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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Purinderivaten mit einer acyclischen Seitenkette in Stellung 9, welche Verbindungen antivirale Wirksamkeit besitzen und daher zur Herstellung von pharmazeutischen und veterinären Zusammensetzungen verwendet werden können, die bei der Behandlung von Virusinfektionen bei Menschen und Säugetieren eingesetzt werden.
Ogilvie und Gillen beschreiben in Tetrahedron Letters 21,327 bis 330, die Synthese der Bis- - (hydroxymethyl)-methoxymethylderivate von Adenin, offenbaren aber keine biologische Wirksamkeit.
Gemäss dieser Literaturstelle wurde die Verbindung mit Adenosindeaminase getestet und erwies sich als schlechtes Substrat für das Enzym und als schwacher Konkurrenzinhibitor.
9- [ (2-Hydroxy-l-hydroxymethyläthoxy)-methyl]-guanin und das entsprechende 6-Aminoanalogon werden von der allgemeinen Formel der GB-PS Nr. 1, 523, 865 umfasst, sind aber darin nicht spezifisch geoffenbart. Die GB-PS Nr. 1, 523, 865 offenbart eine Gruppe von acyclischen Nucleosiden, insbesondere 9- (2-Hydroxyäthoxymethyl)-derivate von Purinen, von welchen gefunden wurde, dass sie antivirale Wirksamkeit gegen verschiedene Klassen von DNA- und RNA-Viren sowohl in vitro als auch in vivo besitzen. Insbesondere besitzen diese Verbindungen eine Wirksamkeit gegen die Herpesgruppe von Viren einschliesslich H. simplex, H. zoster und H. varicella. Diese Viren bewirken Krankheiten, wie herpetische Keratitis, herpetische Encephalitis, kalte Entzündungen, Gürtelrose und Genitalinfektionen.
Von den in der GB-PS Nr. 1, 523, 865 spezifisch geoffenbarten Verbindungen hat sich 9- (2-Hydroxyäthoxymethyl)-guanin, auch als Acyclovir bekannt, als besonders aktiv gegen viele H. simplex-Infektionen erwiesen, leidet aber unter dem Nachteil, dass es in wässerigen Systemen schlecht löslich ist.
Es wurde nun unerwartet gefunden, dass die Verbindungen der im nachstehenden angegebenen Formel (I) im Gegensatz zu andern in der GB-PS Nr. 1, 523, 865 geoffenbarten und bisher getesteten Verbindungen wertvolle antivirale Wirksamkeit aufweisen, die ausreicht, Pferde-Rhinopneumonitisvirus in vivo zu behandeln.
Bei Versuchen mit Mäusen hat sich auch gezeigt, dass die Verbindungen eine vorteilhafte Wirksamkeit gegen herpetische Encephalitis besitzen, im Gegensatz zum diesbezüglich wirkungslosen 9- [Bis- (hydroxymethyl)-methoxymethyl]-adenin. Weiterhin besitzen die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen den selektiven Vorteil der grösseren Löslichkeit in Wasser im Vergleich mit Acyclovir, was die Möglichkeit verbessert, hohe Heilmittelspiegel im Plasma erzielen zu können, ohne dass die Gefahr von Nierenkomplikationen auftritt.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel
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worin R Hydroxy oder Amino bedeutet, und deren physiologisch annehmbaren Salzen.
Beispiele von Verbindungen der Formel (I) sind 9- [ (2-Hydroxy-l-hydroxymethyläthoxy)-me- thyl ]-guanin und 9- [ (2-Hydroxy-l-hydroxymethyläthoxy)-methyl] -2, 6-diaminopurin.
Wie oben erwähnt, weisen die Verbindungen der Formel (I) den wichtigen Vorteil auf, dass sie eine bessere Löslichkeit in Wasser besitzen als Acyclovir. So weisen die Verbindungen der Formel (I), worin R Hydroxy oder Amino bedeutet, Löslichkeiten von 0, 4 bis 0, 5 bzw. 2 bis 3% Masse/Masse im Vergleich mit einem Wert von 0, 14% Masse/Masse für Acyclovir auf.
Salze der Verbindungen der Formel (I), die zweckmässigerweise in der Therapie verwendet werden können, sind physiologisch annehmbare Salze von organischen Säuren, wie Milch-, Essig-, Äpfel- oder p-Toluolsulfonsäure, sowie physiologisch annehmbare Salze von Mineralsäuren, wie Salz- oder Schwefelsäure.
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Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Verbindung der allgemeinen Formel
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worin R die obige Bedeutung hat, oder einem Salz hievon, die CHO-Gruppe zur CH OH-Gruppe redu- ziert und anschliessend gegebenenfalls einen oder beide der folgenden Verfahrensschritte durchführt : i) wenn die erhaltene Verbindung eine Base ist, Überführen derselben in ein physiologisch annehmbares Säureadditionssalz, ii) wenn die erhaltene Verbindung ein Säureadditionssalz ist, Überführen desselben in die Stammbase.
