CZ315494A3 - Protein carriers and process for preparing thereof - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká protehioidů a protetioidních nosičů, které jsou z nich vyrobeny. Nosiče prot^noidů uvolnitelně zapouzdřují účinnou složku a mají delší skladovatelnost a/nebo fotostabilitu. Jsou také řešeny způsoby přípravy těchto nosičů.

Dosavadní stav techniky

Použití jednotlivých kompozic a způsobů pro podávání léčiv je někdy z hlediska organismu chemicky a/nebo fyzikálně limitováno. Tak například orální podávání mnohých léčivých látek lze volit jako vhodnou cestu tehdy, pokud tomu nezabrání chemické nebo fyzikálně-chemické překážky. Těmi bývají extrémní hodnoty pH ve střevech, působení silných trávících enzymů a nepropustnost gastrointestinálních membrán pro zvolenou léčivou látku.

Mezi látky, o nichž je známo, že jsou pro orální podávání nepoužitelné, patří biologicky aktivní peptidy a proteiny, jako je insulin. Tyto účinné látky podléhají ve střevech rychlému rozkladu kyselé a/nebo enzymatické hydrolýzy.

Velká pozornost se proto věnuje výzkumu účinných způsobů a vhodných forem pro orální podávání léčiv. Byla navržena řešení jako je:

(a) společné podávání přísad (například resorcinol a neiontové surfaktanty polyoxyethylenoleyl ether a hexadecylpolyethylenether) pro zvýšení propustnosti střevních stěn a (b) společné podávání enzymatických inhibitorů jako je pankreatický inhibitor tripsinu, diisopropylfluorfosfát (DFF) a trasylol pro zabránění enzymatického štěpení.

Použití těchto látek v systémech pro podávání léčiv je však omezeno z těchto důvodů je však omezeno z následujících důvodů:

(a) jejich vlastní toxicitou, pokud se použije účinné množství, (b) jejich neschopností chránit aktivní přísadu či urychlovat její vstřebávání a (c) jejich nepříznivou interakcí s léčivem.

Jako systémy pro podávání léčiv bývají také uváděny liposomy. Tvoří tukovou vrstvu kolem zapouzdřeného léčiva. Použití liposomů s obsahem heparinu je popisováno v US 4 239 754 a několik prací je zaměřeno na použití liposomů, obsahujících insulin, např. Patel a kol. (1976) FEBS Letters, Vol. 62, str. 60 a Hashimoto a kol. (1979) Endocrinol. Japan, Vol. 26, str. 337. Použití liposomů je však stále ve stadiu vývoje a naráží na násleující problémy:

(a) malá stabilita, (b) špatná skladovatelnost, (c) omezení na nízkomolekulární (do 30 000) vnášené účinné látky (d) obtížná výroba, (e) nepříznivé interakce s vnášenými účinnými látkami.

V poslední době byly popsány pro zapouzdřování léčiv syntetické polymery aminokyselin neboli proteinoidy, tvořící mikrokuličky. Tak například v americkém patentu

US 4 925 673 (dále jen patent '673), jehož obsah je tímto celý zahrnut v popisu formou odkazu, popisuje takové mikrokulovité soustavy včetně způsobů jejich přípravy a použití. Patent 673 také popisuje mikrokuličky, ve kterých je zapouzdřen farmaceutický prostředek pro podávání do zažívacího traktu nebo do krve.

Přestože jsou protefnoidové mikrokuličky, popsané v patentu '673, použitelné pro určitý rozsah aplikací, lze jejich fyzikálně-chemické vlastnosti, jako je citlivost vůči světlu, skladovatelnost a selektivitu jejich rozpustnosti v jednotlivých částech zažívacího traktu, ještě vylepšit. Navíc existuje potřeba nalézat mikrokuličky pro zapouzdření širšího rozsahu účinných látek, jako například polárních léčivých látek.

Způsobem přípravy protdnoidů podle patentu '673 se získají komplexní směsi peptidům podobných polymerů o vysoké molekulové hmotnosti (MW) (> 1000) a nízké MW (< 1000), které se těžko izolují. Kromě nich vzniká malé množství proteéioidů s nízkou MW, které představují frakci, tvořící mikrokuličky. Existuje tudíž také potřeba nalézt zlepšené způsoby přípravy prot^noidů.

Podle toho tedy je pociťována potřeba lepších proteinoidových nosičů a zlapšených způsobů pro jejich přípravu.

Úkolem vynálezu je nalezení proteinoidů, které tvoří proteinoidové nosiče pro systémy pro podávání účinných látek se zlepšenou stabilitou vůči fotodegradaci a/nebo rozkladu po určité době.

Dalším úkolem vynálezu je nalezení proteinoidů, které tvoří proteinoidní nosiče s vyšší selektivitou rozpostnosti za požadovaných různých podmínek, jako pH a podobně.

Dalším úkolem vynálezu je nalezení nosičů na bázi proteinoidů se zapouzdřenými biologicky aktivními látkami, které se selektivně uvolňují v určitých částech zažívacího traktu.

Dalším úkolem vynálezu je nalezení proteinoidních nosičů, které zlepšují přístup do organismu u těch farmaceutických látek, které jsou jinak málo absorbovány v zažívacím traktu.

Dalším úkolem vynálezu je nalezení zlepšeného způsobu výroby protenoidních nosičů s určitými vlastnostmi a zvýšení výtěžku požadovaných proteinoidních nosičů.

Bylo zjištěno, že řešení těchto úkolů a ještě další výhod se dosahuje podle dále popsaného vynálezu.

Podstata vvnálezu

Vynález se týká zlepšených proteinoidních nosičů a způsobů jejich výroby a použití.

Pro přípravu proteinoidních nosičů se zlepšenou stabilitou vůči fotodegradaci a/nebo rozkladu podle vynálezu jsou použitelné proteinoidy o MW v rozmezí asi od 250 do asi 2 400 s definovanými aminokyselinami. Proteinoidy obsahují peptidický polymer, vybraný ze skupiny, vyznačující se tím, že zahrn (i) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fenylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin.

(ii) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fynylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin a z alespoň jednoho třetího monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující lysin, arginin a ornithin, přičemž proteinoid musí tvořit mikrokuličky a/nebo mikrokapsule a musí být rozpustný ve zvoleném rozmezí pH.

Molekuly proteinoidu podle vynálezu obsahují asi 2 až 20 aminokyselinových zbytků, výhodně od asi 2 do asi 8 aminokyselinových zbytků a má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 250 do asi 2 400, výhodně od asi 250 do asi 600, nejvýhodněji od asi 250 do asi 400.

Proteinoidní nosiče jsou použitelné jako systémy pro uvolňovatelné zapouzdření a přenášení velkého rozsahu objektů, včetně farmaceutických účinných látek, barvících činidel a kosmetických přísad. Konkrétně jsou proteinoidní nosiče použitelné jako systémy pro orální podávání citlivých farmaceutických účinných látek, které by normálně nemohly být podávány ústy, s cíleným uvolňováním látek v požadovaných částech zažívacího traku.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje roložení molekulových hmotností polymeru poly(Asp.Bz-co-Phe), připraveného NCA metodou, která je popsána v příkladě 3, jako funkci koncentrace monomeru.

Obr. 2 ukazuje rozložení molekulových hmotností polymeru poly(Asp.Bz), připraveného DPPA metodou, která je popsána v příkladě 5, jako funkci koncentrace monomeru.

Obr.3 ukazuje vliv reakční doby na výtěžek polymeru poly(Asp.Bz), připraveného DPPA metodou, jak je popsána v příkladu 5.

Obr. 4 ukazuje vliv teploty na molekulovou hmotnost poly(Asp.Bz) polyemru, připraveného DPPA metodou podle příkladu 5.

Obr. 5 ukazuje vliv změny molárního poměru [DPPA]/[M] na molekulovou hmotnost poly(Asp.Bz) polymeru při přípravě DPPA metodou, jak je popsána v příkladu 5.

Obr. 6 je rentgenový snímek výsledků analýzy metodou na imunovrstvě Western, která je popsána v příkladu 9, přičemž analyzovány jsou: čištěný murin mAb 9BG5 (2 μ pruh 1; 1 mg pruh 2; 0,25 μg pruh 3), oddělený supernatant proteinoidního nosiče, zbylý po procesu zapouzdřování (žádné mAb) (pruh 4), samotná prázdná peleta proteinoidního nosiče (pruh 5), supernatant po zapouzdřování mAb do proteinoidní nosiče (pruh 6) a peleta proteinoidního nosiče se zapouzdřeným mAb. Pruh MW představuje značky standardních molekulových hmotností.

Ί

Obr. 7 je rentgenový snímek stejné analýzy vzorků, popsaných v příkladu 10.

Obr. 8 (a až c) ukazuje sérovou koncentraci proteinů, které se váží na immobilizované reoviry typu 3 a V_LSH za podmínek ELISA, jak je popsáno v příkladu 11. Prázdné kuličky znamená prázdné proteinoidní nosiče (s žádným mAb 9BG5), podané orálně pokusným zvířatům; mAb kuličky znamená nosiče, obsahující zapouzdřený mAb 9BG5, podané orálně pokusným zvířatům; IV znamená intravenozně zvířatům podaný nezapouzdřený mAb 9BG5; a orálně znamená orálně zvířatům podaný nezapouzdřený mAb 9BG5.

