CN111410754B - 一种s-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种s-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种S‑亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶及其制备方法应用。所述水凝胶由以下方法制得：(1)将巯基化多糖溶于水中得到A溶液；将S‑亚硝基硫醇溶于水中得到B溶液；(2)在搅拌状态下将B溶液加入到A溶液中并混合均匀，然后加入β‑GP调节体系pH至6.5～7.5，于37℃下孵育6～12h，得到S‑亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶。本发明的水凝胶可在人体生理条件下即可实现凝胶化并自发释放适量NO用于抑菌杀菌，可应用作为组织工程材料抗菌使用，且反应迅速、可在5～15min内凝胶化，原位成型、自动粘合，对任何形状、位置的创面都可有效的保护。在伤口敷料抗菌方面具有良好的应用前景。

Description

一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于抗菌材料技术领域，具体涉及一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
人类第一次认识到细菌是1683年，列文虎克首次用显微镜观察到细菌。自此，拉开了人类与细菌斗争的序幕。作为抗生素的代表，青霉素自发明使用以来就拯救了数百万伤员。它能够抑制或杀死细菌、真菌、病毒甚至是肿瘤。然而，近年来随着抗生素被滥用，这不仅会对治疗效果产生不利影响，而且会对人体产生严重的副作用，如致命的毒性或过敏反应。此外，过度使用或者盲目使用抗生素也会导致细菌的耐药性增加，许多抗生素已不再能杀死细菌，世界甚至可能进入“后抗生素时代”，这无疑会构成“恶性循环”灾难。
为了追求更有效的治疗药物，有必要开发能够杀死或抑制细菌的其他产品。一氧化氮(NO)在人体内具有重要的生理和药理作用，体内NO不足可引发高血压、动脉粥样硬化、冠心病、急性心肌梗塞、肺肾疾病以及男性性功能异常等疾病。研究结果表明NO还能够抑制或杀死细菌。NO诱导亚硝化和氧化应激直接修饰膜蛋白，被认为在抗菌方面起着至关重要的作用。这种活性物质可能包括NO自由基(NO·)、二氧化氮(NO2)、三氧化二氮(N2O3)和过氧亚硝酸盐(ONOO)。这些氧化剂通过自由基诱导DNA链断裂，促进脂质过氧化，这种现象能够杀死癌细胞和细菌。
然而，NO在体内具有较短的半衰期(1～5s)，并且与氧或者血红蛋白反应很容易失活，使NO减少，此时补充外源性NO是一种非常有必要的治疗措施。NO供体正是应这一临床需求产生的，不需要经过NO合酶催化，能够自发或者与其他物质作用产生NO的原位化合物，已被研究作为不稳定气态NO的替代物。但现有的供体材料存在NO负载量低，NO控释不容易掌控；有的甚至会产生亚硝胺(致癌物)，大部分抗菌效果不明显等问题。
天然多糖材料如海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖等多糖是自然界生物复合体中主要的有机成分，来源广泛，价格低廉，且这些材料具有良好的生物相容性和生物可降解性等，在组织工程研究中受到众多研究者的青睐，以天然多糖材料为原料进行组织工程研究是模拟天然组织的有效方法。
因此，开发一种原料价廉易得，合成快速简单，NO负载量和释放量适宜，生物相容性好，抗菌效果优异的NO供体水凝胶具有十分重要的意义。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法。该制备方法以改性天然多糖为原料，和亚硝酸钠反应得到S-亚硝基硫醇，再和巯基化多糖基材料复合，控制凝胶的溶胀率、强度、降解速率等制备原位成型NO供体水凝胶。
本发明另一目的在于提供上述方法制得的一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶。本发明的水凝胶原料来源丰富、操作简便、凝胶时间短，反应条件温和、凝胶性能可控，无需其他化学交联剂即可实现凝胶化。且本发明水凝胶可在人体生理条件下自发释放适宜NO。