Die Reduktion einer Verbindung der Formel (II) nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann beispielsweise durch Umsetzung mit einem geeigneten Aldehydreduktionsmittel, wie Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Tetraäthylammoniumborhydrid oder Pyridin/Diboran/Tetrahydrofuran/Trifluoressigsäure erzielt werden.
Gemäss der Erfindung werden Verbindungen der Formel (I) und physiologisch annehmbare Salze hievon zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Viruserkrankungen bei Menschen und Tieren, insbesondere Säugetieren, hergestellt. Die Verbindungen sind besonders verwendbar zur Behandlung oder Prophylaxe von durch verschiedene DNA-Viren verursachte Erkrankungen, wie Herpesinfektionen, z. B. Herpes simplex, varicella und zoster, Cytomegalovirus, sowie durch Heptatitis B- oder Epstein-Barr-Virus hervorgerufene Krankheiten. Die Verbindungen der Formel (I) können auch zur Behandlung oder Prophylaxe von Papillom- oder Warzenvirusinfektionen verwendet werden.
Ausser ihrer Verwendung in der Humantherapie können die Verbindungen der Formel (I) Tieren zur Behandlung oder Prophylaxe von Viruserkrankungen, beispielsweise bei Säugetieren, verabreicht werden. Beispielsweise sind die Verbindungen der Formel (I) besonders verwendbar zur Behandlung von Pferde-Rhinopneumonitis.
Bei der Behandlung oder zur Prophylaxe einer Viruserkrankung bei Menschen und Tieren wird eine wirksame antivirale Dosis einer Verbindung der Formel (I) oder eines physiologisch annehmbaren Salzes derselben verabreicht.
Die Verbindungen der Formel (I) und deren physiologisch annehmbare Salze (im folgenden summarisch Wirkstoff genannt) können auf jede Weise, die für den zu behandelnden Zustand geeignet ist, verabreicht werden, d. h. oral, rektal, nasal, topisch (einschliesslich bukkal und sublingual), vaginal und parenteral (einschliesslich subkutan, intramuskulär, intravenös, interadermal, intrathecal und epidural). Es ist klar, dass die bevorzugte Art beispielsweise gemäss dem Zustand des Empfängers variieren kann.
Für jede der oben angegebenen Anwendungen und Indikationen hängt der benötigte Anteil des Wirkstoffes (wie oben definiert) von einer Reihe von Faktoren ab, einschliesslich der Schwere des zu behandelnden Zustandes und dem Zustand des Empfängers, und wird letztlich der Entscheidung des zuständigen Arztes bzw. Tierarztes überlassen bleiben. Im allgemeinen jedoch liegt für jede dieser Anwendungen und Indikationen eine geeignete wirksame Dosis im Bereich von 0, 1 bis 250 mg/kg Körpermasse des Empfängers pro Tag, vorzugsweise von 1 bis 100 mg/kg Körpermasse pro Tag, insbesondere von 5 bis 20 mg/kg Körpermasse pro Tag ; eine optimale Dosis ist etwa 10 mg/kg Körpermasse pro Tag.
(Wenn nichts anderes angegeben ist, sind alle Massen des Wirkstoffes als Stammverbindung der Formel (I) berechnet : für Salze wären die Anteile entsprechend zu
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erhöhen.) Die gewünschte Dosis wird vorzugsweise in zwei, drei, vier oder mehr Unterdosen in geeigneten Intervallen über den Tag hindurch verabreicht. Diese Unterdosen können in Einheitsdosierungsformen, z. B. mit einem Gehalt von 10 bis 1000 mg, vorzugsweise 20 bis 500 mg, insbesondere 100 bis 400 mg Wirkstoff pro Einheitsdosierungsform, verabreicht werden.
Obwohl es möglich ist, dass der Wirkstoff allein verabreicht wird, wird es bevorzugt, ihn als pharmazeutische Formulierung zu verabreichen. Derartige Formulierungen, sowohl zur Verwendung in der Human- als auch Veterinärmedizin, enthalten zumindest einen Wirkstoff, wie oben definiert, zusammen mit einem oder mehreren geeigneten Trägern hiefür und gegebenenfalls andern therapeutischen Bestandteilen. Der bzw. die Träger müssen" annehmbar" in dem Sinne sein, dass sie mit den andern Bestandteilen der Formulierung verträglich und für den Empfänger nicht schädlich sind.
Die Formulierungen sind solche, die für orale, rektale, nasale, topische (einschliesslich bukkale und sublinguale), vaginale oder parenterale (einschliesslich subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intrathecale und epidurale) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können zweckmässig in Einheitsdosierungsform präsentiert und nach jeder der in der Pharmazie wohlbekannten Methoden hergestellt werden. Derartige Methoden beinhalten die Vereinigung des Wirkstoffes mit dem Träger, der einen oder mehrere Hilfsbestandteile aufweist. Im allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichförmiges und inniges Inverbindungbringen des Wirkstoffes mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beiden und darauffolgend, wenn notwendig, Formen des Produktes hergestellt.
