DE1016263B

DE1016263B - Verfahren zur Herstellung von 20-Oxysteroiden

Info

Publication number: DE1016263B
Application number: DEF20193A
Authority: DE
Inventors: Dr Fritz Lindner; Josef Schmidt-Thome; Dr Rudolf Junk; Dr Georg Nesemann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1956-04-30
Filing date: 1956-04-30
Publication date: 1957-09-26

Description

Verfahren zur Herstellung von 20-Oxysteroiden Aus der Nebennierenrinde ist eine große Zahl von Steroiden isoliert worden. Einige von ihnen haben besondere therapeutische Bedeutung als Nebennierenrindenhormone erlangt, z. B. Hydrocortison, Cortison, Desoxycorticosteron, Aldosteron. Über die Bedeutung anderer aus der Nebennierenrinde gewonnener Stoffe und ihre Entstehung ist noch wenig bekannt. So isolierten R e i c h s t e i n und Mitarbeiter unter anderem auch die dem Cortison und Hydrocortison entsprechenden 20-Dihydroverbindungen, die als Substanz U (44-Pregnen-17 a, 20 ß, 21-triol-3, 11-dion, Helv. Chim. Acta, Bd. 24, 1941, S. 247E) und als Substanz E (44-Pregnen-11 ß, 17 a, 20,B, 21-tetrol-3-on, Helv. Chim. Acta, Bd.20, 1937, S.978) bezeichnet wurden (zur Bezeichnung und Konfiguration vgl. L. F. Fieser und M. Fieser, Experientia, Bd. 4, 1948, S.285). Während R ei ch s t ei n bei diesen Verbindungen im Überlebenstest keine Wirksamkeit feststellte, fanden neuerdings A b e l s o n et a1. (Proc. Soc. exper. Biol. a. Med., Bd. 89, 1955, S. 386), daß Substanz E im Leberglykogentest an Mäusen Nebennierenrindenhormon-Wirkung besitzt. Damit gewinnen diese und ähnliche Verbindungen, vor allem solche mit einer 20ß-ständigen Oxygruppe, wie sie in den Substanzen U und E vorliegt, an Interesse.
Eine Reihe von chemischen Wegen ist beschrieben worden um 20 ß-Oxysteroide aus 20-Ketosteroiden durch Reduktion, vor allem mit Lithiumaluminiumhydrid, herzustellen (z. B. J u 1 i a n et a1., J. Amer. Chem. S oc., Bd. 73, 1951, S. 1982; A n t o n u c c i et a1., J. org. Chem., Bd. 18, 1953, S. 70; P o o s, J. Amer. Chem. Soc., Bd. 77, 1955, S. 4932; S h a p i r o et a1., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 77,1955, S. 2912). Bei dieser Herstellungsweise muß eine eventuell im Molekül vorhandene weitere Ketogruppe, z. B. in 3-Stellung, durch Ketalisierung oder Enolisierung geschützt werden. Eine andere chemische Darstellungsweise geht aus von in 17 (20) -Stellung ungesättigten Verbindungen, an die durch geeignete Überträger Sauerstoff angelagert wird (Logemann, Naturwissenschaften, Bd. 27, 1939, S.196; Serini und Logemann, Ber. dtsch. chem. Ges., Bd. 71, 1938, S. 1362; R u z i ck a und M ü 11 er, Helv. Chim. Acta, Bd. 22, 1939, S. 755). In allen diesen Fällen muß eine mehr oder weniger große Zahl von Zwischenstufen durchlaufen werden, so daß diese Verfahren sehr umständlich sind.
Weiterhin ist bekannt, daß sich eine 20-ständige Ketogruppe auch mikrobiologisch zu einer Oxygruppe reduzieren läßt. So beobachteten. F r i ed et a1. (J. Amer. Chem. Soc., Bd. 75, 1953, S. 5764), daß bei der Fermentation von Progesteron mit Streptomyces lavendulae als Nebenprodukt eine 20ß-Oxyverbindung entsteht. W e t t s t e i n et a1. (zitiert in Experientia, Bd.11, 1955, S.465) erwähnten die Bildung einer nicht näher charakterisierten 20 ß-Oxyverbindung aus Reichsteins Substanz S bei Bebrütung mit Streptomyces coelicolor ohne nähere experimentelle Angaben.
Es wurde nun gefunden, daß man 20-Oxysteroide in sehr guter Ausbeute dadurch erhalten kann, daß man 17 a 21-Dioxy-20-ketosteroide der fermentativen Einwirkung von Streptomyces hydrogenans (nov. spec.) unterwirft.

