CN114159620A

CN114159620A - 一种用于钛及钛合金植入材料的抗菌防松动涂层

Info

Publication number: CN114159620A
Application number: CN202111481179.3A
Authority: CN
Inventors: 张海军; 马慧君; 支树迪; 袁坤山
Original assignee: Shandong Branden Medical Devices Co Ltd
Current assignee: Shandong Branden Medical Devices Co Ltd
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-03-11

Abstract

本发明具体涉及一种用于钛及钛合金植入材料的抗菌防松动涂层，包括以下制备步骤：1）将支链聚乙烯亚胺（BPEI）和一氧化氮（NO）作为原料制备聚乙烯亚胺偶氮二醇烯鎓盐（BPEI‑NONOates）作为NO供体材料；2）制备正离子化钛及钛合金基体；3）表面明胶单层膜的制备。本发明使用明胶和NO供体物质对钛金属材料进行改性，通过延长NO的释放时间来赋予材料持续抗菌的效果；解决了钛及钛合金植入体在体内易感染，易松动等问题。

Description

一种用于钛及钛合金植入材料的抗菌防松动涂层

技术领域

本发明涉及一种用于钛及钛合金植入材料的抗菌防松动涂层，属于生物医学材料技术领域。

背景技术

钛及钛合金具有质轻、无毒、耐磨、抗腐蚀和生物相容性好等优点，在临床上被广泛用作植入体的基体材料。钛及其合金虽然具有良好的强度和韧性，但它们属于生物惰性材料，只能与周围组织之间形成简单的机械锁合，不能形成强有力的化学性键合，因此植入体在植入人体后很容易松动甚至脱落。在钛及钛合金植入物的植入早期，由于内植物/组织界面血管分布少，防御能力低，细菌易入侵从而发生感染，最终会导致植入物植入失败。目前研究在关注钛及钛合金植入物材料抗菌能力的同时，难以兼顾其对组织生长愈合的促进作用。因此，研发一种兼具促进组织细胞生长和抗菌功能的钛及钛合金植入物涂层成为解决问题的关键。

一氧化氮（NO）是一种内源性的亲脂分子，在许多生理学和病理学过程中起关键的调节作用，尤其对天然免疫系统中的抗感染起着关键性作用。NO分子与周围环境中的氧化剂发生反应生成的副产物过氧亚硝酸盐（ONOO^–）和三氧化二氮（N₂O₃）易导致细菌膜的脂质过氧化作用，从而表现出显著的抗菌性能，在针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌研究中显示出高效的抗菌效果，且NO表现出良好的抗生物膜形成效果。同时，NO还能促进伤口愈合，增加肌成纤维细胞和胶原蛋白的产生，是一种良好的抗菌物质。

中国专利文献CN202010784905.8提供了一种抗菌功能材料，其中NO供体材料在光、热或水汽的刺激下能缓慢释放NO，加入促释剂帮助NO的释放行为，能起到抑制微生物生长、杀菌抗病毒的作用。但是该发明的NO释放需要的光、热等条件，且需要外加促释剂，不适用于人体内环境，无法用于体内植入物。同时，NO的释放时间为4~8 h，也不适用于长时间需要抑菌的环境。

中国专利文献CN202010565315.6提供了一种兼具抗菌、促成骨分化及矿化的载碘钛合金植入物及其制备方法，该发明通过共价接枝及氧化还原反应的方法将碘涂层固定到钛合金上，制得的碘涂层钛片表现出抗菌性能，同时能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化。但是该专利中使用碘元素作为杀菌有效成分，不能促进组织、皮肤细胞的生长，且利用共价键合的碘涂层无法发挥游离碘的强抑菌性，长期使用的抑菌效果难以判断。

发明内容

本发明的目的在于利用NO的抗菌和促进组织愈合的能力以及明胶良好的生物相容性，提供一种基于钛及钛合金植入体抗菌防松动的涂层材料及其制备方法。本发明根据偶氮二醇烯鎓盐（NONOates）在体内能自发稳定地释放NO，且释放简单、无需细胞代谢等优点，将NONOates连接到明胶上，制备出拥有持续性灭菌效果、促进组织细胞愈合生长和防止体内植入物松动的钛及钛合金涂层材料。

