，洗脱2倍柱体积。
本发明所述的条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其进一步优选的技术方案是，步骤（3）中：再分组份B2和B4，C1和C2，以及D3和D4采用硅胶柱层析分离，洗脱液分别为体积比是6:1二氯甲烷/甲醇，16:1的二氯甲烷/甲醇和1:1的二氯甲烷/甲醇；经过分离，获得B21、B22、B23、B41、B42、B43、C11、C12、C21、D31和D41共11个组份。
本发明所述的条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其进一步优选的技术方案是，步骤（3）中：组份B21进行硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比是12:1的二氯甲烷/甲醇，获得2个组份B211和B212；B23、B41、B42、C11和C12采用划线法，加载于硅胶薄层层析预制板上，分别以体积比是8:1的氯仿/甲醇和6:1氯仿/甲醇为展开剂，制备到组份B211、B212、B231、C112和C121。
以上所述的一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法制得的倍半萜类化合物B211、B212、B231、C112和C121中的一种或几种在制备抑制米氏凯伦藻的生长组合物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用活性追踪法，通过甲醇浸提、液液萃取、硅胶柱层析和薄层层析制备等方法，从条斑紫菜中纯化制备具有抑制赤潮微藻活性的倍半萜类化合物。其方法设计合理，可操作性强，制得的化合物的抑微活性好。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法：
（1）条斑紫菜干粉末加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，获得浸提液。反复浸提3次，合并浸提液。经过滤和减压蒸干，制备到条斑紫菜浸膏。此浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。取适量此上清液减压蒸干后，溶解于甲醇，此甲醇溶液进行抑藻活性检测，结果表明，它显著抑制了米氏凯伦藻的生长；
（2）将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次。上层减压蒸干，获得组份A。下层减压蒸发出乙酸乙酯后，调节其pH为7，加入乙酸乙酯萃取3次，上层减压蒸干，获得组份B；将下层pH调节到2，乙酸乙酯萃取3次，上层和下层分别减压蒸干，获得组份C和组份D。上述4种组份分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。此4种组份中，除组份A外，其余3种组份均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用；
（3）前述3个组份采用硅胶柱层析进行分离，分离后，组份B获得4个再分组份，B1、B2、B3和B4；组份C获得2个再分组份，C1和C2；组份D获得9个再分组份，D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9；。抑藻活性检测表明，此15个组份中，仅6个再分组份（B2、B4、C1、C2、D3和D4）具有明显的抑藻活性。在此基础上，此6个活性组份采用硅胶柱层析进行再次分离。经过分离，依次得到B21、B22、B23、B41、B42和B43；C11、C12和C21；D31和D41等11个组份。其中，组份B21、B23、B41、B42、C11和C12较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。除组份B21继续进行硅胶柱层析分离外，其余组份采用硅胶薄层层析进行制备。经硅胶柱层析分离，制备到样品B211和B212；经薄层层析制备，得到样品B231、B411、B421、C112和C121。此7个样品中，B211、B212、B231、C112和C121等5个样品能明显抑制米氏凯伦藻的生长。纯度检测表明，它们的纯度已达薄层纯。经结构鉴定，此5个样品分别为Gossonorol、7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol、cyclonerodiol、杜松醇和4-杜松烯-1-醇，均为倍半萜类化合物。
实施例2，一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法：
条斑紫菜干品粉碎成0.3 mm粉末，加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，反复浸提3次，合并浸提液。经过滤和减压蒸干，制备到条斑紫菜浸膏。此浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。取适量此上清液，60℃下减压蒸干后，溶解于甲醇，进行抑藻活性检测（本发明中，除特别说明外，抑藻活性检测方法相同）。在96孔板上，1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板在光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。结果表明，此上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长；用1.0 mol/L氢氧化钠溶液将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次。上层40℃下减压蒸干，获得组份A。下层40℃下减压蒸发出乙酸乙酯后，调节其pH为7，加入乙酸乙酯萃取3次，上层40℃下减压蒸干，获得组份B；用1.0 mol/L盐酸将下层pH调节到2，加入乙酸乙酯萃取3次。萃取完成后，上层和下层分别在40℃和60℃下减压蒸干，依次获得组份C和组份D。上述4种组份分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。除组份A外，组份B、组份C和组份D均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用；
