DD202717A5

DD202717A5 - Antivirale purinderivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DD202717A5
Application number: DD82242394A
Authority: DD
Inventors: Howard J Schaeffner
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1981-08-11
Filing date: 1982-08-10
Publication date: 1983-09-28
Also published as: DE3278501D1; JPS5841879A; CS594082A2; FI76086B; FI822783L; EP0072027B1; DK154561B; PL141281B1; PL247394A1; JPH04989B2; KR840001169A; NO822725L; ES8403128A1; PH20148A; DK359082A; IE821921L; FI822783A0; NO158539B; PH18814A; IE54148B1

Abstract

Von Verbindungen der allgemeinen Formel (worin R eine Hydroxy- oder Aminogruppe und X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeuten) und ihren physiologisch vertraeglichen Salzen und Estern ist bekannt, dass sie eine antivirale Wirkung vor allem gegen Herpesviren besitzen. Es werden Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen sowie pharmazeutische und tiermedizinische Zubereitungen beschrieben, welche diese Verbindungen enthalten.

Description

Anwendungsgebiet der¹ Erfindung

Die Erfindung betrifft antivirale Purinderivate, die eine acyclische Nebenkette in der 9-Stellung besitzen. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur synthetischen Herstellung dieser Verbindungen, pharmazeutische und tiermedizinische Zubereitungen, die diese Verbindungen enthalten, sowie deren Verwendung bei- der Behandlung von Virusinfektionen bei Säugetieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ogilivie und Gillen beschreiben in' Tetrahedron Letters, 21, 1980, 327-330, die Synthese der Bis-(Hydroxymethy1)-methcxymethylderivate des Adenin, jedoch wurde keine biologische Aktivität dargestellt. Die Verbindung wurde mit Adenosindesaminase getestet und erwies sich als schlechtes Substrat für das Enzym und als schwacher kompetitiver Hemmer.

9-[(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyIj-guanin und das ent-, sprechende 6-Aminoanaloge werden von der allgemeinen Formel der GB-PS 1 52 3 865 gedeckt, jedoch darin nicht speziell erwähnt, In der GB-PS 1 52 3 86 5 wird eine Gruppe von acyclischen Nucleotiden, insbesondere 9-(2-Hydroxyethoxymethy1)-derivate von Purinen beschrieben, die sowohl in vitro als in vivo antivirale Aktivität gegen verschiedene Klassen von DNA und RNA. Viren zeigten, Diese Verbindungen sind vor allem gegen die Herpesvirusgruppe aktiv, wozu H. simplex, H. zoster und H. varicella gehören. Diese Viren verursachen Erkrankungen wie Herpeskeratitis, Herpesencephalitis, Erkältungsentzündungen, Gür-felrose und Genitalinfektionen. Von den in der GB-PS 1 523 865 speziell aufgeführten Verbindungen bewies 9-(2-Hydroxyethoxymethyl)-guanin, auch als Acyclovir bekannt, besondere Aktivität gegen viele H. simplex Infektionen, es hat jedoch den Nachteil, daß es in wässrigen Systemen schlecht löslich .ist.

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Unerwartet wurde nunmehr gefunden, daß die Verbindungen der unten dargestellten Formel I im Gegensatz zu den anderen in der GB-PS 1 52 3 86 5 dargestellten und bisher getesteten Verbindungen eine brauchbare antivirale Aktivität besitzen, die ausreicht» um den equinen Rhinopneumonitisvirus in vivo zu behandeln. Bei Mäuseversuchen zeigten die Verbindungen auch eine günstige Aktivität gegen Herpesencephalitis. Diese Verbindungen haben ferner gegenüber Acyclovir den speziellen Vorteil einer größeren Löslichkeit in Wasser, was die Möglichkeit verbessert, höhere Spiegel des Medikaments im Plasma ohne das Risiko von Nierenkomplikationen zu erzielen.

Die Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I ' R

_(I)

CH₀XCHCH OH

¹ I ^z

Cworin R eine Hydroxy- oder Aminogruppe, und X ein Sauerstoffoder Schwefelatom bedeutet), sowie physiologisch verträgliche Salze und Ester derselben.

Beispiele für die Verbindungen der Formel I sind u.a.

9-C(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl]-guanin und 9-£(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl] -2,6-diaminopurin.

Wie bereits erwähnt haben die Verbindungen der Formel I den wichtigen Vorteil, daß sie besser in Wasser löslich sind als Acyclovir. So haben die Verbindungen der Formel I, in denen X ein Sauerstoffatom, und R eine Hydroxy-oder Aminogruppe bedeutet, Löslichkeiten von 0,4 bis 0,5 Gew.% bzw. 2 bis 3 Gew.%, gegenüber einem Wert von 0,14 Gew.% für Acyclovir.

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Salze der Verbindungen der Formel I, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können, sind u.a. physiologisch verträgliche Salze von organischen Säuren wie Milch-, Essig-, Apfel- oder p-Toluolsulfosäure, sowie physiologisch verträgliche Salze von Mineralsäuren wie Salz- oder Schwefelsäure.

Zu den Estern der Verbindungen der Formel I, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können, gehören u.a. diejenigen, die eine Formyloxy- oder C_1-1-- (z.B. C "__g-) Alkanoyloxy-(z.B. Acetoxy- oder Propionyloxy) Estergruppe, eine substituierte Aralkanoyloxy- (z.B. Phenyl-C.^-Alkanoyloxy-, wie z.B. Phenyl-Acetoxy-) Estergruppe, oder eine substituierte Aroyloxy-(z.B. Benzoyloxy- oder Naphthoyloxy-) Estergruppe an einer oder beiden der Endstellungen der 9-Seitenkette der Verbindungen der Formel I besitzen. Die erwähnten Aralkanoyloxy- und Aroyloxyestergruppen können z.B. mit einem oder mehreren Halogenatomen (z.B. Chlor oder Brom), oder mit Amino-, Nitril- oder Sulfamidogruppen substituiert sein, wobei der Arylanteil der Gruppe vorteilhafterweise 6 bis 10 Kohlenstoffatom enthält.

Die Erfindung betrifft auch Biovorläufer der Verbindungen der Formel I und deren physiologisch verträglichen Salzen und Estern, d.h. Verbindungen, die in vivo zu Verbindungen der Formel I und deren oben-erwähnten Derivaten umgewandelt werden.

Die Verbindungen der Formel I und ihre Salze und Ester können in herkömmlicher Weise mit zur Herstellung von Verbindungen gleicher Struktur analogen Verfahren, wie sie in der GB-PS 1 52 3 -865 beschrieben sind, hergestellt werden.

In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I und deren physiologisch verträglichen Salzen und Estern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß a) eine Verbindung der Formel II

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(π)

CH₂XCHCH₂OVJ ~ CH OW¹

(worin X die obige Bedeutung hat und Vi und W jeweils ein Wasserstoff atom oder eine blockierende Gruppe bedeuten, Y ein Wasserstoffatom oder eine blockierende Gruppe, und Z eine Gruppe der Formel -OY oder -NHY, worin Y die obige Bedeutung hat, darstellen, mit der Maßgabe, daß mindestens eines von W, W und Y eine blockierende Gruppe bedeuten)

entblockiert, wird, so daß eine Verbindung der Formel I oder ein Salz oder ein Ester derselben entstehen; b) eine Verbindung der Formel III

(III)

CH₂XCHCH₂OH

(worin X die obige Bedeutung hat, und worin entweder M eine 6-Hydroxy- oder eine Aminogruppe, und G ein Atom oder eine Gruppe bedeutet, die ersetzt oder zu einer Aminogruppe umgewandelt werden können, oder G eine 2-Aminogruppe und M ein Atom oder eine Gruppe bedeutet, die ersetzt oder zu einer Amino- oder Hydroxygruppe umgewandelt werden können)

oder ein Salz oder ein Ester derselben zu einer Verbindung der Formel I oder einem Salz oder Ester derselben umgewandelt wird; c) eine Verbindung der Formel IV

(IV)

-/SQ

CH XCHCH OH CHO

S.

- i-θ -

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(worin R und X die obige Bedeutung haben) oder ein Salz, oder ein Ester derselben mit einem bekannten Verfahren reduziert wird; d) eine Verbindung der Formel V

(worin R die obige Bedeutung hat und Q eine Abspaltgruppe oder -atom ist)

mit einer Verbindung der. Formel VI

A CH₂ X CH CH₂OH

CH₂ OH (VI)

(worin X die obige Bedeutung hat_s und A eine Abspaltgruppe oder -atom ist)

umgesetzt wird;

e) eine Verbindung der Formel VII

'N

(VII)

(worin R und X die obige Bedeutung haben) hydrolysiert wird;

und daß wahlweise eine oder mehrere der folgenden Umwandlungen in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden:

1. Ist das erhaltene Produkt eine Base, wird diese zu einem physiologisch verträglichen Säureadditionssalz umgewandelt;

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2. Ist das erhaltene Produkt ein Säureadditionssalz, wird dieses zu der Ausgangsbase umgewandelt;

3. Ist das erhaltene Produkt eine Verbindung der Formel I oder ein Salz derselben, wird diese Verbindung oder das Salz derselben zu einem physiologisch verträglichen Ester der Verbindung oder des Salzes umgewandelt;

4. Ist das erhaltene Produkt ein Ester der Verbindung der Formel I, wird dieser zu der Ausgangsverbindung der Formel I oder einem physiologisch verträglichen Salz derselben umgewandelt .

Bei Verfahren a) können die blockierenden Gruppen W, W und Y z.B. aus Acy!gruppen wie C.^-Alkanoy!gruppen, z.B. Acetyl-, Aroyl-, z.B. Benzoylgruppen, gewählt werden; ferner aus Arylmethylgruppen, z.B. Benzyl, oder Tri-C. ^-Alkylsilyl, wie z.B. Trimethylsilyl. Blockierende Arylmethylgruppen können beispielsweise durch Hydrogenolyse entfernt werden, so z.B. durch Hydrieren in Gegenwart eines Raney-Nickel- oder eines Palladiumkatalysators, oder durch Verwendung von Natrium in flüssigem Ammoniak. Blockierende Acy!gruppen können z.B. durch Hydrolyse entfernt werden, wozu man z.B. ein Amin, wie Methylamin oder Triehtylamin vorzugsweise in einem wässrigen Medium verwendet. Blockierende Trialkylsilylgruppen können beispielsweise durch Solvolyse, z.B. mit alkoholischem oder wässrigen Ammoniak, oder durch Alkoholyse entfernt werden.