Der genannte Streptomycet wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in der Nähe von Frankfurt entnommen wurde. Er läßt sich folgendermaßen beschreiben (vgl. Tabelle 1)

Tabelle 1

Diagnost. Kennzeichen des Streptomyces hydrogenans (nov. spec.)

Nährboden Sporen und Luftmycel Wachstum Lösliches Kolonie

Bemerkungen

(Form und Farbe) Pigment

rückseite

Asparagin- hellgrau versport sehr gut - gelbbraun

glukoseagar mit bräunlichem

Ton

Der neue Streptomycesstamm ähnelt morphologisch sehr dem Streptomyces albus - besonders hinsichtlich seiner Wachstumsformen, sowie der Färbung von Luftmycel und Sporen -, unterscheidet sich jedoch in zwei biochemischen Reaktionen, von denen jede einzelne als Unterscheidungsmerkmal gewertet werden

Tabelle 2

Unterschiede zwischen Streptomyces hydrogenans und Streptomyces albus

Nährboden I Streptomyces hydrogenans I Strept. albus

Nitratbrühe .................... keine Reduktion Reduktion zu Nitrit

zu Nitrit

Celluloseagar .................. spärliches Wachstum kein Wachstum

und Sporenbildung

Stärkeagar .................... gute Stärkehydrolyse keine Stärkehydrolyse

Die Fermentaktivität des neuen Streptomycesstammes ist sehr hoch: Daher sind auch seine Anforderungen an den Nährböden gering.