此组份B、组份C和组份D 3个组份采用硅胶（200-300目）柱层析进行分离，洗脱液分别为二氯甲烷/甲醇（6:1，体积比，下同）、二氯甲烷/甲醇（4:1）和甲醇/水（4:1）。洗脱2倍柱体积后，所得馏分在40℃或60℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测。合并相同馏分后，40℃或60℃下减压蒸干，获得15个再分组份，B1、B2、B3和B4；C1和C2；D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9。取适量上述15个再分组份重新溶解于无水甲醇中，进行抑藻活性检测。结果表明，B2、B4、C1、C2、D3和D4等6个再分组份对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。将此6个再分组份分别溶解于甲醇后，再次加载于硅胶（100-200目）柱层析上，洗脱液分别为二氯甲烷/甲醇（6:1）、二氯甲烷/甲醇（16:1）和二氯甲烷/甲醇（1:1）。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，获得11个组份，B21、B22、B23、B41、B42和B43；C11、C12和C21；D31和D41。40℃下减压蒸干后，此11个组份重新溶解于甲醇。抑藻活性检测结果表明，组份B21、B23、B41、B42、C11和C12较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。此6个组份中，组份B21继续进行硅胶（100-200目）柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷/甲醇（12:1）。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，获得2个样品B211和B212；其余5个组份，采用划线法，加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上，分别以氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（6:1）和氯仿/甲醇（6:1）为展开剂。经展开，此5个组份分别在硅胶预制板上呈现1个清晰且明显的条带。将条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，经过滤和40℃下减压蒸干后，制备到样品B231、B411、B421、C112和C121。抑藻活性检测结果表明，此7个样品中，B211、B212、B231、C112和C121对米氏凯伦藻的生长表现出明显的抑制作用。取适量上述5种抑藻活性样品（B211、B212、B231、C112和C121），溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5个样品均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5个样品同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。采用HR-ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR光谱测定，样品B211、B212、B231、C112和C121依次为Gossonorol、7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol、cyclonerodiol、杜松醇和4-杜松烯-1-醇，均为倍半萜类化合物。
实施例3，一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法：
称取条斑紫菜干粉末1500 g，加入3.0 L无水甲醇，室温（15-20℃）浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液（浸提共3次）。经过滤和减压蒸干，制备到条斑紫菜浸膏34.74 g。向此浸膏中加入200 mL90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液180 mL。
取上清液1 mL，60℃下减压蒸干后，溶解于20 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。在96孔板上，将1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板放置于光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。当浓度为400 µg/mL时，此甲醇溶液对米氏凯伦藻的生长抑制率为53.75%（第8d）。结果表明，条斑紫菜浸膏上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长。用1.0 mol/L氢氧化钠溶液将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次（90 mL、45 mL和45mL）。上层40℃下减压蒸干，获得1.74 g组份A。下层40℃下减压蒸发出乙酸乙酯后，调节其pH为7，加入乙酸乙酯萃取3次（125 mL、65mL和60 mL），上层40℃下减压蒸干，获得1.89 g组份B；用1.0 mol/L盐酸将下层pH调节到2，加入乙酸乙酯萃取3次（125 mL、65mL和60 mL）。萃取完成后，上层和下层分别在40℃和60℃下减压蒸干，依次获得1.18 g组份C和14.05 g组份D。分别称取10 mg上述4种组份，分别溶解于1 mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行抑藻活性检测。在浓度100 µg/mL时，除组份A外，组份B、组份C和组份D均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用。
将组份B、组份C和组份D分别溶解于5 mL、3 mL和20 mL甲醇中，进行硅胶柱层析分离。组份B加载于硅胶柱（200-300目，2.0×40 cm）上，以二氯甲烷/甲醇（6:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份C采用硅胶柱层析（200-300目，2.0×30 cm）进行分离，二氯甲烷/甲醇（4:1）洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份D采用硅胶柱层析（200-300目，6.0×80 cm）进行分离，甲醇/水（4:1），流速1.0 mL/min，每个馏分40 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测。合并相同馏分后，40℃或60℃下减压蒸干，获得15个再分组份，B1、B2、B3和B4；C1和C2；D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9。上述15个再分组份分别称取10 mg，依次溶解于1 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度100 µg/mL时，再分组份B2、B4、C1、C2、D3和D4对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。
