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Verfahren zur Herstellung von Diazoketo-aminocarbonsäuren Aus Journ.
Am. Chem. Soc., 76 (1954), S. 2881 ff., 2884 ff. und 2887, ist O-Diazoacetyl-serin
als eine Diazogruppe enthaltendes Antibiotikum bekannt, welches auf gewisse Bakterien-
und Tumorarten wachstumshemmend wirkt. In den genannten Literaturstellen sind auch
fermentative und synthetische Verfahren zur Herstellung dieser neuen Verbindung
beschrieben. Nach den synthetischen Verfahren werden nur sehr geringe Ausbeuten
erhalten.
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Es wurde nun gefunden, daß man die Diazoketogruppe enthaltende Aminosäureabkömmlinge
in glatter Reaktion und mit guten Ausbeuten durch Umsetzung von Aminosäurederivaten
mit Diazomethan und anschließende alkalische Verseifung erhält, wenn man als Ausgangsverbindungen
Aminosäurehalogenide oder -säureanhydride verwendet, deren freie Aminogruppen trifluoracetyliert
sind.
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Der Erfindung liegt die Problemstellung zugrunde, freie Aminogruppen
in den als Ausgangsverbindungen verwendeten Aminosäurederivaten durch solche Gruppen
zu schützen, bei deren Eliminierung Reagentien eingesetzt werden können, welche
die Diazoketogruppe nicht angreifen. Aus diesem Grunde scheiden allgemein bekannte
Schutzgruppen, wie der Carbobenzoxy-, der p-Toluolsulfonyl- und der Phthalylrest,
aus. Bei den synthetischen Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-serin (vgl.
den ersten Absatz der Beschreibung) wird der Carbobenzoxyrest als Schutzgruppe verwendet,
womit die geringen Ausbeuten dieses Verfahrens zu erklären sind. Als geeignete Schutzgruppe
für die Aminogruppe wird nach dem Verfahren gemäß der Erfindung der Trifluoracetylrest
verwendet, welcher durch Behandlung mit wäßrigen Alkalien oder mit wäßrigem Ammoniak
ohne Beeinflussung der im Molekül vorhandenen Diazoketogruppe wieder eliminiert
werden kann.
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Als Aminosäurederivate, deren freie Aminogruppen trifiuoracetyliert
sind und die in Form der Säurehalogenide oder Säureanhydride eingesetzt werden,
seien beispielsweise genannt: N-Trifluoracetyl - L - asparaginsäure-4-chlorid-1
-äthylester, N-Trifluoracetyl-L-glutaminsäure-5-chlorid-1-äthylester, 2-Trifluoracetylamino-adipinsäure-6
-chlorid-1 -methylester, fl-Trifluoracetylamino-propionsäurechlorid, sym. -Bis-
(ß-trifluoracetylamino propion-
| NH-CO-CFa NH - CO - CF, |
| Diazomethan |
| QH5-QC-CHCH2-CH2-COU QH5QC-CH-CH2-CH2-CO-CHN2 |
| Alkalien, N Ha |
| Ammoniak |
| > HQC-CHCH-CH2-CH2-CO-CHN2 |
Die Umsetzung der Ausgangsverbindungen mit Diazomethan erfolgt in üblicher Weise,
wobei zweckmäßig ein säure)-anhydrid. Weiterhin kommen selbstverständlich auch entsprechende
Di- und Polypeptide in Betracht, von denen beispielsweise erwähnt seien: N -Trifluoracetyl
- L - alanyl - L - alamnchlorid, N - Trifluoracetylglycyl-L-valyl-L-alanyl-chlorid,
N-Trifluoracetyl-y- (L-glutamyl)-L-glutaminsäurechlorid-bis-a-äthylester, N-Trifluoracetyl
- a - (L - glutamyl) - glycin - äthylester - 5-chlorid.
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Insbesondere sind solche Aminosäurederivate geeignet, die in f-Stellung
eine veresterte Carboxylgruppe tragen, sowie die entsprechend gebauten Peptide.
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Die Herstellung der als Ausgangsstoffe verwendeten Aminosäurederivate
kann beispielsweise durch Umsetzen der zugrunde liegenden Aminosäuren mit Trifluoressig
säureanhydrid, Öffnung des Ringes in den gebildeten N-Trifluoracetyl-amino-dicarbonsäureanhydriden
mit absoluten Alkoholen und Überführen der gebildeten Halbester, beispielsweise
mit Thionyl-chlorid, in die entsprechenden Esterchloride vorgenommen werden (vgl.
auch Chem. Ber., 87 {1954, S. 248 ff.).