Als Steroide, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung der Hydrierung- unterworfen werden können, sind solche geeignet, die an den Kohlenstoffatomen 17, 20, 21 eine Dioxyacetongruppierung tragen und im übrigen Teil des Steroidmoleküls weitere Oxy-und/oder Ketogruppen und/oder Doppelbindungen enthalten können. Beispielsweise seien erwähnt Reichsteins Substanz @ S (d4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion), Hydrocortison (44-Pregnen-11 ß, 17a, ;21-triol-3, 20-dion), Cortison (44-Pregnen-17a, 21-triol-3, 11, 2:0-trion), Prednison (d1, 4-Pregnadien-17 a, 21-diol-3, 11, 20-trion), Prednisolon (4I, 4-Pregnadien-11 fl, 17 a, 21-kann, eindeutig von diesem, so daß die Einordnung als neue Species gerechtfertigt erscheint.
Die Unterscheidungsmerkmale sind aus nachstehender Tabelle ersichtlich.
Der neue Stamm wird daher als Streptomyces hydrogenans bezeichnet. triol-3, 20-dion), 11-epi-Hydrocortison (d4-Pregnen-11 a, 17a, 21-triöl-3, 20-diön), 11-epi-Prednisolon (dl, 4-Pregnädien-11 a, 17a, 21-triol-3, 20-dion), Pregnan-3, 17, 21-triol-20-on, Allopregnan-3, 17, 21-triol-20-on, Pregnan-17; 21-diol-3, 20-dion, Allopregnan-17, 21-diol-3, 20-dion, die 11 a-, bzw. 11 ß-Oxy-, bzw.
'-11-Ketoderivate der zuletzt genannten Pregnan- und Allopregnanverbindungen und die entsprechenden di-Pregnen-, bzw. Al-Allopregnenverbindungen.
Die Züchtung und Fermentierung erfolgt in üblicher Weise auf einem geeigneten Nährboden, bestehend aus einer Kohlenstoffquelle, einer stickstoffliefernden Substanz, anorganischen Salzen und akzessorischen Stoffen. Als Kohlenstoffquelle kommen z. B. in Betracht Kohlenhydrate; Stärke; Dextrine; Zucker, Beispielsweise Glukose, Fruktose, Mannose, Galaktose, Maltose und Pentosen; Proteine, Peptone, Aminosäuren; Glycerin und andere Alkohole; Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure, Fettsäuren, bzw. deren Salze; Fette.
Als Stickstofflieferanten kommen z. B. in Frage pflanzliches oder tierisches Eiweiß, beispielsweise Sojamehl, Albumin, Milcheiweiß, Eieralbumin, Peiltone, Polypeptide, Aminosäuren, Harnstoff, Ammonsalze, Hefeextrakte und Maisquellwasser. Der Nährlösung können anorganische Salze zugesetzt werden, z. B. solche von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Mangan, Cobalt, Kupfer, Zink, Eisen und Molybdän; Sulfate; Phosphate. Als akzessorische Nährstoffe sind beispielsweise geeignet Hefeextrakt, Maisquellwasser, Malzextrakt, weiterhin auch Vitamine, Pyrimidine und Purine.
Die Fermentierung wird zweckmäßig aerob und submers entweder im Schüttelkolben oder in einem mit Rührer und Lufteinleitungsrohr versehenen Fermenter vorgenommen. Die Beimpfung der Fermenter erfolgt entweder direkt mit einer Sporenabschwemmung oder durch Myceleinsaat aus einer Vorkultur im Schüttelkolben. Die Fermentierung der Steroide wird bei 15 bis 40°, vorzugsweise bei etwa 30°, durchgeführt. Sie kann sowohl in einer normalen Kultur wie auch in sehr stark verdünnten Kulturen vorgenommen werden. Auch mit gewaschenem und in Wasser bzw. in einer Salz- oder Pufferlösung suspendiertem Mycel findet noch eine rasche und gute Umsetzung statt.
Die Steroide werden zweckmäßig gelöst in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Methanol, Äthanol, Propanol oder Aceton, einer einige Stunden bis Tage vorgewachsenen Kultur des Strept. hydrogenans in einer normalen oder mehr oder weniger verdünnten Nährlösung oder gewaschenen und in Wasser bzw. in einer Salz- oder Pufferlösung suspendiertem Mycel zugesetzt. Die Fermentation erfolgt submers in einem Fermenter oder Schüttelkolben. Die Dauer der Fermentierung beträgt einige Stunden bis Tage.