Formulierungen, die für orale Verabreichung geeignet sind, können in Form einzelner Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, hergestellt werden, die jeweils einen vorherbestimmten Anteil des Wirkstoffes enthalten ; weiterhin als Pulver oder Granulat ; als Lösung oder Suspension in einer wässerigen oder nichtwässerigen Flüssigkeit ; als Öl-in-Wasser-Flüssigemulsion oder Wasser- -in-Öl-Flüssigemulsion. Der Wirkstoff kann auch als Bolus, Latwerge oder Paste präsentiert werden.
Eine Tablette kann durch Komprimieren oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen, hergestellt werden. Komprimierte Tabletten können durch Komprimieren des Wirkstoffes in freifliessender Form, wie als Pulver oder Granulat, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel, Schmiermittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, oberflächenaktiven Mittel oder Dispergiermittel, in einer geeigneten Vorrichtung hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen einer Mischung der pulverförmigen Verbindung, angefeuchtet mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel, erhalten werden. Die Tabletten können gegebenenfalls überzogen oder gekerbt sein und so formuliert werden, dass sie eine langsame oder regulierte Freigabe des darin befindlichen Wirkstoffes gestatten.
Für Infektionen der Augen oder anderer externer Gewebe, z. B. des Mundes und der Haut, werden die Formulierungen vorzugsweise als topische Salze oder Creme mit einem Gehalt des Wirkstoffes in einem Anteil von beispielsweise 0, 075 bis 20% Masse/Masse, vorzugsweise 0, 2 bis 15% Masse/Masse, insbesondere 0,5 bis 10% Masse/Masse, aufgebracht. Wenn zu einer Salbe formuliert, können die Wirkstoffe entweder mit einer paraffinischen oder einer mit Wasser mischbaren Salbengrundlage verwendet werden. Anderseits können die Wirkstoffe mit einer Öl-in-Wasser-Cremegrundlage zu einer Creme formuliert werden.
Wenn gewünscht, kann die wässerige Phase der Cremegrundlage beispielsweise zumindest 30% Masse/Masse eines mehrwertigen Alkohols, d. h. eines Alkohols mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen, wie Propylenglykol, Butan-1, 3-diol, Mannit, Sorbit, Glycerin und Polyäthylenglykol und deren Mischungen, enthalten. Die topischen Formulierungen können zweckmässigerweise eine Verbindung enthalten, welche die Absorption oder Durchdringungsfähigkeit des Wirkstoffes durch die Haut oder andere affizierte Flächen erhöht. Beispiele eines derartigen dermalen Durchdringungserhöhers sind Dimethylsulfoxyd und verwandte Analoga.
Die ölige Phase von Emulsionen kann in bekannter Weise aus bekannten Bestandteilen zusammengesetzt werden. Obwohl die Phase nur einen Emulgator enthalten kann, enthält sie zweckmässigerweise eine Mischung zumindest eines Emulgators mit einem Fett oder einem Öl oder mit beiden.
Vorzugsweise wird ein hydrophiler Emulgator zusammen mit einem lipophilen Emulgator einverleibt,
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der als Stabilisator wirkt. Es wird auch bevorzugt, sowohl ein Öl als auch ein Fett einzuverlei- ben. Miteinander machen der (die) Emulgator (en) mit oder ohne Stabilisator (en) das sogenannte
Emulgierwachs aus und das Wachs zusammen mit dem Öl und/oder Fett machen die sogenannte emul- gierende Salbengrundlage aus, welche die ölige dispergierte Phase der Cremeformulierungen bildet.
Emulgiermittel und Emulsionsstabilisatoren, die zur Verwendung in den Formulierungen ge- eignet sind, sind Polyoxyäthylenderivate von Sorbitanstearat, Sorbitanoleat-Tenside, Cetostearyl- alkohol, Myristylalkohol, Glycerylmonostearat und Natriumlaurylsulfat.
Die Wahl geeigneter Öle oder Fette für die Formulierung basiert auf der Erzielung der ge- wünschten kosmetischen Eigenschaften, weil die Löslichkeit des Wirkstoffes in den meisten Ölen, die wahrscheinlich in pharmazeutischen Emulsionsformulierungen verwendet werden sollen, sehr gering ist. So soll die Creme vorzugsweise ein nichtschmieriges, nichtfleckendes und waschbares
Produkt mit geeigneter Konsistenz sein, dass ein Auslaufen aus Tuben und andern Behältern vermie- den wird. Gerad- oder verzweigtkettige mono- oder dibasische Alkylester, wie Diisoadipat, Isocetylstearat, Propylenglykoldiester von Kokosnussfettsäuren, Isopropylmyristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2-Äthylhexylpalmitat oder eine Mischung von verzweigtkettigen Estern kön- nen verwendet werden, wobei die letzteren drei bevorzugte Ester sind.