本发明再一目的在于提供上述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的应用，特别适用于抗菌敷料。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将巯基化多糖溶于水中得到A溶液；将S-亚硝基硫醇溶于水中得到B溶液；
(2)在搅拌状态下将B溶液加入到A溶液中并混合均匀，然后加入β-甘油磷酸钠(β-GP)调节体系pH至6.5～7.5，于37℃下孵育6～12h，得到淡黄色透明的S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶。
优选的，步骤(1)所述巯基化多糖为巯基化透明质酸、巯基化海藻酸钠和巯基化壳聚糖中的至少一种。
优选的，步骤(1)所述S-亚硝基硫醇为S-亚硝基海藻酸钠(SA-SNO)、S-亚硝基透明质酸(HA-SNO)和S-亚硝基壳聚糖(CS-SNO)中的至少一种。
优选地，步骤(1)所述巯基化多糖与制备S-亚硝基硫醇所用的巯基化多糖相同。
所述S-亚硝基硫醇由以下方法制得：
将巯基化多糖配制成pH为3～4的酸性水溶液，于避光、0℃下加入亚硝酸钠，在该条件下反应1～3h，纯化，得到S-亚硝基硫醇，其中反应体系中巯基和亚硝基摩尔比为2:1～1:2。
所述亚硝酸钠以亚硝酸钠水溶液的形式加入反应体系中，其中亚硝酸钠水溶液的浓度为5～15mg/mL。
当所述巯基化多糖为巯基化海藻酸钠时，配制成的酸性巯基化海藻酸钠水溶液的浓度为5～20mg/mL。当所述巯基化多糖为巯基化透明质酸时，配制成的酸性巯基化透明质酸水溶液的浓度为4～10mg/mL。当所述巯基化多糖为巯基化壳聚糖时，配制成的酸性巯基化壳聚糖水溶液的浓度为3～10mg/mL。
所述纯化的方法为：使用3500MWCO膜将产物混合物用去离子水透析8～12小时，冷冻后冻干，得到目标产物。
优选的，步骤(1)所述A溶液的浓度为0.03～0.04g/mL；所述B溶液的浓度为0.01g/mL。
优选的，步骤(2)所述B溶液中的S-亚硝基硫醇和A溶液中的巯基化多糖的摩尔量比为1:3～1:4。
优选的，步骤(2)所述β-GP以β-GP水溶液的形式加入，所述β-GP水溶液的浓度为0.3～0.58g/mL。
上述方法制得的一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶。
所述S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶是一种NO供体，可以在人体生理条件下自发释放NO。
上述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的应用。
所述应用优选在组织工程抗菌材料中的应用，更优选在抗菌辅料材料中的应用。
本发明制备方法以改性天然多糖为原料，和亚硝酸钠反应得到S-亚硝基硫醇，再和巯基化多糖基材料复合，控制凝胶的溶胀率、强度、降解速率等制备得到凝胶性能可控的NO供体水凝胶。本发明的水凝胶原料来源广泛，合成反应条件温和、生物相容性好且性能可控，NO负载量和释放量可调，抗菌效果优异。且该水凝胶可有效保护手术创面，减少手术创面出血，具有消炎抗菌作用，促进伤口愈合，可应用作为组织工程材料，具有可注射性，且反应迅速、可在5～15min内凝胶化，原位成型、手术操作性强、手术过程中自动粘合，对任何形状、位置的创面都可有效的保护。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明的天然多糖基用水凝胶反应体系条件温和、容易操作和控制。
(2)本发明的天然多糖基水凝胶来源丰富，原料易得。
(3)本发明的巯基化多糖与亚硝酸钠合成S-亚硝基硫醇，反应简单快速，产率高，可得到适宜的NO供体。
(4)本发明天然多糖基水凝胶可利用不同的官能团摩尔比及溶液浓度与S-亚硝基硫醇共混，控制凝胶的溶胀率、强度、降解速率以及NO的释放速率与释放量等，制备得到凝胶性能可控的水凝胶。
(5)本发明的S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶可有效保护手术创面，减少手术创面出血，且具有消炎抗菌作用，能促进伤口愈合。
