DD158916A1 - Verfahren zur herstellung von bacillus-beta-1,3-1,4-glucanase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bacillus-Beta-1,3-1,4-Glucanase fuer technische, pharmazeutische und wissenschaftliche Zwecke, wenn eine hydrolytische Spaltung von Beta-glycosidischen Bindungen erforderlich oder erwuenscht ist. Ziel der Erfindung ist es, die Wirtschaftlichkeit der industriellen Herstellung von Beta-Glucanase zu verbessern, indem ein Zellmaterial mit hoeherem Bildungsvermoegen fuer extrazellulaere Beta-Glucanase verwendet wird, dessen Bereitstellung fuer die Produktion einen verringerten Arbeits- und Zeitaufwand erfordert. Erfindungsgemaess wird das Ziel dadurch erreicht, indem Bacillus spec. ZF-194, der in der zentralen Stammsammlung der DDR (Zentralinstitut fuer Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Jena) unter der Nr. IMET B615 hinterlegt ist, fuer die Enzymsynthese verwendet wird. Der Stamm kann als Schraegagarkultur und als Sporensuspension in Saline aufbewahrt werden. Die Sporensuspension wird durch Abschwemmen von Zellmaterial von Agarnaehrboeden, Behandlung mit Lysozym, thermischer Inaktivierung sowie Suspendierung in Saline hergestellt und bei 4 Grad C aufbewahrt. Sie dient der langfristigen Aufbewahrung ("Konserve") und zur Bereitstellung von Schraegagarkulturen. Letztere werden zum Beimpfen von Submersvorkulturen verwendet. Sporen zeigten ueber einen Zeitraum von 15 Monaten, Schraegagarkulturen ueber 6 Monate volle Leistungsstabilitaet. Der Einfluss von Medienbestandteilen auf die Hoehe der extrazellulaeren Beta-Glucanase-Aktivitaet wurde geprueft.

Description

2 1971

a) Tital der 3rfindung

Verfahren 2112 Herstellung von 3acillus-ß-1_s3-1 j4-Glucanase

b) Anwendungsgebiet der Srfindung

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren 2m Herstellung von Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucariase für technische, pharmazeutische und wissenschaftliche Stecke* Das Snsym kann bei der Herstellung ¹VQS ITahsungsaittelu, Genußaitteln und G-etreLaksn sowie als Hilfsmittel füs die Grundlagenforschung und die angewandte Forschung eingesetzt werden, vvenn aus unterschiedlichen Gründen eine hydrolytische Spaltung von ß-glycosidischen Bindungen erforderlich oder erminscht ist. Die hauptsächliche aktuelle Anwendung des SDsyins liegt in der Brauindustrie, νιο bei der Bierherstellung in zunehmendem MaSe Malz durch Hohfrucht (z· B* durch Gerste) ersetzt ^ird.

c) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

ß-Glucanase wird bereits industriell hergestellt. In den Verfahrensvarianten nach DL WP 69 330 und DL WP C 12 D/ 190 401 werden Bacillus subtilis-Stämme verwendet, die bis zu maximal I50 Γ3 ß-Glucanase/ml Kulturflüssigkeit synthetisierenο Schwankungen in der ß-Glucanase-Bildung des B_e subtilis-Stanimes machten die 12 SL IP C 12 D/ 190 401 beschriebenen Maßnahmen zur Konservierung, Se-

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und Heaktivierung erforderlich, um durch Stabilisierung von Wachstumsverlauf und ISazymsynthese eine verbesserte Heproduzierbarkeit und eine störungsfreie Produktion zu erreichen. Diese vorgeschlagenen Lösungen zum Entgegenwirken von Aufspaltungs- und Degenerationserscheinungen sind arbeits- und zeitaufwendig·

d) Ziel der Erfindung

Ziel der .Srfindung ist, dia Wirtschaftlichkeit der industriellen Herstellung von ß-Glucanase zu verbessern, indem ein Zellmaterial mit höherem Bildungsvermögen für extrazelluläre ß-Glucanase verwendet wird, dessen Bereitstellung für die Produktion einen verringerten Arbeits- und Zeitaufwand erfordert·

e) Darlegung des Wesens der Srfindung

Die wesentlichen Kennseichen der Erfindung sind

1, ein Bacilius-Stamm mit einer gegenüber bisher verfügbarem Stammaterial erhöhten 3-Glucanase-Bildung,

2. einer hinsichtlich Wachstumsverhalten und Höhe der ß-Glucanase-Bildung stabilen Konservierungsform des enzymbildenden Bacillus-Stammes, die bei minimiertem Arbeits- und Zeitaufwand die Bereitstellung von reproduzierbarem Impfmaterial erlaubt,

3· die Möglichkeit, bei Benutzung des Bacillus-Stammes eine höhere ß-Giucanase-Aktivität zu produzieren, ohne daß die biotechnischen und technologischen Parameter des üblichen industriellen Verfahrens wesentlich geändert werden müssen.