Diese können allein oder in Kombination je nach den erforderlichen Eigenschaften verwendet werden. Anderseits können Lipide mit hohem Schmelzpunkt, wie weisses Weichparaffin und/oder flüssiges Paraffin oder andere Mineralöle, verwendet werden.
Formulierungen, die für topische Verabreichung in die Augen geeignet sind, sind Augentropfen, worin der Wirkstoff in einem geeigneten Träger, insbesondere einem wässerigen Lösungsmittel für den Wirkstoff, gelöst oder suspendiert ist. Der Wirkstoff ist vorzugsweise in derartigen Formulierungen in einer Konzentration von 0, 5 bis 20%, vorteilhafterweise 0, 5 bis 10%, insbesondere etwa 1, 5% Masse/Masse, vorhanden.
Formulierungen, die für topische Verabreichung in den Mund geeignet sind, sind Lutschtabletten, die den Wirkstoff in einer Geschmacksbasis, gewöhnlich Saccharose und Akaziengummi oder Traganth enthalten ; Pastillen, die den Wirkstoff in einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akaziengummi enthalten ; und Mundwäschen, die den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger enthalten.
Formulierungen, die für nasale Verabreichung geeignet sind, wobei der Träger ein Feststoff ist, sind ein grobes Pulver mit einer Teilchengrösse von beispielsweise 20 bis 500 11m, das so wie Schnupftabak genommen wird, d. h. durch rasches Inhalieren durch die Nase aus einem Behälter mit dem Pulver, der knapp an die Nase gehalten wird. Geeignete Formulierungen, worin der Träger flüssig ist, zur Verabreichung beispielsweise als Nasenspray oder Nasentropfen, sind wässerige oder ölige Suspensionen des Wirkstoffes.
Formulierungen, die für vaginale Verabreichung geeignet sind, können als Pessare, Tampons, Cremen, Gele, Pasten, Schäume oder Spray formulierungen hergestellt werden, die ausser dem Wirkstoff geeignete bekannte Träger enthalten.
Formulierungen, die für parenterale Verabreichung geeignet sind, sind wässerige und nichtwässerige sterile Injektionslösungen, die Antioxydantien, Puffer, Bakteriostatika und löslich machende Stoffe enthalten können, welche die Formulierung mit dem Blut des Empfängers isotonisch machen ; und wässerige und nichtwässerige sterile Suspensionen, die Suspendier- und Verdickungsmittel enthalten können. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern präsentiert werden, beispielsweise verschlossenen Ampullen und Phiolen, und sie können in gefriergetrocknetem Zustand gelagert werden, wobei lediglich die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, beispielsweise Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erforderlich ist.
Extemporierte Injektionslösungen und-Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der oben beschriebenen Art hergestellt werden.
Bevorzugte Einheitsdosierungsformulierungen sind jene, die eine tägliche Dosis oder tägliche Einheitssubdosis, wie oben angegeben, oder eine geeignete Fraktion hievon, eines Wirkstoffes enthalten.
Es ist klar, dass ausser den Bestandteilen, die oben besonders erwähnt wurden, die Formulierungen auch andere herkömmliche Mittel enthalten können, wie sie eben bei der in Frage stehen-
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den Art von Formulierung üblich sind ; beispielsweise können jene, die für orale Verabreichung geeignet sind, Aromatisierungsmittel enthalten.
Veterinärformulierungen enthalten zumindest einen Wirkstoff, wie oben definiert, zusammen mit einem auf dem Gebiet der Veterinärmedizin üblichen Träger.
Veterinärträger sind Materialien, die zum Zwecke der Verabreichung der Zusammensetzung verwendbar sind und können feste, flüssige oder gasförmige Materialien sein, die inert oder sonst auf dem Gebiet der Veterinärmedizin annehmbar oder mit dem Wirkstoff verträglich sind. Diese Veterinärformulierungen können oral, parenteral oder auf jede andere gewünschte Art und Weise verabreicht werden.
Für orale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten, eines Granulats, eines Arzneitrankes, einer Paste, von Cachets, Kapseln oder Nahrungsmittelzusätzen sein.
Das Granulat kann gemäss der wohlbekannten Technik des Nassgranulierens, des Vorkomprimierens oder Schlagens hergestellt werden. Es kann Tieren in einem inerten flüssigen Träger zur Bildung eines Arzneitrankes oder in einer Suspension mit Wasser- oder Ölgrundlage verabreicht werden.
Vorzugsweise werden weitere Hilfsbestandteile, wie Dispergiermittel, zugegeben. Diese Formulierungen enthalten vorzugsweise 15 bis 85% des Wirkstoffes.
Eine Paste kann durch Suspendieren des Wirkstoffes in einem flüssigen Verdünnungsmittel formuliert werden. Ein Versteifungs- oder Verdickungsmittel kann zusammen mit einem Netzmittel oder einem Feuchthaltemittel, wenn das flüssige Verdünnungsmittel Wasser ist, einverleibt werden.