本发明的目的之一是提供一种钛及钛合金植入体抗菌防松动的涂层及其制备方法，其采用的技术方案如下：

一种持续性抑菌涂层，其特征在于，所述涂层为明胶单层膜结合聚乙烯亚胺偶氮二醇烯鎓盐所制；所述涂层的接触角为54±7°；所述涂层持续释放NO时间为40~60小时。

优选的，所述聚乙烯亚胺为低分子量支链聚乙烯亚胺（BPEI），分子量为500Da~2kDa，伯、仲胺的摩尔比约为1:1.5~2。

进一步优选的，所述BPEI-NONOates的合成方法，包括以下步骤：

（1）将BPEI、无水甲醇、四氢呋喃混合后，在室温下搅拌均匀；

（2）将甲醇钠溶于无水甲醇，加入步骤（1）的混合溶液中，室温下恒温搅拌均匀；

（3）将步骤（2）中所得的混合溶液放置在内部高压反应器中，通入NO气体，反应一段时间后排出NO，产物用无水乙醚沉淀洗涤后真空干燥，得到淡黄色粉末即BPEI-NONOates；

反应方程式：

。

优选的，所述明胶单层膜是由分子量为1.40×10⁵g/mol的明胶分子构成的，M_w/M_n为1.43，制备明胶膜时所用的明胶溶液浓度为3.5 wt%~4.2 wt%。

优选的，明胶单层膜的厚度为12.4~15 nm，所述膜的接触角为54±7°。

本发明具有以下技术效果：

1、本发明所选的抗菌有效成分为NO，是一种重要的体内生物信使分子，有着增强骨骼肌、延缓骨骼衰老、消炎抗炎、帮助伤口愈合等优异的功效；

2、利用支链重氮化制备的BPEI-NONOates是一种亲核NO供体，是最近十几年发展起来的具有优良性能的外源性NO供体药物，在体内能自发稳定地释放NO，且释放简单、无需细胞代谢，长时间应用不易产生耐受性；

3、明胶单层膜与BPEI-NONOates的结合应用赋予了涂层良好的生物相容性和抗菌作用，且不影响NO在体内的释放，同时加速组织细胞的生长和伤口的愈合，减小钛金属植入物与组织之间的空隙，起到良好的固定作用，也减少了细菌在空隙的吸附，更能起到抗感染的效果。

附图说明

图1为37℃时涂层在DPBS缓冲溶液中的累积NO释放量(%)随时间的变化。

图2为各涂层对HUVEC进行细胞增殖试验结果。数据以纯钛片的实验结果作为底数表示。

图3为样品的抑菌实验结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。

本发明实施例所用试剂除非特别说明，均为普通市售产品。

本发明中BPEI-NONOates制备方法，包括以下步骤：

（1）将BPEI按质量比1:4:13溶于无水甲醇和四氢呋喃中制备BPEI的溶液，在室温下搅拌均匀；

（2）将甲醇钠（与BPEI的摩尔比为2.5:1）溶于无水甲醇并加入到BPEI溶液中，搅拌均匀后放置在内部高压反应器中；

（3）高压反应器用140 kPa的氩气冲洗两次，每次10 min，以除去残留的氧气。然后在550 kPa下充入NO气体，在室温下搅拌反应充分。然后排出NO，用140 kPa的氩气冲洗反应器两次，之后用四氢呋喃/无水乙醚沉淀产品。通过过滤快速去除溶剂，并用无水乙醚洗涤产物，然后真空干燥，得到淡黄色产物。产物储存在-20℃下。

实施例1

一种基于钛及钛合金植入体抗菌防松动的涂层材料及其制备方法，包括以下步骤：

（1）钛金属样品均为圆形，直径为1.0 cm且厚度为1 mm，使用600目、1200目、2500目、6000目砂纸依次对钛片进行打磨抛光至表面光滑，用去离子水和无水乙醇分别超声清洗钛片各15 min，之后在50℃烘箱干燥12 h备用。配制30% H₂O₂和浓硫酸体积比为3:7的酸刻蚀液，将清洗干燥后的钛片浸入刻蚀溶液1 h，然后用去离子水冲洗至中性，放入50℃烘箱干燥12 h；

（2）用分子量为800Da，伯、仲胺的摩尔比为1:1.8的BPEI制备BPEI-NONOates，用4℃的去离子水配制1 mg/mL的BPEI-NONOates水溶液，将上述酸蚀的钛片用BPEI-NONOates溶液在4℃低温下处理，之后用2 mol/L的NaOH溶液清洗5次，去除掉结合不牢的电荷，最后用氮气吹干后再冷冻干燥12 h；

（3）配制50 mL质量浓度为4%的明胶溶液，将明胶置于去离子水中，室温溶胀后，将其放入50 ℃的水浴中加热搅拌，使其完全溶解，然后用NaOH把溶液的pH调节至10.00±0.2，在水浴中稳定一段时间后，向溶液中加入6 wt% 的十二烷基硫酸钠，水浴中稳定6 h备用，将处理好的钛片放入沉积盒中，向沉积盒倒入上述配制好的明胶溶液，室温下沉积10min，然后将其在2 mol/L的NaOH溶液中提拉20次，用氮气吹干后置于氮气中保存；

