DE112011103342T5

DE112011103342T5 - Stickstoffoxid-Abgabesysteme unter Verwendung von wärmeempfindlichen svnthetischen Polymeren

Info

Publication number: DE112011103342T5
Application number: DE112011103342T
Authority: DE
Inventors: Won-Jong Kim; Yanggy Lee; Kwideok Park; Jihoon Kim; Dong-Keun Han
Original assignee: Academy Industry Foundation of POSTECH
Current assignee: Academy Industry Foundation of POSTECH
Priority date: 2010-10-04
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2013-07-25
Also published as: CN103153342B; JP2013540132A; KR20120035044A; CN103153342A; WO2012046994A9; JP5689972B2; US9212259B2; KR101255337B1; WO2012046994A3; WO2012046994A2; US20130189340A1

Abstract

Ein Donor, der zur gezielten Freisetzung von Stickstoffmonoxid befähigt ist, und ein prothetisches Implantat, dessen Oberfläche mit diesem Donor beschichtet ist, werden offenbart. Der Donor umfasst eine Hauptkette aus einem organischen Polymer und eine Seitenkette, die kovalent an die Hauptkette gebunden ist und eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe aufweist. Der Donor für die gezielte Freisetzung von Stickstoffmonoxid liegt bei Raumtemperatur in einem fluiden Zustand, wie als Flüssigkeit, vor und erfährt bei physiologischen pH-Werten, wenn die Temperatur über die kritische Temperatur hinaus steigt, einen Sol-Gel-Phasenübergang. Die kritische Temperatur des Phasenübergangs liegt im Bereich von 25 bis 35°C, und das Gel ist ein Hydrogel ohne chemische Vernetzungen.

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Stickstoffoxid-Donor und insbesondere auf ein wärmeempfindliches Stickstoffoxid-freisetzendes Polymer, das zur gezielten Freisetzung von Stickstoffmonoxid befähigt ist.
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung ist das Ergebnis der Durchführung des vielversprechenden und bahnbrechenden Forschungsprojekts, das unter Führung des koreanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Technik und vom 1. April 2010 bis 28. Februar 2011 vom Korea Institute of Science and Technology durchgeführt wurde, und den Titel "Entwicklung eines Stickstoffoxidfreisetzenden blutverträglichen Stents (Zuordnungs-Nr. 20100002175)" trug.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein Biomodulator, der auf einer Vielzahl von Gebieten Wirksamkeit zeigt. Im Jahre 1992 wurde NO vom American Journal of Science als ”Molekül des Jahres” nominiert und war der Hauptforschungsgegenstand des 1998 verliehenen Nobelpreises für Physiologie und Medizin. NO wirkt im menschlichen Körper als signalgebendes Molekül und entsteht auch als Produkt einer Immunreaktion. Physiologische Wirkungen von NO umfassen die Ausdehnung von Blutgefäßen, Neurotransmission, Regulation des Haarzyklus, Erzeugung von reaktiven Stickstoff enthaltenden Zwischenstufen, die Regulation der männlichen Erektion, antibakterielle Wirkungen, antivirale Wirkungen und Wundheilung.
Unter diesen physiologischen Wirkungen von NO hat die Ausdehnung von Blutgefäßen viel Aufmerksamkeit erregt. In Gefäßendothelzellen übermittelt NO ein Signal für die Entspannung der Zellen der umgebenden glatten Muskulatur, wodurch sich Blutgefäße ausdehnen und mehr Blut hindurchfließt. Außerdem verhindert NO die Kontraktion und das Wachstum der glatten Muskulatur der Gefäße und verhindert die Aggregation von Blutplättchen in Endothelien und die Adhäsion von weißen Blutkörperchen an Endothelien, was zur Erhaltung der Homöostase von Blutgefäßen beiträgt.
Eine Angioplastie, die einen Stenteinsatz begleitet, wird bei Patienten durchgeführt, deren Koronarblutgefäße aufgrund einer Akkumulation von Fettmasse in denselben blockiert sind. Bei einem Angioplastieverfahren wird ein kleiner Ballon in ein Blutgefäß eingesetzt und dann aufgeblasen, wodurch die Fettmasse fest gegen die Wände des Blutgefäßes gepresst wird und das Blutgefäß daher aufgeweitet wird. Dabei wird ein röhrenförmiges Netzgerüst, so genannter ”Stent”, in das Blutgefäß eingesetzt, wodurch die Erweiterung des Blutgefäßes zwangsweise aufrechterhalten wird. In einigen Fällen verengt sich das Blutgefäß wieder, was eine weitere Angioplastie-Operation notwendig macht. Wenn man Mittel finden kann, um Wirkstoffe wie NO, die Zellwachstum und Entzündung verhindern können, kontrolliert aus einem Stent freizusetzen, kann dies daher signifikant zu einem erfolgreichen Angioplastieverfahren beitragen.
Es gibt verschiedene Verbindungen, die NO aus der Oberfläche eines künstlichen Implantats, wie eines Stents, freisetzen können. Beispiele für die Verbindungen sind organische Nitrate, Ester, Eisen-Nitrosyl-Komplexe, Sydnonimin, C-Nitroso-Verbindungen und S-Nitrosothiole (R-S-NO). Insbesondere die Erforschung von S-Nitrosothiolen wird aktiv durchgeführt. Leider gibt es Fälle, bei denen Implantate, die solche Verbindungen beherbergen, kein NO in den menschlichen Körper freisetzten, und die NO-Freisetzungsgeschwindigkeit wird durch die Konzentration von Kupferionen (Cu⁺) beeinflusst. Außerdem sind S-Nitrosothiole selbst nicht stabil und somit schwierig in einer reinen Form zu erhalten.
Daher wird seit Kurzem die Erforschung eines neuen Materials, das NO effizienter freisetzen kann, und eines Verfahrens der effizienteren Freisetzung von NO aktiv durchgeführt. Wenn die Freisetzung von NO effizienter durchgeführt wird, muss ein künstliches Implantat außerdem ein Teil umfassen, mit dem die Freisetzungsgeschwindigkeit, die auf einer Oberfläche des künstlichen Implantats auftritt, eingestellt werden kann.
Eine hohe Konzentration von NO ist toxisch, und da es sich dabei um einen Vasodilatator handelt, kann ein Überschuss an NO im menschlichen Körper einen vollständigen Kollaps des Kreislaufsystems verursachen. Eine erhebliche Verbesserung der Leistungsfähigkeit von prothetischen Implantaten kann also erreicht werden, indem man ein Abgabesystem zur Freisetzung von NO entwickelt, das als Reaktion auf Signale aus der Umgebung eine geeignete Konzentration an NO mit einer geeigneten Geschwindigkeit freisetzt oder, wenn notwendig, seine Freisetzung unterdrückt oder verzögert, wobei seine Freisetzungscharakteristik durch ein unerwünschtes Rauschen aus der Umgebung nicht beeinflusst wird. Wenn herkömmliche NO-Abgabesysteme verwendet werden, wird in einem frühen Stadium ein Überschuss an NO freigesetzt, und somit ist es schwierig, eine nachhaltige Freisetzung von NO zu erreichen.
Offenbarung der Erfindung
Technisches Problem
Die vorliegende Erfindung stellt einen polymeren Stickstoffmonoxid-Donor bereit, der zu einer verzögerten oder gezielten Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus einem prothetischen Implantat innerhalb des Körpers befähigt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein prothetisches Implantat bereit, das den polymeren Stickstoffmonoxid-Donor auf seiner Oberfläche umfasst.
Lösung des Problems
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Donor für die gezielte Freisetzung von Stickstoffoxid bereitgestellt. Der Donor ist ein Polymer, das eine Hauptkette aus einem organischen Polymer und eine Seitenkette, die kovalent an die Hauptkette gebunden ist und eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe aufweist, umfasst. Der Donor liegt bei Raumtemperatur in einem fluiden Zustand, beispielsweise als Flüssigkeit, vor und erfährt bei in-vivo-pH-Werten, wenn die Temperatur über eine kritische Temperatur hinaus steigt, einen Sol-Gel-Phasenübergang. Die kritische Temperatur des Phasenübergangs liegt in einem Bereich von 25 bis 35°C, und das Gel ist ein Hydrogel ohne chemische Vernetzungen.