Die Umwandlung einer Verbindung der Formel III zu einer Verbindung der Formel I mit Verfahren b) kann auf verschiedene Weise erfolgen. So können z.B. M und/oder G jeweils eine Azidgruppe darstellen, die durch katalytische Hydrierung unter Verwendung. eines geeigneten Katalysators wie Palladium zu einer Aminogruppe reduziert werden kann. M und/oder G können auch jeweils ein Halogenatom oder eine Alkylthio- oder Alkylsulfonylgruppe sein, die durch Aminolyse mit z,B. Ammoniak zu einer Aminogruppe umgewandelt werden können. Zur Herstellung der Verbindung der Formel I, worin R eine Hydroxygruppe bedeutet, kann eine Verbin-

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düng der Formel III, worin M eine Aminogruppe darstellt, z.B. durch Behandlung mit Salpetrigsaure umgewandelt werden. Auch kann eine Verbindung der Formel III, worin M eine Mercapto- oder Alkylthiogruppe bedeutet, zu einer Verbindung der Formel I, worin R eine Kydroxygruppe bedeutet, umgewandelt werden, indem man sie auf herkömmliche Weise oxidiert und hydrolysiert. Ferner kann eine Verbindung der Formel III, worin M Halogen bedeutet, zu einer Verbindung der Formel I, worin R Hydroxy bedeutet, umgewandelt werden, wenn man sie mit 2-Mercaptoethanol und einem Alkalimetallalkoxid, z.B. Natriummethoxid behandelt.

Diese Verfahren sind zusammen mit anderen herkömmlichen Verfahren in "Fused Pyrimidines", Part II, Purines, Ed. by D.J.Brown, 19 71, Wiley-Interscience, beschrieben. In einem weiteren Alternativverfahren kann eine Verbindung der Formel III, worin M eine Aminogruppe darstellt, durch Behandlung mit einem desaminierenden Enzym, wie z.B. Adenosindesaminase, zu einer Verbindung der Formel I umgewandelt werden.

Die Reduktion einer Verbindung der Formel IV in Verfahren c). kann z.B. durch Umsetzung mit einem geeigneten Aldehydredukticnsmittel wie Natriumborhydrid, Natriumcyanborhydrid, Tetraethylammoniumborhydrid oder Pyridin/Diboran/Tetrahydrofuran/ Trifluoressigsäure bewirkt werden.

In Verfahren d) kann die Gruppe Q in Formel V z.B. ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe, z.B. eine C, -Alkanoylgruppe wie z.B. eine Acetylgruppe, oder eine Aroylgruppe, wie z.B. eine Benzoylgruppe, sein; ferner eine Tri-C.^-Alkylsilylgruppe, wie z.B. eine Trimethylsilylgruppe. Die Gruppe A der Formel VI kann z.B. ein Halogenatom (z.B. Chlor) oder eine Acyloxygruppe sein, worin der Acylanteil z.B. eine C, _u~Alkanoy!gruppe wie Acetyl, oder eine Aroylgruppe wie Benzoyl sein kann. Die Reaktion wird am besten in einem starken polaren Lösungsmittel wie Dimethylformamid oder Hexamethylphosphoramid durchgeführt, vorteilhafterweise in Gegenwart einer Base wie Triethylamin,"

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oder Kaliumcarbonat. Auch kann eine thermische Kondensation durch Erhitzen der Verbindungen der Formel V und VI in Gegenwart einer katalytischer! Menge einer starken Säure, wie z.B. Schwefelsäure, bewirkt werden.

In Verfahren e) kann die Hydrolyse der Verbindung der Formel VII z.B. unter basischen Bedingungen durchgeführt werden, so z.B. durch Behandlung mit einem organischen Amin wie Methylamin oder Triethylamin.

In einem Verfahren, das die oben beschriebenen Verfahren a) und b) umfaßt, kann eine Verbindung der Formel VIII

CH„XCHCH„OW 2 ι 2

(VIII)

^/- CH OW

worin W, W , X und Z die obige Bedeutung haben, und G ein Halogenatom darstellt, mit alkoholischem Ammoniak behandelt werden, damit man das gewünschte Endprodukt der Formel I erhält.

Verbindungen der Formel II bis VIII, die als Zwischenprodukte bei der Synthese der Verbindungen der Formel I verwendet werden, können in herkömmlicher Weise z.B. mit Verfahren, wie sie in der GB-PS 1 52 3 865 beschrieben sind, hergestellt werden. Diese Verfahren sehen Zwischenprodukte vor, die aus einfach substituierten Purinen hergestellt werden, und die entweder im Handel erhältlich sind oder mit Verfahren hergestellt werden können, die bekannt und in der Literatur, wie z.B. dem obigen Lehrbuch, beschrieben sind.

So können z.B. die Verbindungen der Formeln II. und III im Allgemeinen mit einem zu Verfahren d) analogen Verfahren hergestellt werden, d.h. man setzt ein geeignetes Purin, dessen 2-,6- und/oder 9-Stellungen wahlweise z.B. durch Acyl- oder

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Trialkylsilylgruppen der oben beschriebenen Art geschützt sind, mit einer Verbindung der Formel VI um, deren endständige Hydroxygruppen wahlweise durch Acyl- oder Trialkylsilylgruppen der beschriebenen Art geschützt sind; anschließend werden vor der Verwendung in den Verfahren a) oder b) die Schutzgrupperi soweit notwendig und/oder gewünscht entfernt. Oder eine Verbindung der Formel III, worin W und W jeweils eine blockierende Benzoylgruppe darstellen, kann z.B. durch Behandlung eines entsprechenden 9-bis-(Chlormethyl)-methoxy (oder -thio)- methyI-purinanalogen mit einem Benzoylierungsmittel, z.B. Natriumbenzoat, hergestellt werden, wobei das Ausgangspurinanaloge z.B. durch Behandlung einer Verbindung der Formel V, die wahlweise in den 2- und/oder 6-Stellungen geschützt ist, mit einer Verbindung der Formel

ACH₂XCHCH₂Cl

. CH₂Cl (worin A und X die obige Bedeutung haben) hergestellt wird.

Verbindungen der Formel IV können in herkömmlicher Weise hergestellt werden, so z.B. wie in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung beschrieben, oder mit analogen Verfahren.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verbindungen der Formel I und physiologisch verträgliche Salze und Ester derselben, die bei der Behandlung oder Prophylaxe einer Viruserkrankung von Mensch oder Tier verwendet werden können. Die Verbindungen sind besonders brauchbar für die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, die durch verschiedene DNA Viren verursacht werden, so z.B. Herpesinfektionen durch H. simplex, H. varicella und H. zoster, Cytomegalovirus, oder Erkrankungen durch Hepatitis B oder Epstein-Barr-Viren. Die Verbindungen der Formel I können auch zur Behandlung oder Prophylaxe von Papilloma- oder Warzenvirus Infektionen verwendet werden. Außer in der Humanmedizin können die Verbindungen der Formel I auch zur Behandlung

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und Prophylaxe von Viruserkrankungen an Tiere, z.B. Säugetiere, verabreicht werden. So sind die Verbindungen der Formel I besonders brauchbar für die Behandlung der equinen Rhinopneumonitis. ·..' '

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer Viruserkrankung von Mensch oder Tier, bei dem eine wirksame antivirale Menge einer Verbindung der Formel I oder eines physiologisch verträglichen Salzes oder Esters derselben verabreicht wird. . .

Die Verbindungen der Formel I und die physiologisch verträglichen Salze und Ester derselben (nachfolgend kollektiv als Wirkstoffe bezeichnet) können auf jedem Weg verabreicht werden, der für den zu behandelnden Zustand geeignet ist, so u.a. oral, rektal, nasal, topisch (einschließlich buccal und sublingual), vaginal und parenteral (einschließlich subkutan, intramuskulär, intravenös, intradermal, intrathecal und epidural). Der bevorzugte Weg kann z.B. vom Zustand des Patienten abhängen.

Für jede der oben aufgeführten Anwendungsmöglichkeiten und Indikationen hängt die benötigte Wirkstoffmenge von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Schwere des zu behandelnden Zustandes und der Identität des Patienten, und sie wird letztlich von dem behandelnden Arzt oder Tierarzt bestimmt. Im allgemeinen liegt jedoch für die genannten Anwendungsmöglichkeiten und Indikationen eine geeignetewirksame Dosis im Bereich von 0,1 bis 2 50 mg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 mg/kg täglich, und am besten im Bereich von 5 bis 20 mg/kg täglich; eine optimale Dosis ist etwa 10 mg/kg täglich. (Sofern nichts anderes angegeben ist, sind die Gewichtsangaben für den Wirkstoff für die Ausgangsverbindung der Formel I berechnet; für Salze und Ester derselben müssen die Werte entsprechend erhöht werden). Die bevorzugte Dosis wird vorzugsweise in zwei, drei, vier oder mehr Teildosen über den Tag verteilt verabreicht. Diese Teildosen können in Einheitsdosen verabreicht werden, die z.B. 10 bis 1000 mg,

-MA—

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vorzugsweise 20 bis 500 mg, am besten 100 bis 400 mg Wirkstoff pro Einheitsdosis enthalten.

Es ist möglich, die Wirkstoffe alleine zu verabreichen, vorzugsweise werden sie jedoch als pharmazeutische Zubereitungen angeboten. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen für die Verwendung in der Human- und Tiermedizin enthalten mindestens einen Wirkstoff, wie er oben definiert ist, zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägerstoffen, und wahlweise anderen therapeutischen Bestandteilen. Der bzw. die Trägerstoffe müssen insofern "verträglich" sein, daß sie mit den anderen Bestandteilen der Zubereitung vereinbar und für den Empfänger nicht schädlich sind.