Bei Einsatz von Steroiden mit stark aktivierten Doppelbindungen - kann es vorkommen, daß gleichzeitig mit der 20-Ketogruppe auch eine Doppelbindung hydriert wird. So erhält man bei Anwendung einer Kulturlösung in normalem Nährmedium aus Prednison das 20-Dihydrocortison, wobei also die 20-ständige Ketogruppe und die 1 (2) -ständige Doppelbindung gleichzeitig hydriert werden. Die Hydrierung der Doppelbindung läßt sich aber weitgehend zurückdrängen, wenn man mit stark verdünnten Kulturlösungen arbeitet bzw. mit gewaschenem Mycel. Man kann in diesem Fäll beispielsweise so vorgehen. daß man eine in einem Schüttelkolben gezüchtete Vorkultur des Strept. hydrogenans in einen steriles Wasser oder eine Salzlösung enthaltenden Fermenter eingießt und erst dann das Steroid zusetzt, Die Verdünnung kann hierbei das 2- bis 100fache betragen. Man kann das Mycel aus der Vorkultur auch abfiltrieren, eventuell waschen; dann in einen Wasser oder eine Salz- bzw. Pufferlösung enthaltenden Fermenter überführen und dann das Steroid zusetzen und bebrüten.
Zur Aufarbeitung wird die gesamte Kulturlösung, eventuell nach vorherigem - Einen gen unter vermindertem Druck bis auf ein Zehntel -des ursprünglichen Volumens, mit einem finit Wasser nicht oder nur »beschränkt mischbaren Lösungsmittel erschöpfend extra= liiert. Als Lösungsmittel .kommen beispielsweise in Frage Chloroform, Methylenchlorid, Äthylenchlorid und entsprechende chlorierte Lösungsmittel; Butanol und entsprechende höhere Alkohole; Ketone; wie Diäthylketon, Dipropylketon und Dibutylketon; Essigester und Butylester. Die Extrakte werden stark eingeengt, worauf in den meisten Fällen das Hydrierungsprodukt direkt in Ausbeuten von 50 bis 80°/9 auskristallisiert. In manchen Fällen ist eine Reinigung durch Adsorptions- oder Verteilungschromatographie zweckmäßig. Der Verlauf der Fermentierung läßt sich mit Hilfe der Papierchromatographie, z. B. mit einer Mischung von Propylenglykol und Toluol, nach Z a f f a r o n i verfolgen.
Die erhaltenen 20-Dihydrosteroide, die zum Teil schon bekannt sind, besitzen Nebennierenrindenhormonwirkung und können therapeutisch als Heilmittel bei Nebennierenrindeninsuffizienz oder bei der Behandlung rheumatischer Erkrankungen Anwendung finden. Beispiel 1 a) Ein Fermentierungskolben von 201 Inhalt, der mit Rührer, Lufteinleitungsrohr und einem Zugabestutzen mit Kapsenbergverschluß versehen ist, wird mit 12 1 einer Nährlösung gefüllt, die 0,4% Fleischextrakt, 0,4% Peilton, 0,25% Kochsalz, 1% Glukose, 0,1% Leberextrakt, 0,1% Hefeextrakt enthält.
Nach dem Sterilisieren wird der Kolben mit 100 ccm einer 24 Stunden alten Schüttelkultur von Strept. hydrogenans auf dem gleichen Nährboden angeimpft. Man läßt 24 bis 36 Stunden bei 31° unter Rühren (250 Umdr./Min.) und Einleiten von Luft (2501/Std.) anwachsen und gibt dann eine Lösung von 4 g Reichsteins Substanz S (44-Pregnen-17 a, 21-diol-3, 20-dion) in 400 ccm Aceton unter sterilen Bedingungen der Kulturlösung zu und inkubiert unter den gleichen Bedingungen 48 Stunden.