Wenn eine Emulsionspaste benötigt wird, sollten zweckmässigerweise ein oder mehrere oberflächenaktive Mittel einverleibt werden. Der Wirkstoff kann 25 bis 80 %-Masse dieser Pastenformulierungen ausmachen.
Bei Nahrungsmittelzusätzen ist der Wirkstoff im allgemeinen in grossen Anteilen in bezug auf die Hilfsbestandteile vorhanden und die Zusätze können direkt oder nach Zwischenmischung oder Verdünnung zugegeben werden. Beispiele von Hilfsbestandteilen für derartige Formulierungen umfassen feste, oral einnehmbare Träger, wie Maismehl, Sojamehl, Weizenkleie, Sojaschrot, essbare pflanzliche Materialien und Fermentationsrückstände. Der Wirkstoff wird gewöhnlich einem oder mehreren der Hilfsbestandteile einverleibt und innig und gründlich durch Mahlen, Schleudern oder Rühren mit herkömmlichen Vorrichtungen dispergiert. Formulierungen mit einem Gehalt von 1 bis 90 %-Masse des Wirkstoffes sind zur Zugabe zu Futtermitteln geeignet.
Zur Behandlung von Herpesinfektionen bei Pferden kann eine orale oder parenterale Dosis von 0, 1 bis 250 mg/kg Körpermasse/Tag, vorzugsweise 2 bis 100 mg/kg/Tag erforderlich sein. Die Dosis kann in einzelne Einheiten aufgespalten werden, die in regelmässigen Intervallen während des Tages und wiederholt täglich bis zu 14 Tage lang oder bis die Infektion beseitigt ist, verabreicht werden. Für Virusinfektionen bei andern Tieren kann die Dosis in Abhängigkeit von der Grösse und dem Metabolismus des Tieres variieren. Die Zusammensetzungen können in Einheitsdosierungsform, wie in Form von Tabletten einige Male täglich in einem Anteil von 10 bis 1000 mg pro Einheitsdosis verabreicht werden.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese hierauf beschränkt sein soll.
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Eine Mischung von 111, 8 g 1, 4-Dichlorbutan-2, 3-diol, 42, 2 g p-Formaldehyd und 22 ml Bortrifluorid-ätherat in 460 ml trockenem Acetonitril wurde unter Rühren am Rückfluss gehalten, bis sich die Feststoffe gelöst hatten. Molekularsiebe wurden zugegeben und die Reaktionsmischung weitere 3 h am Rückfluss gehalten. Die Mischung wurde gekühlt und durch Zugabe von mehr Sieben getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft.
Der ölige Rückstand wurde zu 250 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung zugesetzt und dreimal mit gleichen Volumina an gereinigtem Äther extrahiert. Die ätherischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft.
Die verbleibende Flüssigkeit wurde unter Wasserstrahlpumpendruck (2128 Pa) destilliert und die bei 99 bis 109 C siedende Fraktion gesammelt, wobei 4, 5-Bis- (chlormethyl) -1, 3-dioxolan erhalten wurde.
Die Mischung von 76, 5 g 4, 5-Bis- (chlormethyl) -1, 3-dioxolan und 258 g Natriumbenzoat in
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portionsweise 18 mg (0,47 Mol) Natriumborhydrid zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und abgeschreckt und der PH-Wert mit 4n wässeriger Salzsäure auf 6 eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wurde filtriert, wobei 9-[ (2-Hydroxy-l-hydroxymethyläthoxy)- - methyl]-guanin in einer Ausbeute von 74% erhalten wurde, Fp. 248 bis 250 C.
In vivo-Aktivität von 9- [ (2-Hydroxy-l-hydroxymethyläthoxy)-methyl] -guanin und Acyclovir gegen Pferderhinopneumonitisvirus
Verfahren : Männliche, von Milch frisch entwöhnte syrische Hamster mit einer Masse von 40 bis 50 g, 21 bis 24 Tage alt, wurden in Gruppen zu 5 in Käfige eingebracht und es wurde ihnen Wasser und Futter ad lib. gegeben.
Pferderhinopneumonitisvirus (EHV-1), hamsteradaptierter Vakzinestamm"Pneumabort"wurde verwendet ; die Vakzine wurde 10 in Gewebskulturflüssigkeit verdünnt und dieser Vorrat in 1 ml aliquoten Anteilen in verschlossenen Glasphiolen bei-70 C aufbewahrt. Am Tag Null erhielten die zu infizierenden Hamster 0, 2 ml Vorratsvakzinevirus, weiter 2 x 10-1 in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt, subkutan in die linke Flanke.
9- [(2-Hydroxy-1-hydroxymethyläthoxy)-methyl]-guanin (im folgenden 759U bezeichnet) und Acyclovir wurden in sterilem, destilliertem Wasser in den im nachstehenden angegebenen Konzentrationen als wässerige Lösungen aufbereitet.