Srfindungsgemäß wird das dadurch erreicht» daß Bacillus spec.' ZE-194, der in der zentralen Stammsammlung der DDH (Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDH₃ Jena)

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unter der Nr. JMBS B 615 hinterlegt ist, verwendet wird.

BÖS?. B 615 wächst ausgesprochen aerob. Die mittleren Generationszeiten bei 30 - 37 ⁰C in Glucose-Nährbouillon und Medien auf Kohlehydrat-Basis mit unterschiedlichen Konzentrationen an Polysacchariden und Zuckern betragen 60 - 70 min. Unter Testbedingungen werden nach

14 - 16 Stunden 10⁹ - 10¹⁰ Zeilen/ml im SchuttelkoIben

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bzwV 10 - 10 Zellen/ml in zwangsbelüfteten KulturgefäBen erreicht. Bei emersem Wachstum sind nach 5 Tagen ca* 90 %-dex Zellen verlort. Die Sporen sind gestrecktoval und liegen zentral.

HMD B 615 wächst auf den üblichen komplexen Agarnährböden als mittelgroBe Einzelkolonien mit mattglänzender Oberfläche. Im zentralen Bereich treten lytische ISffekte ein, wodurch bei längerer Inkubation abgeflachte Kolonien mit gerunzelter bis gefalteter Oberfläche zu beobachten sind*

Die biochemischen !Reaktionen von EUST B 615 (Säure- bzw. Gasbildung aus verschiedenen Mono- und Disacchariden sowie Zuckeralkoholen, ünzymtests, ITitratverwertung u. a.) sprechen für eine nahe taxonomische Yerv7andtschaft mit der morphologischen Gruppe I, insbesondere mit Bacillus amyloliquefaciens, nach BEEGSI (1974). Gegen eine direkte Zuordnung zu dieser Species sprechen das Fehlen einer extrazeilulär stabilen «£ -Amylase und Differenzen in der Sensibilität bzw« Unempfindlichkeit gegenüber 20 verschiedenen Bacillus-Phagen, was als Unterschiede in der Struktur der Zellwand zu interpretieren ist. Gegenüber der Species Bacillus subtilis ist IMHD B 615 durch eine Säurebildung aus Galactose, schlechtes Wachstum auf Glucose-Nitrat-Agar, Gasbildung aus Nitrat sowie einer weniger ausgeprägten Ansäuerung des Mediums bei Wachstum ±d G-Iucοse-Nährbouillon (5_?8 - 6,9 statt 5j4 - S₅2) neben Unterschieden in der Koloniemorphologie eindeutig abzugrenzen.

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Gegenüber den in DL WP 69 33-0 bzw. DL WP G 12 D/190 401 benutzten Bacillus subtilis-Stämmen unterscheidet sich BIST B 615 durch seine Fähigkeit, Arabinose, Xylose und Galactose unter Säurebildung abzubauen, seine Fähigkeit, in Gegenwart von 5 % NaCl wachsen au können, durch eine Seihe von koloniemorphologischen Merkmalen, durch sein Verhalten gegenüber Testphagen sowie durch seine hohe Versporungsrate.

EIHlT 3 615 produziert unter Testbedingungen (vgl. Ausführungsbeispiele) bis zu 260 HS J3-Glucanase/ml Kulturflüssigkeit, bis zu 3 Tu c neutrale Protease/nil Kultur-

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flüssigkeit und keine nachweisbare e6-Amylase.

HIST 3 615 ist apathogen und setzt keine toxisch wirkenden Substanzen frei.

J5rfindungsgemäß hergestellte Sporensuspensionen wurden bei +4 ⁰G aufbewahrt· Die Überprüfungen der ß-Glucanase-BiIdung über einen Zeitraum von 15 Monaten ergaben ein stabiles Snzymbildungsvermögen von ca, 200 Γ3 ß-Glucanase/ml SuIturflüssigkeit (negativ-Abweichungen bis zu X3/inl, Positiv-Abweichungen bis zu 250 IS/ml). Von diesen Sporensuspensionen lassen sich Schrägagarkulturen anlagen, die bis zu δ Monaten ohne Leistungsverlust direkt benutzt oder zur Anlage von SehragagarSubkulturen ohne Leistungsverlust verwendet werden können. Die ß-Glucanase-Aktivitäten solcher Schrägagarkulturen betrug ca· 200 13/ml (Negativ-Abweichungen bis zu 180 13/ml, Positiv-Abweichungen bis zu 260 ΙΕ/ml)· Die Stabilität der ß-Glucanase-Bildung wird zusätzlich dadurch dokumentiert, daß die Standardabweichung einer Versuchsserie maximal 7 % des zugehörigen Mittelwertes betrug.