将此6个再分组份分别溶解于2 mL、2 mL、5 mL和5 mL甲醇后，再次加载于硅胶（100-200目）柱层析上（2.0×40 cm）。再分组份B2和B4以二氯甲烷/甲醇（6:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL；再分组份C1和C2以二氯甲烷/甲醇（16:1）为洗脱液，流速1.0mL/min，每个馏分10 mL；再分组份D3和D4以二氯甲烷/甲醇（1:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分20 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，获得11个组份，B21、B22、B23、B41、B42和B43；C11、C12和C21；D31和D41。分别称取5 mg此11个组份，分别溶解于0.5 mL甲醇中，进行抑藻活性检测。抑藻活性检测结果表明，在浓度100 µg/mL时，组份B21、B23、B41、B42、C11和C12较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。此6个组份分别溶解于2 mL甲醇，组份B21继续进行硅胶（100-200目）柱层析（1.0×30cm）分离，洗脱液为二氯甲烷/甲醇（12:1），流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，获得2个样品B211（0.016g）和B212（0.007 g）；组份B23、B41、B42、C11和C12，采用划线法，分别加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上进行纯化制备，展开剂依次为氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（6:1）和氯仿/甲醇（6:1）。经展开，此5个组份分别在硅胶预制板上呈现1个清晰且明显的条带。将条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，经过滤和40℃下减压蒸干后，制备到样品B231（0.010 g）、B411（0.012 g）、B421（0.016 g）、C112（0.018 g）和C121（0.015g）。分别称取2 mg此7个样品，分别溶解于0.2 mL甲醇后，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度为50 µg/mL时，B231、B411、B421、C112和C121等5个样品较为明显地抑制了米氏凯伦藻的生长。取适量上述5种抑藻活性样品（B231、B411、B421、C112和C121），溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5个样品均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5个样品同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。采用HR-ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR光谱测定，样品B211、B212、B231、C112和C121依次为Gossonorol、7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol、cyclonerodiol、杜松醇和4-杜松烯-1-醇，均为倍半萜类化合物。
实施例4，一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法：
称取条斑紫菜干粉末2500 g，加入6 L无水甲醇，室温（15-20℃）浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液（浸提共3次）。经过滤和减压蒸干，制备到条斑紫菜浸膏55.0 g。向此浸膏中加入300 mL90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液280 mL。取此上清液1 mL，60℃下减压蒸干后，溶解于20 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。在96孔板上，将1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板放置于光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。当浓度为400 µg/mL时，此甲醇溶液对米氏凯伦藻的生长抑制率为52.54%（第8d）。结果表明，条斑紫菜浸膏上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长。用1.0 mol/L氢氧化钠溶液将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次（140 mL、70 mL和70 mL）。上层40℃下减压蒸干，获得2.75 g组份A。下层40℃下减压蒸发出乙酸乙酯后，调节其pH为7，加入乙酸乙酯萃取3次（125 mL、65mL和60 mL），上层40℃下减压蒸干，获得3.0 g组份B；用1.0 mol/L盐酸将下层pH调节到2，加入乙酸乙酯萃取3次（125 mL、65mL和60 mL）。萃取完成后，上层和下层分别在40℃和60℃下减压蒸干，依次获得1.88 g组份C和22.25 g组份D。分别称取10 mg上述4种组份，分别溶解于1 mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行抑藻活性检测。在浓度100 µg/mL时，除组份A外，组份B、组份C和组份D均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用。
将组份B、组份C和组份D分别溶解于5 mL、3 mL和20 mL甲醇中，进行硅胶柱层析分离。组份B加载于硅胶柱（200-300目，2.0×40 cm）上，以二氯甲烷/甲醇（6:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份C采用硅胶柱层析（200-300目，2.0×30 cm）进行分离，二氯甲烷/甲醇（4:1）洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份D采用硅胶柱层析（200-300目，6.0×80 cm）进行分离，甲醇/水（4:1），流速1.0 mL/min，每个馏分40 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测。合并相同馏分后，40℃或60℃下减压蒸干，获得15个再分组份，B1、B2、B3和B4；C1和C2；D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9。上述15个再分组份分别称取10 mg，依次溶解于1 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度100 µg/mL时，再分组份B2、B4、C1、C2、D3和D4对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。将此6个再分组份分别溶解于2 mL、2 mL、5 mL和5 mL甲醇后，再次加载于硅胶（100-200目）柱层析上（2.0×40 cm）。再分组份B2和B4以二氯甲烷/甲醇（6:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL；再分组份C1和C2以二氯甲烷/甲醇（16:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL；再分组份D3和D4以二氯甲烷/甲醇（1:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分20 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，获得11个组份，B21、B22、B23、B41、B42和B43；C11、C12和C21；D31和D41。分别称取5 mg此11个组份，分别溶解于0.5 mL甲醇中，进行抑藻活性检测。抑藻活性检测结果表明，在浓度100 µg/mL时，组份B21、B23、B41、B42、C11和C12较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。