该方法制备的涂层NO释放时间为60 h，明胶膜厚约为13.2 nm。

实施例2

一种基于钛及钛合金植入体抗菌防松动的涂层材料及其制备方法：

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（2）改变BPEI的分子量为500Da，伯、仲胺的摩尔比为1:1.5，然后制备BPEI-NONOates；

该方法制备的涂层NO释放时间为55 h，明胶膜厚约为13.4 nm。

实施例3

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（2）改变BPEI的分子量为2kDa，然后制备BPEI-NONOates；

该方法制备的涂层NO释放时间为45 h，明胶膜厚约为13.2 nm。

实施例4

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（2）改变BPEI的分子量为2kDa，伯、仲胺的摩尔比为1:2，然后制备BPEI-NONOates；

该方法制备的涂层NO释放时间为42 h，明胶膜厚约为13.3 nm。

实施例5

一种抗菌防松动的涂层，制备方法：

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（3）改变明胶溶液的质量浓度为3.5%，然后制备明胶膜；

该方法制备的涂层NO释放时间为53 h，明胶膜厚约为12.6 nm。

实施例6

一种抗菌防松动的涂层，制备方法：

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（3）改变明胶溶液的质量浓度为4.2%，然后制备明胶膜；

该方法制备的涂层NO释放时间为48 h，明胶膜厚约为14.8 nm。

对比例1

一种抗菌防松动的涂层，制备方法：

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（2）改变BPEI分子量为25kDa，伯、仲胺的摩尔比为1:2，然后制备BPEI-NONOates；

该方法制备的涂层NO释放时间为30 h，明胶膜厚约为13.5 nm。

对比例2

一种抗菌防松动的涂层，制备方法：

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（2）改变BPEI分子量为2kDa，伯、仲胺的摩尔比为1:1，然后制备BPEI-NONOates；

该方法制备的涂层NO释放时间为38 h，明胶膜厚约为14.2 nm。

对比例3

一种抗菌防松动的涂层，制备方法：

其他同实施例1，不同之处在于，步骤（2）改变BPEI分子量为2 kDa，伯、仲胺的摩尔比为1:2，然后制备BPEI-NONOates；步骤（3）改变明胶溶液的质量浓度为6%，且不添加十二烷基硫酸钠，然后制备明胶膜，所制备的明胶膜厚约为380 nm；

该方法制备的涂层NO释放时间为6 h，明胶膜厚约为380 nm。

测试方法及步骤

1、通过Griess比色法分析测定涂层中的NO释放。将各样品（实施例1、实施例2、实施例5、对比例1）置于4℃的去离子水中5 min，之后在37℃、1.2 mL的DPBS缓冲溶液中培养。使用Griess比色法分析监测NO的释放，该方法基于高活性NO氧化为亚硝酸盐进行亚硝酸盐测量。简言之，在预定时间间隔取样1.2 mL后，将全新的DPBS（1.2 mL）添加到小瓶中。将样品（100 μL）添加到磺胺溶液（100 μL）中，并在室温下孵育5 min，避光处理。然后向混合物中添加萘乙二胺（100 μL）以刺激比色变化；用微孔板荧光分光光度计在548 nm处测量荧光强度，并与已知的亚硝酸钠标准品进行对比，部分结果如图1所示。

涂层释放NO的反应分子式为：

测试结果说明，NO的持续释放时间长短与聚乙烯酰胺的分子量和伯仲胺含量有关，BPEI-NONOates是以BPEI的仲胺为原料合成的，所以伯仲胺的比例对NO的储存量有影响。25kDa的BPEI-NONOates在初始阶段迅速释放NO，并在30 h内完成释放，而低分子量的BPEI-NONOates在初始快速释放，后续呈现持续释放模式，时间长达近60 h。考虑原因为低分子量的BPEI-NONOates其伯胺位置更接近重氮化位置，质子化的伯胺基通过与NONOates阴离子形成氢键，使NONOates部分具有稳定性，NO的释放更缓慢。

2、体外细胞增殖试验。将样品（纯钛片、实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3）在紫外线下灭菌30 min，之后将样品置于4℃的去离子水中，并在4℃下保持1h，然后在37℃的细胞培养皿上孵育2 min。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以1×10⁴个细胞/孔的密度接种在涂层细胞培养板（24孔）上，并在37℃下培养48 h。之后，通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖。结果如图2所示。

在合适剂量下，NO可以加速内皮细胞增殖，且明胶具有良好的生物相容性实验结果可得，该涂层对HUVEC的增殖具有良好的促进作用。4wt%位于明胶接触浓度和缠结浓度的交界区域，而十二烷基硫酸钠诱导明胶结构的展开，这一系列条件促进了明胶单层膜的制备，改变这些条件会导致明胶结构缠结和明胶层厚度增加，不利于NO的有序释放。但即使是NO释放时间短，涂覆明胶膜的对比例3依旧比纯钛片的效果好。