(6)本发明的S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶反应快速，原位成型，粘度大，手术操作性强，手术过程中可以自动粘合，对任何形状、位置的创面都可有效的保护。
附图说明
图1为实施例3中S-亚硝基海藻酸钠(SA-SNO)合成紫外谱图。
图2为实施例3中S-亚硝基透明质酸(HA-SNO)合成紫外谱图。
图3实施例4和5所得S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶成品图，其中a对应实施例4的水凝胶，b对应实施例5的水凝胶。
图4为实施例6中S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的上表面SEM图，a1对应实施例4的水凝胶，a2对应实施例5的水凝胶。
图5为实施例6中S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的横截面SEM图，b1对应实施例4的水凝胶，b2对应实施例5的水凝胶。
图6为实施例6中S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的纵截面SEM图，c1对应实施例4的水凝胶，c2对应实施例5的水凝胶。
图7为实施例7中S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶NO实时释放速率曲线图。
图8为实施例7中S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶NO释放总量曲线图。
图9为实施例8多种水凝胶抑菌圈测试图，其中，左图为对SA(金黄色葡萄球菌)的抑菌圈，右图为对EC(大肠杆菌)的抑菌圈，1为对比例1多糖基水凝胶，3为对比例2的多糖基水凝胶；2对实施例4的S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶，4为实施例5的S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶。
图10为实施例8中水凝胶对金黄色葡萄球菌(SA)的抑菌率曲线图。
图11为实施例8中水凝胶对大肠杆菌(EC)的抑菌率曲线图。
图12为实施例9中的CCK8测试图。
图13为实施例9中的细胞活死染色图(比例尺均为200μm)。
图14为对比例3所得水凝胶的成品图。
图15为对比例4所得水凝胶的成品图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：巯基化海藻酸钠的制备
将1g海藻酸钠(SA)粉末溶解于100ml去离子水中，加入一水吗啉乙磺酸(MES)使其浓度为0.1mol/L，用1mol/L的HCl溶液调整pH＝6.0。按照最终投料乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：COO-＝1:1:1的摩尔比，依次加入EDAC和NHS，并利用盐酸(HCl)溶液(1mol/L)调节体系pH＝5.0～6.0。避光条件下、室温搅拌反应20min后，再按照n-NH2/n-COOH＝1:1的摩尔比，往反应体系中加入半胱氨酸盐酸盐，并利用氢氧化钠(NaOH)溶液(1mol/L)调节体系pH＝5.0。同样在避光条件下、室温搅拌反应10h，将反应液置于透析袋(φ30,5000～8000KDa)中，分别用HCl溶液(pH＝5.0)、含1％(wt.％)氯化钠(NaCl)的HCl溶液(pH＝5.0)、HCl溶液(pH＝5.0)于4℃避光各透析1天，冷冻干燥24h，得到巯基化海藻酸钠(SA-SH)，密封避光4℃保存。从表1的巯基含量测定中可以看出，所得到的巯基化海藻酸钠中巯基含量较高，故合成成功。
实施例2：巯基化透明质酸的制备
将0.5g透明质酸(HA)粉末溶解于100ml去离子水中，按照最终投料乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：COO-＝1:1:1的摩尔比，依次加入EDAC和NHS，并利用盐酸(HCl)溶液(1mol/L)调节体系pH＝5.0～6.0。避光条件下、室温搅拌反应20min后，再按照n-NH2/n-COOH＝1:1的摩尔比，往反应体系中加入半胱氨酸盐酸盐，并利用氢氧化钠(NaOH)溶液(1mol/L)调节体系pH＝5.0。同样在避光条件下、室温搅拌反应10h，将反应液置于透析袋(φ30,5000～8000KDa)中，分别用HCl溶液(pH＝5.0)、含1％(wt.％)氯化钠(NaCl)的HCl溶液(pH＝5.0)、HCl溶液(pH＝5.0)于4℃避光各透析1天，冷冻干燥24h，得到巯基化透明质酸(HA-SH)，密封避光4℃保存。从表1的巯基含量测定中可以看出，所得到的巯基化透明质酸中巯基含量很高，故巯基化透明质酸制备成功。