Srfindungsgemäß erfolgen Anzucht und Snzymsynthese bei submerser Kultivierung von 33£3T B 615 in Medien, die aus polysaccharidhaltigen ITaturstoffen, einer anorganischen Stickstoffquelle und anorganischen Salzen bestehen. Die Kcnzentrationsbereiche wurden bewußt den üblichen ange-

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glichen, da diese ihre Eignung für eine großtechnische Fermentation und für eine Anreicherung der fermentativ gebildeten. länzymaktivität au einem applizierbaren Enzympräparat erwiesen haben. Bestandteile des Hauptkulturmediums worden einzeln und kombiniert variiert. Dabei -waren die höchsten extrazellulären ß-Glucanase-Aktivitäten unter den gewählten Y er Suchsbedingungen (entspr. Ausführungsbeispielen 1-5) nach 45 - 55 Stunden nachweisbar» Erhöhungen der Polysaccharidkonzentrationen verhindern Aktivitätsabηahmen der fermentativ bereits vorhandenen 8-Glucanase. Hinsichtlich der Höhe der exfcrazellulär nachweisbaren ß-Glucanase-Aktivität existieren relativ breite Sonzentrationsoptiina für Polysaccharide, (KEE₂,) Mg⁺⁺, Ga⁺⁺, SO₄ ²" und Gl", was für großtechnische Fermentationen vorteilhaft ist. Die Konzentration des als anorganische Stickstoffquelle und als pH-Stabilisator angebotene (M,J pE^O'! ^¹³-³ sorgfältig auf die Gesanitkonsentration der angebotenen Polysaccharide abgestimmt werden_? da sonst ein. ß-Giucanase-Abbau beobachtbar ist. Überangebote an Sulfat-Ionen führten zu drastischen Aktivitätsverlusten.

f) Ausführungsbeispiele

Die 23rf indung soll an nachstehenden Beispielen näher erläutert werden:

Beispiel 1

Kultur führun g

Zeliinaterial von ZF-^VIMISD B 6^5 von Schrägagarkuituren von ^lähragar I (Staatliches Institut für Immunpräparate und Mhrmedien, Berlin-Weißensee, DDH) werden naeh 48 Stunden Bebrütxmg bei 37 ⁰G entweder direkt oder nach einer 2wischeapassage auf Hähragar I oder Gerstensehnotagar (2,5 % Ger st en schrot, 1 % Sorjaschrot, 0,5 % Glucose, 2 % ITa₉HPO^ β' 2 H₂O, 3 % Agar, pH 7,O) in 50 nil Yorkulturmedium (O₅5 % Waisenfein se brot, 0_s7 % Sojasciicot,' 1 %

-δ - 2 13710

Maisstärke, 0,1 % Hefeexbrakt, 0,1 % Glucose, 0,5 % (M^)₂HPO₄, 0,1 % KCl, 0,05 % MgSO₄ .7 H₂O, pH 7,0) in 500 ml-I^dschüttelkolben geimpft. Nach 16 Stunden Inkubation bei 30 ⁰C unter Schütteln (Hundschütteltisch, 200 U/min) wenden Zellen entnommen und 50 ml Hauptkulturmedium in 5OO ml-Ihindschüttelkolben mit einer Zellzahl von 2-5. 10^/ml beimpft. Die Kultivierung erfolgt bei 30 ⁰C unter Schütteln. Die ß-Glucanase-Aktivitäten werden nach 48 und 72 Stunden bestimmt.

Hauptkultur

In einem Hauptkulturmedium aus 2 % Weisenfeinschrot, 1,5 % Sojaschrot, 2,0 % Maisstärke, 1,5 JS (Μϊ₄)₂ΗΡ0₄, 0,15 % KCl, 0,05 % MgSO₄ . 7 H₂O, 0,02 % CaCl₉. 6 H₂O, pH 7j0,wurden nach 48 Stunden 160 - 200 L3/ml und nach 72 Stunden 180 - 225 13/al ß-Glucanase gemessen.

Beispiel 2 Kultur führ un g

V/13 in Beispiel 1 (s. 0,). Das Zellmaterial zur Beimpfung der Yorkultur wurde auf Gerstensebrotagar gehalten.

nauptkultur

Wie Beispiel 1. B-Glucanase-Aktivitäten nach 48 Stunden 160 - 190 IS/ml und nach 72 Stunden 200 - 260 HS/ml.