Obr. 9 ukazuje vázání mAb za obvyklých podmínek ELISA postupů s použitím immobilizovaných reovirů typu 3 a V_LSH proteinů v sérii roztoků čištěného mAb v 0,85 N citrátu 0,5% gumy (obr. 9(a)) nebo fosforečnanem pufrovaného roztou soli (obr. 9 (b)), jak jsou popsány v příkladě 11.

Obr. 10 ukazuje hladiny erythropoietinu (EPO), zjištěné v séru krys, kterým byl podáván proteinoidní nosič se zapouzdřeným EPO (15 μg/kg) a zapouzdřený EPO (15 μg/kg) podle příkladu 15.

Obr. 11 ukazuje hladiny EPO v séru krys, kterým byl podáván bud samotný erythropoietin (50 μg/kg) nebo zapouzdřený erythropoietin (50 μg/kg) přímo do dvanácterníku způsobem, který je popsán v příkladu 15. Hladiny erythropoietinu v séru byly stanoveny po určité době po podání pomocí erythropoietinového enzymového imunitního testu.

Obr. 12 ukazuje hladiny EPO v séru krys, kterým byl orálně podáván bud zapouzdřený nebo nezapouzdřený erythropoietin (100 y.g/kq) nebo ho obdržely podkožní injekcí 2 ^g/kg nebo 10^g/kg podle příkladu 15. Hladiny erythropoietinu v séru byly stanoveny po určité době erythropoietinovým imunitním testem.

Obr. 13 ukazuje změny koncentrace vápníku v séru po orálním podání lososího kalcitoninu v proteinoidních nosičích (0,25 mg kalcitoninu /kg tělesné hmotnosti) u opic rodu cynomolgus, jak je popsáno v příkladu 17. Výsledky jsou vyjádřeny jako absolutní změna koncentrace vápníku v séru oproti původní hodnotě. Data představují průměr +/- SEM.

** Znamená signifikantní změnu koncentrace kalcia oproti původní hodnotě.

Obr. 14 ukazuje změny koncentrace kalcia v séru, které nastávají po orálním podání lososího kalcitoninu v proteinoidníchm nosičích (0,60 mg/kg tělesné hmotnosti) u krys, jak je popsáno v příkladu 18. Výsledky jsou vyjádřeny jako absolutní změna koncentrace kalcia v séru oproti původní hodnotě. Data představují průměr +/- SEM. ** Znamená koncentrace kalcia signifikantně odlišné ve srovnání s kontrolní skupinou po stejné době.

Obr. 15 ukazuje změny koncentrace po intraduodenálním podání lososího kalcitoninu nebo kalcitoninu v proteinoidních nosičích (3 μg/kg tělesné váhy) u krys, jak je popsáno v příkladu 18. Výsledky jsou vyjádřeny jako absolutní změna koncentrace kalcia v séru oproti původní hodnotě. Data představují průměr +/- SEM. ** Znamená koncentrace kalcia signifikantně odlišné ve srovnání s kontrolní skupinou, které byly podávány nezapouzdřené látky, v časových intervalech, které jsou uvedeny.

Obr. 16 ukazuje doby srážení po orálním podání Faktoru IX (FIX sph PO), zapouzdřeného v proteinoidním nosiči a Faktoru IV, podávaného v roztoku FIX (FIX IV) způsobem, popsaným v příkladu 20.

Obr. 17 ukazuje doby srážení po orálním podání Faktoru IX (FIX sph PO), zapouzdřeného v proteinoidním nosiči a Faktoru IV, podávaného v roztoku FIX (FIX IV) způsobem, popsaným v příkladu 21.

Obr. 18 ukazuje procentický podíl neporušeného alfa-interferonu (IFN), který zůstal po inkubaci IFN a IFN v proteinoidních nosičích v napodobené žaludeční kapalině (SGF).

Obr. 19 ukazuje procentický podíl neporušeného IFN, který zůstal po inkubaci IFN a IFN v proteinoidních nosičích v 0,08 N HC1.

Obr. 20 ukazuje procentický podíl neporušeného IFN, který zůstal po inkubaci IFN a IFN v proteinoidních nosičích v napodobené střevní tekutině (SIF).

Obr. 21 ukazuje doby srážení krve krys, kterým byl podán ve vodním roztoku jednak heparin a jednak proteinoid/heparin. Data představují průměr hodnot, získaných od šesti krys. Data představují průměr +/- SEM.

Obr. 22 ukazuje doby srážení krve krys, kterým byl podán v prostředí kyseliny citrónové jednak USP heparin a jednak heparin na proteinoidních nosičích. Každá hodnota pro jednotlivý čas představuje průměr hodnot, získaných od dvanácti krys. Data představují průměr +/- SEM.

Obr. 23 ukazuje doby srážení krve krys, kterým byly podány orálně jednak proteinoidní nosiče bez heparinu a jednak heparin na proteinoidních nosičích. Každá hodnota pro jednotlivý čas představuje průměr hodnot, získaných od dvanácti krys. Data představují průměr +/- SEM.

Obr. 24 ukazuje střední titry krys, imunizovaných orálně Ml na proteinoidních nosičích ve srovnání s nezapouzdřeným Ml. Jenom průkazné hodnoty byly v každé skupině průměrovány.

Obr. 25 ukazuje HA-NA titry u krys, imunizovaných orálně HA-NA mikrokuličkami ve srovnání s nezapouzdřeným HA-NA.

Všechny citované literární prameny jsou celým svým obsahem zahrnuty v popisu formou odkazu. Pokud uvádějí něco, co je v rozporu s údaji v popisu, má přednost údaj v popisu.

Vynález je založen na objevu, že proteinoidy s molekulovou hmotností mezi asi 250 a 2 400 a s definovaým pořadím aminokyselin lze získat modifikací známých reakcí a vhodnou volbou výchozích látek. Tyto proteinoidy tvoří proteinoidní nosiče s podstatně vyšší stabilitou vůči fotodegradaci a/nebo samovolnému rozkladu. Navíc proteinoidní nosiče, připravené z těchto proteinoidů, mohou být použity pro širší spektrum farmaceuticky účinných látek včetně nestabilních polypeptidů jako je insulin, alfa interferon, kalcitonin, antigenů, například protein chřipkového viru Ml a faktor IX a vykazují na rozdíl od známých proteinoidních mikrokuličkových nosičů schopnost selektivního uvolňování v jednotlivých částech zažívacího traktu.

Proteinoidy podle vynálezu obsahují peptidický polymer vybraný ze skupiny, zahrnující:

(i) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, zvoleného ze skupiny zahrnující tyrosin a fenylalanin, a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny zahrnující glutamovou kyselinu, pyroglutamovou kyselinu, glutamin a aspartovou kyselinu, (ii) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, zvoleného ze skupiny zahrnující tyrosin a fenylalanin, z alespoň jednoho druhého monomeru, zvoleného ze skupiny zahrnující glutamovou kyselinu, pyroglutamovou kyselinu, glutamin a aspartovou kyselinu a z alespoň jednoho třetího monomeru, zvoleného ze skupiny zahrnující lysin, arginin a ornithin, přičemž proteinoid tvoří mikrokuličky nebo mikro tobolky a je rozpustný ve zvoleném rozmezí pH.

Molekuly proteinoidú podle vynálezu obsahují 2 až 20, výhodně 2 až 8 aminokyselinových jednotek, a mají molekulovou hmotnost v rozmezí 250 až 2 400, výhodně 250 až 600, ještě výhodněji 250 až 400..

Proteinoidní nosiče, připravené z molekul proteinoidú podle vynálezu, vykazují selektivní rozpustnost v určitých kyselých či zásaditých pH rozmezích, podle zvoleného množství druhého a třetího monomeru v proteinoidú.

Proteinoidní nosiče, které jsou selektivně rozpustné v v alkalickém prostředí o takovém pH, které se nachází v distální části střev, se připravují z bazicky rozpustných proteinoidú. Tyto proteinoidy obsahují, jako výchozí monomery v reakční směsi, alespoň jeden druhý monomer, vybraný ze skupiny, zahrnující glutamovou kyselinu, pyroglutamovou kyselinu, glutamin a aspartovou kyselinu. Při pH v rozmezí asi 7,2 až 11 jsou bazicky rozpustné proteinoidy převážně přítomny v podobě aniontů a jsou rozpustné. Při pH pod 7,0 je takový proteinoid převážně protonován a je ve vodě nerozpustný.

Podobně lze připravit z kysele rozpustných proteinoidú proteinoidní nosiče selektivně rozpustné v kyselém prostředí, jaké je například v žaludku. V takovém případě se použije výchozí směs pro přípravu proteinoidú, obsahující alespoň jeden druhý monomer, vybraný ze skupiny, zahrnující glutamovou kyselinu, pyroglutamovou kyselinu, glutamin a aspartovou kyselinu a z alespoň jednoho třetího monomeru, zvoleného ze skupiny zahrnující lysin, arginin a ornithin. Při pH v rozmezí asi 1 až 7 je kysele rozpustný proteinoid v podobě kationtu a je rozpustný. Při pH nad asi 7,2 je proteinoid převážně odprotonován a je ve vodě nerozpustný.