Um ein solches Hydrogel zu erhalten, kann das Kohlenstoffgerüst der Hauptkette des Donors ein Blockcopolymer sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Ethylenglycol/Propylenglycol-Copolymer, einem Lactat/Glycolat-Copolymer, einem Lactat/Ethylenglycol-Copolymer, einem Lactat-Glycolat-Ethylenglycol-Copolymer, einem Lactat-Glycolat-Propylenglycol-Ethylenglycol-Copolymer, einem ε-Caprolacton/Ethylenglycol-Copolymer, einem 3-Hydroxybutyrat/Propylenglycol-Copolymer, einem Propylenfumarat/Ethylenglycol-Copolymer, einem Organophosphagen/Ethylenglycol-Copolymer und einem Blockcopolymer auf Polypeptidbasis besteht.
Die Seitenkette des Donors kann ein Polymer sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus sekundäres Amin enthaltenden Polymeren, wie Polyethyleniminen, Polypropyleniminen und sekundäres Amin enthaltenden Polypeptiden, sowie Biopolymeren, wie Chitosan, besteht.
Der Donor kann weiterhin ein pharmazeutisch aktives Material im Hydrogel umfassen. Das pharmazeutisch aktive Material kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus einem Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), einem entzündungshemmenden Mittel, Vitamin C, Acetylsalicylat, einem cholesterinsenkenden Wirkstoff, einem thrombolytischen Mittel, einem antithrombotischen Mittel, Heparin, Krebsmedikamenten und Oligonucleotiden mit antiproliferativer Aktivität besteht.
Es ist auch möglich, dass das pharmazeutisch aktive Material nicht direkt kovalent an den Donor gebunden, sondern im Hydrogel dispergiert ist, oder es kann ein Konjugat bilden und kovalent an Sauerstoffatome der funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe der Seitenkette des Donors gebunden sein.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein prothetisches Implantat bereitgestellt, das einen auf seine Oberfläche aufgetragenen Donor umfasst.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Gemäß einer oder mehreren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein Donor für die gezielte Freisetzung von Stickstoffoxid in Form eines wärmeempfindlichen Hydrogels bereitgestellt. Der Donor kann Stickstoffmonoxid in vivo stabil und biokompatibel über einen langen Zeitraum bereitstellen. Es ist zu erwarten, dass der Donor und ein prothetisches Implantat, das den Donor auf seine Oberfläche aufgetragen umfasst, in medizinischen und Gesundheitsanwendungen verbreitet verwendet werden, zum Beispiel bei der Behandlung von ischämischen Störungen, wie Arteriosklerose, Regulation der männlichen Erektion, antibakterieller und antiviraler Behandlungen sowie Wundheilung.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein schematisches Diagramm, das einen Reaktor zeigt, der zum Synthetisieren einer funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe der Seitenkette, die den Stickstoffmonoxid(NO)-Donor gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet, verwendet wird.
2 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum einer Seitenkette, die eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe enthält, gemäß einer Ausführungsform.
3 ist eine Graphik, die ein Ultraviolett(UV)-Spektrum einer Seitenkette, die eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe enthält, gemäß einer Ausführungsform zeigt.
4 ist eine Graphik, die die NO-Freisetzungseigenschaften einer Seitenkette, die eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe enthält, gemäß einer Ausführungsform zeigt.
5 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum eines Hauptketten-Seitenketten-Konstrukts, das frei von einer funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe ist.
6 ist eine Graphik, die die Gelierungseigenschaften eines Hauptketten-Seitenketten-Konstrukts, das frei von einer funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe ist, in Bezug auf Temperatur und Konzentration analysiert.
7 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum eines NO-Donors gemäß einer Ausführungsform.
8 ist eine Graphik, die die NO-Freisetzungseigenschaften eines NO-Donors gemäß einer Ausführungsform zeigt.
9 ist eine Graphik, die zeigt, dass ein Gel, das aus einem Donor für die gezielte Freisetzung von NO gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gebildet ist, das Wachstum von Gefäßendothelzellen verstärkt und das Wachstum von Zellen der glatten Gefäßmuskulatur hemmt.
Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Donor für die gezielte Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO), der auf eine Oberfläche einer künstlichen Vorrichtung, die in einem menschlichen Körper untergebracht werden soll, unter Bildung eines wärmeempfindlichen Hydrogels aufgetragen ist, wodurch die gezielte Freisetzung von NO durchgeführt wird, bereitgestellt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein prothetisches Implantat bereitgestellt, das den Donor auf seiner Oberfläche trägt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine implantierbare medizinische Vorrichtung bereitgestellt, die das prothetische Implantat umfasst.
Der hier verwendete Ausdruck ”gezielte Freisetzung” bezieht sich auf die Freisetzung von NO oder anderer bioaktiver Verbindungen, die fähig sind sofort NO unter in-vivo-Bedingungen aus einem NO-Donor zu erzeugen, einem prothetischen Implantat oder einer Oberfläche einer implantierbaren medizinischen Vorrichtung mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit. ”Gezielte Freisetzung” impliziert, dass NO oder die bioaktiven Verbindungen nach Kontakt mit einer bestimmten biologischen Umgebung nicht in einer unvorhersehbaren, sporadischen Weise oder schlagartig aus dem Donor, dem prothetischen Implantat oder der Oberfläche der implantierbaren medizinischen Vorrichtung austreten. Eine Ausnahme bezüglich der obigen Definition sind jedoch abrupte Freisetzungen, die absichtlich vorbestimmt sind, wie solche, die auftreten, wenn die in einem wärmeempfindlichen Hydrogel enthaltene bioaktive Verbindung nach der Zersetzung des wärmeempfindlichen Hydrogels unterhalb der Phasenübergangstemperatur direkt in-vivo-Bedingungen ausgesetzt wird. In bestimmten Ausführungsformen des Donors für die gezielte Freisetzung von NO oder der oben beschriebenen bioaktiven Verbindungen kann es günstig sein, in einem Anfangsstadium, in dem das prothetische Implantat oder die implantierbare medizinische Vorrichtung installiert wird, für eine schlagartige Freisetzung sorgen, auf die dann eine allmähliche Freisetzung folgt. Die Freisetzungsgeschwindigkeit kann in einem stationären Zustand (als ”zeitgesteuerte Freisetzung” oder ”Kinetik nullter Ordnung” bezeichnet) gehalten werden, d. h. eine gleichmäßige Freisetzung einer bestimmten Menge NO über eine vorbestimmte Zeit (mit oder ohne anfängliche schlagartige Freisetzung), oder es kann sich um eine Gradientenfreisetzung handeln. Die Gradientenfreisetzung impliziert, dass sich die Konzentration von NO oder von bioaktiven Verbindungen, die aus dem prothetischen Implantat oder der Oberfläche der implantierbaren medizinischen Vorrichtung freigesetzt werden, mit der Zeit verändert. Die Lebensdauer von NO oder der bioaktiven Verbindung, die sofort NO erzeugen kann, ist sehr kurz, wenn sie direkt der biologischen Umgebung ausgesetzt sind. Wenn der NO-Donor in Form eines Hydrogels also die Freisetzung von NO-Molekülen oder von Molekülen der bioaktiven Verbindung verzögern kann, bezieht sich dies auf die hier definierte gezielte Freisetzung.
Der hier verwendete Ausdruck ”Hydrogel” bezieht sich auf ein halbfestes Netzwerk, in dem organische Moleküle außer kleinen Molekülen in einem wässrigen Dispersionsmedium suspendiert sind. Die organischen Moleküle in einem Hydrogel bilden ein wasserunlösliches Netzwerk, in dem physikalische Vernetzungen zwischen denselben gebildet werden. Der hier verwendete Ausdruck ”wärmeempfindliches Hydrogel” zeigt diejenigen an, bei denen die organischen Moleküle, die das Hydrogel bilden sollen, in einer fluiden Form, wie als Lösung oder als Sol in einem wässrigen Dispersionsmedium unter Raumtemperatur, vorliegen, aber bei einer Temperaturerhöhung in einen bestimmten Temperaturbereich oberhalb der kritischen Temperatur hinein einen Phasenübergang erfahren und dadurch ein Hydrogel ohne chemische Vernetzungen bilden. Je nach dem Typ der konstituierenden organischen Moleküle kann ein wärmeempfindliches Hydrogel bei Temperaturerhöhung ein solches Verhalten wie einen Sol(oder ein anderer Typ von Fluid)-Gel-Übergang oder in einer komplexeren Weise einen Sol(oder ein anderer Typ von Fluid)-Gel-Sol(oder ein anderer Typ von Fluid)-Übergang aufweisen. Die gegenseitige Sol-Gel-Umwandlung eines wärmeempfindlichen Hydrogels kann durch den pH-Wert und die Konzentration der organischen Moleküle besonders stark beeinflusst sein.