Die Zubereitungen sind u.a. für die orale, rektale, nasale, topische (einschließlich buccale und sublinguale), vaginale oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intrathecale und epidurale) Verabreichung geeignet. Sie werden am besten in Form von Einheitsdosen angeboten und können mit jedem in der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Dazu gehört der Schritt, in dem der Wirkstoff mit dem Träger, der aus einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen besteht, vereinigt wird. Im allgemeinen werden die Zubereitungen hergestellt, indem man den Wirkstoff gleichförmig und innig mit flüssigen oder fein zerteilten festen Trägern oder mit beiden vermengt, und anschliessend, wenn nötig, das Produkt formt.

Erfindungsgemäße Zubereitungen für die orale Verabreichung können als einzelne Einheiten in Form von Kapseln, Cachets oder Tabletten angeboten werden, die jeweils eine bestimmte Wirkstoffmenge enthalten; ferner als Pulver oder Granula, als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit, oder als flüssige öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl-Emulsion. Der Wirkstoff kann auch als Bolus, Latwerge oder Paste angeboten werden.

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Tabletten können gepreßt oder gegossen werden, wahlweise zusammen mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen. Preßtabletten werden hergestellt, indem man in einer geeigneten Vorrichtung den Wirkstoff in freifließender Form als Pulver oder Granula, wahlweise vermischt mit einem Binde-, Gleit-, inerten Verdünnungs-, Konservierungs-, oberflächenaktiven oder Dispergiermittel, komprimiert. Gegossene Tabletten werden hergestellt, indem man ein Gemisch aus der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet ist, in einer geeigneten Vorrichtung formt. Die Tabletten können beschichtet oder eingekerbt werden, und können so zubereitet sein, daß eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs erfolgt.

Bei Infektionen des Auges und anderer äußerer Gewebe, z.B. Mund und Haut, werden die Zubereitungen vorzugsweise örtlich als Salbe oder Creme aufgebracht, die den Wirkstoff z.B. in einer Menge von 0,075 bis 2 0 Gew.%, vorzugsweise 0,2 bis 15 Gew.% und am besten 0,5 bis 10 Gew..% enthält. Für eine Salbe können die Wirkstoffe mit einer paraffinischen oder einer wassermischbaren Salbengrundlage verwendet werden. Die Wirkstoffe können auch als Creme mit einer öl-in-Wasser Cremegrundlage verarbeitet werden.

-Wenn gewünscht, kann die wässrige Phase der Cremegrundlage z.B. mindestens 30 Gew.% eines mehrwertigen Alkohols enthalten, so z.B. einen Alkohol mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen, wie Propylenglycol, Butan-1,3-diol, Mannitol, Sorbitol, Glycerin oder Polyethylenglycol, sowie Gemische daraus. Die Zubereitungen für die örtliche Anwendung können eine Verbindung enthalten, welche die Absorption oder Penetration des Wirkstoffs .durch die Haut oder andere befallene Flächen fördert. Beispiele für derartige Substanzen sind u.a. Dimethylsulfoxid und verwandte Analoge.

Die ölige Phase der erfindungsgemäßen Emulsionen kann auf bekannte Weise aus bekannten Bestandteilen gebildet werden. Die

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Phase kann zwar nur ein Emulgiermittel enthalten, vorzugsweise enthält sie jedoch ein Gemisch aus mindestens einem Emulgiermittel und einem Fett oder einem Öl, oder einem Fett und einem Öl. Vorzugsweise wird ein hydrophiles Emulgiermittel zusammen mit einem lipophilen Emulgiermittel, das als Stabilisator wirkt, zugegeben. Vorzugsweise wird sowohl ein Öl als auch ein Fett zugegeben. Zusammen bilden die Emulgiermittel mit oder ohne Stabilisator(en) das sogenannte Emulgierwachs, und das Wachs ergibt zusammen mit dem Öl und/oder Fett die sogenannte emulgierende Salbengrundlage, welche die ölige dispergierte Phase der Cremezubereitungen bildet.

Für die erfindungsgemäße Zubereitung geeignete Emulgiermittel und Emulsionsstabilisatoren sind u.a. Tween 60, Span 80, Cetostearylalkohol, Myrist-yl alkohol, Glycerinmonostearat und Natriumlaurylsulfat.

Die Wahl der für die Zubereitung geeigneten Öle oder Fette richtet sich nach den gewünschten kosmetischen Eigenschaften, da die Löslichkeit des Wirkstoffs in den meisten Ölen, die gewöhnlich für pharmazeutische Emulsionen verwendet werden, sehr gering ist. So sollte die Creme vorzugsweise ein nicht-fettendesnicht-fleckendes und auswaschbares Produkt sein, dessen Konsistenz ein Auslaufen aus Tuben und anderen Behältern verhindert-. Mono- oder dibasische Alkylester mit gerader oder verzweigter Kette, wie Diisoadipat, Isocetylstearat, Propylenglycoldiester von Kokosnußfettsäuren, Isopropylmyristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2-Ethylhexylpalmitat oder ei-n Gemisch aus Estern mit verzweigter Kette, bekannt als Crodamol CAP können verwendet werden, wobei die letzten drei Ester bevorzugt werden. Sie können je nach den gewünschten Eigenschaften alleine oder in Kombinationen verwendet werden. Es können auch Lipide mit hohem Schmelzpunkt, wie weißes weiches Paraffin und/oder flüssiges Paraffin oder andere Mineralöle verwendet werden.

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Zu geeigneten Zubereitungen für die lokale Anwendung am Auge gehören auch Augentropfen, bei denen der Wirkstoff in einem geeigneten Träger, insbesondere in einem wässrigen Lösungsmittel, gelöst oder suspendiert ist. Der Wirkstoff ist in solchen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 20 Gew.%, vorteilhafterweise 0,5 bis 10 Gew.%, und insbesondere etwa 1,5 Gew.% vorhanden.

Geeignete Zubereitungen für die lokale Anwendung im Mund sind u.a. Lutschtabletten, die den Wirkstoff in einer wohlschmeckenden Grundlage, gewöhnlich Zucker und Akaziengummi oder Tragant, enthalten; Pastillen, die den Wirkstoff in einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin, oder Zucker und Akaziengummi enthalten; sowie Mundwasser, bei dem der Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger vorliegt.

Zubereitungen für die rektale Anwendung können als Suppositorien mit einer geeigneten Grundlage, die z.B. Kakaobutter oder ein Salicylat enthält, angeboten werden.

Geeignete Zubereitungen für die nasale Anwendung,'bei denen der Träger ein Feststoff ist, bestehen z.B. aus einem groben Pulver mit einer Teilchengröße im Bereich von z.B. 20 bis 500 pm, das wie Schnupftabak verabreicht wird, d.h. es wird aus einem an die Nase gehaltenen Pulverbehälter rasch durch die Nasenpassage inhaliert. Zubereitungen, bei denen·der Träger eine Flüssigkeit ist, und die als Nasenspray oder Nasentropfen angewendet werden, sind u.a. wässrige oder ölige Lösungen des Wirkstoffs.

Für die vaginale Verabreichung geeignete Zubereitungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayzubereitungen angeboten werden, die außer dem Wirkstoff bekannte geeignete Träger enthalten.

Für die parenterale Verabreichung geeignete Zubereitungen sind u.a. wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe,

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welche die Zubereitung mit dem Blut des Empfängers isotonisch machen, enthalten können; ferner wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspendierungs- und Eindickungsmittel enthalten können. Die Zubereitungen können in Einfach- oder Mehrfachdosenbehältern angeboten werden, z.B. in versiegelten Ampullen oder Phiolen, und sie können im gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden. Direkt vor der Verwendung muß dann lediglich der sterile flüssige Träger, z.B. Wasser zur Injektion, zugegeben werden. Aus sterilen Pulvern, Granula und Tabletten der beschriebenen Art können sofort Injektionslösungen und Suspensionen zubereitet werden.

Bevorzugte Einheitsdosen-Zubereitungen enthalten eine Tagesdosis eines Wirkstoffs, bzw. eine Teildosis, wie oben ausgeführt, oder einen geeigneten Teil davon.

Zusätzlich zu den oben besonders erwähnten Bestandteilen können die erfindungsgemäßen Zubereitungen noch andere übliche Stoffe enthalten, die mit der besonderen Art der Zubereitung in Zusammenhang stehen; so können die oralen Zubereitungen z.B. Geschmacks stoffe enthalten.

Die Erfindung betrifft ferner tiermedizinische Zubereitungen, die zumindest einen der oben definierten Wirkstoffe zusammen mit einem tiermedizinischen Träger enthalten.

Tiermedizinische Träger sind Stoffe, die für die Verabreichung der Zubereitung brauchbar sind; sie können fest, flüssig oder gasförmig sein, müssen jedoch im übrigen inert oder tiermediziriisch verträglich und mit dem Wirkstoff vereinbar sein. Diese tiermedizinischen Zubereitungen können oral, parenteral oder auf jedem anderen gewünschten Weg verabreicht werden.

Für die orale Anwendung können die Zubereitungen in Form von Tabletten, Granula, Arzneitränken, Pasten, Cachets, Kapseln oder Futterzusätzen verwendet werden. Granula können mit den bekannten Verfahren der Naßgranulation, Vorkompression oder

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1b

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Zerstoßen hergestellt werden. Sie können den Tieren-in einem inerten flüssigen Träger als Trank oder in einer Suspension mit Wasser- oder Ölgrundlage verabreicht werden. Vorzugsweise werden weitere Bestandteile wie z.B. ein Dispergiermittel zugegeben. Diese Zubereitungen enthalten vorzugsweise 15 bis 85% Wirkstoff.

Zur Herstellung einer Paste kann der Wirkstoff in einem flüssigen Verdünnungsmittel suspendiert werden. Ein Eindickungsmittel kann zusammen mit einem Benetzungs- oder Anfeuchtungsmittel zugegeben werden, wenn der flüssige Verdünner Wasser ist. Wird eine Emulsionspaste benötigt, dann sollten ein oder mehrere oberflächenwirksame Mittel zugegeben werden. Der Wirkstoff kann 25 bis 80 Gew.% dieser Pastenzubereitungen ausmachen.