Zur Aufarbeitung wird der gesamte Kolbeninhalt durch Einengen unter vermindertem Druck auf ein Volumen zwischen 200 bis 500 ccm gebracht, dann sechsmal mit 500 ccm Methylenchlorid extrahiert, die Methylerichloridlösüng über Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Ein .aliquoter Anteil wird nach der Methode von Z a f f a r o n i und Mitarbeiter (Science, Bd. 111, 1950, S. 6) an Schleicher & Schüll-Papier Nr. 2043 b M, chromatographiert. Die Zonen werden durch UV-Kontaktfotografie bei 240 a festgelegt, mit salzsaurem Äthanol extrahiert und die Lösungen im UV-Spektrophotometer bei 240 1,i. quantitativ ausgemessen. Dabei ergibt sich, daß der Methylenchloridextrakt 10 % unveränderte Substanz S und 75°/o 20-Dihydro-Substanz S (d4-Pregnen-17 a, 20 ,8, 21-triol=3-on) enthält.
Aus der Hauptmenge des eingeengten Methylenchloridextraktes erhält man ein Rohkristallisat. das aus 20-Dihydro-Substanz Sund etwas Substanz S besteht. Zur Reinigung wird es an einer Säule von 130 g Ma= gnesiumsilikat, bekannt unter dem Handelsnamen Florisil, adsorbiert und durch Elution mit folgenden Gemischen aufgetrennt: 1. 300 ccm -Benzöl -2. 300 ccm Äther 3. 300 ccm Äther-Aceton (9 : 1 v/v) 4. 150 ccm Äther-Aceton (9 : 1 v/v) 5. 150 ccm Äther-Aceton (7 : 3 v/v) 6. 150 ccm Äther-Aceton (7 : 3 v/v) 7. 200 ccm Äther-Aceton (2 : 1 v/v) g. 200 ccm Äther-Aceton (1 : 1 v/v) 9: 150 ccm Äther-Aceton (1 : 2 v/v) 10. 300 ccm Acetdn 11. 300 ccm Methanöl Aus der Fraktion 3 kristallisieren nach dem Einengen des Lösungsmittels 250 mg (6,3 %) Reichsteins Substanz S aus. Die Fraktionen 6 und 7 ergeben 2,8 g (70°/o) eines Kristallisats, das auf der Kofler-Schmelzbankbei 183"0" schmilzt, dann wieder fest wird und bei 194° erneut schmilzt. Beim Umkristallisieren aus Aceton oder Essigester bleibt der Schmelzpunkt unverändert. Aus den restlichen Fraktionen werden keine weiteren Kristalle erhalten. Auf Grund der analytischen Zusammensetzung und des Vergleichs mit authentischer Substanz (IR-Spektrum, Misch-Schmelzpunkt, optische Drehung) handelt es sich bei dem Hauptprodukt um 20-Dihydro-Substanz S (44-Pregnen-17a, 20,8, 21-triol-3-on).
b) Bei analoger Arbeitsweise, aber unter Verwendung von 3 1 Kulturlösung und einer Lösung von 1 g Reichsteins Substanz S in 100 ccm Aceton und bei einer Inkubationszeit von 5 Tagen ergibt die papierchromatographische Messung 90°/o Umwandlung in 20-Dihydro-Substanz S. Sie kristallisiert direkt aus der eingeengten Methylenchloriäextraktlösung rein aus.
- Beispiel 2 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g 11-epi-Hydrocortison (44-Pregnen-11 a, 17 a, 21-triol-3, 20-dion) in 100 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 4 Tage beträgt. Die papierchromatographische Messung ergibt eine Umwandlung zu 74% in 20-Dihydro-11-epihydrocortison (/J4-Pregnen-11 a, 17 a, 20 ß, 21-tetrol-3-on). Das aus dem Methylenchloridextrakt erhaltene Rohprodukt schmilzt nach dem Umkristallisieren aus Aceton bei 205 bis 206' (Kofler-Schmelzbank) bzw. 195 bis 196' (Schmelzblock) ; [a]" = 58 ± 2' (Alkohol).
Durch Acetylierung mit Pyridin-Essigsäureanhydrid erhält man das entsprechende 11a, 20ß, 21-Triacetat vom Schmelzpunkt 160° (Kofler-Schmelzbank) ; [a] D = 93 ± 3' (Alkohol).
Beispiel 3 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g Hydrocortison in 100 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 5 Tage beträgt. Die papierchromatographische Messung ergibt eine Umwandlung zu 70% in 20-Dihydro-hydrocortison (d4-Pregnen-11 ß, 17a, 20f, 21-tetrol-3-on). Die aus dem Methylenchloridextrakt erhaltenen Kristalle schmelzen bei 145' (Kofler-Schmelzbank) bzw. 126 bis 130' (Schmelzblock) ; [a] D = F 84°' (Alkohol). 20, 21-Diacetat: Schmelzpunkt 236 bis 238° (Kofler-Schmel.zbank) bzw. 227 bis 229° (Schmelzblock) ; [a1 ö = -f- 163,5' (Alkohol).