Der hier verwendete Ausdruck ”Copolymer” bezieht sich, wenn hier nicht ausdrücklich etwas Anderes gesagt wird, auf irgendeinen Typ von Copolymeren, wie ein lineares Copolymer, ein statistisches Copolymer, ein Blockcopolymer, ein Pfropfcopolymer, ein Sterncopolymer und dergleichen. Außerdem unterliegen, wenn hier nichts Anderes gesagt wird, die Wiederholungszahl und der Typ der Monomere oder Repetiereinheiten, die das Copolymer bilden, keiner besonderen Einschränkung. Wenn man zum Beispiel bei einem Ethylenglycol/Propylenglycol-Copolymer eine von Ethylenglycol abgeleitete Repetiereinheit mit EG und eine von Propylenglycol abgeleitete Repetiereinheit mit PG bezeichnet, bedeutet dies hier, dass dieses Copolymer nicht nur ein statistisches Copolymer mit der durchschnittlichen Zusammensetzung (EG)_m(PG)_n umfasst, sondern auch ein Diblockcopolymer der Zusammensetzung (EG)_m(PG)_n und ein Triblockcopolymer der Zusammensetzung (EG)_l(PG)_m(EG)_n oder dergleichen. Wenn man außerdem bei einem Lactat-Glycolat-Ethylenglycol-Copolymer eine von Lactat (oder Lactid) abgeleitete Repetiereinheit mit L und eine von Glycolat (oder Glycolid) abgeleitete Repetiereinheit mit G bezeichnet, bedeutet dies hier, dass dieses Copolymer nicht nur ein Triblockcopolymer mit der durchschnittlichen Zusammensetzung (G)_l(EG)_m(L)_n umfasst, sondern auch solche Triblockcopolymere mit der Zusammensetzung (EG)_l(G/L)_m(EG)_n, wobei ein gemischter G/L-Block mit sowohl G- als auch L-Repetiereinheiten und ein Ethylenglycol-Block nebeneinander vorliegen. In den obigen Formeln sind l, m und n positive Zahlen.
Der hier verwendete Ausdruck ”prothetisches Implantat” oder ”Implantat” bezieht sich auf irgendeine Art von Artikeln, die in eine Position gebracht werden können, die es ihnen ermöglicht, im Körper eines Tiers einschließlich Menschen und Säugern physiologische Wirkungen auszuüben, indem es NO freisetzt, und die mit einem Donor für die gezielte Freisetzung von NO auf ihrer Oberfläche ausgestattet werden können. Was dies betrifft, so braucht nicht das gesamte Implantat in den menschlichen oder tierischen Körper eingesetzt zu werden, solange ein Teil davon hineingebracht wird. Zum Beispiel können Verbindungsteile, wie Röhren und Drähte, außerhalb des menschlichen Körpers vorliegen. Der hier verwendete Ausdruck ”implantierbare medizinische Vorrichtung” oder ”medizinische Vorrichtung” bedeutet dasselbe wie der Ausdruck ”prothetisches Implantat” und umfasst medizinische Vorrichtungen zur Behandlung, medizinischen Verfahren, Operation, Diagnose und Untersuchung. Die implantierbare medizinische Vorrichtung kann auch für eine vorbestimmte Zeitspanne ganz oder teilweise in den menschlichen Körper eingesetzt werden. Zum Beispiel wird nur eine Sonde oder ein Sensor der implantierbaren medizinischen Vorrichtung dort eingesetzt.
Der erfinderische Donor für die gezielte Freisetzung von NO ist ein Polymer, das eine Hauptkette und eine Seitenkette, die durch eine chemische Bindung mit der Hauptkette verknüpft ist, umfasst. Diese chemische Bindung ist im Allgemeinen eine kovalente Bindung, aber nicht auf eine solche beschränkt. Zum Beispiel kann eine nichtkovalente intermolekulare Kraft, wie eine Biotin-Avidin-Wechselwirkung, die eine mit der von kovalenten Bindungen vergleichbare Stärke aufweist, als chemische Bindung dienen, die die Haupt- und die Seitenketten miteinander verknüpft. An seiner Seitenkette oder als Teil seines Kohlenstoffhauptgerüsts weist der Donor eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe auf, die NO freisetzen kann, wenn sie der biologischen Umgebung ausgesetzt ist.
Der Donor weist eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe auf, die durch eine chemische Bindung daran gebunden ist, und liegt unterhalb von Raumtemperatur in einem fluiden Zustand, wie als Sol, Emulsion, Dispersion oder Flüssigkeit vor, während er bei Kontakt mit der Körperumgebung, zum Beispiel dem allgemeinen pH-Wert und der allgemeinen Temperatur im menschlichen Körper, einen Phasenübergang erfährt, wodurch ein Hydrogel entsteht. Der Donor der vorliegenden Erfindung für die gezielte Freisetzung, ein Polymer, das ein wärmeempfindliches Hydrogel bilden kann, unterstützt also zweckmäßigerweise die sogenannte in-situ-Gelbildung, wenn der Donor in einem flüssigen Zustand in eine gewünschte Stelle des Körpers eingefügt wurde.
Ein Gel ist ein poröser elastischer Feststoff, der die kondensierten Eigenschaften eines Feststoffs und die diffundierenden Transporteigenschaften einer Flüssigkeit aufweist. Die Geleigenschaften sind bei der gezielten Freisetzung eines aktiven Materials sehr wünschenswert. Ein Hydrogel hat ähnliche Eigenschaften wie natürliche biologische Weichgewebe und ist mit den biologischen Weichgeweben hochgradig verträglich und wird daher in dem prothetischen Implantat verwendet. Eine gewünschte Konzentration des Donors mit der funktionellen Gruppe, die NO freisetzen kann, kann leicht bis zu einer gewünschten Dicke auf eine Oberfläche des prothetischen Implantats oder der implantierbaren medizinischen Vorrichtung aufgetragen werden. Wenn das prothetische Implantat oder die implantierbare medizinische Vorrichtung in den menschlichen Körper eingesetzt wird, liegt der in diesem Implantat oder in dieser Vorrichtung untergebrachte Donor der vorliegenden Erfindung als Hydrogel vor, und dies ermöglicht es, das hochgradig labile und instabile NO ohne einen plötzlichen Ausbruch langsam freizusetzen.
In dem Donor spielt das Kohlenstoffgerüst seiner Hauptkette eine entscheidende Rolle bei der Bildung eines Hydrogels. Vorzugsweise bilden die Polymere, aus denen die Hauptkette des NO-Donors der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist, ein wärmeempfindliches Hydrogel, und zwar unabhängig davon, ob sie mit der Seitenkette verknüpft sind oder als unabhängige Polymere, die nicht mit der Seitenkette verknüpft sind, vorliegen. Eine Teilliste von Beispielen für die Polymere, die das Kohlenstoffgerüst der Hauptkette des Donors bilden, umfasst etwa ein Ethylenglycol/Propylenglycol-Copolymer, ein Lactat/Glycolat-Copolymer, ein Lactat/Ethylenglycol-Copolymer, ein Lactat-Glycolat-Ethylenglycol-Copolymer, ein Lactat-Glycolat-Propylenglycol-Ethylenglycol-Copolymer, ein ε-Caprolacton/Ethylenglycol-Copolymer, ein 3-Hydroxybutyrat/Propylenglycol-Copolymer, ein Propylenfumarat/Ethylenglycol-Copolymer, ein Organophosphagen/Ethylenglycol-Copolymer, ein Blockcopolymer auf Polypeptidbasis und ein Copolymer, das wenigstens zwei dieser Copolymere, die miteinander verknüpft sind, umfasst. Das Kohlenstoffgerüst der Hauptkette des Donors kann ein biologisch abbaubares Polymer sein. Außerdem kann das Kohlenstoffgerüst der Hauptkette des Donors auch ein Polymer sein, das dadurch erhalten wird, dass man eine Repetiereinheit mit einer funktionellen Gruppe (z. B. einer funktionellen Estergruppe) zur Beschleunigung oder Induktion des biologischen Abbaus an ein nicht biologisch abbaubares Polymer oder ein Konjugat von Biomolekülen, wie ein Saccharid, bindet. Der Donor, der als Kohlenstoffgerüst der Hauptkette das Polymer oder das Konjugat von Biomolekülen aufweist, kann auch ein wärmeempfindliches Hydrogel bilden. Diesbezüglich ist es für den Fachmann naheliegend, dass das nicht biologisch abbaubare Polymer aus der Gruppe, die aus den oben beschriebenen Copolymeren besteht, ausgewählt werden kann.