表1
Figure BDA0002430398700000071
实施例3：S-亚硝基硫醇的制备
将两种100ml巯基化多糖水溶液(分别为SA-SH、HA-SH水溶液，其浓度均为0.005g/ml)分别使用1mol/L HCl调节至pH 3.5，并在冰浴中冷却至约0℃。用铝箔保护其免受光照。然后分别添加0.5g NaNO2在黑暗中于0℃下与巯基化多糖反应1.5h。在黑暗条件下，在冰浴中，使用3500MWCO膜将该反应溶液(S-亚硝基硫醇)用去离子水透析10小时。纯化后，将R-SNO溶液冷冻干燥并保存在-20℃下，分别得到SA-SNO和HA-SNO。如图1、2所示，紫外谱图中350nm左右处有特征峰，350nm处的峰表明S–NO键的n 0→p*电子跃迁，证明产物有S-NO键。由上表1，产物S-亚硝基硫醇的巯基含量变得很低，间接反映了亚硝基取代了巯基。综上得出S-亚硝基硫醇制备成功。
实施例4：S-亚硝基硫醇/巯基化海藻酸钠水凝胶的制备
将0.4g实施例1的巯基化海藻酸钠加入10mL去离子水中，充分溶解后得到巯基化海藻酸钠质量体积比为0.04g/mL的A液；将0.1g实施例3中的S-亚硝基海藻酸钠加入10mL去离子水中，充分溶解后得到质量体积比为0.01g/mL的B液；在磁力搅拌下将B液缓慢倒入A液中混合均匀；混合液在室温下磁力搅拌下加入1.67ml、浓度为0.58g/mL的β-GP水溶液调节pH至7，然后于37℃恒温水浴箱中孵育处理12h成淡黄色透明S-亚硝基硫醇/巯基化海藻酸钠水凝胶，如图3所示。
对比例1：SA-SH水凝胶的制备
取0.36g实施例1中巯基化海藻酸钠溶于10ml去离子水中，在磁力搅拌下溶解均匀，之后继续在搅拌状态下加入1.67ml、浓度为0.58g/mL的β-GP水溶液将溶液pH调至7，最后放入37℃恒温水浴箱中孵育处理12h即可得到白色的巯基化海藻酸钠水凝胶。
实施例5：S-亚硝基硫醇/巯基化透明质酸水凝胶的制备
将0.4g巯基化透明质酸加入10mL去离子水中，充分溶解后得到巯基化海藻酸钠质量体积比为0.04g/mL的A液；将0.1g S-亚硝基透明质酸加入10mL去离子水中，充分溶解后得到质量体积比为0.01g/mL的B液；在磁力搅拌下将B液缓慢倒入A液中，混合均匀；混合液在室温下磁力搅拌下加入1.67ml、浓度为0.58g/mL的β-GP水溶液调节pH至7，然后于37℃恒温水浴箱中孵育处理12h成淡黄色透明S-亚硝基硫醇/巯基化透明质酸水凝胶，如图3所示。
对比例2：HA-SH水凝胶的制备
取0.36g实施例2的巯基化透明质酸溶于10ml去离子水中。在磁力搅拌下将它溶解均匀，之后继续在搅拌状态下加入1.67ml、浓度为0.58g/mL的β-GP水溶液将溶液pH调至7，最后放入37℃恒温水浴箱中孵育处理12h即可得到白色的巯基化透明质酸水凝胶。
实施例6：在光学显微镜下观察S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的微观形貌
用扫描电镜观察实施例4和5所得两种水凝胶冻干后的微观形貌，如图4、5、6所示，其中a1、b1、c1分别为实例4水凝胶的上表面、横截面和纵截面，a2、b2、c2分别为实例5水凝胶的上表面、横截面和纵截面。从图中可知，水凝胶中上表面横截面富含大量孔隙，这与所预期的常规水凝胶形貌类似，且孔隙孔径均在100μm-2000μm，这些丰富孔隙的存在，保证了水凝胶的强大吸水能力和保水能力，纵截面孔隙小且致密，使得水凝胶有良好的力学性质。也正是由于以上特性，才使得水凝胶具有良好的生物相容性和类细胞质基质的特性，这为产物水凝胶随后的细胞实验打下了基础。
实施例7：S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶NO释放总量与释放速率测试