.Bei Futterzusätzen ist der Wirkstoff im allgemeinen im Verhältnis zu den zusätzlichen Bestandteilen in großen Mengen vorhanden, und die Zusätze können direkt oder nach vorläufigem Mischen oder Verdünnen zugegeben werden. Beispiele für Zusätze zu solchen Zubereitungen sind feste, oral aufzunehmende Träger wie Maismehl, Sojamehl, Weizenkleie, Sojaschrot, eßbare Pflanzenstoffe und Fermentationsrückstände. Der Wirkstoff wird gewöhnlich zu einem oder mehreren der Zusätze gegeben und damit gleichmäßig und innig durch Mahlen, Schleudern und Rühren mit herkömmlichen Vorrichtungen vermischt. Zubereitungen, die 1 bis 90 Gew.% Wirkstoff enthalten, sind als Futterzusätze geeignet.

Für die Behandlung von Herpesinfektionen bei Pferden kann eine orale _oder parenterale Dosis von 0,1 bis 250 mg/kg/Tag, vorzugsweise 2 bis 100 mg/kg/Tag notwendig sein. Die Dosis kann auf einzelne Einheiten aufgeteilt werden, die regelmäßig über den Tag verteilt verabreicht werden, und zwar täglich bis zu 14 Tagen oder bis die Infektion abgeheilt ist. Bei Virusinfektionen von anderen Tieren kann die Dosis variieren, je nach Größe und Stoffwechsel des Tieres. Die Zubereitungen können als Einheitsdösen verabreicht werden, so z.B. als Tablette mehrmals täglich mit jeweils 10 bis 1000 mg Wirkstoff pro Einheitsdosis.

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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

9-Q2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl]-guanin Chlorwasserstoffgas wurde in ein gekühltes (0 ⁰C) Gemisch aus 20,725 g 1,3-Dibenzyloxypropanol (J. Chem. Soc. 445 (1931) A. Fairbourne) und 2,2 8 g Paraformaldehyd in 100 ml trockenem Dichlormethan geleitet, bis die Lösung gesättigt war. Die wolkige farblose Lösung wurde über molekularen Sieben und Kalziümchlorid getrocknet, abfiltriert und das Filtrat im Vakuum verdampft. Das 1,3-bis-(Benzyloxy)-2-(chlormethoxy)-propan bildete sich als gelber ölrückstand und hatte zufriedenstellende IR (Fehlen der OH-Gruppe) und H-NMR Spektren.

Eine Lösung aus 13 mmol/1 2,6,9-tris-Trimethylsily!guanin, 5,45 g 1,3-bis-(Benzyloxy)-2-(chlormethoxypropan) und 4 ml (29 mmol/1) trockenem Triethylamin in 10 ml trockenem Toluol wurde 18 h unter Stickstoff im Rückfluß gehalten. Die rötliche bernsteinfarbene Lösung wurde im Vakuum verdampft und mit Methanol 30 min im Dampfbad gehalten. Das Lösungsmittel wurde durch Flash-Verdampfung entfernt und der ölige Rückstand mit Säulenchromatographxe auf Kieselgel gereinigt; das gewünschte 9-(2-Benzyloxy-l-(benzyloxymethyl)-ethoxymethyD-guanin, das etwa 10% des 7-Isomeren enthielt, erhielt man durch EIuieren der Säule mit Aceton und Umkristaliisation aus Acetonitril·, Schmelzpunkt 173-80 ⁰C.

Zu einer Suspension von 3,88 g 9-(2-Benzyloxy-l-(benzyloxymethyl)-ethoxymethyl)-guanin in 300 ml flüssigem Ammoniak wurden bei einer Temperatur von -45 bis -30 ⁰C (Acetontrockeneisbad) unter magnetischem Rühren 1,54 g Natriumchips in Portionen innerhalb eines Zeitraumes von 15 min gegeben. Das Gemisch wurde weitere 30.min gerührt, das überschüssige Natrium mit Methanol zerstört. Die Lösungsmittel wurden durch Verdampfen im Vakuum entfernt, der Rückstand in einer Mindestmenge Wasser gelöst, abgekühlt, und der pH mit Eisessigsäure auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde erneut im Vakuum verdamüft

^Ä- 242394

und zweimal aus Wasser umkristallisiert.

Endgültige UmkTistallisation aus Methanol ergab analytisch reines 9-[(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl]-guanin, Schmelzpunkt 250 C mit Wiederverfestigung.

Beispiel 2

a) 9- ^(.2-Benzoyloxy-l-benzoyloxymethyD-ethoxymethylJ -guanin

Zu einer kalten (0 ⁰C) Lösung eines Acetylierungsgemisches, das aus 7 ml Essigsäureanhydrid, 3 ml Eisessigsäure und 0,1 ml konzentrierter Schwefelsäure hergestellt worden war, wurde unter magnetischem Rühren 1,0 g Tetrabenzoyl-methylen-bis-2-glycerol gegeben. A.T. Ness, R.M. Hann & CS. Hudson, J. Arner. Chem. Soc, Nov. 1943, 2215.

Die Lösung wurde bei Temperaturen von 3 bis 10 C 30 min gerührt, dann in ein Gemisch aus 2 60 ml Eis und Wasser gegossen. Die acidische Lösung wurde dreimal mit Chloroform extrahiert, und die organischen Extrakte mit Salzlauge ausgewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

Die filtrierte Chloroformlösung wurde im Vakuum verdampft, und der Ölrückstand durch Säulenchromatographie auf Kieselgel gereinigt. Eluieren mit Dichlormethan ergab 2-0-Acetoxymethyl-l,3-bis-(O-benzoyl)-glycerol. Die Proton- und Kohlenstoff 13 NMR-Spektren stimmten mit der gewünschten Struktur überein.

Ein Gemisch aus 0,49 g 2,9-Diacety!guanin, 1,22 g 2-0-(Acetoxymethyl)-l,3-bis-(0-benzoyl)-glycerol, und 0,013 g p-Toluolsulfosäure in 30 ml trockenem Toluol wurde unter Rühren 18h unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wurde durch Flash-Verdampfung entfernt, und der Rückstand in 35 ml kochendem Methanol gelöst. 1 ml n-Butanol wurde zugegeben und das Gemisch 5 min unter Rückfluß gehalten, um die 2-Acetamidogruppe zu hydrolysieren. Das Gemisch wurde im Vakuum bei einer Badtemperatur von 30 C verdampft und einmal aus Methanol und einmal

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aus Formamid umkristallisiert, was 9- [(2-Benzoyloxy-i-benzoyloxymethyl)-ethoxymethyl]-guanin ergab. Die Elementaranalyse ergab, daß das Produkt 0,75 mol Formamid enthielt, und das NxMR-Spektrum stimmte mit der Struktur überein. DünnschichtChromatographie auf Kieselgel mit 2 0% Methanol in Chloroform ergab einen Spot, Rf = 0,49. Fließpunkt 2 2 0-222 ⁰C.

b) 9-£(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl] -guanin

0,6 g 9-(2-Benzoyloxy-l-(benzoyloxymethyl)-ethoxymethyl)-guanin wurde in einem Gemisch aus 1:1 Methanol und 40%igem wässrigem Methylamin im Dampfbad 1 h lang erhitzt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand zweimal aus Wasser umkristallisiert, was 9- £( 2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl]-guanin als Einviertel-Hydrat ergab. Fließpunkt 230 °C.

Beispiel 3

9-[(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl]-guanin

Ein Gemisch aus 111,8 g l,4-Dichlorbutan-2,3-diol, 42,2 g Paraformaldehyd und 22 ml Bortrifluoridethereat in 46 0 ml trockenem Acetonitril wurde-unter Rühren unter Rückfluß gehalten, bis die.Feststoffe gelöst waren. Molekularsiebe wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch Weitere 3 h unter Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde abgekühlt und durch Zugabe weiterer Molekularsiebe getrocknet, abfiltriert und im Vakuum verdampft.

Der ölige Rückstand wurde zu 250 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung gegeben und dreimal mit gleichem Volumen gereinigten Äther extrahiert. Die etherischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum verdampft.

Die restliche Flüssigkeit wurde mit 16 mm Wassersaugdruck destilliert und die bei 99-109 ⁰C siedende -Fraktion gesam was 4,5-bis-(Chlormethyl)-l,3-dioxolan ergab.

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Ein Gemisch aus 76,5 g 4,5-bis-(Chlormethyl)-l,3-dioxolan und 258 g Natriumbenzoat in 15 00 ml trockenem Dimethylformamid wurde unter Erhitzen bei einer Temperatur von 142 C 18 h gerührt .

Das Gemisch wurde abgekühlt, abfiltriert, und die Feststoffe mit Äther ausgewaschen. Die Mutterlaugen und Waschlösungen wurden im Vakuum zur Trockne verdampft und dreimal mit Dichlormethan und Wasser geschieden. Die organischen Schichten wurden mit Wasser ausgewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abfiltrieren und Flash-Verdampfung wurde der Rückstand mit Flash-Chromatographie auf Kieselgel in Dichlormethan gereinigt, was M-,5-bis-(Benzoyloxymethyl)-1,3-dioxolan als dickes Öl ergab. Man erhielt eine Analyseprobe, indem manlAliquot des Öls an der Luft kristallisieren ließ, Schmelzpunkt 66,5-68 ⁰C.

Zu einer gekühlten (0 ⁰C) Lösung von 100 ml Essigsäureanhydrid und 0,3 ml konzentrierter Schwefelsäure wurden portionsweise 114,2 g 4,5-bis-(Benzoyloxymethyl)-l,3-dioxolan gegeben, während eine Innentemperatur von 0-5 ⁰C aufrecht erhalten wurde. Man ließ sich die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde sie 3 h bei Dampfbadtemperatur erhitzt (Innentemperatur 92 ⁰C). Nach dem Abkühlen wurde die Lösung auf 500 ml Eis und Wasser gegossen und dreimal mit gereinigtem Äther extrahiert. Die-etherischen Extrakte wurden einmal mit Wasser und einmal mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit Salzlösung ausgewaschen. Die etherischen Extrakte wurden getrocknet (Na-SO^) und die klare bernsteinfarbige Lösung wurde äbfiltriert und im -Vakuum/verdampft, was 2-Acetoxy-3-acetoxymethoxy-l,4-butandiyldibenzoat ergab. Man erhielt eine Analyseprobe durch Umkristallisation aus Benzol-Hexan. Schmelzpunkt 56-58 ⁰C.