Insbesondere kann das Kohlenstoffgerüst der Hauptkette des Donors ein Blockcopolymer sein. Zum Beispiel kann das Blockcopolymer ein Blockcopolymer des A-B-A-Typs sein. Als Polymer, das ein wärmeempfindliches Hydrogel bilden kann, sind auch kompliziertere Blockcopolymere als das Blockcopolymer des A-B-A-Typs bekannt.
Das Blockcopolymer des A-B-A-Typs, das ein Hydrogel bilden kann, weist sowohl einen hydrophilen Block oder ein hydrophiles Segment als auch einen hydrophoben Block oder ein hydrophobes Segment auf. Wenn die Temperatur zunimmt, bildet ein wärmeempfindliches Polymer, das zur Bildung eines Hydrogels geeignet ist, reversibel ein Hydrogel, oder je nach Temperatur wird das Hydrogel zum Polymer dissoziiert, da die meisten wärmeempfindlichen Polymere keine chemischen Vernetzungen umfassen. Die treibende Kraft bei der Bildung eines Hydrogels bei hohen Temperaturen ist die Zunahme der hydrophoben Wechselwirkung, die mit der Temperaturerhöhung einhergeht. Solche Polymere sind meistens selbstassembliert und bilden eine physikalische Vernetzung.
Organische Polymere, die ein Hydrogel bilden können, sind in der Technik wohlbekannt, und daher wird hier keine ausführliche Beschreibung derselben gegeben. Ein Polymer, das bei einer geeigneten Temperatur einen Phasenübergang erfährt und in einem geeigneten Temperaturbereich in einem Hydrogelzustand gehalten wird kann von Fachmann je nach Verwendung des Donors aus der Gruppe der oben beschriebenen Copolymere ausgewählt werden, und der Fachmann kann ein Hydrogel bilden, indem er das Polymer gegebenenfalls modifiziert.
Das in der Hauptkette des Donors verwendete Blockcopolymer kann ein Triblockcopolymer sein, zum Beispiel ein Polyethylenglycol-Polypropylenglycol-Polyethylenglycol(PEG-PPG-PEG)-Copolymer. Als kommerziell erhältliches Triblockcopolymer kann Pluronic F127 (Produktname), das von der BASF in Deutschland hergestellt wird, verwendet werden, das eine durchschnittliche Zusammensetzung von (EG)₉₉-(PG)₆₅-(EG)₉₉ (Molekulargewicht: 12600) aufweist. Pluronic F127 ist ein biokompatibles, biologisch resorbierbares Polymer, das von der FDA (Food and Drug Administration) in den USA zur Verwendung beim Menschen zugelassen ist.
Insbesondere kann die Hauptkette des Donors das oben beschriebene PEG-PPG-PEG-Copolymer sein, das ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 4600 bis etwa 12600 aufweist.
Die Seitenkette des Donors ist ein Polymer, das durch eine chemische Bindung mit der Hauptkette verknüpft ist, und der Donor umfasst eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe, die NO erzeugen und freisetzen kann, an einem Teil des Gerüsts der Polymerseitenkette oder als funktionelle Gruppe der Seitenkette.
NO ist hochgradig labil, insbesondere wenn die Licht-, Wärme- und Feuchtigkeitsbedingungen jenseits der optimalen Bedingungen liegen. Die Hauptkette des Donors für die gezielte Freisetzung von NO spielt bei der Bildung eines Hydrogels eine entscheidende Rolle, und daher ist es diffizil, wenn der Donor eine funktionelle Gruppe, die NO erzeugen kann, an seiner Hauptkette aufweisen soll. Also kann eine Seitenkette des Donors mit geeigneter Länge, die somit die Bildung des Hydrogels nicht behindert und die eine funktionelle Gruppe aufweist, die NO erzeugen und freisetzen kann, durch eine chemische Bindung mit der Hauptkette des Donors verknüpft sein, wodurch die Freisetzungszeit für NO im Körper erhöht werden kann.
Die funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe an der Seitenkette des Donors kann auch als NONOat bezeichnet werden und kann durch die Formel RR'N-N(O)=NO-dargestellt werden. Eine Diazeniumdiolat-Verbindung kann im festen Zustand stabil gelagert werden und ist gut wasserlöslich, und das Freisetzungsmuster, wie die Freisetzungsgeschwindigkeit oder das Freisetzungsverfahren, kann je nach der Struktur des übrigen Teils des Donors abgesehen von seiner Seitenkette, mit der die funktionelle NONOat-Gruppe verknüpft ist, eingestellt werden.
Außerdem ist die Diazeniumdiolat-Verbindung bei normalen Körpertemperaturen und Körper-pH-Werten biologisch abbaubar und kann je nach pH-Wert in verschiedenen Mustern freigesetzt werden. Der Donor, der die funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe umfasst, kann eine relativ hohe Konzentration von NO freisetzen, da pro funktioneller Diazeniumdiolat-Gruppe zwei NO-Moleküle freigesetzt werden.
Diazeniumdiolat kann zum Beispiel so, wie es in der folgenden Formel 1 gezeigt ist, durch Umsetzen eines sekundären Amins mit NO erhalten werden. Formel 1
Die Seitenkette mit der funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe kann mit verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Kette, die ein sekundäres Aminstickstoffatom in ihrem Gerüst umfasst (mit anderen Worten, bei der R¹-N-R² in Formel 1 oben innerhalb des Gerüsts entlang der Hauptlängsrichtung der entsprechenden Seitenkette verknüpft ist), als Seitenkette des Donors verwendet werden. Alternativ dazu kann die Seitenkette des Donors auch unter Verwendung eines Oligopolymers, das ein sekundäres Aminstickstoffatom an einer seiner Seitenketten umfasst, hergestellt werden.
Alternativ dazu kann Diazeniumdiolat auch dadurch erhalten werden, dass man ein solches, ein sekundäres Aminstickstoffatom enthaltendes Oligopolymer durch eine chemische Bindung mit einer Hauptkette verknüpft und ein organisches Polymer mit dem damit verknüpften Oligopolymer mit NO umsetzt.
Die NO-freisetzenden Eigenschaften von Diazeniumdiolaten können gesteuert werden, indem man funktionelle Gruppen, die R¹ und R² in Formel 1 entsprechen, modifiziert. Wie in Formel 1 gezeigt ist, können, da Diazeniumdiolate Sauerstoffatome mit hoher Elektronendichte aufweisen, auch andere aktive Materialien als NO in die Seitenkette des Donors in Form eines Konjugats, bei dem andere pharmazeutisch aktive Materialien mit den Sauerstoffatomen von Diazeniumdiolat verknüpft sind, aufgenommen werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Kohlenstoffgerüst der Seitenkette des Donors aus sekundäre Amine enthaltenden Polymeren, zum Beispiel Polypropylenamin, Polylysin und dergleichen, und Biopolymeren, wie Chitosan, ausgewählt sein. In einer besonderen Ausführungsform kann es sich bei dem Kohlenstoffgerüst der Seitenkette des Donors um Polyethylenimin, zum Beispiel ein verzweigtes Polyethylenimin (bPEI), handeln. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Seitenkette des Donors (angenommen, dass die Seitenkette unabhängig von der Hauptkette existiert) ein PEI-Polymer mit einem Molekulargewicht von 25000 oder weniger sein. Wenn das Molekulargewicht der Seitenkette des Donors innerhalb dieses Bereichs liegt, kann die Toxizität des Donors in Körperzellen verhindert werden. Insbesondere kann das Molekulargewicht des PEI-Polymers 12000 oder weniger betragen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das verzweigte Polyethylenimin einen Seitenkettenrest zur Bildung von chemischen Bindungen zum Gerüst der Hauptkette an einem verzweigten Teil. Insbesondere kann der Seitenkettenrest ein primäres Alkylenamin sein. Das Alkylenamin ist über ein Kohlenstoffatom des Alkylenamins mit dem Stickstoffatom verknüpft, das einen Teil des Kettengerüsts von bPEI bildet. Diesbezüglich kann das bPEI zu Löslichkeitszwecken vorzugsweise sowohl verzweigte als auch unverzweigte Ethylenimin-Repetiereinheiten umfassen.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das bPEI, das die Seitenkette des Donors bildet, ein Polymer sein, das durch die folgende Formel 2 dargestellt wird. Formel 2
Das bPEI der Formel 2 kann ein Molekulargewicht von 25000 oder weniger, zum Beispiel ein Molekulargewicht von 12000 oder weniger, aufweisen. Diesbezüglich beträgt das Verhältnis von x zu y in kommerziell erhältlichem bPEI 1:2.