Závislost rozpustnosti kysele rozpustných proteinoidú na pH je daná převážně, ale ne výhradně, závislostí koncové aminokyseliny, přidané v průběhu syntézy proteinoidú. Tak například navázání bazické aminokyseliny, např. třetího monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující lysin, arginin a ornithin, má za následek zvýšení hodnoty pí (pH v isoelektrickém bodě) vyráběného proteinoidú.

Proteinoidy podle vynálezu se připravují termální kondenzační reakcí zahříváním směsi vhodných aminokyselin za podmínek, popsaných v patentu 673. Na rozdíl od postupů podle patentu 673, kde se využívá až osmnácti aminokyselin, postup přípravy proteinoidu podle vynálezu vyžaduje pouze směs dvou až pěti specifických aminokyselin, přičemž je třeba dodržet zásadu, že z každé shora definované složky je použita nejméně jedna. Při tom vznikají proteinoidy, ze kterých se tvoří proteinoidní nosiče se selektivní rozpustností v určitém rozmezí a ve vysokém výtěžku.

Bylo zjištěno, že přidání tetramethylensulfonu v inertním polárním rozpouštědle s vysokou teplotou varu maximalizuje výtěžek (nad 80 %) proteinoidů s nízkou molekulovou hmotností. Vypuštěním rozpouštědla se výtěžky těchto nízkomolekulárních proteinoidů sníží. To je zřejmě způsobeno nízkou rozpustností aminokyselinových monomerů v těchto rozpouštědlech a/nebo neodstranitelnými vedlejšími reakcemi mezi monomery a rozpouštědlem v používaných reakčních podmínkách.

Obecně se postupuje tak, že jednotlivé aminokyseliny se přidávají do reakční nádoby, obsahující tetramethylensulfon (sulfolan), která je zahřívána na teplotu v rozmezí 130 až 200 °C, výhodně 175 až 195 °C v inertní atmosféře tvořené plynným argonem nebo dusíkem. Po každém přidání monomeru se roztok míchá po dobu asi v rozmezí 10 minut až asi 5 hodin, v závislosti na typu aminokyseliny a pořadí jejího přidání.

Při zahřátí směsi na teplotu asi 190 °C podle shora uvedeného popisu probíhá reakce a jako vedlejší produkty vznikají voda, amoniak a oxid uhličitý. Voda se z reakční směsi odstraňuje průběžně jak vzniká a reakce je ukončena když se voda přestane tvořit. Pak se proteinoid sráží z reakčního roztoku ochlazením v přebytku vody za intenzivního míchání. Po asi hodinovém míchání se proteinoid oddělí filtrací, promyje vodou a suší ve vakuu.

Proteinoidy podle vynálezu lze také vyrábět kondenzačními reakcemi, při kterých se vychází z derivátů aminokyselin, nebot při těchto reakcích lze dosáhnout lepší kontroly molekulové hmotnosti. Tyto reakce se provádějí obecně při nižších teplotách a používá se při nich iniciátorů. Knkrétně například bylo zjištěno, že proteinoidy vyrobené metodou NCA (t.j. pomocí N-karboxyanhydridu alfa aminokyseliny) a metodou DPPA (t.j. pomocí difenylfosforylazidu) podle autorů N. Nishi et al (1991) popsanou v Makromol. Chem. vol. 192, str. 1789 - 1798 tvoří proteinoidní nosiče se selektivní rozpustností pro určitá rozmezí pH.

Při metodě NCA se připravuji N-karboxyanhydridy esterů alfa aminokyselin, které se pak polymerují pomocí aminů s nízkou molekulovou hmotností jako iniciátorů. Bylo zjištěno, že jiné než NCA deriváty esterů alfa aminokyselin, například esterů alfa methyltyrosinu, jsou účinnými iniciátory, které jsou stabilní a rozpustné v mnoha organických rozpouštědlech jako je tetrahydrofuran (THF). Použití aminokyselin jako iniciátorů není známo, patrné vzhledem k jejich nízké rozpustnosti v organických rozpouštědlech a jejich nízké stabilitě. Reakcí NCA se dosahuje vysokého výtěžku proteinoidů o vysoké čistotě.

Metoda DPPA využívá přímé kondenzace benzylesterů alfa aminokyselinza přítomnosti DPPA a nízkomolekulárního aminu, po které následuje odstranění chránící benzylové skupiny, která je přítomna v proteinoidním produktu, alkalickou hydrolýzou. Pokud se namísto alkalické hydrolýzy použije katalytické hydrogenace, získají se proteinoidy s nízkou molekulovou hmotností s neočekávaně vysokou čistotou a v neočekávaně dobrém výtěžku. Proteinoidy připravené shora uvedeným způsobem lze přímo použít k mikroenkapsulaci farmakologicky účinných látek, nebo mohou být tyto proteinoidy zahušťována či sušeny známými způsoby a skladovány pro pozdější použití.

Proteinoidy podle vynálezu se čistí následovně: surový proteinoid rozmíchá s vodou při pokojové teplotě, například při teplotě 25 °C a pH vzniklé suspenze se při této teplotě upraví na asi 8 pomocí vodného alkalického roztoku, například pomocí roztoku o koncentraci 40 % hydroxidu sodného a roztoku o koncentraci 10 % hydrogenuhličitanu sodného v případě kysele rozpustného proteinoidů. V případě bazicky rozpustného proteinoidů se pH suspenze upraví na kyselou reakci vodným kyselýn roztokem, například 10% kyselinou octovou. Pak se směs zfiltruje a filtrační koláč se promývá malým objemem vody. Promývací voda a filtrát se pak spojí a odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získají proteinoidy. Pokud je to nutné, tento postup lze opakovat, dokud se získávají proteinoidy požadované čistoty.

Pokud je to žádoucí, lze proteinoid dále čistit sloupcovou chromatografii na silikagelu nebo na alumině, vždy s obsahem pevného nosiče s použitím methanolu nebo propanolu jako mobilní fáze, nebo lze k čištění použít iontoměniče s vodou jako mobilní fází nebo chromatografií s reversní fází při použití směsi kyseliny trifluoroctové s acetonitrilem jako mobilní fáze. Proteinoidy lze také čistit extrakcí nižším ethanolem jako je propanol nebo butanol, čímž se odstraní nečistoty s niší molekulovou hmotností.

Proteinoidní nosiče se připravují z čištěných proteinoidů následovně: Proteinoidy se rozpustí v deionizované vodě na koncentraci v rozmezí mezi asi 75 a asi 200 mg/ml při teplotě mezi asi 25 až asi 60 °C, výhodně 40 °C. Nerozpuštěné zbývající částečky se mohou odstranit běžnou filtrací, například gravitační filtrací přes papír.

Poté se roztok proteinoidů, udržovaný při asi 40°C, smíchá s vodným kyselým roztokem (také o teplotě asi 40 °C) o koncentracikyseliny v rozmezí asi 1 mol/1 až asi 2 mol/1, výhodně asi 1,7 mol/1. Získaná směs se dále udržuje při teplotě 40 °C po dobu, potřebnou ke vzniku mikrokuliček a mikrokapslí, což lze pozorovat optickým mikroskopem. V praxi se výhodněji postupuje při míšení tak, že se proteinoid přidává ke kyselému vodnému roztoku.

Vhodnými kyselinami jsou veškeré kyseliny, které nemají (a) nežádoucí účinky na proteinoid, například nezpůsobují rozklad, (b) rušivý vliv na tvorbu mikrokoliček či mikrokapslí, (c) rušivý vliv na kuličky nebo na enkapsulaci vnášené látky do mikrokapslí, a (d) vykazují nežádoucí interakci s vnášenou látkou. Výhodnými aminokyselinami jsou pro použití při způsobu výroby proteinoidních nosičů podle vynálezu kyseliny octová, citrónová, chlorovodíková, fosforečná, malonová a maleinová.

V praktickém provedení podle vynálezu se před procesem vtorby mikrokuliček nebo mikrokapslí do kyselého vodného roztoku nebo do roztoku proteinoidů přidávají přísady, která proteinoidní nosič stabilizují. Přítomnost těchto přísad zvyšuje stabilitu a dispersibilitu proteinoidního nosiče v roztoku.

Přísady lze přidávat v hustotní koncentraci v rozmezí asi 0,1 až 5 mg/lOOml , výhodně asi 0,5 mg/lOOml. Vhodnými příklady, které však neznamenají omezení, jsou přísady ze skupiny zahrnující akáciovou gumu, želatinu, polyethylenglykol a polylysin.

Proteinoidní nosiče pak mohou být ihned použity nebo mohou být skladovány při 4 °C nebo lyofylizovány a uskladněny pod sušidlem při pokojové nebo nižší teplotě.