将实施例4、5制成的S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶，使用Griess试剂(购自上海碧云天生物科技有限公司)间接测定从水凝胶基质中释放的NO量。将水凝胶样品(200μL)浸入37℃的15ml的PBS(pH 7.2)中。以特定的时间间隔对培养基进行采样，并暴露于空气中2小时以产生亚硝酸盐。格里斯试剂是按照制造商的规程用去离子水配制成40g/L的浓度。然后将样品溶液与等体积的Griess试剂在96孔板中混合。将混合物在室温下孵育15分钟，并使用微板分光光度计在540nm处读取其吸光度，计算释放速率。为了测量与多糖基共轭的S-亚硝基硫醇的NO释放总量，使用NaNO2以类似方式制备标准曲线2，在已知浓度为0.72-36μmol/L的范围内将水凝胶以1mg/mL的浓度溶于去离子水中，并加热至120℃，以完全降解SNO键。将水凝胶溶液稀释20倍并按说明书与Griess试剂(购自上海碧云天生物科技有限公司)混合，并测量吸光度。结果如图7、8所示：两种水凝胶的NO释放量足以用来抗菌(研究表明：大于1μmol/mg即为有效抗菌浓度)。
实施例8：多种水凝胶抗菌测试
以每毫升106个菌落形成单位的浓度分别制备大肠杆菌(E.coli ATCC29522)和金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC25923)细菌悬浮液。将细菌悬浮液(200μL)在琼脂平板上擦拭。将实施例4、5所得的S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶(200μL)分别在圆形模具中制备，用于抑菌圈测试。仅多糖基的水凝胶(对比例1中的SA-SH水凝胶和对比例2中的HA-SH水凝胶)(200μL)用作对照。稳定30分钟后，将水凝胶放在琼脂板上。评估水凝胶抑制细菌在琼脂表面上生长的能力。温育12小时后，观察抑制区的面积并用相机记录，结果见图9：S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶相比纯多糖基水凝胶均出现了较明显的抑菌圈。为了进一步评价水凝胶的抗菌性能，测试样品的抑菌率。将灭菌好的水凝胶样品置于试管中，然后加入4mL细菌悬浮液(106/ml)以浸没水凝胶作为实验组，将只加入等体积的细菌悬浮液作为对照组。在37℃的振荡器中分别温育3、6、12、24和48小时后，取200μL细菌悬浮液于96孔板中，使用酶标仪测定培养液在波长570nm处的OD值。从图10、11(分别为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)抑菌曲线图得知，S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶对细菌有巨大的抑制作用。
实施例9：多种水凝胶的生物相容性表征
内皮细胞系(L929s)用于研究水凝胶的生物相容性。首先，将实施例4和5所得水凝胶以及SA-SH水凝胶和HA-SH水凝胶分别切成直径为7mm、厚度为1mm的薄膜试样，所制样品浸入75％乙醇中30分钟和UV照射1小时，再用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次以对样品进行灭菌；随后，将灭好菌的样品置于48孔板并浸入培养基2小时后进行L929s细胞接种，细胞接种密度为1*104/mL。然后转至37℃的细胞培养箱中培养5天，每2天更换培养基。细胞毒性考察：将细胞悬液(浓度为1*104/mLL929s悬液)逐滴加入每个孔中，每孔加200μL，培养两小时后每孔加入1ml培养液，换液2天/次，并在37℃下CO2气氛中培养1、3、5和7天。对照组设置为监测正常环境中的细胞生长。达到预定时间后，每个孔用PBS轻轻冲洗3次，加入1mL培养基和100μLCCK-8试剂(Cell Counting Kit-8购自solarbio)，随后培养1.5小时(37℃)。将各孔的上清液转移到96孔培养板中。用多功能酶标仪(BIO-RAD，USA)测定样品在450nm处的吸光度。从图12中可以看出，S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶和纯多糖基水凝胶活力相比没有明显差异。细胞活死染色：在培养期间的第3和5天，分别使用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)对活/死细胞进行连续染色，通过倒置荧光显微镜观察活/死细胞的状态。结果见图13，四种水凝胶培养的细胞都很密集，细胞形态较好。综上，S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶具有较好的生物相容性。