Es unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wie viele funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppen in bPEI, das die Seitenkette des Donors bildet, eingeführt werden. Die Umsetzungsrate von sekundärem Amin zu Diazeniumdiolat beträgt im Allgemeinen 50% oder mehr, ist aber nicht darauf beschränkt. Obwohl es häufig wünschenswert ist, dass die Umsetzungsrate des Diazeniumdiolats so hoch wie möglich ist, kann der Fachmann die Umsetzungsrate in geeigneter Weise erhöhen oder senken, indem er die Bedingungen der Umsetzungsreaktion von sekundärem Amin zu Diazeniumdiolat je nach den gewünschten NO-Freisetzungseigenschaften des endgültigen Donorprodukts, das erhalten werden soll, anpasst.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das bPEI der Formel 2 als Zwischenstufe für die Seitenkette des Donors verwendet werden, und ein PEG-PPG-PEG-Copolymer kann als Zwischenstufe für die Hauptkette des Donors verwendet werden. Diesbezüglich kann das Stickstoffatom des primären Amins am Seitenkettenrest des verzweigten Polyethylenimins durch Verwendung eines Chlorameisensäureesters über eine Carbamatbindung mit dem terminalen Sauerstoffatom des Triblockcopolymers verknüpft werden. Der Donor für die gezielte Freisetzung von NO bildet bei normaler Körpertemperatur und bei normalem Körper-pH-Wert ein Hydrogel. Diesbezüglich können die Temperatur- und pH-Bedingungen im Körper gegebenenfalls vom Fachmann in geeigneter Weise eingestellt werden. Zum Beispiel sind die Temperatur- und pH-Bedingungen im menschlichen Körper wie folgt: die kritische Temperatur des Phasenübergangs, die bei Temperaturerhöhung einen Sol-Gel-Phasenübergang induziert, liegt in einem Bereich von etwa 25 bis etwa 35°C, und der pH-Wert liegt in einem Bereich von etwa 5,5 bis etwa 8,0.
Zur Bildung eines Hydrogels wird im Allgemeinen eine Wasserdispersionslösung, die den Donor umfasst, auf eine Oberfläche eines prothetischen Implantats oder einer implantierbaren medizinischen Vorrichtung aufgetragen. Die Phasenübergangstemperatur für ein Hydrogel kann je nach der Konzentration des Donors für die gezielte Freisetzung von NO in Wasser als Dispersionslösungsmittel variieren. Die Dispersionskonzentration des Donors für die Beschichtung kann vom Fachmann im Einklang mit den gewünschten mechanischen und chemischen Eigenschaften eines Hydrogels und der gewünschten NO-Freisetzungsgeschwindigkeit in geeigneter Weise bestimmt werden. Obwohl es schwierig ist, geeignete Dispersionskonzentrationen für alle Donorpolymere zu bestimmen, kann die geeignete Dispersionskonzentration des Donors je nach dem im Donor verwendeten Material variieren und kann im Bereich von etwa 10 bis etwa 30% liegen. Zum Beispiel kann die Menge eines NO-Donors, der als Hauptkette aus Polyethylenglycol-Polypropylenglycol und als Seitenkette aus bPEI mit einer Ethylenamin-Seitenkette besteht, im Bereich von etwa 15 bis etwa 25 Gew.-% liegen, bezogen auf das Gesamtgewicht der Donordispersionslösung.
Der Donor kann neben NO weiterhin ein pharmazeutisch aktives Material umfassen. Das pharmazeutisch aktive Material kann in Form eines Konjugats, das über eine chemische Bindung mit dem Donor verknüpft ist, auf dem Donor immobilisiert sein, oder es kann ohne chemische Bindung im Hydrogel dispergiert sein. Das pharmazeutisch aktive Material kann an Sauerstoffatomen der funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe der Seitenkette des Donors kovalent immobilisiert sein. Ein geeignetes Immobilisierungsverfahren für das pharmazeutisch aktive Material kann zum Beispiel die O-Alkylierung sein. Zum Beispiel kann ein positiv geladenes pharmazeutisch aktives Material oder ein Derivat davon elektrisch an eine negative Ladung eines Diazeniumdiolats gebunden sein. Das pharmazeutisch aktive Material kann in einem Dispersionslösungsmittel (Wasser oder wässrige Lösung), das den Donor dispergiert, enthalten sein, so dass es nach der Bildung des Hydrogels langsam freigesetzt wird.
Beispiele für das pharmazeutisch aktive Material können unter Anderem ein die Thrombusbildung verhinderndes Mittel, ein Antikoagulans, ein Antioxidans, ein entzündungshemmendes Mittel und ein Wundheilungsverstärker enthalten, sind aber auf diese nicht beschränkt. Diese pharmazeutisch aktiven Materialien werden in dem Donor, der als NO-freisetzender Stent verwendet werden kann, wünschenswerterweise verwendet, da sie Synergieeffekte aufweisen. Insbesondere umfassen die pharmazeutisch aktiven Materialien einen Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), ein entzündungshemmendes Mittel, Vitamin C, Acetylsalicylat, einen cholesterinsenkenden Wirkstoff, ein thrombolytisches Mittel, ein antithrombotisches Mittel, Heparin, Krebsmedikamente und Oligonucleotide mit antiproliferativer Aktivität.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein prothetisches Implantat und eine implantierbare medizinische Vorrichtung bereitgestellt, deren Oberfläche mit dem Donor für die kontrollierte Freisetzung von NO beschichtet ist.
Das prothetische Implantat oder die implantierbare medizinische Vorrichtung kann sowohl in einem Fall, bei dem die gezielte Freisetzung von NO zur Verbesserung der ursprünglichen Wirkungen des prothetischen Implantats oder der implantierbaren medizinischen Vorrichtung beiträgt, als auch in einem Fall, bei dem nur NO oder NO und ein zusätzliches pharmazeutisch aktives Material freigesetzt werden soll, verwendet werden. Insbesondere wird NO verwendet, um die glatte Gefäßmuskulatur zu entspannen, die Wundheilung zu fördern und die Neurotransmission zu regulieren. Außerdem hat NO auch sterilisierende und antivirale Wirkungen. Insbesondere hat NO eine ausgezeichnete antivirale Wirkung gegen humanes Papillomvirus (hPV).
Außerdem kann der Donor die Funktion eines chemischen Sensors, der mit Blut in Kontakt steht, unterstützen, oder er kann selbst als Teil des chemischen Sensors, der die Konzentration von NO misst, fungieren. In diesem Fall kann ein Hauptketten-Seitenketten-Polymer mit einer Seitenkette, die keine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe aufweist, aber ein sekundäres Amin umfasst, auf eine Oberfläche des prothetischen Implantats oder der implantierbaren medizinischen Vorrichtung aufgetragen werden. Wenn im menschlichen Körper erzeugtes NO in ein gebildetes Hydrogel eindringt, reagiert es mit dem sekundären Amin in dem Hauptketten-Seitenketten-Polymer, wodurch Diazeniumdiolat entsteht. Diesbezüglich kann der Donor quantitativ die Menge des erzeugten Diazeniumdiolats messen und somit als chemischer Sensor wirken. Beispiele für das prothetische Implantat oder die implantierbare medizinische Vorrichtung sind etwa ein Stent, ein Katheter, ein subkutanes Implantat, ein chemischer Sensor, eine Elektrode, ein Schrittmacher, ein Gefäßimplantat, ein Wundverband, ein Penisimplantat, ein implantierbarer Pulsgenerator (IPG), ein implantierbarer Herzdefibrillator und ein Nervenstimulator.