Ein Gemisch aus 5,75 g 2,6-Dichlorpurin und 14,1 g 2-Acetoxy-3-acetoxymethoxy-l,4-butandiyldibenzoat wurde unter Wassersaugdruck bei 140 C erhitzt, bis das Gemisch eine flüssige Schmelze bildete. Nach 10 minütigem weiteren Erhitzen wurde das

-~- 24239 4 8

Reaktionsgemisch abgekühlt und 150 mg p-Toluolsulfosäure wurde unter Rühren zugegeben. Erhitzen unter Saugdruck wurde weitere 2 0 min fortgesetzt, dann wurde die Reaktionslösung abgekühlt und mit Dichlorinethan und Wasser dreimal geschieden. Die organischen Extrakte wurden einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit Wasser und schließlich einmal mit Salzlösung ausgewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Abfiltrieren wurde das Lösungsmittel durch Flash-Verdampfung entfernt und der restliche gelbe Schaum mit Säulenchromatographie gereinigt. Nach Eluieren mit Dichlormethan zur Entfernung von nicht-purinischen Nebenprodukten ergab Eluieren mit 50% Ethylacetat-Hexan nach dem Verdampfen ein farbloses öl mit einem zufriedenstellenden NMR-Spektrum für das gewünschte 9-[.2-Acetoxy-3-(2 , 6-dichlor-9H-purin-9-yl)-methoxy}-l,4-butandiyldibenzoat.

Ein Gemisch aus 11,5 g 2-Acetoxy-3-(2,6-dichlor-9H-purin-9-yl)-methoxy-l,4-butandiyldibenzoat und 2,6 g Natriumazid wurde in 50 ml 1:1 Vol./Vol. Ethanol-Wasser 4h unter Rühren zum Rückfluß erhitzt. *

Das 'heterogene Gemisch wurde im Vakuum verdampft, und der Rückstand mit Äther und Wasser geschieden. Zweimaliges weiteres Auswaschen der wässrigen Phase und Verdampfen der vereinigten getrockneten etherischen Extrakte ergab 2-Acetoxy-3-(2,6-diazido-9H-purin-9-yl)-methoxy-l,4-butandiyldibenzoat. Die NMR und IR Spektren stimmten mit der gewünschten Struktur überein . ·

Eine Lösung von 5,0 g 2-Acetoxy-3-(2,6-diazido-9H-purin-9-yl)-methoxy-l,4-butandiyldibenzoat in 2 00 ml Tetrahydrofuran und 20 ml Methanol, die 190 mg 5% Palladium-auf-Kohle-Katalysator enthielt, wurde unter 35 N/cm Wasserstoffdruck drei Tage bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Gemisch wurde durch ein Celit-Polster filtriert, und die Lösung im Vakuum verdampft. Der sirupartige Rückstand wurde aus Methanol umkristallisiert und ergab 2-Acetoxy-3-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-methoxy-l,4-butandiyldibenzoat, Schmelzpunkt 192-19¹+ ⁰C.

Xl

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2,0 g 2-Acetoxy-3-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-methoxy-l,4-butandiyldibenzoat ir. 100 ml Methanol und 35 ml 40%igem wässrigen Methylamin wurden im Dampfbad eine Stunde erhitzt, dann wurde die Lösung im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Äther trituriert, um das N-Methylbenzamid zu entfernen, und aus Ethanol umkristallisiert, was 3-(2,6-Diamino-9H-purin-9-yl) methoxy-1,2,4-butantriol ergab, Schmelzpunkt 157-169 ⁰C.

Eine Lösung von 0,7 g (2,4 mmol/1) 3-(2,6-Diamino-9H-purin-9-yl)-methoxy-l,2,4-butantriol und 0,6 g (2,8 mmol/1) Natriumperiodat in 50 ml Wasser wurde 3,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Innerhalb von 5 min nach Vereinigung der beiden Reaktanten bildete sich ein Niederschlag.

Das Gemisch wurde abgekühlt, abfiltriert und mit Wasser ausgewaschen, und ergab 2-£(2-Amino-l,o-dihydro-o-oxo-gH-purin-g-yl) jnethoxyj - 3-hydroxypropanal. Ein Massenspektrum dieses Produkts ergab m/e M⁺) = 25 3.

Zu einer Suspension von 150 mg (0,592 mmol/1) des Aldehyd-Derivates in 2 0 ml Wasser wurde portionsweise 18 mg (0,47 mmol/1) Natriumborhydrid gegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei· Raumtemperatur gerührt, abgekühlt, und der pH-Wert mit 4 mol/1 wässriger Salzsäure auf 6 eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und ergab 9- [(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl3-guanin*, Schmelzpunkt 248-250 ⁰C.

Beispiel 4

9-L( 2--Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl]-guanin Zu einer Lösung von 0,5 g 2,6-Diamino-9- [( 2-hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methylj-purin in 10 ml zweifach destilliertem Wasser wurden etwa 600 μΐ Kalbsintestinalmucosa-Adenosindesaminasesuspension in Ammoniumsulfat (Sigma) gegeben. Das Gemisch wurde bei 37 ⁰C inkubiert und mit U.V. .überwacht, bis die Reaktion vollständig war (26 Tage). Das Reaktionsgemisch

- 2-8 -

24 23 94 8

wurde in Intervallen im Vakuum bei Raumtemperatur verdampft und erneut in Wasser gelöst, um das gebildete Ammoniak entfernen und den pK der Lösung zwischen 7-7,5 zu halten.

Die Lösung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand einmal aus Methanol und zweimal aus Wasser umkristallisiert, was 9- [(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy )-me'thylJ -guanin als Einviertel-Hydrat ergab, Schmelzpunkt 230 ⁰C.

Beispiel 5 -

9- £(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methylJ -2,6-diaminopurin

a) 9-[(2-Benzoyloxy-l-benzoyloxymethylethoxy)-methyl]-2,6-dichlorpurin

Ein Gemisch aus 1,16 g (6 mmol/1) 2,6-Dichlorpurin und 2,7 g (7,3 mmol/1) 2-0-(Acetoxymethyl)-l, 3-bis- ( O-benzyD-glycerol wurde unter magnetischem Rühren und unter Wassersaugdruck bei einer Ölbadtemperatur von 155 ⁰C etwa 25 min erhitzt. Die erhaltene klargelbe Flüssigkeit wurde abgekühlt, und das gebildete dicke gelbe Glas wurde in Benzol gelöst und mit Flash-Chromatographie auf einer'Kieselgelsäule (Durchmesser = 6 cm) gereinigt. Anfängliches Eluieren mit 1:1 Benzol-Dichlormethan und Dichlormethan allein entfernte Nebenprodukte, und das gewünschte 9-£(2-Benzoyloxy-1-benzoyloxymethylethoxy)-methyl]-2,6-dichlorpurin wurde durch Eluieren mit 1,77 g 1:1 Dichlormethan-Ether erhalten. Eine weitere Ausbeute des 9-Isomeren, das mit 7-Isomer verunreinigt war, wurde mit 100% gereinigtem Ether eluiert.

Das H'-NMR Spektrum und DünnschichtChromatographie (Kieselgel in Dichlormethan) zeigten eine kleine Menge Verunreinigung in der Hauptcharge, die ein weißgelber Schaum ist.

b) 9- £(2-Benzoyloxy-l-benzoyloxymethylethoxy)-methylJ -2,6-diazidopurin

Ein heterogenes Gemisch von 1,77 g (3, 53 mmol/1) 9-Q2-Benzoyloxy-1-benzoyloxymethylethoxy)-methyl}-2,6-dichlorpurin und

IM

- « -

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45 g (6,88 mmol/1) Natriumazid in 10 ml 1:1 Vol./Vol. Wasser-Ethanol wurde unter magnetischem Rühren 3 h unter Rückfluß gehalten. Die Lösungsmittel wurden durch Flash-Verdampfung entfernt, und der.Ölrückstand mit Wasser trituriert, um das Natriumchlorid zu entfernen. Das Öl wurde in heißem Alkohol aufgenommen und abgekühlt und ergab, nach Filtrieren, einen weißen Feststoff, der nach dem Trocknen eine rosa Tönung hatte. Schmelzpunkt 144-145 ⁰C. Eine weitere Ausbeute erhielt man aus der Mutterlauge durch Verdampfen und Triturieren mit Ethanol; das Material hatte ausreichende Reinheit, um es mit dem anfänglichen Niederschlag für den nächsten Schritt zu vereinigen. NMR und U.V. Spektren stimmten mit der geforderten Struktur überein.

Qual. U.V.-Peaks: pH 1,0, Xmax = 240, 305, 275 (shdr)

pH 13,0, Xmax = 300, 270 (sdr)

c) 9-£( 2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl]-2,6-diaminopurin

Ein Gemisch von 1,6 8 g (3,26 mmol/1) des Produkts aus Schritt b) in 12 0 ml 1:1 Vol./Vol. Tetrahydrofuran-Methanol wurde mit 118 mg 5% Palladium-auf-Kohle-Katalysator unter einem anfängliehen Druck von 35 N/cm 72 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Gemisch wurde durch ein Celit-Polster filtriert, und die Lösungsmittel mit Flash-Verdampfung entfernt. Der Ölrückstand wurde in heißem Benzol und Hexan aufgenommen, was eine Verfestigung verursachte. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoff filtriert und ergab 9-Q2-Benzoyloxy-l-benzoyloxymethyIethoxy)-methyl2-2,6-diaminopurin, das ein zufriedenstellendes NMR (H) Spektrum hatte. Der Feststoff wurde in einer Mindestmenge Methanol gelöst und mit einem gleichen Volumen 40%igem wässrigem Methylamin bei Raumtemperatur gerührt, bis die Dünnschichtchromatographie (Kieselgel in 40% Methanol-Dichlcrmethan) anzeigte, daß eine vollständige Hydrolyse erfolgt war. Die Lösung wurde im Vakuum verdampft, und der Rückstand aus Ethanol-Aceton umkristallisiert und ergab

LS"

24 23 9 4 8

9- [(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methylJ-2, 6-diaminopurin ; Dieses hatte zufriedenstellende H'-NMR Spektren und Elementaranalyse. Schmelzpunkt 182-184 ⁰C.