对比例3
将实施例4中0.4g巯基化海藻酸钠改成0.1g巯基化海藻酸钠，其他条件与实施例4完全相同，制备S-亚硝基硫醇/巯基化海藻酸钠水凝胶。所得水凝胶的样品见图14，结果表明，该水凝胶的成胶性能差，较难成胶。
对比例4
将实施例5中0.4g巯基化透明质酸改成0.1g巯基化透明质酸，其他条件与实施例5完全相同，制备S-亚硝基硫醇/巯基化透明质酸水凝胶。所得水凝胶的样品见图15，结果表明，该水凝胶的成胶性能差，较难成胶。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将巯基化多糖溶于水中得到A溶液；将S-亚硝基硫醇溶于水中得到B溶液；
（2）在搅拌状态下将B溶液加入到A溶液中并混合均匀，然后加入β-甘油磷酸钠调节体系pH至6.5~7.5，于37℃下孵育6~12h，得到S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶；
步骤（1）所述S-亚硝基硫醇为S-亚硝基海藻酸钠、S-亚硝基透明质酸和S-亚硝基壳聚糖中的至少一种。
2.根据权利要求1所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述B溶液中的S-亚硝基硫醇和A溶液中的巯基化多糖的摩尔量比为1:3~1:4。
3.根据权利要求1所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述巯基化多糖为巯基化透明质酸、巯基化海藻酸钠和巯基化壳聚糖中的至少一种；
步骤（1）所述巯基化多糖与制备S-亚硝基硫醇所用的巯基化多糖相同。
4.根据权利要求1或2或3所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述A溶液的浓度为0.03~0.04 g/mL；所述B溶液的浓度为0.01 g/mL。
5.根据权利要求1或2或3所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述β-甘油磷酸钠以β-甘油磷酸钠水溶液的形式加入，所述β-甘油磷酸钠水溶液的浓度为0.3~0.58g/mL。
6.根据权利要求1或2或3所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述S-亚硝基硫醇由以下方法制得：
将巯基化多糖配制成pH为3~4的酸性水溶液，于避光、0℃下加入亚硝酸钠，在该条件下反应1~3h，纯化，得到S-亚硝基硫醇，其中反应体系中巯基和亚硝基摩尔比为2:1~1:2。
7.根据权利要求6所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述亚硝酸钠以亚硝酸钠水溶液的形式加入反应体系中，其中亚硝酸钠水溶液的浓度为5~15 mg/mL；
当所述巯基化多糖为巯基化海藻酸钠时，配制成的酸性巯基化海藻酸钠水溶液的浓度为5~20 mg/mL；
当所述巯基化多糖为巯基化透明质酸时，配制成的酸性巯基化透明质酸水溶液的浓度为4~10 mg/mL；
当所述巯基化多糖为巯基化壳聚糖时，配制成的酸性巯基化壳聚糖水溶液的浓度为3~10 mg/mL。
8.权利要求1~7任一项所述方法制得的一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶。
9.权利要求8所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶在组织工程抗菌材料中的应用。
10.根据权利要求9所述一种S-亚硝基硫醇/多糖基原位成型水凝胶在抗菌材料中的应用，其特征在于，所述组织工程抗菌材料为抗菌辅料。
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