Die Beschichtung des Donors für die gezielte Freisetzung von NO auf der Oberfläche des prothetischen Implantats oder der implantierbaren medizinischen Vorrichtung kann mit Hilfe von in der Technik wohlbekannten Verfahren durchgeführt werden. Diese Verfahren können vom Fachmann je nach Verwendung des Donors in geeigneter Weise ausgewählt werden, und es wird hier keine ausführliche Beschreibung davon angegeben. Zum Beispiel kann das Beschichtungsverfahren durchgeführt werden, indem man das prothetische Implantat oder die implantierbare medizinische Vorrichtung in eine Lösung eintaucht, die den Donor enthält. Alternativ dazu kann das Beschichtungsverfahren auch durchgeführt werden, indem man das prothetische Implantat oder die implantierbare medizinische Vorrichtung einer Oberflächenbehandlung mit dem Donor unterzieht.
Beispiele
Es werden jetzt eine oder mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben. Diese Beispiele dienen jedoch nur Veranschaulichungszwecken und sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
Beispiel 1
Verzweigtes Polyethylenimin, das funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppen enthält (bPEI-NONOat)
Jeweils 0,5-g-Portionen von drei verzweigten Polyethylenimin-Copolymeren (bPEI) (erhältlich von Polysciences, USA, das Verhältnis von primären zu sekundären zu tertiären Amingruppen beträgt 25:50:25), wobei die Copolymere jeweils Gewichtsmittel des Molekulargewichts von 600, 10000 bzw. 25000 aufweisen und eine Repetiereinheit einer Seitenkette mit einem primären Amin und eine Repetiereinheit von Ethylenimin aufweisen, wurden in ein 100-ml-Becherglas gegeben, und 10 ml Methanol und 20 ml Tetrahydrofuran (THF) wurden in jedes Becherglas gegeben, und jedes resultierende Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt.
0,63 g (die Menge, die zu den kombinierten Gesamtmengen von primären bis tertiären Amingruppen jedes bPEI äquivalent ist) Natriummethoxid (NaOMe) wurden in 10 ml Methanol gelöst, und das Gemisch wurde in jedes der Bechergläser, die die bPEIs enthalten, gegeben. Die Bechergläser wurden in einen Reaktor gegeben, und das Innere des Reaktors wurde zweimal mit 20 psi Argongas gespült. Anschließend wurden 80 psi NO in den Reaktor gegeben, und dieser wurde 3 Tage lang stehen gelassen, um die bPEI-NONOate zu erzeugen.
Der für die Reaktion verwendete Reaktor ist in 1 gezeigt. Die erzeugten bPEI-NONOate wurden durch Ausfällen mit Diethylether getrennt.
Der Vorgang der Herstellung von bPEI-NONOat ist in der folgenden Formel 3 gezeigt. In Formel 3 reagieren einige sekundäre Amine aufweisenden Repetiereinheiten (die Zahl der Repetiereinheiten beträgt y) in Gegenwart einer Base mit NO und werden dadurch in funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppen umgewandelt (die Zahl der Repetiereinheiten beträgt z), aber einige davon reagieren nicht und bleiben als sekundäre Amine erhalten (die Zahl der Repetiereinheiten beträgt w). Formel 3
Analyse von Eigenschaften des erzeugten bPEI-NONOats
1) Bestätigung der Bildung von funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppen
Durch quantitative Messung mittels NMR (nuclear magnetic resonance) wurde bestimmt, ob das erzeugte bPEI-NONOat jeweils eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe aufweist. 2 zeigt die ¹H-NMR-Spektrum-Ergebnisse des Reaktionsprodukts. Das α-Wasserstoffatom (das der Position a in 2 entspricht) des tertiären Amins in bPEI-Molekülen der Formel 3 erscheint im ¹H-NMR-Spektrum bei δ = 2,6 ppm, doch sobald die funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe entstanden ist, erscheint dieses frühere α-Wasserstoffatom des tertiären Amins im ¹H-NMR-Spektrum jetzt bei δ = 3,1 ppm (was der Position b in 2 entspricht). Wie in 2 gezeigt ist, wurde als Ergebnis der NMR-Spektralanalyse des Produkts bestätigt, dass von den sekundären Aminen in den bPEI-Copolymeren bei dem bPEI mit einem Molekulargewicht von 600 (bPEI600) 15,3% (siehe 2A), bei dem bPEI mit einem Molekulargewicht von 10000 (bPEI10K) 13,8% (siehe 2B) und bei dem bPEI mit einem Molekulargewicht von 25000 (bPEI25K) 16,0% (siehe 2C) in Diazeniumdiolat umgewandelt wurden. Im Folgenden wird das Diazeniumdiolat des bPEI mit dem Molekulargewicht von 600, das durch das ¹H-NMR-Spektrum von 2A bestätigt wurde, als bPEI600-NONOat bezeichnet, das Diazeniumdiolat des bPEI mit dem Molekulargewicht von 10000, das durch das ¹H-NMR-Spektrum von 2B bestätigt wurde, wird als bPEI10K-NONOat bezeichnet, und das Diazeniumdiolat des bPEI mit dem Molekulargewicht von 25000, das durch das ¹H-NMR-Spektrum von 2C bestätigt wurde, wird als bPEI25K-NONOat bezeichnet.
2) Spektroskopische Analyse von Diazeniumdiolat
Wenn mit der ausgehend von der sekundären Amingruppe von bPEI hergestellten funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe eine Ultraviolett(UV)-Absorptionsspektroskopie durchgeführt wird, erscheint ein Absorptionspeak im Allgemeinen bei 250 bis 260 nm. 3 ist eine Graphik, die UV-Spektrum-Messergebnisse von synthetisierten bPEI-NONOaten bei 200 bis 400 nm zeigt. In 3 weisen bPEI600, bPEI10K bzw. bPEI25K auf bPEIs hin, die vor der Reaktion Molekulargewichte von 600, 10000 bzw. 25000 aufweisen, und bPEI600-NO, bPEI10K-NO bzw. bPEI25K-NO weisen auf die entsprechenden Diazeniumdiolate hin. Wie in 3 gezeigt ist, wird als Ergebnis der UV-Absorptionsspektroskopie bestätigt, dass die Absorptionspeaks von bPEI600-NO, bPEI10K-NO und bPEI25K-NO im Unterschied von denen der bPEIs vor der Reaktion bei 250 bis 260 nm erscheinen.
3) Analyse der NO-Freisetzung
Die Analyse der NO-Freisetzung erfolgte unter Verwendung eines allgemeinen Nachweisverfahrens, zum Beispiel der Grieß-Analyse (siehe H. H. H. W. Schmidt und M. Keim in Methods in Nitric Oxide Research, M. Feelish und J. S. Stamler (Hrsg.), Wiley & Sons, New York, 1996). Hochgradig labiles NO reagiert mit Sauerstoff oder Feuchtigkeit in einem Reaktionslösungsmittel unter Bildung von Stickstoffdioxid, das Stickstoffdioxid reagiert mit Sulfanilamid und wird dadurch aktiviert, und das resultierende aktivierte Material reagiert mit Naphthylendiamin unter Bildung einer Azoverbindung, die Licht mit einer Wellenlänge von 548 nm absorbiert.
Die Ergebnisse der Analyse der drei synthetisierten bPEI-NONOate unter Verwendung eines solchen Prinzips sind in 4 gezeigt. Die in 4 gezeigten abgekürzten Verbindungsnamen sind dieselben, wie sie in der Beschreibung bezüglich 3 definiert sind. Obwohl das NO-Freisetzungsprofil keinen deutlichen Unterschied bezüglich des Molekulargewichts von bPEI-NONOat aufwies, wies bPEI10K-NONOat die größte Menge der anfänglichen Freisetzung und die schnellste Freisetzungsrate von den drei bPEI-NONOaten auf, und es setzte etwa 24 Stunden lang NO frei. Die Menge der anfänglichen Freisetzung von bPEI25K-NONOat war die zweitgrößte, und die NO-Freisetzung dauerte etwa 11 Stunden. Die Menge der anfänglichen Freisetzung von bPEI600-NONOat war die kleinste, und bPEI600-NONOat setzte NO langsam über die längste Zeitspanne hinweg (54 Stunden) frei. Daher wurden die anschließenden Experimente unter Verwendung von bPEI600-NONOat durchgeführt.