Za shora uvedených podmínek tvoří molekuly proteinoidů kuličkovité proteinoidní nosiče včetně proteinoidních mikrokapslí a proteinoidních mikrokuliček o průměru pod 10 mikrometrů. Výraz mikrokulička, jak se zde používá, znamená kulovitý útvar porézní struktury, který uvnitř nemá žádnou jasně ohraničenou dutinu. Výraz mikrokapsle zde znamená kulovitou strukturu, která je tvořena proteinoidními stěnami, obklopujícími dutinu či komůrku Jestliže vznikají proteinoidní nosiče za podmínek popsaných shora v přítomnosti rozpustného materiálu, například léčiva, dochází k jeho zapouzdření v dutinách, uzavření v obalu kulovitého tvaru nebo zachycení v matrici proteinoidních molekul v mikrokulovité struktuře. Touto cestou je možná zapouzdřit nebo zachytit farmakologicky účinné látky jako peptidy, proteiny a polysacharidy, polární organické molekuly jako chinolony nebo antibiotika, což má význam pokud nelze tyto létky podávat orálně. Množství účinné látky, které lze zachytí nebo zapouzdřit v proteinoidním nosiči je závislé na řadě faktorů, mezi které patří koncentrace účinné látky v roztoku, použitém při zapravování do proteinoidního nosiče.

Proteinoidní nosiče podle vynálezu jsou farmakologicky neškodné a nemění fyziologické ani biologické účinky nesených léčiv. Zapouzdřováním nedochází ke změně farmakologických vlastností účinné látky. Přestože lze zapouzdřit pomocí proteinoidů jakékoliv léčivo, je zapouzdření zejména cenné pro podávání látek, které by se bez použití nosiče rozkládaly nebo by ztrácely účinnost v podmínkách těch zon v organismu, kterými musí léčivo projít před dosažením cílové zóny, a které se málo absorbují v zažívacím traktu.

Proteinoidní nosiče podle vynálezu jsou zejména užitečné pro orální podávání určitých farmakologických látek, například peptidických hormonů s malou molekulou, které samotné procházejí příliš pomalu stěnami zažívacího traktu a/nebo jsou náchylné ke štěpení vlivem kyselin a enzymů, přítomných v zažívacím traktu. Jako neomezující příklady takových účinných látek lze jmenovat lidský nebo hovězí růstový hormon, interferon a interleukin-II, kalcitonin, atriální přírodní faktor, antigeny, monoklonální protilátky, faktor IX, krevní srážecí proenzym závislý na vitaminu K.

Volba konkrétního proteinoidů pro zapouzdření nebo zachycení farmakologické látky závisí na řadě faktorů, mezi které patří:

(1) kyselost či zásaditost látky (2) cílová zóna zažívacího traktu, kde se má uvolnit (3) rozpustnost látky v určitém rozmezí pH (4) snadnost zapouzdření (5) interakce látky s proteinoidem

Tak například proteinoidy, vyrobené z kyseliny glutamové, aspartové, tyrosinu a fenylalaninu jsou obzvláště vhodné pro zapouzdřování polysacharidů, jako například heparinu.

Kromě selektivní rozpustnosti při určitém pH, hraje důležitou roli pro regulaci uvolňování léčiva v určité cílové oblasti zažívacího traktu také velikost částic proteinoidu. Proteinoidní nosiče s průměrem částic v rozmezí asi 0,1 nebo méně až 10 mikrometrů, s výhodou asi 0,1 až asi 5,0 mikrometrů jsou použitelné pro uvolňování účinných látek v cílových zónách v zažívacím traktu, neboř takový rozměr částic je dostatečně malý pro tento účel. Větší proteinoidní nosiče (nad 10 mikrometrů) mají spíše nižší účinnost při použití pro orální podávání.

Velikost proteinoidních nosičů, které se připravují se ovlivňuje působením vody nebo vodných roztoků s obsahem účinných látek na proteinoidy, se ovlivňuje pomocí fyzikálních nebo chemických podmínek jako je pH, osmotické poměry, obsah solí v zapouzdřovaném roztoku a výběrem kyseliny, používané pro zapouzdřovací proces.

Výběrem vhodných látek s určit průběhem rozpustnosti proteinoidu a optimálním ovlivněním velikosti částic proteinoidních nosičů lze připravit nosiče s obsahem účinných látek z bazicky rozpustných proteinoidů, stabilních při silně kyselých hodnotách pH obvyklých v žaludku (normálně je toto pH asi 2 až 6), avšak rozpustných v distální části střev. Takovéto soustavy jsou použitelné pro orální podávání peptidických hormonů, např. insulinu, a polysacharidů, např. heparinu, které by byly jinak samostatně při průchodu zažívacím traktem rychle rozloženy.

Lze je také použít pro ochranu žaludku před dráždivými látkami jako je aspirin. Po podání takových proteinoidních nosičů s obsahem aspirinu, tyto přípravky procházejí gastrointestinální sliznicí a uvolňují aspirin dále, a to s mnohem vyšší rychlostí, než se dosáhne při pouití obvyklých potažených aspirinových přípravků, které musí nejprve projít žaludkem a pak, po rozpuštění obalu, musí ze střeva projít do krevního oběhu.

Je také možno vyrábět soustavy na základě kysele rozpustných proteinoidů, které jsou stabilní ve slabě zásaditých podmínkách (pH kolem 8), ale uvolňují nesenou účinnou látku v kyselých podmínkách (pH asi 2 až 5). Takové soustavy jsou použitelné pro intravenozní aplikaci farmaceutických látek jako jsou regulátory hladiny vápníku a redox nosiče pro dopamin nebo kyselinu gama-aminomáselnou.

Proteinoidní nosiče podle vynálezu je možno podávat samostatně ve formě tablet, pelet, kapslí a granulátů, které se mohou uvést do suspenze v kapalinách jako jsou jedlé oleje. Podobné formulace lze připravit pro orální podávání v kombinaci s jedním či více fyziologicky kompatibilními nosiči nebo excipienty. Kompozice mohou obsahovat používané ingredienty jako je želatina, polyvinylpyrolidon a plnidla jako je škrob a methylceluloza.

Proteinoidní nosiče podle vynálezu lze také použít pro injekce.

Příklady provedení vynálezu

Jsou pouze ilustrací vynálezu ale nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu vynálezu.

Příklad 1: Příprava bazicky rozpustného proteinoidů tepelnou kondenzací

Pod inertní dusíkovou atmosféře ve čtyřlitrové baňce bylo za míchání 750 ml tetramethylensulfonu zahřáto na teplotu 190 °C, načež bylo přidáno 294 g glutamové kyseliny a směs byla zahřívána 1,5 hodiny. Pak bylo přidáno 266 g kyseliny aspartové, směs byla co nejrychleji zahřáta na 190 °C a tato teplota byla udržována 15 minut načež bylo přidáno 362 g tyrosinu a směs byla udržována při 190 °C po dobu 3 hodin. Poté bylo přidáno 330 g fenylalaninu a směs byla udržována při 190 °C 1,5 hodiny. Získaná tavenina byla za horka a za intenzivního míchání nalita do 5 1 vody. Poté byla získaná směs ještě 1 hodinu míchána, načež byla zfiltrována a filtrát byl odstraněn. Filtrační koláč byl rozmíchán v 5 litrech vody, filtrován, a získaný filtrační koláč byl opět rozmíchán v 5 1 vody. Do takto získané suspenze byl přidán 40% roztok hydrxidu sodného v takovém množství, že hodnota pH se upravila (při 25 °C) na 8. Směs byla pak zfiltrována a koláč byl promyt malým množstvím vody. Promývací voda byla spojena s filtrátem a získaná kapalina byla pak za sníženého tlaku, čímž byl získán proteinoid GluAspTyrPhe.

V dodatcích A, B a C jsou popsány příklady dalších proteinoidů, připravených thermokondenzací.

Příklad 2: Příprava kysele rozpustného proteinoidů tepelnou kondenzací

Pod inertní dusíkovou atmosféře ve čtyřlitrové baňce bylo za míchání 750 ml tetramethylensulfonu zahřáto na teplotu 190 °C, načež bylo přidáno 294 g glutamové kyseliny a směs byla zahřívána 1,5 hodiny. Pak bylo přidáno 362 g tyrosinu a směs byla udržována při 190 °C po dobu 3 hodin. Poté bylo přidáno 330 g fenylalaninu a směs byla udržována při 190 °C 1,5 hodiny. Poté bylo přidáno 266 g argininu a směs byla udržována při 190 °C 1,5 hodiny. Získaná tavenina byla za horka a za intenzivního míchání nalita do 5 1 vody. Poté byla získaná směs ještě l hodinu míchána, načež byla zfiltrována a filtrát byl odstraněn. Filtrační koláč byl rozmíchán v 5 litrech vody, filtrován, a získaný filtrační koláč byl opět rozmíchán v 5 1 vody. pH směsi pak bylo upraveno na 5 (při 25 °C) přidáním 10% kyseliny octové. Směs byla pak zfiltrována a koláč byl promyt malým množstvím vody. Promývací voda byla spojena s filtrátem a získaná kapalina byla pak za sníženého tlaku, čímž byl získán proteinoid.

V dodatcích A, B a C jsou popsány příklady dalších proteinoidů, připravených thermokondenzací.

Příklad 3: Příprava proteinoidů NCA methodou s použitím aminového iniciátoru

Tento příklad ilustruje NCA metodu pro přípravu kopolypeptidů obsahujících Asp-Bz, Glu-Bz, Phe a Tyr. NCA monomery těchto aminokyselin byly připraveny známými metodami.