Aus dem Vergleich der Angaben der Schmelzpunkte und Drehungen für Reichsteins Substanz E bzw. dessen Diacetat und durch Mischprobe mit authentischem Material ergibt sich die Identität des Reduktionsproduktes mit Substanz E.
Beispiel 4 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, vorgenommen, wobei eine Lösung von 3,3 g Hydrocortison in 330 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 5 Tage beträgt. Ausbeute nach papierehromatographischer Bestimmung 80% an Dihydrohydrocortison; isoliert wurden 2,25 g.
Beispiel 5 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g Hydrocortison in 100 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 6 Tage beträgt.
Der verwendete Nährboden setzt sich folgendermaßen zusammen: 1% Maisquellwasser, 1°/o Glukose, 0,2'% K H2 P 04, 0,2 0/a (N H4) 2 H P 04, 0,02504 Mg S 04, 0,51/o Ca C 03. Ausbeute 80% 20-Dihydrohydrocortison.
Beispiel 6 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g Hydrocortison in 100 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 6 Tage beträgt.
Der verwendete Nährboden setzt sich folgendermaßen zusammen: 1% Sojamehl, 1% Glukose, 0,5% Kochsalz. Ausbeute 75% an 20-Dihydro-hydro= cortison.
Beispiel 7 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g Hydrocortison in 100 ccm Alkohol eingesetzt wird und die Inkubationszeit 6 Tage beträgt.
Der verwendete Nährboden setzt sich folgendermaßen zusammen: 1'% Glukose, 1% Pepton, 0;5% Fleischextrakt, 0,5% Kochsalz, 1% Ca C 03. Ausbeute 95% 20-Dihydro-hydrocortison; isoliert wurden 0,86 g.
Beispiel 8 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g Cortison in 100 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 5 Tage beträgt: Ausbeute nach papierchromatographischer Messung 96% 20-Dihydrocortison (B4-Pregnen-17 x, 20 ß, 21-triol-3, 11-dion), Die Substanz kristallisiert schwer, man erhält etwa 0,68g, Schmelzpunkt 190', danach wieder fest werdend und erneutes Schmelzen bei 204' (Kofler-Schmelzbank) : [a] " = -f- 148' (Dioxan), -f- 154'° (Alkohol). 20, 21-Diacetat: Schmelzpunkt 258' (Kofler-Schmelzbank') ; [a] ö = -184' (Dioxan), -f- 175', (Aceton).
Auf Grund des Vergleiches der Eigenschaften des Dihydroproduktes und seines Diacetats mit den Angaben der Literatur ist die Substanz identisch mit Reichsteins Substanz U.
Beispiel 9 Zu einer Lösung von 5,8g K H2 P 04 und 9,2g Nag H P 04 in 2,7 1 Wasser setzt man eine entsprechend Beispiel 1, a, gewonnene Vorkultur des Strept. hydrogenans in 300 ccm Nährlösung zu und gibt anschließend eine Lösung von 0,5 g Cortison in 50 ccm Aceton hinzu. Nach einer Inkubationszeit von 5 Tagen bei 31' C, 250 Umdr./Min. und 1001 Luft/Stunde erhält man eine Umwandlung zu 960/n in 20-Dihydrocortison.
Beispiel 10 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 9, vorgenommen, wobei unter Verwendung eines 48 Stunden vorgewachsenen Mycels aus einer Schüttelkultur in 300 ccm Nährlösung gearbeitet wird, das mit Wasser gut ausgewaschen und dann der Phosphatpufferlösung zugesetzt wurde.
Ausbeute nach papierchromatographischer Messung 70°/o 20-Dihydrocortison, 200/a eine nicht identifizierte Substanz, 8% Cortison. Beispiel 11 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g Prednisolon (d1,4-Pregnadien-11 ß, 17, 21-triol-3, 20-dion) in 100 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 5 Tage beträgt. Nach der papierchromatographischen Analyse und Messung findet eine Umwandlung zu 95% in 20-Dihydro-prednisolon (dP,4-Pregnadien-11ß,17a,20ß-21-tetrol-3-on) statt. Das Reaktionsprodukt kristallisiert sehr schwer. Es wird daher durch Acetylieren mit Essigsäureanhydrid-Pyridin in das 20, 21-Diacetat übergeführt. Man erhält 560 mg 20-Dihydroprednisolondiacetat (dl, 4-Pregnadien-11 ß, 17 a, 20,ß, 21-tetrol-3-on-20, 21-diacetat) vom Schmelzpunkt 243'' , wieder festwerdend, und erneutes Schmelzen bei 256 bis 258° (Kofler-Schmelzbank); [a]" =+134" (Alkohol). Das IR-Spektrum zeigt das Vorhandensein der dl, 4-3-Ketogruppe.