Beispiel 2
Hauptketten-Seitenketten-Konstrukt, das keine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe aufweist
(1) Synthese von F127-bPEI
10,0 g Pluronic F127 (eingetragene Marke der BASF) mit einem Molekulargewicht von 12600 wurde in einen 250-ml-Rundkolben gegeben und in 70 ml Methylenchlorid gelöst. Dann wurde der Kolben mit Stickstoff gespült. Anschließend wurden 1,29 g p-Nitrophenylchlorformiat (p-NPC) in 70 ml Methylenchlorid gelöst, und die gemischte Lösung wurde in einen Tropftrichter gegeben. Während die Pluronic-F127-Lösung in der Stickstoffatmosphäre gerührt wurde, wurde p-NPC während 12 Stunden in den Kolben getropft und reagieren gelassen, wobei man ein endaktiviertes Pluronic F127 erhielt. Das resultierende Produkt wurde mit Hilfe von Diethylether-Fällung getrennt. Anschließend wurde das endaktivierte Pluronic F127 mit bPEI umgesetzt, um bPEI mit einem seiner Molekülenden zu verknüpfen. Das Syntheseschema von F127-bPEI ist in Formel 4 gezeigt. In Formel 4 bezeichnet ”F127-bPEI” Pluronic F127 mit an das Molekülende gebundenem bPEI. Formel 4
Im Einzelnen wurde das oben beschriebene endaktivierte Pluronic F127 mit einem Überschuss an bPEI600 in Äquivalentgewichtsverhältnissen von 1:1,5, 1:3 und 1:10 umgesetzt, um jeweils drei Hauptketten-Seitenketten-Konstrukte herzustellen, die keine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe aufweisen (F127-bPEI0.8, F127-bPEI1.0 bzw. F127-bPEI1.3).
F127-bPEI0.8 wurde wie folgt synthetisiert: 43 mg bPEI600 (1,5 Äquiv.) wurden in einen 100-ml-Rundkolben gegeben und dann in 20 ml Methylenchlorid und 1 ml Triethylenamin gelöst. Dann wurde der Kolben mit Stickstoff gespült. 0,6 g des endaktivierten Pluronic F127 (1 Äquiv.) wurden in 20 ml Methylenchlorid gelöst, und das resultierende Gemisch wurde in einen Tropftrichter gegeben. Während das resultierende Gemisch enthaltend bPEI in der Stickstoffatmosphäre in einem Eisbad gerührt wurde, wurde das endaktivierte Pluronic F127 während 12 Stunden in den Kolben getropft und reagieren gelassen, wobei man F127-bPEI0.8 erhielt. Das synthetisierte F127-bPEI0.8 wurde mit MWCO-Dialyse 10000 als Dialysemembran zur Trennung dialysiert, um Verunreinigungen daraus zu entfernen, und dann gefriergetrocknet, um ein Endprodukt zu erhalten. F127-bPEI1.0 und F127-bPEI1.3 wurden jeweils mit demselben Verfahren synthetisiert, wie es bei der Synthese von F127-bPEI0.8 verwendet wurde, außer dass 86 mg bPEI600 (3 Äquiv.) und 0,6 g des endaktivierten Pluronic F127 (1 Äquiv.) verwendet wurden und 289 mg bPEI600 (10 Äquiv.) und 0,6 g des endaktivierten Pluronic F127 (1 Äquiv.) verwendet wurden.
Analyse von Eigenschaften des erzeugten F127-bPEI
(1) Bestätigung der Bindung zwischen Pluronic F127 und bPEI
Durch quantitative Messung mittels ¹H-NMR wurde bestimmt, ob Pluronic F127 und bPEI in den drei erzeugten Hauptketten-Seitenketten-Konstrukten über eine Carbamatbindung verknüpft waren. Die Ergebnisse der ¹H-NMR-Spektren der drei erzeugten Hauptketten-Seitenketten-Konstrukte sind in 5 gezeigt. Wie durch a und c in 5 dargestellt wird, ist das Spektrum von Pluronic F127 im Allgemeinen weitgehend in Methyl-Wasserstoffatome a und Methylen-Wasserstoffatome c unterteilt. Das ¹H-NMR-Signal des Methyl-Wasserstoffatoms a einer von Propylenglycol abgeleiteten Repetiereinheit erscheint bei δ = 1,15 ppm, während das ¹H-NMR-Signal des restlichen Methylen-Wasserstoffatoms c bei δ = 3,2 bis 4,0 ppm erscheint. Außerdem erscheint das ¹H-NMR-Signal des mit Kohlenstoff verknüpften Wasserstoffatoms b von bPEI bei δ = 2,6 ppm. In 5 zeigen (1), (2), (3) bzw. (4) die ¹H-NMR-Spektren von nicht umgesetztem Pluronic F127, des erzeugten F127-bPEI0.8, des erzeugten F127-bPEI1.0 bzw. des erzeugten F127-bPEI1.3 an. Anhand der Ergebnisse von 1 wurde bestätigt, dass bei F127-bPEI0.8 40%, bei F127-bPEI1.0 50,0% und bei F127-bPEI1.3 62,5% der terminalen Hydroxygruppen der Hauptkette von Pluronic F127 an bPEI gebunden waren.
2) Bestätigung der Gelbildung
Ein Gelierungsexperiment wurde durchgeführt, um zu bestätigen, ob das Hauptketten-Seitenketten-Konstrukt, das aus Pluronic F127 und bPEI besteht, ein wärmeempfindliches Hydrogel wie Pluronic F127 bilden kann, und wenn ja, wie es die Gelierungseigenschaften beeinflusst. Die Anwesenheit von Sol-Gel je nach Temperatur und Konzentration (Gelierungstest durch Inversion) wurde so aufgezeichnet, dass dann, wenn Hauptketten-Seitenketten-Konstrukte, die in verschiedenen Konzentrationen (Gew.-%) in Wasser dispergiert waren, invertiert wurden und es dabei zu einem Fließen der Lösung kam, der Zustand als Lösungszustand (Solzustand) bestimmt wurde, und wenn nicht, wurde er als Gelzustand bestimmt. Die Testergebnisse sind in 6 gezeigt. Alle erzeugten Hauptketten-Seitenketten-Konstrukte konnten selbst bei einer viel geringeren Konzentration als bei Pluronic F127 ein wärmeempfindliches Hydrogel bilden. Bezüglich der Stabilität bildeten F127-bPEI0.8, F127-bPEI1.0 und F127-bPEI1.3 in dieser Reihenfolge stabile Hydrogele. Alle drei Konstrukte dienen also als geeigneter Vorläufer zur Verwendung bei der Herstellung eines Donors.
Beispiel 3
Funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppen enthaltender Donor F127-bPEI-NONOat
(1) Synthese von F127-bPEI-NONOat
0,46 g F127-bPEI wurden in ein 100-ml-Becherglas gegeben, und 0,23 ml einer 5,3 M Natriummethoxid, 2,07 ml Methanol und 2,3 ml Tetrahydrofuran wurden hinzugefügt. Das Becherglas wurde in einen Reaktionsbehälter gegeben, wie es in 1 gezeigt ist, und Luft in dem Reaktionsbehälter wurde zweimal abgesaugt und durch 20 psi Argon ersetzt. Anschließend wurden 80 psi Stickstoffmonoxid in den Behälter gegeben, und der Behälter wurde 3 Tage lang stehen gelassen. Das Reaktionsprodukt wurde zur Trennung mit Diethylether ausgefällt. Das Reaktionsschema ist in der folgenden Formel 5 gezeigt. Formel 5
Bestätigung von Eigenschaften von F127-bPEI-NONOat
1) Bestätigung der Bildung von funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppen
Durch quantitative Messung mittels NMR wurde bestimmt, ob in F127-bPEI1.3-NONOat eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe entstanden ist. Die ¹H-NMR-Spektrum-Ergebnisse sind in 7 gezeigt. F127-bPEI hat seine Signale im Allgemeinen an drei Positionen im ¹H-NMR-Spektrum. Im ¹H-NMR-Spektrum erscheint das Signal für das Methyl-Wasserstoffatom (a von 7) einer von Propylenglycol abgeleiteten Repetiereinheit von Pluronic F127 bei δ = 1,15 ppm, während das Signal für die Methylen-Wasserstoffatome (c von 7) bei δ = 3,2 bis 4,0 ppm erscheint. Außerdem zeigen Methylen-Wasserstoffatome in α-Stellung (d von 7) zu einer funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe von bPEI Signale um δ = 2,9 ppm herum, während die Signale für Methylen-Wasserstoffatome (b von 7) von bPEI im Allgemeinen um δ = 2,6 ppm herum im ¹H-NMR-Spektrum erscheinen.