Reakce byly prováděny v tetrahydrofuranu (THF) nebo v dichlormethanu s použitím benzylaminu (BzNH₂) nebo

4-methylbenzylaminu (MeBzNH₂) jako iniciátorů při pokojové teplotě ([M] = 10 %). Charakterizace získaných kopolymerý byla prováděna pomocí H-NMR a GPC. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 1.

Jak vyplývá z tabulky 1, proteinoidy, které mají na druhém místě Asp a/nebo Glu a Phe a/nebo Tyr jako první monomer na prvním místě byly získány ve vysokém výtěžku polymerací iniciovanou BzNH₂ při poměru [M]/[I] = 5 (č.2-1 až 2-7).

Křivka GPC (Obr.l) charakterizuje póly(Asp.Bz-co-Phe), který má vypočtenou polydisperzitu 1,91. Podobná distribuce molekulových hmotností byla pozorována i u ostatních kopolymerů.

Polydisperzitou se zde rozumí míra distribuce molekulových hmotností vzorku. Byla stanovena jako numerická hodnota, vypočtená vydělením molekulové hmotnosti (MW) molekulovým číslem (Mn). Hodnota polydisperzity je pro homopolymer rovna 1, neboť molekulová hmotnost je rovna molekulovému číslu. Polymer s polydisperzitou o hodnotě 1,6 až 1,7 se považuje za polymer se střední distribucí. Polymer s polydisperzitou o hodnotě 2,0 až 2,1 se považuje za polymer s velkou distribucí.

NCA homopolymerace Asp-Bz a NCA kopolymerace Asp-Bz, Glu-Bz, Phe a Tyr byla také prováděna pomocí MeBzNH₂ jako iniciátoru (č. 2.11, 2.15 a 2.16). Podobné výsledky byly získány u reakcí, iniciovaných Bz-NH₂.

Tabulka 1

KOPOLYMERACE NCAs INICIOVANÁ AMINY PONECHÁNO PRl POKOJOVÉ TEPLOTĚ 4 DNY

POLYM. č.	SLOŽENÍ KOMONOMERU	INICIÁTOR (ΙΜΙΠΙ1)	ROZPOUŠ- TĚDLO	VÝTĚŽEK (%)	Mw
2-1	Asp-Glu-Phe-Tyr (1:1:1:11	BzNHj (5:1)	THF	34.1	830
2-2	Asp-Phe (1:1)	BzNH, (5:1)	THF	70.9	730
2-3	Asp-Tyr (1:1)	BzNH, (5:1)	THF	83.6	1000
2-4	Aso-Tyr (2:1)	BzNH, (5:1)	THF	8S.3	1050
2-5	Glu-Tyr (1:1)	BzNH. (5:1)	THF	84.9	870
2-6	Glu-Phe-Tyr (2:1:1)	BzNH. (5:1)	CHjCI;	68.3	790
2-7	Glu-Phe-Tyr (1:1:1)	BzNH; (5:1)	CH;CI;	53.7	1000 ‘
2-11	Asp	MeBzNH, (5:1)	THF	88.3	870
2-15 .	Asp-Giu-Phe-Tyr (1:1:1:11	MeBzNH; (5:1)	THF	76.4
2-15	Asp-Giu-Phe-Tyr (1:1:1:11	MeBzNH; (5:1)	THF	76.4	630

Příklad 4: Příprava proteinoidů NCA methodou s použitím alfa-methyltyrosinu jako iniciátoru

Tento příklad ilustruje způsob provádění NCA polymerace s použitím alfa-methyltyrosinu (Tyr-Me) jako iniciátoru. Reakční podmínky byly v podstatě stejné jako v příkladu 4 jen bylo jako rozpouštědla použito tetrahydrforánu (THF). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

SYNTÉZA PROTEINOIDU AMINOKYSELINAMI INICIOVANÝMI NCA PONECHÁNO PRITEPLOTÉ 4 DNY

PQLYM. Č.	SLOŽENÍ KOMONOMERU	INICIÁTOR (IMI/III)	ROZPOUŠ- TĚDLO	VÝTĚŽEK (%)	Mw
2-8	Asp-Glu-Phe (1:1:1)	Tyr.Me (1:1)	CH,CI,	100	450
2-9	Asp-Glu-Phe 11:1:1)	Tyr.Me (3:1!	CHjCÍ2	71.4	450
2-10	Asp-Glu-Phe (1:1:1)	Tyr.Me (5:1)	CHjCI,	68.0	730
2-12	Asp	Tyr.Me (1:1)	THF	100	460
2-13	GIu-Tyr (1:1)	β·Ala (2:1) Suc.An (2:1)	THF (reflux)	67.4	480
2-14	Asp	Tyr.Me (8:1)	THF	91.8	890
2-17	Phe	Tyr.Me (1:1)	THF	73.0	NQ
2-18	Tyr	Tyr.Me (1:1)	THF	65.7	NO
2-19	Phe	Tyr.Me (5:1)	THF	78.3	NO
2-20	Tyr	Tyr.Me (5:1)	THF	63.3	NO

Bylo zjištěno, že iniciace Tyr-Me je velmi rychlá (č. 2.17 až 2.20) a všechny NCA byly zreagovány po 2 hodinách. Z GPC výsledků bylo zjištěno, že molekulová hmotnost polymeru roste s rostoucím poměrem [M]/[Tyr-Me] a polydisperzita je celkem nízká. Přítomnost rezidua Tyr-Me v polymeru byla pomocí H NMR spekter potvrzena. V souladu s tím je Tyr-Me nový a účinný iniciátor pro NCA polymerace aminokyselin.

Vzorek č. 2.13 reprezenuje polymeraci iniciovanou beta alaninem a ukončenou sukcinanhydridem. Jelikož beta alanin je nerozpustný ve většině organických rozpouštědel, byla reakce prováděna v THF pod refluxem. Polydisperzita získaného produktu byla větší než u polymerů, iniciovaných Tyr-Me.

Příklad 5: Příprava proteinoidú DPPA metodou (*1)

Tento příklad ilustruje přímou polykondenzaci Asp-Bz za přítomnosti DPPA a triethylaminu (TEA) jako báze za různých polymeračních podmínek ((a), (b), (c) a (d)). Molekulová hmotnost polymerů, stejně jako polydisperzita, byly hodnoceny ve všech případech GPC. Polymery jsou charakterizovány IČ a NMR spektroskopií.

Asp-Bz byl připraven esterifikací kyseliny L-aspartové podle následujícího postupu: kyselina 1-aspartová (26,6 g,

0,2 mol) bylo rozmícháno ve 300 ml čerstvě destilovaného benzylalkoholu v půllitrové kruhové nádobě, načež se přidalo 45 ml koncentrované (12 mol/1) kyseliny chlorovodíkové. Směs pak byla za intenzivního míchání zahřívána na 60 °C po dobu 30 minut, načež byl reakční roztok ochlazen na pokojovou teplotu. Poté byl roztok zneutralizován (na pH asi 7) přidáním triethylaminu (asi 56 ml). Surový produkt byl oddělen filtrací, promyt ethanolem a acetonem, sušen za sníženého tlaku a dvakrát překrystalován z horké vody. Bylo získáno 18 g (44 %) produktu o teplotě tání 217 °C.

Bylo použito obchodně dostupného DPPA bez dalšího čištění. TEA byl před použitím destilován. Rozpouštědla pro polymeraci byla čištěna běžnými metodami. Přímá polykondenzace Asp-Bz byla prováděna mícháním dimethylformamidového (DMF) roztoku monomeru za přítomnosti DPPA a TEA. Směs byla míchána 1 hodinu při 0 až 10 °C a poté míchána při pokojové teplotě 2 dny. Výsledný polymer byl vysrážen ve velkém objemu vody, oddělen filtrací a pak sušen za sníženého tlaku.

a. Vliv koncentrace monomeru

V tabulce 3 jsou uvedeny výsledky polymerace Asp-Bz v DMF při pokojové teplotě po dobu 2 dnů. Poly(Asp.Bz) byly při těchto přímých polykondenzacích získány ve vysokém výtěžku.

Bylo zjištěno, že molekulová hmotnost polymerů závisí na koncentraci monomeru [M]. Nízká molekulová hmotnost byla získána při nízkých [M] (obr. 2, křivka A). Na druhé straně když byla koncentrace monomeru [M] vyšší než 0,2 g/ml, byl získán polymer s bimodální distribucí molekulové hmotnosti (obr. 2, křivka B). Nižší molekulová hmotnost oligomerů (1000) může být důsledkem intramolekulárního uzavírání rostoucích řetězců reakcí koncových aminoskupin s beta karboxyskupinami. Po několikerém přesrážení z THF/methanol byl úspěšně ze směsi polymerů, připravované při [Μ] = 1 g/ml izolován polymer s molekulovou hmotností (M_n = 22 000) a s nízkou polydisperzitou (M_w/M_n = 1,68). Separace byla také prováděna pomocí GPLC kolony s Bio-Beads.