Versuch 1 : Intraperitoneale Verabreichung
Vom Tag Null bis einschliesslich Tag 4 erhielten die Hamster 759U oder Acyclovir in unterteilten Dosen zweimal am Tag in wässeriger Lösung, wobei die Konzentration von 759U wie folgt variierte, nämlich 5 mg/ml, um eine Dosisrate von 100 oder 50 mg/kg/Tag zu ergeben, 1, 2 mg/ml für 20 mg/kg/Tag, 0, 18 mg/ml für 4 mg/kg/Tag und 0, 036 mg/ml für 2 mg/kg/Tag. Unbehandelte Kontrollhamster erhielten ein äquivalentes Volumen an sterilem destilliertem Wasser.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt :
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<tb>
<tb> Behandlung
<tb> mg/kg/Tag <SEP> kumulative <SEP> Sterblichkeit
<tb> Anzahl <SEP> in <SEP> intraperider <SEP> Gruppe <SEP> toneal <SEP> Tag <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7
<tb> 10 <SEP> 50/Acyclovir <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 100/Acyclovir <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1+ <SEP> 2 <SEP> 2+ <SEP> 3+ <SEP>
<tb> 10 <SEP> 100/759U <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1+ <SEP>
<tb> 10 <SEP> 50/759U <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 20/759U <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 4/759U <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 2/759U <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> unbehandelt <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP>
10 <SEP> 10
<tb>
+) spezifische Nichtvirustodesfälle
Folgerung
Eine Dosisrate von Acyclovir von 100 mg/kg/Tag intraperitoneal während 5 Tagen, beginnend 5 h vor der Infektion, war im allgemeinen notwendig, um jegliche virus-induzierte Sterblichkeit zu verhindern. Im Vergleich dazu ergab 759U bei 2 mg/kg/Tag intraperitoneal eine vollständige Bekämpfung.
Versuch 2 (a) : Orale Verabreichung von 759U
Eine Vorratslösung von 759U wurde in sterilem, destilliertem Wasser mit 0, 304 mg/ml herge-
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stellt und dann in Dreifachschritten auf 0, 101 und 0, 034 mg/ml verdünnt. Hamstern wurde mit Medikament versetztes Trinkwasser 5 Tage lang, beginnend 5 h vor der Infektion, gegeben. Einer Kontrollgruppe wurde Wasser ohne Medikament gegeben.
Ergebnisse :
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<tb>
<tb> Behandlung+
<tb> Anzahl <SEP> in <SEP> mg/kg/Tag <SEP> kumulative <SEP> Sterblichkeit
<tb> der <SEP> Gruppe <SEP> 759U <SEP> oral <SEP> Tag <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7
<tb> 1039000000
<tb> 10 <SEP> 13 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 10 <SEP> unbehandelt <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP>
<tb>
EMI8.2
dikament versetztes Trinkwasser, das Acyclovir in einem Anteil von 2 mg/ml enthielt, 5 Tage lang, beginnend 5 h vor der Infektion gegeben. Die orale Behandlung resultierte in einer Dosisrate von annähernd 100 mg/kg/Tag. Eine Kontrollgruppe mit Wasser ohne Medikament wurde ebenfalls verwendet.
Ergebnisse :
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<tb>
<tb> Behandlung
<tb> Anzahl <SEP> in <SEP> mg/kg/Tag <SEP> kumulative <SEP> Sterblichkeit
<tb> der <SEP> Gruppe <SEP> Acyclovir <SEP> oral <SEP> Tag <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 12 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 12 <SEP> unbehandelt <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb>
Folgerung :
Acyclovir zeigte eine geringe Wirkung gegen EHV-1 bei oraler Verabreichung in einer Dosis von 100 mg/kg/Tag während 5 Tagen, während 759U in einer Dosis von 13 mg/kg/Tag oral vollständig wirksam war, wobei nur eine begrenzte Sterblichkeit in einer Dosisrate von 3 mg/kg/Tag auftrat.
Vergleich der in vivo-Wirksamkeiten von 759U und seinem 6-Amino-Analogon (457U) gegen
Pferderhinopneumonitisvirus
Materialien und Verfahren :
Hamster :
50 männliche syrische WO/CR-Hamster wurden in 10 nach dem Zufall zusammengesetzten Gruppen zu 5 Tieren in Käfige gegeben und mit Wasser und Futter (Samenmischung) ad lib. versorgt.
Die Hamster wurden an den Tagen-3, Null, 4 und/oder beim Tod/Tötung gewogen. Der Wasserverbrauch wurde während der Tage-3 bis Null bis 4 aufgezeichnet.
Virus und Infektion : EHV-1-Pneumabort-Vakzinestamm, gelagert in einer Verdünnung von 10 -1, wurde für die Infektion weiter zin PBS verdünnt. Am Tag Null erhielten Hamster der Gruppen 1 bis 9 0, 2 ml Virusinoculum subkutan in die linke Flanke, was etwa 2 x 105 PFU (plaquebildende Einheiten) entspricht.