6个组份分别溶解于2 mL甲醇，组份B21继续进行硅胶（100-200目）柱层析（1.0×30cm）分离，洗脱液为二氯甲烷/甲醇（12:1），流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，获得2个样品B211（0.027g）和B212（0.011 g）；组份B23、B41、B42、C11和C12，采用划线法，分别加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上进行纯化制备，展开剂依次为氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（6:1）和氯仿/甲醇（6:1）。经展开，此5个组份分别在硅胶预制板上呈现1个清晰且明显的条带。将条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，经过滤和40℃下减压蒸干后，制备到样品B231（0.018 g）、B411（0.020 g）、B421（0.027 g）、C112（0.030 g）和C121（0.025g）。分别称取2 mg此7个样品，分别溶解于0.2 mL甲醇后，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度为50 µg/mL时，B231、B411、B421、C112和C121等5个样品较为明显地抑制了米氏凯伦藻的生长。取适量上述5种抑藻活性样品（B231、B411、B421、C112和C121），溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5个样品均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5个样品同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。采用HR-ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR光谱测定，样品B211、B212、B231、C112和C121依次为Gossonorol、7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol、cyclonerodiol、杜松醇和4-杜松烯-1-醇，均为倍半萜类化合物。
实施例5，一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法：
称取条斑紫菜干粉末5000 g，加入10 L无水甲醇，室温（15-20℃）浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液（浸提共3次）。经过滤和减压蒸干，制备到条斑紫菜浸膏104.76 g。向此浸膏中加入600 mL90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液550 mL。取此上清液1 mL，60℃下减压蒸干后，溶解于20 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。在96孔板上，将1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板放置于光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。当浓度为400 µg/mL时，此甲醇溶液对米氏凯伦藻的生长抑制率为55.56%（第8d）。结果表明，条斑紫菜浸膏上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长。用1.0 mol/L氢氧化钠溶液将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次（125 mL、65mL和60 mL）。上层40℃下减压蒸干，获得5.24 g组份A。下层40℃下减压蒸发出乙酸乙酯后，调节其pH为7，加入乙酸乙酯萃取3次（125 mL、65mL和60 mL），上层40℃下减压蒸干，获得5.71 g组份B；用1.0 mol/L盐酸将下层pH调节到2，加入乙酸乙酯萃取3次（125 mL、65mL和60 mL）。萃取完成后，上层和下层分别在40℃和60℃下减压蒸干，依次获得3.57 g组份C和42.38 g组份D。分别称取10 mg上述4种组份，分别溶解于1 mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行抑藻活性检测。在浓度100 µg/mL时，除组份A外，组份B、组份C和组份D均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用。
将组份B、组份C和组份D分别溶解于5 mL、3 mL和20 mL甲醇中，进行硅胶柱层析分离。组份B加载于硅胶柱（200-300目，2.0×40 cm）上，以二氯甲烷/甲醇（6:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份C采用硅胶柱层析（200-300目，2.0×30 cm）进行分离，二氯甲烷/甲醇（4:1）洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份D采用硅胶柱层析（200-300目，6.0×80 cm）进行分离，甲醇/水（4:1），流速1.0 mL/min，每个馏分40 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测。合并相同馏分后，40℃或60℃下减压蒸干，获得15个再分组份，B1、B2、B3和B4；C1和C2；D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9。上述15个再分组份分别称取10 mg，依次溶解于1 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度100 µg/mL时，再分组份B2、B4、C1、C2、D3和D4对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。将此6个再分组份分别溶解于2 mL、2 mL、5 mL和5 mL甲醇后，再次加载于硅胶（100-200目）柱层析上（2.0×40 cm）。再分组份B2和B4以二氯甲烷/甲醇（6:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL；再分组份C1和C2以二氯甲烷/甲醇（16:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL；再分组份D3和D4以二氯甲烷/甲醇（1:1）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分20 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，获得11个组份，B21、B22、B23、B41、B42和B43；C11、C12和C21；D31和D41。分别称取5 mg此11个组份，分别溶解于0.5 mL甲醇中，进行抑藻活性检测。抑藻活性检测结果表明，在浓度100 µg/mL时，组份B21、B23、B41、B42、C11和C12较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。