Beispiel 6

2 ,-S-piamino-Q- [(2-hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl3 -9H-purin

Ein Gemisch von 33,6 g (0,2 mol/1) 2,6-Diaminopurinhydrat in 400 ml Xylol wurde unter Wasserabspaltung in einer Dean-Stark-Falle unter Rückfluß gehalten. 63,84 g (0,625 mol/1) Essigsäureanhydrid wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde erhitzt, um ein Gemisch aus Essigsäure und Xylol abzudestillieren (Kopftemperatur 115 ⁰C). Am Ende einer 4stündigen Reaktionszeit wurde die Temperatur auf 12 5 ⁰C angehoben. Zu dem Gemisch wurden 0,95 g (0,005 mol/1) p-Toluolsulfosäurehydrat und 74,47 g (0,3 mol/1) 2-0-(Acetoxymethyl)-1,3-bis-(0-acetyl)-glycerol gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde erhitzt, um ein Gemisch aus Xylol und Essigsäure bei 125 ⁰C abzudestillieren. Am Ende einer 3stüdigen Reaktionszeit wurde die Destillatioiistemperatur auf 135 ⁰C erhöht. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, und man erhielt das Rohprodukt durch Flash-Verdampfung und Triturieren des Rückstandes mit Aceton. Umkristallisation aus Ethanol ergab das analytisch reine Zwischenprodukt ._„2_ jL6-Diacetamido-9- [( 2-acetoxy-l-acetoxymethylethoxy)-methyl] purin. Der Feststoff wurde in Methanol gelöst und mit einem gleichen Volumen 40%igem wässrigen Methylamin 15 min im Dampfbad er-hitzt. Flash-Verdampfung und Umkristallisation des Rückstands aus Ethanol ergab 2,6-Diamino-9- [(2-hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methylJ-9H-purin.

Beispiel 7 ' \

a) 9-£(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl]-2-chloradenin

Eine Lösung von 2,0 g (4 mmol/1) 9- r(2-Benzoyloxy-(l-benzoyloxymethylethoxy)-methylj -2,6-dichlorpurin in 6 5 ml gesättigtem

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methanolischen Ammoniak wurde in einer Bombe 20 h auf 8 5 ⁰C erhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum verdampft und zweimal aus Ethanol umkristallisiert und ergab analytisch reines 9-£(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl]-2-chloradenin.

b) 9- [(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy )-methyl] -2-chlor-6-hydroxypurin

Zu einer Lösung von 500 mg (1,83 mmol/1) 9-£( 2-Hydroxy-l-hydroxymethyIethoxy)-methyl] -2-chloradenin in 10 ml Eisessigsäure wurden 0,6 3 g (9,15 mmol/1) Natriumnitrit portionsweise innerhalb von 45 min zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 4 h gerührt, dann im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde einmal aus Wasser und einmal aus Ethanol umkristallisiert, und ergab analytisch reines 9-Q 2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl] -2-chlor-D-hydroxypurin.

c) 9-[(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl] -guanin

Eine Lösung von 0,274 g (1 mmol/1) 9- [(2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyl]-2-chlor-6-hydroxypurin in 60 ml gesättigtem methanolischen Ammoniak wurde 25 h in einer Bombe auf 12 0 C erhitzt. Die abgekühlte Lösung wurde im Vakuum verdampft und zweimal aus Wasser umkristallisiert, was analytisch reines 9-[(2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methyl3 guanin ergab; Schmelzpunkt 220-222 ⁰C,

Beispiel 8

a) 5-Benzyloxy-l,3-dioxan-2-on

Eine Lösung von 182 g (1 mol/1) 2-0-Benzylglycerol (Carbohydrate Research 91 (1981) 85-88 G. Chittenden), 128 ml (1,1 mol/1) 2,6-Lutidin und 550 ml (1,1 mol/1) 20% Phosgen in Toluol wurde 2 Tage.· bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand mit fraktioneller Destillation gereinigt, was 15 7 g (75%) 5-Benzyloxy-1,3-dioxan-2-on ergab. _,

"-»- -24239A- 8

b) 5-Hydroxy-l,3-dioxan-2-on ·

Eine Lösung von 177 g (0,85 mol/1) 5-Benzyloxy-l,3-dioxan-2-on in 100 ml 1:1 Tetrahydrofuran-Ethanol wurde mit 16 g 5% Palladiumauf -Kohle bei Normaldruck geschüttelt, bis die theoretische Wasserstoffmenge verbraucht war. Der Katalysator wurde abfiltriert, das Filtrat durch ein Celit-Polster geleitet und im Vakuum verdampft; dies ergab 94.5g (80%) 5-Hydroxy-l,3-dioxan-2-on.

c) 5,5-Methylendioxybis-(l,3-dioxan-2-on)

Ein Gemisch von 59 g (0,5 mol/1) 5-Hydroxy-l,3-dioxan-2-on, H5 g (0,5 mol/1) Paraformaldehyd und 24 ml Bortrifluoridetherat in 80 ml trockenem Tetrahydrofuran wurde mit 30 g 3A Molekularsieben 18 h bei Raumtemperatur gerührt.

Das Gemisch wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum verdampft. Der Ölrückstand wurde in Ether gelöst und zweimal mit 5%igem wässrigem Natriumbicarbonat und zweimal mit Wasser extrahiert. Die etherischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert- und verdampft, und ergaben 5,5-Methylendicxybis-(1,3-dioxan-2-on).

d) (2-Oxo-l,3-dioxan-5-yl)-oxymethylacetat

Zu einer gekühlten (0 ⁰C) Lösung von 100 ml Essigsäureanhydrid und 0,3 ml konzentrierter Schwefelsäure wurde portionsweise 100.4 g(0,33 mol/1) 5,5-Methylendioxybis-(1,3-dioxan-2-on) gegeben, während eine Innentemperatur von 0-5 ⁰C aufrecht erhalten- wurde. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur 18 h gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 600 ml Eis und Wasser gegossen und dreimal mit einem gleichen Volumen gereinigtem Ether extrahiert. Die Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und verdampft, und ergaben (2-Oxo-l,3-dioxan-5-yl)-oxymethylacetat.

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e ) 2-Acetamido-l, 9-dihydro-9- [_( 2-oxo-l, 3-dioxan-5-yl)-oxyme thy iQ - purin- 6 - on

Ein Gemisch aus 6,53 g (27,8 mmol/1) Diacety!guanin, 0,217 g p-Toluolsulfcsäuremonohydrat und 9,16 g (48,2 mmol/1) (2-Oxo-l,3-dioxan-5-yl)-oxymethylacetat in 60 ml trockenem Xylol wurde unter Rühren 18 h unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt, und der Rückstand mit Säulenchromatographie auf Kieselgel gereinigt, wobei das getrocknete 9-Isomere mit 10% Methanol in Dichlormethan eluiert wurde. Umkristallisation aus Methanol ergab 5,4 g (60%) 2-Acetami do-1,9-dihydro-9-[(2-oxo-l,3-dioxan-5-yl)-oxymethyl] -6K-purin-6-on.

f) 9-Q2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy)-methylj -guanin

Eine Lösung von 0,63 g (1,96 mmol/1) 2-Acetamido-1,9-dihydro-9-[(2-oxo-l,3-dioxan-5-yl)-oxymethyl]-6H-purin-6-on in 30 ml 40%igem wässrigen Methylamin wurde 0,5 h im Dampfbad erhitzt, dann im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert und ergab 9- [( 2/-Hydroxy-1-hydroxymethy 1)-ethoxymethyl] -guanin .

Die folgenden Beispiele 9 bis 13 erläutern die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen, deren Wirkstoff eine Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz oder ein Ester derselben ist.

Beispiel 9 ' Tablette

Wirkstoff 100 mg

Lactose 200 mg

Stärke 50 mg

Polyvinylpyrrolidon 5 mg

Magnesiumstearat 4 mg

Die Tabletten wurden aus den obigen Bestandteilen mittels Nassgranulation und anschließende Kompression hergestellt.

--- 242394

Beispiel 10

Injektionslösung

Wirkstoff 0,775 g

Steriler, pyrogenfreier Phosphatpuffer,

pH 7 ad * 2 5 ml

Beispiel 11 Ophthalmologische Lösung

Wirkstoff 1,0 g

Natriumchlorid, p.a. 0,9 g

Thiomersal 0,001 g

Gereinigtes Wasser ad Γ00 ml

pH eingestellt auf ' 5,5-7,5

Beispiel 12 Paste auf ö'lgrundlage

Kaolin (festes Streckmittel) 20,0 Gew.%

Mineralöl* (flüssiges Streckmittel) 60,0 Gew.%

Wirkstoff 20,0 -Gew.%

Die Bestandteile wurden zu einer Paste mit gleichförmiger Konsistenz vermischt.

Mineralöl ist eine hochsiedende Fraktion eines raffinierten Erdöls, das nicht weniger als 96% nonsulfonatables Material enthält. .

Beispiel 13 Futtermittelzusatz - Pellets

Wirkstoff 1%

Getreidebasis 99%

Die zwei Bestandteile wurden vermischt und das Gemisch in eine herkömmliche Futtermittel-Pelletierungsanlage eingespeist.

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Beispiel 14

In vivo Aktivität von 9- [](2-Hydroxy-l-hydroxymethylethoxy )-methyl]-guanin und Acyclovir gegen equinen Rhinopneumonitis-Virus

Methode

Männliche entwöhnte Syrische Hamster, 40-50.g, 21-24'Tage alt, wurden in "5er*»Gruppen in Käfige gegeben und erhielten Wasser und Nahrung nach Belieben.

Es wurdeequiner Rhinopneumonitisvirus (EHV-I), hamsteradaptierter Vaccinestamm "Pneumabort" verwendet; der Impfstoff wurde 1Ofach in Gewebekulturflüssigkeit verdünnt, und diese Stammlösung wurde in 1 ml Aliquots in versiegelten Glasphiolen bei -70 C gelagert. Am Tag 0 erhielten die- zu infizierenden Hamster subkutan in die linke Seite 0,2 ml Stammvaccinevirus, der nochmals 5fach in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt worden war.

9-'£( 2-Hydroxy-1-hydroxymethylethoxy)-methyIJ -guanin , (nachfolgend als 759 U bezeichnet) und Acyclovir wurden als wässrige Lösungen in sterilem destillierten Wasser in den unten aufgeführten Konzentrationen zubereitet.