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Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegt, beispielsweise im Falle
der Verwendung von N-Trifluoracetyl-L-glutaminsäure-4-chlorid-1 -äthylester, nachstehendes
Reaktionsschema zugrunde: Überschuß von mehr als 2 Mol Diazomethan angewendet wird.
Man arbeitet vorteilhaft in indifferenten Lösungs-
mitteln, beispielsweise
Äther und Tetrahydrofuran, sowie bei Zimmertemperatur oder mäßig erniedrigter Temperatur.
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Die Eliminierung der Trifluoracetylgruppe wird durch alkalische Verseifung,
vorzugsweise bei Zimmertemperatur, vorgenommen. Als Verseifungsmittel können wäßrige
Alkalien, wie Alkali- und Erdalkalihydroxyde, sowie wäßriges Ammoniak eingesetzt
werden. Enthalten die Aminosäurederivate eine in eine Estergruppierung umgewandelte
Carboxylgruppe, so wird diese bei der alkalischen Verseifung gleichzeitig regeneriert.
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Die Verfahrenserzeugnisse stellen wertvolle Heilmittel dar, die beispielsweise
antibiotische oder tumorhemmende Eigenschaften aufweisen. So wird das Wachstum von
Bacterium coli durch 0,8 Fg e-Diazo-d-oxo-L-norleucin pro ccm in einem synthetischen
Nährmedium ohne Purine halbmaximal gehemmt.
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Beispiel 1 e-Diazo-8-oxo-L-norleucin a) £-Diazo -8-oxo-N -trifluoracetyl
- L-norleucin - äthylester 19 g N -Trifluoracetyl-L-glutaminsäure - 5-chlorid- 1-äthylester
werden in fester Form allmählich in eine ätherische Diazomethanlösung eingetragen,
die einen Überschuß an Diazomethan enthält. Nach Beendigung der Stickstoffentwicklung
werden überschüssiges Diazomethan und der Äther abdestilliert. Man erhält nach dem
Waschen des festen Rückstandes mit Äther den E-Diazob-oxo-N-trifluoracetyl-L-norleucin-äthylester
zunächst in öliger Form. Die Ausbeute beträgt mehr als 90°lO der Theorie. Die grünlichgelbgefärbte
Verbindung wird beim Abkühlen im Eisschrank fest und schmilzt bei 17 bis 18° C.
Sie läßt sich unter teilweiser Zersetzung bei 10-3 Torr destillieren. e-Diazo-8-oxo-L-norleucin
bl) I g£-Diazo-8-oxo-N-trifluoracetyl-L-norleucin-äthylester wird mit 15 ccm wäßrigem
Ammoniak über Nacht geschüttelt, wobei Lösung eintritt. Nach Eindampfen der erhaltenen
Lösung unter vermindertem Druck und nach Umfällen aus einem Wasser-Alkohol-Gemisch
erhält man einen leicht gefärbten Rückstand, welcher nach Gefriertrocknung das e-Diazo-a-oxo-L-norleucin
darstellt.
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Die Verbindung zeigt eine positive Ninhydrinreaktion und entwickelt
mit Salzsäure Stickstoff. b2) Man schüttelt den in wenig Alkohol gelösten e-Diazod-oxo-N-trifluoracetyl-L-norleucin-äthylester
1$2 Stunde mit der zehnfachen Gewichtsmenge 1 n-Natronlauge bei 0° C, wobei Lösung
eintritt. Mit 1 n-Trifluoressigsäure
wird auf PH 5,4 eingestellt, mit etwas Tierkohle
gesdüttelt, filtriert und das Filtrat im Hochvakuum weitgehend, aber nicht vollständig
eingeengt. Beim Versetzen mit Aceton fällt das e-Diazo-8-oxo-L-norleucin aus. Es
wird aus Wasser (9 Volumen) durch Zusatz von Aceton (28 Volumen) ohne Erwärmen umkristallisiert.
Die Ausbeute beträgt 70 bis 80°lo der Theorie. Die Verbindung kristallisiert in
Form schwachgelbgefärbter: Nadeln und zersetzt sich beim Erhitzen zwischen 140 und
150° C.