3、对涂层的抑菌性能进行测试。用无菌针管向培养皿中注入10⁷CFU/mL的混合菌液（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为主）0.5 mL和15 mL的熔化状琼脂培养基，将菌液与培养基混合均匀。用无菌镊子将样品（实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例3）置于带菌培养基平板的中央，盖上盖子。在37℃下培养48 h，观察样品圆片周围抑菌圈的有无及大小，结果如图3。NO可以杀灭或抑制多种病原微生物的生长，对体内环境起到良好的抗菌抗感染效果。NO的有序持续性释放是抗菌效果的一个关键因素。

Claims

1.一种用于钛及钛合金植入材料的抗菌防松动涂层，其特征在于，使用偶氮二醇烯鎓盐（NONOates）和明胶单层膜对钛及钛合金进行了改性，所述支链聚乙烯亚胺偶氮二醇烯鎓盐（BPEI-NONOates）的NO持续释放时间为40~60小时，明胶单层膜的厚度为12.4~15.0nm，涂层的接触角为54±7°。

2.根据权利要求1所述的涂层，其特征在于，制备BPEI-NONOates的支链聚乙烯亚胺分子量为500Da~2kDa，伯、仲胺基的摩尔比为1:1.5~2。

3.权利要求1所述的涂层，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

（1）合成BPEI-NONOates：支链聚乙烯亚胺（BPEI）和一氧化氮作为原料，加入甲醇钠的甲醇溶液，通过高压反应器进行支链重氮化反应，制备作为NO供体的BPEI-NONOates；

反应方程式为：

（2）正离子化处理：使用酸刻蚀液对钛金属进行处理，将步骤（1）制备好的BPEI-NONOates结合在钛金属表面，形成表面正离子化；

（3）钛金属表面明胶单层膜的制备：配置一定浓度的明胶溶液，加入一定量的十二烷基硫酸钠，调节pH至10.0±0.2，将步骤（2）处理好的钛金属放置在沉积盒中用配置好的溶液进行沉积，之后清洗干燥，得到所述涂层。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）的具体方法为：将BPEI、无水甲醇、四氢呋喃按一定比例混合后，在室温下搅拌均匀；将甲醇钠溶于无水甲醇后加入混合溶液中，搅拌均匀；将混合溶液放置在内部高压反应器中，通入NO气体，反应一段时间后排出NO，产物用无水乙醚沉淀洗涤后真空干燥，得到淡黄色粉末即BPEI-NONOates；

进一步优选的，BPEI、无水甲醇、四氢呋喃得质量比为1:4:13；

进一步优选的，甲醇钠与BPEI的摩尔比为2.5:1。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）的具体方法为：钛金属样品打磨抛光至表面光滑，用去离子水和无水乙醇分别超声清洗，之后用烘箱50℃干燥备用；配制30%H₂O₂和浓硫酸体积比为3:7的酸刻蚀液，将清洗干燥后的样品浸入刻蚀溶液1 h，然后用去离子水冲洗至中性，放入50℃烘箱干燥；配制一定浓度的BPEI-NONOates溶液，将上述酸蚀的样品用BPEI-NONOates溶液低温下处理一段时间后，用2 mol/L的NaOH溶液清洗5次，去除掉结合不牢的电荷，最后用氮气吹干后冷冻干燥12 h；

进一步优选的，步骤（2）中所述BPEI-NONOates溶液浓度为1 mg/mL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）的具体方法为：配制50 mL一定浓度的明胶溶液，然后用氢氧化钠把溶液的pH调节至10.00±0.2，在水浴中稳定一段时间后，向溶液中加入5~7 wt%的十二烷基硫酸钠，所有溶液在水浴中稳定6 h备用，将BPEI-NONOates处理好的样品放入沉积盒中，向沉积盒中倒入上述配制好的明胶溶液，室温下沉积10 min，然后将其在2 mol/L的氢氧化钠溶液中提拉20次，用氮气吹干后置于氮气中保存；

进一步优选的，步骤（3）中所述配制50 mL质量浓度为3.5~4.2 wt%的明胶溶液；

进一步优选的，步骤（3）中所述十二烷基硫酸钠的用量为6 wt%。

7.由权利要求1-6任一项所述方法制备得到的钛表面持续释放NO的明胶单层膜涂层材料。

8.如权利要求7所述的钛表面持续释放NO的明胶单层膜涂层材料的应用，其特征在于，用于钛植入物表面在人体内的抗菌和促进组织细胞生长，所述抗菌的菌种包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、表皮葡萄球菌等常见细菌。