Tabulka 3

VLIV KONCENTRACE MONOMERU NA POLYMERACI Asp-Bz METODOU DPPA V DMF

PRI POKOJOVÉ TEPLOTĚ [DPPA]/[M] = 1.3 [TEA]/[M] -2.3

[M] (g/ml)	VÝTĚŽEK %	Mjciir31'1	Mw/M,
0.025	71.5*	1.4	4.15
0.033	74.7*	1.0	3.50
0.05	67.2*	1.1	5.11
0.10	53.2*	0.91	3.70
0.20	85.4*	16.3 (60.7), 1.0 (39.3)	1.84,.1.13
0.50	86.5*	11.0 (59.4), 0.92 (40.6)	2.22, 1.08
1.0	97.6*	15.1 (71.4, 0.38 (28.8)	1.81, 1.05

a) The polymer waa collecced by cenrrifugacion afcer polymerization for 2 daya;

a) Polymer byl oddělován odstředěním po dvoudenní polymeraci,

b) Polymer byl oddělen filtrací po polymeraci 2,5 dne,

c) Hodnoty ve vzorci jsou v mol. %.

b. Vliv reakční doby a teploty

Výtěžek získávaných polymerů vzrůstá s reakční dobou: 75% konverze po 5 hodinách a 95% po 4 dnech (obr. 3, křivka A). Molekulová hmotnost výsledných polymerů také roste s rostoucí dobou iniciační fáze (do 4 hodin). Polymerace je negativně ovlivňována rostoucí teplotou (obr. 3, křivka B). Polymery získané při 60 a 80 °C byly žluté a nerozpustné v THF, ale rozpustné v DMF a DMSO. To je patrně důsledkem vzniku imidového kruhu, o kterém se v literatuře uvádí, že vzniká při termální polykondenzaci aspartové kyseliny.

c. Vliv molárního poměru [DPPA]/[M] a [TEA]/[M]

Závislost výtěžku a molekulové hmotnosti polymeru na molárním poměru [DPPA]/[M], stěně jako [TEA]/[M] je na základě pokusů uvedena v tabulce 4. Nejvyššího výtěžku bylo dosaženo při [DPPA]/[M] = 1,3 a [TEA]/[M] = 2,3 (obr. 5). Tato pozorování jsou ve shodě s výsledky uváděnými Nishi a kol. Vyšší molekulová hmotnost produktů se dosáhne v rozmezích [DPPA]/[M] = 1,3 až 2,0 a [TEA]/[M] = 2,0 až 3,0.

Tabulka 4

VLIV MOLÁRNÍ KONCENTRACE DPPA A TEA NA POL YMERACI * Asp-Bz v DMF PŘI POKOJOVÉ TEPLOTÉ: [M] - 0,50 g/_mg

(MI)DPPA	[Ml/ITEAI	YIELO (%)	M„X10’3ia'	Mw/M„
0.5	2.3	16.3	0.81	4.09
1.0	2.3	69.6 .	3.1 (45.4), 0.39 (54.6)	2.58, 1.48
1.3	2.3	86.5	11.0 (59.4), 0.92 (40.6)	2.22, 1.08
1.5	2.3	69.4	15.9 (34.2), 0.83 (65.8)	1.77. 1.21
2.0	2.3	64.3	13.1 (58.3), 0.89 (41.7)	1.87, 1.09
1.3'	1.5	58.4	6.0 (39.3), 0.63 (60.7)	2.43, 1.37
1.3	2.0	78.3	13.3 (64.3), 0.92 (35.7)	1.87, 1.19
1.3	3.0	74.6	13.6 (64.8), 0.83 (35.2)	1.98, 1.18
1.3	3.5	65.0	8.3 (60.0), 0.30 140.0)	2.70, 1.10

A) Hodnota ve vzorci je v mol. %

d. Vliv rozpouštědla

Srovnání polymerace v různých rozpouštědlech je uvedeno v tabulce 5. Je z ní vidět, že výtěžek a molekulová hmotnost polymeru jsou rozpouštědlem ovlivňovány. Vyšší výtěžky byly získány v DMF zatímco vyšší molekulové hmotnosti byly získány v THF a podle objemu. Na druhé straně polymerace v dioxanu poskytla produkt o nižší molekulové hmotnosti, a proto je výhodná.

Tabulka 5

VLIV ROZPOUŠTĚDLA NA POLYMERACÍ Aap-Bz PŘI POKOJOVÉ TEPLOTĚ 2 DNY [M]/[DPPAj = 1,3 [Μ]/[TEA] = 2J [M] = 030 g/mg ,

ROZPOUŠTĚDLO	VÝTĚŽEK %	M„X1Q'3“'	Mw/M„
DMF	36.5	11.0 159.4), 0.92 (40.6)	2.22, 1.08
DMSO	70.6	'11.5 (78.9), 1.05 (21.1)	1.87, 1.13
THF	49.9	29.6 (74.6, 1.14 (25.4)	1.31, 1.13
ACETONITHILE	71.1	20.3 (79.3), 1.05 (20.7)	1.65, 1.14
DIOXANE	70.5	4.7 (68.5), 0.82 (31.5)	3.60, 1.13
ΝΟΝΕ*	61.2	29.8 (82.8), 0.86 (17.2)	1.32, 1.16

a) Objemová polymerace

b) Hodnota ve vzorci je v mol. %

Příklad 6: Příprava proteinoidů DPPA metodou (*2)

Kopolymerace Asp-Bz s jinými aminokyselinovými monomery, například gama benzylglutamátem (Glu-Bz), beta alaninem (Ala), Fenylalaninem (Phe) a O-benzyltyrosinem (Tyr-OBz) za přítomnosti DPPA byla prováděna stejným postupem, který je popsán pro homopolymeraci (příklad 5). Různé kopolymery aminokyselin byly získány ve vysokých výtěžcích (nad 77 %), jak ukazuje tabulka 6. Z těchto výsledků vyplývá, že kopolymerace aminokyselins použitím DPPA je vhodná pro syntézy kopolypeptidů. Bimodální distribuce molekulových hmotností byly podle výsledků analýz podobné jako u homopolymerů. Asp-Bz.

Tabulka 6

KOPOLYMERACE alfa-AMINOKYSELIN ZA PŘÍTOMNOSTI DPPA JAKO KONDENZAČNÍHO ČINIDLA VDMFPftl POKOJOVÉ!TEPLOTĚ 2 DNY

POLYM. i.	SLOŽENÍ KOMONOMERU	VÝTĚŽEK (%)	Mw	Mw/M„
Co.lOPPA	Asp.Bz-GIu.Bz (1:1)	97.4	15900, 1080	1.76, 1.13
Co.2DPPA	Asp.Bz-^-Ala (1:1)	91.2	1590	1.18
Co.3OPPA	Asp.Bz-Phe (1:1)	89.7	13700, 800	1.89 1.25
Co.40PPA	Asp.Bz-Tyr.QBz (1:1)	87.3	9000, 1000	1.78, 1.17
Co.SDPPA	Asp.Bz-Glu.Bz-Phe-Tyr.OBz (1:1:1:1)	92.5	16800, 960	1.66, 1.14

Příklad 7: Redukční debenzylace proteinoidů, získaných DPPA metodou

Příklad ilustruje výhodný způsob odstraňování benzylových chránících skupin z poly(Asp-Bz) a poly(Glu-Bz) katalytickou hydrogenací.

Hydrogenace polymerů byla prováděna následovně: do roztoku polymeru ve směsi THF/methanol (1:1, v/v), bylo přidáno Pd na aktivním uhlí (10 %) v množství 1/10 hmotnosti polymeru. Poté byl nahrazen vzduch dusíkem, byl přiváděn vodík a udržován pod tlakem balonu. Reakční směs byla míchána přes noc při pokojové teplotě. Pak byl odfiltrován katalyzátor a roztok byl po zahuštěn přidán k velkému objemu petrolétheru, čímž se vysrážel polymer. Pak byl získaný polymer sušen za sníženého tlaku.

Úplnost průběhu reakce byla potvrzena H NMR spektrem polymeru. Ve většině případů byly získány použitelné ve vodě rozpustné polymery. Hydrogenace je účinnou a čistou metodou pro odstranění benzylových skupin.

Příklad 8: Příprava prázdných proteinoidních nosičů z proteinoidů na bázi Glu, Asp, Tyr a Phe.

Tento příklad ilustruje způsob přípravy a čištění samotných proteinoidních nosičů.

POSTUP

1. Reakční složky:
	a. b. c. d. e.	Práškový proteinoid připravený podle příkladu 1 Bezvodá kyselina citrónová (USP) Akáciová guma NF Deionizovaná voda Ledová kyselina octová
2 .	Přístroje:
	a.	Ph-metr
	b.	Vodní lázeň 40 °C
3 .	Příprava	roztoků:

a. Proteinoidní roztok - rozpustí se 100 mg proteinoidů v 1 ml deionizované vody (nebo násobek).

Filtruje se přes Whatman *1 filtrační papír (pokud je to nutné a udržuje se teplota 40 °C pomocí vodní lázně. Tato směs se dále nazývá roztok A.

b. Roztok 1,7 N kyseliny citrónové s 0,5 % akácií - rozpustí se 5 g akácie a 109 g kyseliny citrónové v 1 litru deionizované vody. Uchovává se při 40 °C. Tím se získá roztok B.

4. Příprava proteinoidních nosičů:

a. Rychle se v jediném kroku vlije veškerý roztok A do roztoku B a směs se udržuje na 40 °C teplé vodní lázni.