6个组份分别溶解于2 mL甲醇，组份B21继续进行硅胶（100-200目）柱层析（1.0×30cm）分离，洗脱液为二氯甲烷/甲醇（12:1），流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，获得2个样品B211（0.056g）和B212（0.024 g）；组份B23、B41、B42、C11和C12，采用划线法，分别加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上进行纯化制备，展开剂依次为氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（8:1）、氯仿/甲醇（6:1）和氯仿/甲醇（6:1）。经展开，此5个组份分别在硅胶预制板上呈现1个清晰且明显的条带。将条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，经过滤和40℃下减压蒸干后，制备到样品B231（0.038 g）、B411（0.042 g）、B421（0.057 g）、C112（0.063 g）和C121（0.052g）。分别称取2 mg此7个样品，分别溶解于0.2 mL甲醇后，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度为50 µg/mL时，B231、B411、B421、C112和C121等5个样品较为明显地抑制了米氏凯伦藻的生长。取适量上述5种抑藻活性样品（B231、B411、B421、C112和C121），溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5个样品均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5个样品同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。采用HR-ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR光谱测定，样品B211、B212、B231、C112和C121依次为Gossonorol、7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol、cyclonerodiol、杜松醇和4-杜松烯-1-醇，均为倍半萜类化合物。

Claims (5)

1.一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）条斑紫菜干粉末加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，获得浸提液；反复浸提3次，合并浸提液；经过滤和减压蒸干，制备到条斑紫菜浸膏；浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液；上清液进行抑藻活性检测具有抑制米氏凯伦藻的生长的活性；
（2）将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次；上层减压蒸干，获得组份A；下层减压蒸发出乙酸乙酯后，调节其pH为7，加入乙酸乙酯萃取3次，上层减压蒸干，获得组份B；下层pH调节到2，乙酸乙酯萃取3次，上层和下层分别减压蒸干，获得组份C和组份D；组份B、C和D进行抑藻活性检测具有抑制米氏凯伦藻的生长的活性；
（3）组份B、C和D采用硅胶柱层析进行分离，组份B获得4个再分组份，B1、B2、B3和B4；组份C获得2个再分组份，C1和C2；组份D获得9个再分组份，D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9；分别进行抑藻活性检测，其中6个再分组份B2、B4、C1、C2、D3和D4具有明显的抑制米氏凯伦藻活性，此6个活性组份采用硅胶柱层析进行再次分离，依次得到组份B21、B22、B23、B41、B42，B43，C11、C12和C21；D31和D41共11个组份，其中组份B21、B23、B41、B42、C11和C12具有显著抑制米氏凯伦藻的生长的活性，除组份B21继续进行硅胶柱层析分离外，其余组份采用硅胶薄层层析进行制备；B21经硅胶柱层析分离，得到B211和B212；B23、B41、B42、C11和C12经薄层层析制备，得到B231、B411、B421、C112和C121；其中B211、B212、B231、C112和C121共5个组份具有抑制米氏凯伦藻的生长的活性，且其纯度已达薄层纯；经结构鉴定，B211、B212、B231、C112和C121分别为Gossonorol、7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol、cyclonerodiol、杜松醇和4-杜松烯-1-醇，均为倍半萜类化合物。
2.根据权利要求1所述的条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中：组份B、C和D采用硅胶柱层析进行分离，洗脱液分别为体积比是6:1二氯甲烷/甲醇、4:1的二氯甲烷/甲醇和4:1的甲醇/水，流速为1.0 mL/min，洗脱2倍柱体积。
3.根据权利要求1所述的条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中：再分组份B2和B4，C1和C2，以及D3和D4采用硅胶柱层析分离，洗脱液分别为体积比是6:1二氯甲烷/甲醇，16:1的二氯甲烷/甲醇和1:1的二氯甲烷/甲醇；经过分离，获得B21、B22、B23、B41、B42、B43、C11、C12、C21、D31和D41共11个组份。
4.根据权利要求1所述的条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中：组份B21进行硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比是12:1的二氯甲烷/甲醇，获得2个组份B211和B212；B23、B41、B42、C11和C12采用划线法，加载于硅胶薄层层析预制板上，分别以体积比是8:1的氯仿/甲醇和6:1氯仿/甲醇为展开剂，制备到组份B211、B212、B231、C112和C121。
5.权利要求1－4中任何一项所述的一种条斑紫菜倍半萜类抑藻活性化合物的制备方法制得的倍半萜类化合物B211、B212、B231、C112和C121中的一种或几种在制备抑制米氏凯伦藻的生长组合物中的用途。
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