Verbindungen und Medikation :
457U und 759U wurden in Trinkwasser in einem Anteil von 0, 075 mg/ml gelöst. Unter der Annahme einer mittleren täglichen Aufnahme von 134 ml/mg Körpermasse würde dies in einer täglichen
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Dosis von etwa 10 mg/kg resultieren. Mit Medikament versetztes Wasser wurde 96 h lang etwa ab 5 h vor der Infektion, wie im nachstehenden angeführt, vorgesehen.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Gruppe <SEP> Medikation
<tb> 1 <SEP> - <SEP> 3 <SEP> 759U
<tb> 4 <SEP> - <SEP> 6 <SEP> 457U
<tb> 7 <SEP> - <SEP> 9 <SEP> unbehandelt/infiziert
<tb> 10 <SEP> unbehandelt/nicht <SEP> infiziert
<tb>
Ergebnisse :
Muster der kumulativen Sterblichkeit sind in der folgenden Tabelle angegeben. Die Heilmitteleinnahme wurde aus der Masse der Tiere und dem Wasserverbrauch, der während der Zeitdauer des Versuches aufgezeichnet wurde, berechnet.
Es gab lediglich einen Todesfall durch virusinduzierte Hepatitis bei den 15 mit 457U behandelten Hamstern im Vergleich zu 14 Todesfällen bei 15 unbehandelten Kontrolltieren und keine Todesfälle bei 15 Hamstern, die 759U erhalten hatten.
Tabelle
EMI9.2
<tb>
<tb> Wasser <SEP> Konz. <SEP> Wasser <SEP> Konz. <SEP> mittlere <SEP> Auf- <SEP> kumulative <SEP> Sterblichkeit
<tb> von <SEP> 457U <SEP> von <SEP> 759U <SEP> nahme <SEP> (von <SEP> 15) <SEP> am <SEP> Tag
<tb> Gruppe <SEP> mg/ml <SEP> mg/ml <SEP> mg/kg/Tag <SEP> 234
<tb> 1-3-0, <SEP> 075 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 000 <SEP>
<tb> 4-6 <SEP> 0, <SEP> 075- <SEP> 6, <SEP> 8011 <SEP>
<tb> 7 <SEP> - <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 14
<tb> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
EMI9.3
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und nichtinfizierte Kulturen wurden ebenfalls hergestellt. Die Deckschicht wurde bei Raumtemperatur verfestigen gelassen, bevor die Kulturen 4 Tage lang in den Inkubator bei 37 C in 5% CO/Luft zurückgebracht wurden.
Dann wurden die Kulturen mit 10% Formalin in PBS 30 min bis 1 h fixiert ; die Deckschicht wurde entfernt und die Zellen mit 0, 05% Masse/Vol. Methylviolett in 20% Methanol befleckt. Die resultierenden Plaques wurden gezählt und als Prozentsatz der Plaquezahl unbehandelter Viruskontrollkulturen ausgedrückt. Diese Werte wurden dann gegen die log 10
EMI10.1
renden Dosis-Reaktionslinie abgelesen.
Ergebnisse :
EMI10.2
<tb>
<tb> 759U <SEP> Acyclovir
<tb> ICtiM <SEP> ICg <SEP> M
<tb> Versuch <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP>
<tb> Versuch <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 075 <SEP>
<tb> Versuch <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 036 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP>
<tb> Durchschnitt <SEP> 0,059 <SEP> 0,118
<tb>
Folgerung :
759U weist in vitro gegen Herpes simplex Typ 1 eine stärkere Wirksamkeit auf als Acyclovir.
In vivo-Wirksamkeit von 759U gegen herpetische Encephalitis
Herstellung von Vorratsvirus :
Swiss-Mäuse mit einer Masse von 12 bis 15 g wurden mit Äther anästhesiert und intracerebral mit 0, 025 ml eines Gewebekulturpräparats vom Typ 1 Herpesvirus angeimpft. Die Mäuse wurden täglich auf Anzeichen von Herpesencephalitis untersucht, d. h. cerebrale Irritation, die zu Paralyse, Koma und Tod führt. Mäuse wurden getötet, wenn sie Frühzeichen von cerebraler Irritation zeigten. Die Eingeweide der Mäuse wurden auf Anzeichen von Infektion mit Bakterien oder andern Mitteln geprüft, und, wenn keine Anomalien gefunden wurden, wurden die Gehirne aseptisch entfernt und zu einer glatten Paste vermahlen. Das Homogenat wurde in 4 ml Gewebekulturaufrechterhaltungsmedium für jedes Gehirn wieder suspendiert und mit Glycerin im Verhältnis 2 : 1 gemischt.
Mäusegehirne wiegen annähernd 400 mg und das Präparat stellte so eine Verdünnung von 10-1 dar.