Experiment 1

Intraperitoneale Verabreichung:von Tag 0 bis Tag 4 einschließlich erhielten die Hamster 759 U oder Acyclovir aufgeteilt auf zwei Dosen täglich in wässriger Lösung, wobei die 759 U Konzentration wie folgt variierte: 5 mg/ml für. eine Dosis von 100 oder 50 mg/kg/Tag, 1,2 mg/ml für 20 mg/kg/Tag, 0,18 mg/ml für 4 mg/kg/Tag und 0,036 mg/ml für 2 mg/kg/Tag. Unbehandelte Kontrolltiere erhielten ein entsprechendes Volumen steriles destilliertes Wasser.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

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Anzahl Behandlung Tag Kumulative Mortalität in der mg/kg/Tag Gruppe intraperitoneal

10	50/Acyclovir	1	2	5	6	6
10	100/Acyclovir	0	1*	2*	2*	3*
10	1OO/759U	0	0	o	0	1*
10	5O/759U	0	0	0	0	0
10	2O/759U	0	0	0	0	0
10	4/759U	0	0	0	0	0
10	2/759U	0	0	0	0	0
10	unbehandelt	5	9	10	10	10

nicht Viurs-spezifische Todesfälle

Zusammenfassung

Eine Acyclovirdosis von 100 mg/kg/Tag intraperitoneal über 5 Tage, beginnend 5 h vor der Infizierung, war im allgemeinen notwendig, um virusinduzierte Todesfälle zu verhindern. Im Vergleich dazu ergaben 2 mg/kg/Tag 759 U intraperitoneal vollständige Beherrschung der Erkrankung.

Experiment 2(a)

Orale Verabreichung von 759 U

Es wurde eine Stammlösung von 759 U in destilliertem Wasser mit 0,304 mg/ml hergestellt und dann in 3 Schritten auf 0,101 und 0,034 mg/ml verdünnt. Die Hamster erhielten 5 Tage lang mit Medikament versetztes Trinkwasser, beginnend 5 h vor der Infi-, zierung. Eine Kontrollgruppe erhielt Wasser ohne Medikament.

2Λ239 4

Ergebnisse

Anzahl in der GrupDe

Behandlung mg/kg/Tag· 759U oral

Tag

Kumulative Mortalität

10 10 10 10

39

13

unbehandelt

0	0	0	0	0	0
0	0	0	0	0	0
0	1	1	1	1	1
1	5	10	10	10	10

berechnet aus der durchschnittlichen täglichen'Aufnahme

Experiment 2(b)

Orale Verabreichung von Acyclovir

Acyclovir wurde in sterilem destillierten Wasser mit 2 mg/ml gelöst, unter Zugabe von etwas Natriumhydroxid und Erwärmen auf 42 C, um das Auflösen zu erleichtern. Die Hamster erhielten 5 Tage lang mit Medikament versetztes Trinkwasser, das 2 mg/ml Acyclovir enthielt, beginnend 5 h vor der Infizierung. Die orale Behandlung ergab eine Dosis von etwa 100 mg/kg/Tag. Eine Kontrollgruppe, die medikamentfreies Wasser erhielt, wurde gebildet.

Ergebnisse Anzahl Behandlung in der mg/kg/Tag Gruppe Acyclovir oral	100 unbehandelt	Kumulative .... 2 3 4	2 5 6 12	Mortalität 5 6	8 12
12 12	Zusammenfassung	0 0		7 12

Bei oraler Verabreichung mit 100 mg/kg/Tag über 5 Tage zeigte Acyclovir eine schlechte Wirksamkeit gegen EHV-I, während 759 U

TA

-ss-

242394 8

oral mit 13 mg/kg/Tag voll wirksam war und bei 3 mg/kg/Tag nur begrenzte Mortalität auftrat.

Beispiel 15 . .

Vergleich der in vivo Aktivität von 7 59 U und seinem 6-Amino-Analogen (45 7 U) gegen equinen Rhinopneumonitisvirus

Material und Methoden

Hamster: 50 männliche WO/CR Syrische Hamster wurden mit zufälliger Verteilung in 10 5er-Gruppen in Käfige gegeben und erhielten Wasser und Nahrung (Samenmischung) nach Belieben. Die Hamster wurden am Tag -3, 0, 4 und/oder bei Tod/Opferung gewogen. Der Wasserverbrauch wurde über die Tage -3 bis 0 bis 4 aufgezeichnet.

Virus und Infizierung: EHV-I Pneumabort Vaccinestamm, der als lOfache Verdünnung gelagert war, wurde nochmals lOfach in PBS zur Infizierung verdünnt. Am Tag 0 erhielten die Hamster in den Gruppen 1 bis 9 0,2 ml Virusinocculat subcutan in die linke Seite, was etwa 2x10 plaquebildenden Einheiten entsprach.

Verbindungen und Behandlung:

45 7 U und 759 U wurden mit 0,075 mg/ml im Trinkwasser gelöst. Bei Annahme einer täglichen Aufnahme von 134 ml/kg Körpergewicht ergibt dies eine tägliche Dosis von etwa 10 mg/kg. Mit Medikament versetztes Trinkwasser wurde wie unten 96h lang verabreicht, beginnend 5h vor der Infizierung;

Gruppe Behandlung

759U 457U unbehandeIt/infiziert unbehandelt/nicht infiziert

In der folgenden Tabelle sind die kumulativen Mortalitäten zusammengestellt. Die Medikamentaufnahme wurde aus dem Gewicht

Λ mm	3
4-	CTi
7-	9
10
Ergebnisse

24239 4 8

- 3-9 -

der Tiere und dem Wasserverbrauch berechnet, der für den Zeitraum des Experiments aufgezeichnet wurde.

Es gab nur einen Todesfall durch virusinduzierte Hepatitis bei den 15 mit 45 7 U behandelten Kamstern, im Vergleich zu 14 Todesfällen bei 15 unbehandelten Kontrolltieren und keinem Todesfall bei 15 Hamstern, die 759 U erhielten.

Gruppe	Konz. von 457U in Wasser mg/ml	Konz. von 759U in Wasser mg/ml	Durchschnittl. Kumulative Mortalität Aufnahme (aus 15) am Tag mg/kg/Tag 2 4 4t	0	0	0
1-3	—	0,075	6,6	0	1	1
4-6	0,075	'-	6,8	0	9	14
7-9	-	-	-	0	0	0
10*	—	—
Zusammenfassung

Die Verbindung 457 U, das Diaminoderivat des 759 U_; verhinderte fast vollständig eine EHV-I induzierte Sterblichkeit bei Syrischen Hamstern, wenn es oral im Trinkwasser mit etwa 7 mg/kg/Tag verabreicht wurde, während 759 U die EHV-I induzierte Mortalität vollständig verhinderte.

Beispiel 1_6_

In vitro Aktivität von 759 U gegen Herpes simplex Typ 1

Methode

Auf 60 mm Kunststoffzellkulturschalen wurde eine VERO Zellsuspension (6 ml 2x10 Zellen/ml) in VERO Zellwachstumsmedium verteilt, das 5% Fetales Kälberserum, 10% Eagles Minimal Essential Medium, 0,11% Natriumbicarbonat und 0,25% Crystamycin enthielt (50 000 Einheiten/ml Natriumbenzylpenicillin B.P. und 50 mg/ml Streptomycinsulfat B.P.). Die Schalen wurden vorsichtig geschüttelt, um eine vollständige Dispersion der Zellen

242394 8

sicherzustellen, dann wurden die Kulturen bei 37 ⁰C in einer Atmosphäre von 50% C0_/Luft über Nacht incubiert, um Konfluenz zu erreichen. Das Wachsturnsmedium wurde dann durch 2 ml Virus-' inoccultat (Herpes simplex Typ 1) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ersetzt. Die Viruskonzentration war ausreichend, um die Bildung von 200 bis 400 Plaques/Platte herbeizuführen. Eine Stunde lang wurde der Virus bei 37 ⁰C in 5% C0₂/Luft absorbiert, dann wurden die Platten abgegossen und bei 42 C mit Abdeckmedium (8 ml) versehen. Das Abdeckmedium bestand aus 0,6% Agarose, 2% Fetalem Kälberserum, 10% Eagle's Minimal Essential Medium, 0,11% Natriumbicarbonat und 0,25 % Crystamycin.

Im Micromolbereich der aktiven Verbindung wurden Verdünnungsreihen in Zweierschritten in der Abdeckschicht hergestellt. Replizierte Kulturen wurden mit der Abdeckschicht auf der Nährlösung beschickt, wobei die Abdeckschichten einen gewissen Konzentrationsbereich der Verbindung enthielten. Ebenso wurden yr.bahandelte Viruskontrollkulturen und nicht-infizierte Kulturen hergestellt. Die Abdeckschicht ließ man sich bei Raumtemperatur verfestigen, bevor die Kulturen für 4- Tage bei 37 C und 5% C0_/Luft in den Inkubator zurückgestellt wurden. Dann wurden die Kulturen mit 10% Formalin in PBS 30 bis 60 min fixiert; die Abdeckschicht wurde entfernt und die Zellen mit 0,-05% Gew./Vol. Methylviolett in 20% Methanol gefärbt. Die erhaltenen Plaques wurden gezählt und als Prozentsatz der in unbehandelten Viruskontrollkulturen gezählten Plaques ausgedrückt. Diese Werte wurden dann gegen den Logarithmus 10 der Verbindungskonzentration aufgetragen, und die IC₁-Q Werte, welche die Menge der Verbindung darstellen, welche benötigt wird, um die Plaqueanzahl um 50% zu verringern, wurde aus der sich ergebenden Dosiswirkungskurve abgelesen.