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Sie zeigt ein zweibandiges Absorptionsspektrum, Schulter bei 244 mp
und ein ausgeprägtes Maximum bei 274 mp.
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C6H9O3N3 (171) Berechnet C 42,10, H 5,26, N 24,46, N (Diazo) 16,37;
gefunden C 41,91, H 5,32, N 24,11, N (Diazo) 16,04.
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Herstellung des als Ausgangsverbindung verwendeten N-Trifluoracetyl-L-glutaminsäure-5-chlorid-1-äthylesters
6,5 g N-Trifluoracetyl-L-glutaminsäureanhydrid - erhalten nach der in den Chem.
Ber., 87 (1954), S. 248 ff., angegebenen Vorschrift - werden auf 36 ccm absolutem
Äthylalkohol 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Abdampfen des
Alkohols wird der Rückstand in Benzol aufgenommen und mit der berechneten Menge
Dicyclohexylamin versetzt. Das erhaltene Dicyclohexylaminsalz des N - Trifluoracetyl
- L - glutaminsäure-l-äthylesters (Schmelzpunkt 188 bis 1890 C) wird in wäßrigem
Äthylalkohol gelöst und mit einem sauren sulfogruppenhaltigen Ionenaustauscher geschüttelt.
Nach Abfiltrieren des Ionenaustauschers, Entfärben der Lösung mit Aktivkohle und
Eindampfen unter vermindertem Druck zum Sirup tritt Kristallisation ein, und man
erhält den freien N-Trifluoracetyl-L-glutaminsäure-läthylester vom Schmelzpunkt
76 bis 770 C der mit einem Überschuß von Thionylchlorid in Benzol erhitzt wird.
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Nach Abdestillieren des Thionylchloridüberschusses und des Benzols
kristallisiert der N-Trifluoracetyl-L-glutaminsäure-5-chlorid-1 -äthylester aus,
der unter vermindertem Druck sublimiert werden kann.
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Beispiel 2 L-2-Amino-6-oxo-7-diazo-önanthsäure a) L-2-Trifluoracetylamino-adipinsäure-1
-äthylester E-Diazo-8-oxo-N- trifluoracetyl-L-norleucin-äthylester, erhalten nach
der im Beispiel 1, a) angegebenen Vorschrift, wird in wäßrigem Dioxan durch Belichten
mit UV-Licht einer Wolffschen Umlagerung unterworfen. Dabei resultiert der L - 2
- Trifluoracetylamino - adipinsäure - 1 - äthylester
der als Dicyclohexylaminsalz isoliert wird. Dieses schmilzt bei 156 bis 157° C.
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C22H37 O5N2F3 (466,5) Berechnet ....... C 56,63, H 8,00, N 6,01; gefunden
........ C56,75, H7,97, N6,15. b) L-2-Trifluoracetylamino-6-oxo-7-diazo-önanthsäureäthylester
Das nach a) gewonnene Dicyclohexylaminsalz (2 g) wird in 25 ccm Benzol heiß gelöst
und mit 3 ccm Thionylchlorid einige Stunden lang erwärmt. Nach Absaugen des ausgefallenen
Dicyclohexylaminhydrochlorids wird
unter vermindertem Druck eingedampft und das Benzol
abdestilliert. Das Säurechlorid bleibt in Form von Schuppen kristallisiert zurück.
Es wird in 40 ccm absolutem Äther gelöst und tropfenweise einer auf 0° C gekühlten
ätherischen Lösung von Diazomethan zugegeben.
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Nach Stehen über Nacht wird der Äther abdestilliert.
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Ausbeute 0,95 g (71 0/o der Theorie). Das Rohprodukt schmilzt bei
62 bis 65" C und bildet gelbe Kristalle. c) L-2-Amino-6-oxo-7-diazo-önanthsäure
Die Abspaltung des Trifluoracetylrestes und die Verseifung der Estergruppe aus dem
L-2-Trifluoracetylamino
6-oxo-7-diazo-önanthsäure-äthylester sowie
die weitere Aufarbeitung erfolgen nach der gleichen Vorschrift wie unter 1, b,)
bzw. 1, b2) angegeben. In der gleichen Weise wird die L-2-Amino-6-oxo-7-diazo-önanthsäure
aus Wasser unter Acetonzusatz umkristallisiert.
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Die Ausbeute beträgt 7801o der Theorie; Schmelzpunkt 125 bis 126°
C (unter Zersetzung, ab 1200 C Braunfärbung) .