Beispiel 3 Sulturführung

BacV amyloliquefaciens ΖΡ-194/ΏΙΈΠ? B 615 winde auf ITähragar 15-7 Tage bei 37 ⁰C als Einaelkolonie bebrütet. Die Yersporungsrate betrug 60 — 80 %, Danach vjurde das Zellmaterial mit sterilem Aqua dest. abgeschwemmt, unter Zwischenwäsche in sterilem Aqua de st. zweimal hitzeinaktiviert (30 min im Dampftopf) und die resultierende Spo-

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rensuspension in Saline (0,585 % HaCl, 0,15 % KH₂PO₄, 0,84 % Ka₂HPO₄VIa H₂O, 0,002 % MgSO₄ V 7 H₂O, pH 7,0) ⁰

bei 4 ⁰C aufbewahrt. Hit ihr wurden Sabragar-I-Platten beimpft· Sinzeikoloniea (rundlich, schmutzig-weiß, matte Oberfläche, unregelmäßig gebuchteter Hand, Zentrum faltig) wurden auf Ger st en schrot ag ar überführt;·. Weitere Behandlung wie Beispiel 1.

Hauptkuitur

Wie Beispiel 1· ß-Glucanase-Aktivitäten nach 48 Stunden 140 - 210 I3/ml und ,nach 72 Stunden I70 - 250 IS/ml.

Beispiel 4

Kulturführung

Sporengewinnung wie Beispiel 3· Zusätzliche !Reinigung der Sporen durch 30 mjja Lysozym-Behandlung (400/ug/ml) vor der ersten Hitzeinaktivierung» Weitere Behandlung wie Beispiel 1.

Hauptkultur

Wie Beispiel 1. ß-Glucanase-AIctivitäten nach 48 Stunden 145 - 210 ΙΕ/ml und nach 72 Stunden 130 - 240 IS/ml.

Beispiel 5

Kultur führun g

Wie in den Beispielen 1 bis 4.

Hauptkultur

IjQ einem Haupt kulturmedium aus O₉5 % Weizenfein schrot, 0,7 % Sojaschrot, 1 %*Maisstärke, 0,2 % Trockenhefe, O₅5 % (SH₄)2HPO₄, 0,1 % KGl, 0,05 % MgSO₄. 7 H₂O, pH 7,0, wurden nach 48 Stunden 90 - 110 IS/ml und nach 72 Stunden 120 - 140 IE/ml ß-Glucanase bestimmt»

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Beispiel 6

Eulturf ührung

Verfahrensweise bis zur Vorkultur wie in Beispielen 1-4. Hauptkultur im Laborfermenter "Biofer": 5 1 Medium, Kultivierung bei 30 ⁰C und Bührung (800 - 900 U/min) unter Verwendung von Silikon-Antischaum-Smulsion SLS (Wacker Chemie, Braunsehweig/BHD, 1 : 10 in Wasser), Lufteintrag 80 l/Stunde.

Hauptkultur

In Medium entsprechend Beispiel 1 wurden nach 20 Stunden ~120 ΙΕ/ml, nach 40 Stunden */ 155 13/ml, nach 60 Stunden »ν, 170 ΙΕ/ml und nach 70 Stunden λΊ40 is/ml J3-Giucanase gemessen«

In Medium entsprechend Beispiel 5 wurden folgende ß-Glucanase-AJrfeivitäten bestimmt; Nach 20 Stunden ' ^100 O/ml, nach 40 Stunden ^ 100 I55/ml, nach 60 Stunden ~ 100 und nach 70 Stunden *> 90 I3/ml.

Claims (4)

- 9 - 2 19710 g) 3rfindungsanSprüche

1· Verfahren zur Herstellung von Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanase dusch submerse Anzucht und Sinzynisynthese, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus spec. ZE-194 (hinterlegt als IM3T ITr»3 615 )j für den neben einer hohen Bildung von axferazeliulärer ß-Glucanase eine hohe Versporungsrate auf komplexen Agarnährbcden charakteristisch ist, verwendet wird.

2» Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufbewahrung des Stammes ZF-194 ia Form von Sporen erfolgt, die als durch Lysozym-Behandlung gereinigte Suspensionen in Saline bei 4 ⁰C über längere Zeiträume aufbewahrt werden.

3. Verfahren nach Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Sporen auf jtfähragar aua Auskeimen gebracht werden, wobei von typisch aussehenden Kolonien Schrägagarkulturen angelegt werden, die für einen Zeitraum von wenigstens S Llonaten direkt zur Beispfung einer leistungsfähigen Subniersvorkultur oder zum Erhalt einer weiteren Schrägagarpassage, die dann zur Beinipfung einer leistungsfähigen Subniersvorkultur dient, geeignet sind.

4» Verfahren nach Punkten 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur f ernientativen B-G-lucanase-Bildung Medienzusamniensetzungen verwendet werden, die den üblichen Vorschriften entsDrechen.