Die so hergestellten Virusvorräte wurden in Mäusen titriert, um den LD50 -Titer zu bestimmen, indem die Mäuse intracerebral mit 10fachen Verdünnungen des Vorratspräparats des Virus angeimpft und anschliessend zweimal täglich auf Anzeichen von Infektion geprüft wurden. Der LD 50 -Titer wurde gemäss der Karber-Methode berechnet.
Verfahren :
Gruppen von 5 Mäusen wurden intracerebral mit Vorratsvirus infiziert, der auf eine Dosis von etwa 300 x LD 50 verdünnt worden war. Die zu untersuchende Verbindung wurde zweimal täglich als Suspension oral in einer Dosis von 100 mg/kg verabreicht. Die Tiere wurden zweimal täglich untersucht und die Überlebenszeiten wurden für den nächsten Halbtag aufgezeichnet. Die Verabreichung wurde 5 Tage lang durchgeführt und die Gesamtbeobachtungszeit betrug 14 Tage. Die Überlebenszeiten wurden in reziproke Werte umgewandelt und die mittlere Überlebenszeit für jede Gruppe bestimmt (L. Bauer, D. J., Brit. J. Exp. Path., 1960, 41, 130).
EMI10.3
<tb>
<tb>
Acyclovir <SEP> 759U <SEP> unbehandelt
<tb> mittlere <SEP> reziproke
<tb> Überlebenszeit <SEP> 0,26 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0,33
<tb>
Folgerung : Die beobachtete Wirksamkeit von 759U bei oraler Verabreichung an intracerebral infizierte
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Mäuse war wesentlich grösser als jene von Acyclovir unter den gleichen Bedingungen.
Vergleich der in vivo-Wirksamkeit von 759U und 457U gegen herpetische Encephalitis
759U und 457U wurden in vivo gegen herpetische Encephalitis bei Mäusen im Vergleich zu Acyclovir und dessen 6-Aminoanalogen 2-Amino-9- (2-hydroxy-äthoxymethyl)-adenin (134U) getestet.
Materialien und Verfahren :
Mäuse :
CD 1-Mäuse mit einer Masse von 16 bis 20 g wurden von Charles River, Manston, Kent (GB) erhalten. Die Tiere wurden in Gruppen von etwa 10 gehalten und es wurde ihnen Futter und Wasser ad lib. gegeben.
Antivirale Verbindungen :
Die Verbindungen, nämlich Acyclovir, 134U, 759U und 457U, wurden als Suspensionen oder Lösungen in sterilem Wasser bei einer Konzentration von 20 mg/ml vor jedem Versuch hergestellt und während des Verabreichungszeitraumes bei 4 C gelagert.
Virus :
Der ICI-Stamm von Herpes simplex-Virus Typ 1 wurde für alle Versuche in einer Konzentration von 300 LD 50 (105 pfu/mO verwendet. Verdünnungen der Virusvorräte (107 pfu/ml) wurden in PBS"A"hergestellt.
Testverfahren :
Das Testverfahren ist analog, wie im vorhergehenden beschrieben.
Drei Versuche wurden durchgeführt, wobei drei Verabreichungsarten der Verbindung untersucht wurden : i) subkutan, ii) oral und iii) intraperitoneal. Die Verbindungen wurden mit 100 mg/ml/Dosis zweimal täglich 4 1/2 Tage lang, beginnend 2 bis 3 h nach der Infektion, verabreicht.
Ergebnisse :
Die mittleren reziproken Überlebenszeiten nach oraler, subkutaner und intraperitonealer Verabreichug derantiviralen Verbindungen sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
EMI11.1
<tb>
<tb>
Mittlere <SEP> reziproke <SEP> Überlebenszeit
<tb> Behandlungsgruppe <SEP> oral <SEP> subkutan <SEP> intraperitoneal
<tb> Viruskontrollen
<tb> 300 <SEP> LD <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 334 <SEP> 0, <SEP> 344 <SEP> 0, <SEP> 307 <SEP>
<tb> Acyclovir
<tb> 100 <SEP> mg/kg/Dosis <SEP> 0, <SEP> 237 <SEP> 0, <SEP> 174 <SEP> 0, <SEP> 236 <SEP>
<tb> 134U
<tb> 100 <SEP> mg/kg/Dosis <SEP> 0, <SEP> 222 <SEP> 0, <SEP> 226 <SEP> 0, <SEP> 231 <SEP>
<tb> 759U
<tb> 100 <SEP> mg/kg/Dosis <SEP> 0, <SEP> 146 <SEP> 0, <SEP> 084 <SEP> 0, <SEP> 093 <SEP>
<tb> 457U
<tb> 100 <SEP> mg/kg/Dosis <SEP> 0, <SEP> 155 <SEP> 0, <SEP> 102 <SEP> 0, <SEP> 077 <SEP>
<tb>
Vergleicht man die beiden Gruppen Acyclovir und 134U mit 759U und 457U, ergibt letztere Gruppe die stärkste antivirale Wirkung. Die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen waren bei jeder der drei Verabreichungsarten äusserst signifikant.