Příklad 9: Příprava Proteinoidního nosiče s obsahem monoklonálních protilátek murinu IgG

Tento experiment popisuje zapouzdření antireovirové monoklonální potilátky (mAb) 9BG5, mAb zaměřeného proti sigma-1 genovému produktu (Hemaglutininu, HA3) reovirového typu 3. HA3 vnáší na buněčný povrch receptor pro reoviry typu 3 a mAb 9GB5 interferuje s virovou vazbou na receptor.

Myší monoklonální protilátka IgG 9BG5 byla připravena a vyčištěna podle W.V.Wiliamse et al. (1991) J.Biol.Chem., vol. 266(8), str. 5182 až 5190, včetně tam uvedených odkazů s použitím přípravy čištěného reoviru typu 3 podle téhož autora (1988) Proč.Nati.Acad.Sci. USA, vol. 85, str. 6488 až 6492. Čištěná protilátka 9BG5, použitá v tomto příkladu, měla koncentraci proteinů 1,5 mg/ml ve fosfátovém slaném pufru (pH 7,2).

Zapouzdřením mAb 9BG5 do proteinoidních nosičů byly získány produkty o koncentraci proteinoidů GluAspTyrPhe (molání poměr Glu : Asp : Tyr : Phe uváděných do reakční směsi byl 1:1:1:1) rovné 50 mg/ml, koncentrace mAb byla 0,7 mg/mg a arabská guma byla přítomna v produktu v koncentraci 0,5 % v 0,85 N kyselině citrónové. Prázdné proteinoidní nosiče byly připraveny tak, že měly tytéž koncentrace všech složek, jen mAb je vynecháno. Alikvotní podíly (0,5 ml), z duplikátů přípravků s mAb a prázdných nosičů byly odstředěny při 5 000 otáčkách za minutu. Pelety a supernatanty byly zmrazený a pomocí Western vrstvy byla stanovena účinnost zapouzdřené protilátky.

Na obr. 6 jsou rentgenové snímky Western imunoanalýz čištěného mAb, prázdných proteinoidních nosičů (bez přídavku mAb) a proteinoidních nosičů obsahujících 9BG5. Analýza byla prováděna na imunovrstvě s anti - myším IgG, který specificky reaguje s mAb 9BG5. Jednotlivé sloupce odpovídají následujícím zkouškám:

Sloupec

MW

Vzorek

2μg 9BG5 mAb 9BG5

0,25 μg 9BG5

Standarty molekulových hmotností

Supernatant z prázdného proteinoidního nosiče po zapouzdření

Prázdná peleta proteinoidního nosiče

Supernatant s obsahem mAb po zapouzdření Peleta z proteinoidního nosiče s obsahem mAb

Získaná data ukazují, že 9BG5 proteinoidní nosiče obsahují asi 40 % mAb v peletách a zbývajících 60 % nebylo zapraveno do nosiče a zůstalo v supernatantu. Prázdné proteinoidní nosiče podle očekávání neobsahovaly protilátky v supernatantu ani v peletách.

Relativní pohyblivost (molekulová hmotnost) čistého mAb je lehce odlišná od hodnoty pro mAb na proteinoidních nosičích. To je pravděpodobně důsledek rozdílů v koncentracích solí ve vzorcích, nebot při zapouzdřování se používá slaného roztoku o koncentraci 0,8 mol/1.

Příklad 10; Vliv přísad na stabilitu proteinoidních nosičů se zapraveným murinem mAb 9BG5

Byly zkoumány různé formulace proteinoidních nosičů s a bez přísad za účelem nalezení optimálních podmínek pro přípravu nosiče a optimálních koncentrací mAb vhodných pro přípravu produktu.

Přípravky mAb 9BG5, použité pro zapouzdřování této látky do proteinoidních nosičů měly koncentraci proteinů asi 2 mg/ml ve fosfátovém solném pufru.

Finální koncentrace proteinoidu byla 50 mg/ml a dále bylo přítomno 5 % hmotnostních akáciové gumy (dále též gumy) nebo želatiny (dále též gel). Všechny proteinoidní nosiče byly připraveny v 0,85 N kyselině citrónové. Prázdné nosiče byly připraveny jako kontrola stejným způsobem jennebylo přidáváno mAb. Alikvotní podíl (0,5) duplikátu suspenze proteinoidního nosiče byl odstředěn při 5 000 ot/min. Pelety a supernatanty byly při odběru k analýze zmrazovány suchým ledem.

Tabulka 7 uvádí vzorky, které byly připraveny, čísla v závorkách vyjadřují množství přidaného mAb.

Tabulka 7

VZOREK	PROTEINOID	PŘÍSADA	ZÍSKANÝ PROTEIN ( NG/ME)
	326	Gum	0
3	326	Gel	0
5	334	·· Gum	0
7	334	Gel	0
9, 10	326	Gum	0.5
11,12	326	Gum	0.25
13	326	Gel	0.25
15, 16	334	Gum	0.25
17, 19	334	Gel	0.25

Za účelem testování odolnosti proteinoidních nosičů vůči mrznutí a tání byly srovnávací dvojice pelet promyty dvojím jemným rozmícháním ve 25 ml 0,85 N kyseliny citrónové. Pak byly pelety analyzovány ve srovnání s nepromytými peletami, aby bylo možno stanovit, jaká je

3Ί ztráta mAb vymýváním.

Vzorky byly analyzovány obvyklým postupem mna Western vrstvě postupem, jak je popsáno v příkladu 9. Pelety byly rozmíchány v dodecylsulfonanu sodném s přísadou NaOH v koncentraci 0,05 mol/1 a analyzovány v redukčních podmínkách (mAb do 50 kDa a 25 kDa pásy). Alikvotní vzorky (50 μΐ) supernatantů byly analyzovány v redukčních podmínkách (očekáváno neporušených 150 kDa mAb). Tím bylo diferenciálně stanoveno, zda je zbytkový mAb denaturovaný nebo neporušený.

Je vidět, že rentgenový snímek analýzy na Western vrstvě (obr. 7), vzorky pelet č. 9, 10, 11 a 12 obsahují mezi 5 až 10 μg mAb. Promývané vzorky nevykazují signifikantní ztrátu mAb, z čehož lze přdpokládat, že proteinoidní nosiče zůstávají po zmrznutí a roztavení neporušeny. Supernatanty ze vzorků 9 a 11 neobsahovaly měřitelné množství mAb, což ukazuje, že nezapouzdřený materiál myl v průběhu přípravy ztracen.

U vzorku se projevila určitá ztráta zapouzdřeného mAb vymýváním (viz č. 18). Tento kuličkovitý přípravek nebyl odolný vůči zmrazení a roztavení. Navíc pás pro MW 150 kDa pro supernatanty vzorku 17 ukazuje, že signifikantní množství mAb se ztrácelo z produktu když už byl vyroben.

Na základě těchto výsledků lze říci, že mAb zůstává neporušeno a zapouzdřovací proces jej nedegraduje. Prázdný proteinoidní nosič byl analyzován pro kontrolu, zda nevznikají nějaké další pásy apodle očekávání neobsahují mAb.

Příklad 11: Účinnost zapouzdřené monoklonální protilátky murinu IgG

V tomto experimentu byl připraven mAb 9BG5 proteinoidní nosič a byl porovnáván s nezapouzdřeným mAb 9BG5 pomocí testů na krysách. Podle příkladu 9 bylo připraveno mAb 9BG5 a zapouzdřeno do proteinoidů GluAspTyrPhe (molání poměr Glu : Asp : Tyr : Phe uváděných do reakční směsi byl 1 : 1 : 1 : 1) ve formulaci nosiče s arabskou gumou. Nosiče proteinoidů mAb obsahovaly 0,25 mg/ml proteinoidů v 0,85 N kywselině citrónové s 0,5 % gumy. Prázdný proteinoidní nosič byl připraven podobně, jen bez obsahu mAb. Vzhledem k tomu, že bylo potvrzeno zapouzdření 30 % mAb, lze odhadnout, že v produktu je 0,075 mg/g mAb a tato hodnota byla proto použita pro stanovení dávek. Proteinoidní nosiče s obsahem mAb byly zkoumány mikroskopicky a jevily se jako homogenní přípravek.

Pro dávkování zvířatům byla zvolená alikvotní dávka odstředěna při 5 000 ot./min po dobu 15 minut a pelety byly resuspendovány v 1,0 ml 0,85 N kyseliny citrónové s 0,5 % gumy.

Vyčištěný roztok mAb (0,95 mg/ml mAb v 0,85 N kyselině citrónové s 0,5 % gumy byl používán pro orální aplikaci. Tento roztok byl před podáním předehřát na 40 °C. Pro IV podání byl použit čištěný roztok mAb o složení 1 mg/ml mAb ve slaném fosfátovém pufru.

Množství a způsoby podávání v experimentu jsou následující:

1. Prázdný proteinoidní nosiče (žádné mAb): v 1 ml alikvotního roztoku bylo obsaženo 50 mg prázdných proteinoidních nosičů při orální aplikaci (krysy *2312 a

2313).

2. Zapouzdřený mAb 9BG5 v proteinoidním nosiči: 3,7 mg mAb/kg tělesné hmotnosti krysy při orální aplikaci (krysy *2287, 2288, 2290, 2291).