*- 242394 8

Ergebnisse

759 U ₅Q ymol/l	Acyclovir IC₅₀ ymol/l
0,09	0,17
0,05	0,075
0,036	0,11

Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3

Durchschnitt 0,059 0,118

Zusammenfassung

759 U hat in vitro eine größere Aktivität gegen Herpes simplex Typ I als Acyclovir.

Beispiel 17

In vivo Aktivität von 75 9 U gegen Herpes encephalitis Herstellung einer Virusstammlösung

Schweizer Mäuse mit einem Gewicht von 12-15 g wurden mit Ether betäubt und intracerebral mit 0,02 5 ml einer Gewebekulturzubereitung des Herpesvirus Typ I geimpft. Die Mäuse wurden täglich auf Zeichen von Herpes encephalitis, d.h. zur Lähmung führende cerebrale Irritation, Koma und Tod, untersucht. Die Mäuse wurden getötet, wenn frühe Anzeichen einer cerebralen Irritation auftraten. Die Viscera der Mäuse wurden nach Zeichen einer Infektion mit Bakterien oder anderen Erregern untersucht, und wenn keine Anormalitäten gefunden wurden, wurden die Gehirne aseptisch entnommen und zu einer glatten Paste verrührt. Das Homogenat wurde in 4 ml Gewebekulturnährlösung pro Gehirn resuspendiert, und im Verhältnis 2:1 mit Glycerin vermischt

Mäusgehirne wiegen etwa 400 mg und die Zubereitung hatte folglich eine lOfache Verdünnung.

Die auf diese Weise hergestellten Virusstammlosungen wurden in Mäusen titriert, indem der LD₅ q Titer durch intracerebrale Impfung der Mäuse mit 1Ofaeher Verdünnung der Virusstammlösung

2Λ2394

bestimmt wurde; die Mäuse wurden anschließend zweimal täglich auf Anzeichen einer Infektion untersucht. Der LDrq Titer wurde mit-der Karbermethode bestimmt. \

Methode

Gruppen von 5 Mäusen wurden intracerebral mit VirusStammlösung infiziert, die so verdünnt war, daß eine Dosis von etwa 300 χ LDcn entstand. Die zu testende Verbindung wurde zweimal täglich als Suspension oral mit einer Dosis von 100 mg/kg verabreicht. Die Tiere wurden zweimal täglich untersucht und die Oberlebenszeiten wurden mit Halbtaggenauigkeit berechnet. Die Behandlung erfolgte 5 Tage lang, die gesamte Überwachungszeit betrug 14 Tage. Die Oberlebenszeiten wurden in ihre Kehrwerte umgewandelt und für jede Gruppe die durchschnittliche Oberlebenszeit bestimmt (L.Bauer, D.J., Brit.J.Exp.Path., 1960, 41, 130).

Acyclovir 759 U Unbehandelt

Durchschnittliche reziproke Überlebenszeit . 0,26 0,15 0,33

Zusa'-iimen f as s un g

Die beobachtete Aktivität von 7 59 U bei oraler Verabreichung an intracerebral infizierte Mause^.war. viel höher, als dieje- . nige von Acyclovir unter den selben Bedingungen.

Beispiel 18

Vergleich der in vivo Aktivität von 759 U und 457 U gegen Herpes encephalitis '

759 U und 457 U wurden in vivo gegen Herpes encephalitis bei Mäusen getestet, und zwar im Vergleich zu Acyclovir und seinem 6-Aminoanalogen, 2-Amino-9-(2-hydroxymethoxymethyl)-adenin (134 U).

242394

Material und Methoden

Mäuse: CD.l Mäuse mit 16 bis 20 g wurden von Charles River, Mansion, Kent, U.K. bezogen. Die Tiere wurden in Gruppen von etwa 10 gehalten und erhielten Wasser und Nahrung nach Belieben .

Antivirale Verbindungen: Die Verbindungen Acyclovir, 134 U, 759 U und H57 U wurden vor jedem Experiment als Suspensionen oder Lösungen in sterilem Wasser mit einer Konzentration von 20 mg/ml zubereitet und während der Behandlungszeit bei 4 C gelagert.

Virus: Für alle Experimente, wurde der ICI Stamm des Herpes simplex Virus Typ I in einer Konzentration von 300 LD₅₀ verwendet (10 PFU/ml). Verdünnungen der Virusstammlösung (10⁷ PFU/ml) wurden in PBS "A" hergestellt.

Testverfahren: Es entspricht dem in Beispiel 13 beschriebenen. Es wurden drei Experimente durchgeführt, bei denen die Verbindung auf 3 Arten verabreicht wurde: 1. subcutan, 2. oral, und 3. intraperitoneal. Die Verbindungen wurden mit 100 mg/ ml/Dosis zweimal täglich 4,5 Tage lang verabreicht, beginnend 2 bis 3 h nach der Infizierung.

Ergebnisse

Die durchschnittliche reziproke Überlebenszeit nach oraler, subcutaner und intraperitonealer Verabreichung der antiviralen Verbindungen ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

242.394 8

Behändlungsgruppe

oral

Durchs chnittl.re ziproke Überlebens zeit

s . c.

Viruskontrollen 300 LD₅₀

Acyclovir

100 mg/kg/Dosis

134 U

100 mg/kg/Dosis

759 U

100 mg/kg/Dosis

1+57 U

100 mg/kg/Dosis

0,334

0,146

0,155

0,344 0,307

0,237 0,174

0,222 0,226

0,2 36

0,231

0,084 0,093

0,102 0,077

Vergleicht man die beiden Therapiegruppen, nämlich Acyclovir und 134 U mit 75 9 U und 45 7 U, dann zeigt die zweite Gruppe die größte antivirale Wirkung. Die Differenz zwischen den beiden Gruppen war für jede Verabreichungsform hoch signifikant.

Ende der Beschreibung

Claims

242394 rfindungsa η Sprüche

1.2.4 Ist das erhaltene Produkt ein Ester der Verbindung der Formel I, wird dieser zu der Ausgangsverbindung der Formel I oder einem physiologisch verträglichen Salz derselben umgewandelt.

1.2.3 Ist das erhaltene Produkt eine Verbindung der Formel I oder ein Salz derselben, wird diese Verbindung oder das Salz derselben zu einem physiologisch verträglichen Ester der Verbindung oder des Salzes umgewandelt;

1.2.2 Ist das erhaltene Produkt ein Säureadditionssalz, wird dieses zu der Ausgangsbase umgewandelt;

1.2.1 Ist das erhaltene Produkt eine Ease, wird diese zu' einem physiologisch verträglichen Säureadditionssalz umgewandelt;

1.1.5 eine Verbindung der Formel VII

r- O

L- O

(VII)

(worin R und X die obige Bedeutung haben) hydrolysiert wird;

und daß ferner wahlweise eine oder mehrere der folgenden Umwandlungen in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden:

242394 8

1.1.4 eine Verbindung 'der Formel V

(V)

(worin R die obige Bedeutung besitzt, und Q

eine Abspaltgruppe oder -atom bedeutet) mit einer Verbindung der Formel VI

ACH XCHCH OH

(VI)

CH OH

(worin X die obige Bedeutung hat₅ und A eine

Abspaltgruppe oder -atom bedeutet) umgesetzt wird; ·

1.1.3 eine Verbindung der Formel IV

R

(IV)

CH„XCHCH„OH
2 , 2

CHO

242 39h

(worin R und X die obige Bedeutung haben)

oder ein Salz oder Ester derselben mit einem bekannten Verfahren reduziert wird;

1.1.2 eine Verbindung der Formel III

(III) CH XCHCH OH

"I

CH OH

(worin X die obige Bedeutung besitzt, und worin entweder M eine 6-Hydroxy- oder Aminogruppe, und G ein Atom oder eine Gruppe, die durch eine Aminogruppe ersetzt oder zu einer solchen umgewandelt werden können, bedeuten, oder G eine 2-Aminogruppe, und M ein Atom oder eine Gruppe, die durch eine Amino- oder Hydroxylgruppe ersetzt oder zu solchen umgewandelt werden können, bedeuten) · oder ein Salz oder ein Ester derselben zu einer Verbindung der Formel I oder einem Salz oder Ester derselben umgewandelt wird;

1.1.1 eine Verbindung der Formel II

(ID ·

CH XCHCH OW

"'ι

CH₀OW

(worin X die obige Bedeutung besitzt, W und W jeweils ein Wasserstoffatom oder eine blockierende Gruppe darstellen, Y ein Wasserstoffatom oder eine blockierende Gruppe, und Z eine Gruppe der,Formel -OY oder -NHY bedeuten, wobei Y die obige Bedeutung besitzt, mit der Maßgabe, daß

239 4

-H -

mindestens eines von W, VJ und Y eine blökkierende Gruppe darstellt)

entblockiert wird, so daß eine Verbindung der Formel I oder ein Salz oder Ester derselben gebildet wird;

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I

(D CH₀XCHCH OH

²I

CH₂OH

(worin R eine Hydroxy- oder Aminogruppe, und

X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeutet) sowie von physiologisch verträglichen Salzen und Estern derselben, dadurch gekennzeichnet , daß

2. Verfahren nach Punkt 1.1.1, dadurch gekennzeichnet , daß die blockierenden Gruppen W, W und Y aus blockierenden C._,-Alkanoyl-, Aroyl-, Arylmethyl- und Tri-C._ -Alkylslylgruppen gewählt werden.

3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch g.ekennzeich net, daß die Entblockierung durch Hydrolyse oder Hydrogenolyse erfolgt.

4. Verfahren nach Punkt 1.1.2, dadurch gekennzeichnet , daß M und/oder G jeweils eine Azidgruppe darstellen, die durch katalytische Hydrierung zu einer Ami- -nogruppe umgewandelt wird.

5. Verfahren nach Punkt 1.1.2, dadurch gekennzeichnet , daß M und/oder G jeweils ein Halogenatom oder eine Alkylthio- oder Alkylsulfony!gruppe bedeuten, die durch Aminolyse zu einer Aminogruppe umgewandelt werden.

6. Verfahren nach Punkt 1.1.4, dadurch gekennzeichnet , daß A ein Halogenatom oder eine Acyloxygruppe bedeutet.

242394

7. Verfahren nach Punkt 1.1.4, dadurch gekennzeichnet > daß Q ein Wasserstoffatom oder eine Acyl- oder Tri-C._ -Alkylsilylgruppe bedeutet. '

8. Verfahren nach einem der Punkte 1.1.4, 6 oder 7, d a durch gekennzeichnet , daß die Umsetzung in Gegenwart einer Base erfolgt.

9. Verfahren nach Punkt 1.1.5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse unter basischen Bedingungen erfolgt.

10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeich net, daß X ein Sauerstoffatom, und R eine Hydroxygruppe bedeuten. .

11. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekenn zeich net, daß X ein Sauerstoffatom, und R eine Aminogruppe bedeuten.