In 7 weisen (1), (2) bzw. (3) auf ¹H-NMR-Spektren von erzeugtem F127-bPEI0.8-NONOat, erzeugtem F127-bPEI1.0-NONOat und erzeugtem F127-bPEI1.3-NONOat hin. Die NMR-Analyse bestätigte, dass im Verlaufe der Herstellung des Donors 35,1% der sekundären Amingruppen bei F127-bPEI0.8-NONOat, 33,1% bei F127-bPEI1.0-NONOat und 35,1% bei F127-bPEI1.3-NONOat vor der Reaktion im Hauptketten-Seitenketten-Konstrukt in funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppen umgewandelt wurden.
2) Hydrogelbildungsexperiment
Ein Experiment wurde mit F127-bPEI-NONOat durchgeführt, um die Bildung eines wärmeempfindlichen Hydrogels zu belegen. Es ergab sich, dass F127-bPEI-NONOat ein ähnliches Hydrogel bildet, wie es unter Verwendung des in 6 gezeigten F127-bPEI gebildet wurde (Daten nicht gezeigt). Alle drei oben beschriebenen F127-bPEI-NONOate bildeten stabil wärmeempfindliche Hydrogele wie bei F127-bPEI.
3) Analyse der NO-Freisetzung
Die NO-Freisetzung der F127-bPEI-NONOat-Donoren, die Hydrogele bildeten, wurde wie bei bPEI-NONOat durch Grieß-Analyse analysiert. Die Analyseergebnisse sind in 8 gezeigt. Bei bPEI600-NONOat betrug die Halbwertszeit des gesamten freigesetzten NO nicht mehr als 1 Minute, während die Halbwertszeiten des gesamten freigesetzten NO von F127-bPEI0.8-NONOat, F127-bPEI1.0-NONOat und F127-bPEI1.3-NONOat im Bereich von etwa 1,6 bis 2,4 Stunden lagen, was bedeutet, dass F127-bPEI0.8-NONOat, F127-bPEI1.0-NONOat und F127-bPEI1.3-NONOat NO in einer nicht weniger als 100-mal langsameren Geschwindigkeit als bPEI600-NONOat freisetzten.
4) Zelltoxizitätstest
Ein Zelltoxizitätstest (analysiert mit einem CCK-8-Kit, erhältlich von Dojindo, Japan) wurde mit F127-bPEI0.8-NONOat-Hydrogel durchgeführt. Als Versuchsgruppen wurden humane Nabelschnurendothelzellen (HUVECs), bei denen es sich um Gefäßendothel-Zelllinien handelt, oder Zellen der glatten Muskulatur von Koronararterien, bei denen es sich um Zelllinien der glatten Gefäßmuskulatur (SMC) handelt, auf einem F127-bPEI0.8-NONOat-Hydrogel kultiviert, und die Zahl der kultivierten Zellen wurde gemessen. Als Kontrolle wurden dieselben Zellen, wie sie in der Versuchsgruppe verwendet wurden, auf einer allgemeinen 24-Well-Platte kultiviert. Die Testergebnisse sind in 9 gezeigt. Die Daten in 9 sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Student-T-Test vorgenommen. Die Symbole ** und *** zeigen eine statistische Signifikanz auf einem Niveau von p < 0,001 bzw. p < 0,001 an.
Wie aus 9 hervorgeht, bewies F127-bPEI0.8-NONOat eine Verstärkung von 48,1% bzw. 26,1% bei der Vermehrung von HUVEC im Vergleich zu denjenigen, die durch F127- bzw. F127-BPEI0.8-vermittelte Vermehrung erreicht wurden. Weiterhin war die Vermehrung der SMC auf den mit F127-bPEI0.8-NONOaten beschichteten Platten im Vergleich zu mit F127 bzw. F127-bPEI0.8 beschichteten Platten signifikant um 35,0% bzw. 80,8% reduziert.
Anhand der in 9 gezeigten Ergebnisse wurde bestätigt, dass der Donor für die gezielte Freisetzung von NO unterschiedliche physiologische Wirkungen in Bezug auf die HUVECs und die SMCs aufwies. Wenn der Donor unter verschiedenen Anwendungen in einem Stent verwendet wird, kann die in-Stent-Restenose also stabil und effizient verhindert werden.
Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass die hier beschriebenen beispielhaften Ausführungsformen nur in einem beschreibenden Sinn und nicht für Zwecke der Beschränkung anzusehen sind. Beschreibungen von Merkmalen oder Aspekten innerhalb jeder Ausführungsform sollten typischerweise als für andere ähnliche Merkmale oder Aspekte in anderen Ausführungsformen verfügbar angesehen werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

”Entwicklung eines Stickstoffoxidfreisetzenden blutverträglichen Stents (Zuordnungs-Nr. 20100002175)” [0002]
H. H. H. W. Schmidt und M. Keim in Methods in Nitric Oxide Research, M. Feelish und J. S. Stamler (Hrsg.), Wiley & Sons, New York, 1996 [0072]

Claims

Donor für die gezielte Freisetzung von Stickstoffoxid, wobei der Donor ein Polymer umfasst, enthaltend: eine Hauptkette aus einem organischen Polymer; und eine Seitenkette, die kovalent an die Hauptkette gebunden ist und eine funktionelle Diazeniumdiolat-Gruppe aufweist; wobei das Gerüst der Hauptkette ein Blockcopolymer umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Ethylenglycol/Propylenglycol-Copolymer, einem Lactat/Glycolat-Copolymer, einem Lactat/Ethylenglycol-Copolymer, einem Lactat-Glycolat-Ethylenglycol-Copolymer, einem Lactat-Glycolat-Propylenglycol-Ethylenglycol-Copolymer, einem ε-Caprolacton/Ethylenglycol-Copolymer, einem 3-Hydroxybutyrat/Propylenglycol-Copolymer, einem Propylenfumarat/Ethylenglycol-Copolymer, einem Organophosphagen/Ethylenglycol-Copolymer und einem Blockcopolymer auf Polypeptidbasis besteht; wobei das Polymer des Donors bei einer Temperaturerhöhung einen Sol-Gel-Phasenübergang erfährt, wobei die kritische Temperatur des Phasenübergangs in einem Bereich von 25 bis 35°C liegt und das Polymer des Donors oberhalb der kritischen Temperatur und bei einem in-vivo-pH-Wert ein Hydrogel ohne chemische Vernetzungen bildet.
Donor gemäß Anspruch 1, wobei das Gerüst der Hauptkette ein Ethylenglycol/Propylenglycol-Copolymer umfasst.
Donor gemäß Anspruch 1, wobei das Gerüst der Seitenkette ein Polymer umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyethylenimin, Polypropylenimin, Polypeptid und Chitosan besteht.
Donor gemäß Anspruch 1, der im Hydrogel weiterhin wenigstens ein pharmazeutisch aktives Material umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), einem entzündungshemmenden Mittel, Vitamin C, Acetylsalicylat, cholesterinsenkenden Wirkstoffen, thrombolytischen Mitteln, einem antithrombotischen Mittel, Heparin, Krebsmedikamenten und Oligonucleotiden mit antiproliferativer Aktivität besteht.
Donor gemäß Anspruch 4, wobei das pharmazeutisch aktive Material nicht kovalent an den Donor gebunden, sondern im Hydrogel dispergiert ist.
Donor gemäß Anspruch 4, wobei das pharmazeutisch aktive Material ein Konjugat bildet und kovalent an Sauerstoffatome der funktionellen Diazeniumdiolat-Gruppe gebunden ist.
Prothetisches Implantat, das auf seiner Oberfläche mit dem Donor für gezielte Freisetzung von Stickstoffoxid gemäß Anspruch 1 beschichtet ist.
Prothetisches Implantat gemäß Anspruch 7, wobei das prothetische Implantat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Stents, Kathetern, Elektroden, subkutanen Implantaten, chemischen Sensoren, Schrittmachern, Gefäßimplantaten, Wundverbänden, Penisimplantaten, implantierbaren Pulsgeneratoren (IPG), implantierbaren Herzdefibrillatoren und Nervenstimulatoren besteht.