Durch vorsichtige Verseifung des Diacetats erhält man das freie 20-Dihydroprednisolon. Beispiel 12 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 1, b, vorgenommen, wobei eine Lösung von 1 g Prednison (dl, 4-Pregnadien-17 a, 21-diol-3, 11, 20-trion) in 100 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 5 Tage beträgt. Auf Grund der papierchromatographischen Analyse und Messung findet hierbei gleichzeitig Hydrierung der 20-Ketogruppe und der dl-Doppelbindung statt, und man erhält zu 751/o 20-Dihydrocortison (44-Pregnen-17 a, 20ß, 21-triol-3, 11-dion) . Aus der Extraktionslösung lassen sich 450 mg 20-Dihydrocortison isolieren, das identisch ist mit dem nach Beispiel 8 erhaltenen Produkt. Beispiel 13 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach den Beispielen 9 und 10, vorgenommen, wobei eine Lösung von 0,5 g Prednison in 50 ccm Aceton eingesetzt wird und die Inkubationszeit 5 Tage beträgt. Auf Grund der papierchromatohraphischen Analyse und Messung erhält man 60% 20-Dihydro-prednison (d1,4-Pregnadien-17a, 20ß, 21-triol-3, 11-dion). Da es sehr schwer kristallisiert, wird es durch Acetylieren mit Essigsäureanhydrid-Pyridin in das 20, 21-Diacetat übergeführt, das kristallisiert und bei 244° (Kofler-Schmelzbank) schmilzt. Durch vorsichtige Verseifung erhält man aus dem Diacetat das freie Dihydro-20-prednison.
Beispiel 14 Zu einer Schüttelkultur des Strept. hydrogenans in 500 ccm Nährlösung, entsprechend Beispiel 1, a, wird eine Lösung von 100 mg Cortison in 10 ccm Methanol zugesetzt und mit der Kultur 3 Tage unter Schütteln bei 28° inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgt entsprechend Beispiel 1, a. Auf Grund der papierchromatographischen Analyse ist das Cortison zu 64% in 20-Dihydrocortison übergeführt worden. Beispiel 15 Die Fermentation wird entsprechend Beispiel 1, a, modifiziert nach Beispiel 14, vorgenommen, wobei eine Lösung von 100 mg Cortison in 10 ccm Äthanol eingesetzt wird. Die Ausbeute an 20-Dihydrocortison nach papierchromatographischer Messung beträgt 70%.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 20-Oxysteroiden, dadurch gekennzeichnet, daß man 17a, 21-Dioxy-20-ketosteroide der fermentativen Einwirkung von Streptomyces hydrogenans (nov. spec.) unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation zwischen 15 und 40° vornimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Steroide, in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln gelöst, der Kultur des Streptomyces hydrogenans zusetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Steroidlösung einer vorgezüchteten Kultur des Streptomyces hydrogenans zusetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Steroidlösung einer stark verdünnten Kulturlösung des Streptomyces hydrogenans zusetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fermentpräparat für die Hydrierung das von der Lösung befreite, gegebenenfalls gewaschene Mycel von Streptomyces hydrogenans benutzt und die Fermentierung in reinem Wasser oder in einer Salz- bzw. Pufferlösung durchführt.