3. Nezapouzdřený mAb 9BG5: 0,73 mg/kg tělesné hmotnosti krysy při intravenózni aplikaci (krysy *2292, 2293 a 2311).

4. Nezapouzdřený mAb 9BG5: 3,7 mg/kg tělesné hmotnosti krysy při orální aplikaci

Před podáváním (1 ml alikvotní dávky) byla krysám odebrána základní řada krevních vzorků (čas 0). Po podání byly odebrány vzorky krve po lh, 6h a 24h. Krevní vzorky byly ihned zpracovávány a jejich sérum bylo uchováváno při -20 °C.

Před analýzou bylo každé sérum zahřáto až roztálo a pomocí známí techniky ELISA, při trojím opakování, s použitím čištěného reoviru typu 3 a V_LSH dimerních peptidů immobilizovaných na mnohajamkových deskách (W.V.Wiliams et al (1991) J.Biol.Chem. vol. 266(8), str. 5182 až 5190). Kontrolní desky včetně jamek bez immobilizovaného reoviru i bez V^SH peptidů byly k prvním deskám přidány. VLSH peptid je syntetická varianta (W.V. Wiliams et al. ibid Tabulka 1) VL peptidů, jehož složení koresponduje s částí lehkého řetězce variabilní CDR II oblasti protilátky 87.92.6. Protilátka 87.92.6 se chová vůči receptoru reoviru typu 3 a mAb 9BG5 idiotypicky a antiidiotypicky (W.V.Wiliams et al. ibid). Množství navázaného proteinu v každé jamce bylo stanoveno obvyklými metodou pro stanovení proteinů, např. metodou Lowryho, a výsledky pro každou vícejamkovou desku uvedeny na obr. 8 (a až c).

Obr. 8 a) až c) ukazuje, jaká množství sérových proteinů se navázala na immobilizovaný reovirus typu 3 a V_lSH podle hodnot měření koncentrace proteinů. Z těchto výsledků vyplývá, že hladiny navázaných sérových proteinů byly 24 hodin po podání nejvyšší u zvířat, kterým bylo podáno orálně mAb na proteinoidním nosiči a u zvířat, jímž bylo mAb podáno nezapouzdřené cestou IV. U zvířat, kterým bylo podáváno nezapouzdřené mAb byly nalezeny nižší hladiny navázaného sérového proteinu. Sérum, odebrané zvířatům, která dostala pouze prázdný nosič (žádné mAb), nevykazovalo žádnou specifickou vazbu sérového IgG proteinu, jak bylo očekáváno za zmíněných podmínek.

Obr. 9 ukazuje navázání mAb při obvyklém testu E1ISA s / použitím immobilizovaného reoviru typu 3 a V-^SH proteinů. Bylo použito roztoků: mAb v 0,85 N citrátu s 0,5 % gumy (obr. 9a) nebo ve fosfátem pufrované solance (obr. 9b). Z obrázků vyplývá, že hladiny navázaných proteinů byly vyšší u mAb v citratovém pufru než u mAb ve fosfátu. Aniž by se touto tím vynález omezoval lze vyslovit theorii, že rozdíl je vysvětlitelný podporou vazby změnami v prostorové konformaci, ke kterým dochází při vazbě citrát - protein.

Souhrnem lze říci, že hladiny mAb v séru, jak je ukazují absorbance vázaných proteinů, byly větší u zvířat, která dostala zapouzdřený mAb orální cestou nebo nezapouzdřený mAb IV cestou, než u zvířat, kterým bylo orálně podáno nezapouzdřené mAb.

Příklad 12: Příprava proteinoidního nosiče s obsahem heparinu

Tento příklad popisuje způsob přípravy a čištění proteinoidních nosičů s heparinem

POSTUP

Reakční	složky:
a.	Práškový proteinoid připravený podle příkladu 1
b.	Heparin
c.	Bezvodá kyselina citrónová (USP)
d.	Akáciová guma NF
e.	Deionizovaná voda
f.	Vysoušeči činidlo
g·	Kapalný dusík

2. Přístroje:

a. Magnetické míchadlo

b. Bireta

c. Mikroskop

d. Klinická odstředivka

e. Dialyzační trubicová membrána (Spectrum 6, 10 mm

000 M.W. Cutoff

f. Ph-metr

g. Lyofylizér

h. Lyofylizační baňky (150 až 300 ml)

i. Rotační vymrazovací odparka

j. Lázeň Izopropanol/suchý led nebo kapalný dusík

k. Třecí miska s loučkem

l. Skladovací nádoby (500 ml)

m. Eppendorfova pipeta (0 až 100 μΐ)

n. Plastové uzávěry pro dialyzační trubici (Spectrum)

o. 2 ml injekční stříkačka a 0,45 um Acrodisk

3. Příprava roztoků:

a. Proteinoidní roztok A nebo jeho násobky (80 mg/ml): Rozpustí se 160 mg proteinoidú v 1 ml deionizované vody. Pomocí 2 ml injekční stříkačky s 0,45 um Acrodiskem se roztok proteinoidú zfiltruje do 10 ml testovací trubice a ponechá se při 40 °C.

b. Roztok B (1,7 Nkyselina citrónová s 1 % gumy): Rozpustí se 10 g akáciové gumy a 109 g kyseliny citrónové v litru deionizované vody.

c. Roztok C (Heparinový roztok):

Rozpustí se heparin v roztoku B při 150 mg/ml a směs se ponechá při 40 °C.

4. Příprava proteinoidních nosičů:

a. Rychle se vlije veškerý roztok A do roztoku C, přičemž se směs mírně ručně míchá, načež se udržuje na 40 °C teplé vodní lázni.

5. Dialyza proteinoidních nosičů s obsahem heparinu:

Bylo zjištěno, že že přítomnost kyseliny citrónové v proteinoidních nosičích se zapouzdřenou nesenou látkou ruší následnou lyofylizaci. Přesto tyto proteinoidní nosiče připravené z roztoků s obsahem kyseliny citrónové se výhodně dialyzují proti 5% kyselině octové po dobu alespoň dvou hodin s alespoň čtyřmi změnami dialyzačního roztoku kvůli dokonalému odstranění kyseliny citrónové průchodem přes membránu. Tedy,

a. Suspenze se přenese stříkačkou (bez jehly) do dialyzačni trubice a uzavře plastovými uzávěry. Trubice nemá být víc plná než ze 70 %.

b. Odstraní se veškeré amorfní materiály usazené na dně a/nebo agregované na povrchu.

c. Dialyzuje se suspenze proteinoidního nosiče proti roztoku kyseliny octové (použije se 20 ml roztoku kyseliny octové na ml suspenze proteinoidního nosiče) přičemž se roztok kyseliny octové míchá magnetickým míchadlem.

d. Každou hodinu se vyměňuje roztok kyseliny octové. Dialyza se provádí celkem 3 hodiny.

6. Lyofylizace:

a. Přidá se 1 díl 50% trehalozy (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, USA) do devíti dílů dialyzovaného roztoku proteinoidního nosiče. Rychle se proteinoidní nosič zmrazí ve vymrazovací odpařovací baňce s použitím cca 190 otáček za minutu přičemž je baňka v kontaktu s kapalným dusíkem.

b. Zbytek se dále suší a mrazí 24 hodin nebo dokud se evidentně nepřestane sám odpařovat.

c. Zaznamená se suchá hmotnost proteinoidního nosiče.

d. Rozdrtí se na třecí misce tloučkem na jemný prášek.

e. Proteinoid se přenese do desikátoru s vloženým vysoušecím prostředkem a ponechá se při pokojové teplotě.

7. Resuspendování:

a. Zváží se lyofylizovaný prášek a vypočte se množství proteinoidu v tomto prášku.

b. K lyofylizovanému prášku se při 40 °C přidá 0,85 N vodný roztok kyseliny citrónové. Finální koncentrace proteinoidu v roztoku je 80 mg/ml.

Příklad 13: Příprava proteinoidního nosiče s insulinem

Tento příklad ilustruje způsob přípravy proteinoidních nosičů s obsahem insulinu

POSTUP

Reakční složky:

a. Práškový proteinoid

b. Bezvodá kyselina citrónová (USP)

c. Želatina (USP)

d. Porcin insulin (Novo Nordisk)

e. Deionizovaná voda (Novo Nordisk)

2. Přístroje:

a. Vodní lázeň 40 °C

b. Filtr Acrodisk 0,2 μπι

c. Sterilní injekční stříkačka

3. Příprava roztoků:

a. 1,7 N kyselina citrónová s 5,0 % želatiny:

Rozpustí se 109 mg bezvodé kyseliny citrónové a 50 mg želatiny na 1 ml deionizované vody požadovaného objemu** a inkubuje se na vodní lázni při 40 °C až se želatina dokonale rozpustí. Roztok lze připravit a uschovat při 40 °C pro pozdější použití.

** Proteinoidový a insulinový roztok by měly každý být připraven v objemu, rovném polovině požadovaného celkového objemu roztoku mikrokuliček

b. Roztok insulinu:

Rozpustí se 12 mg insulinu na 1 ml 1,7 N kyseliny citrónové s 5 % želatiny při 40 °C v požadovaném objemu.

c. Roztok proteinoidů:

Rozpustí se 100 mg proteinoidů na 1 ml deionizované vody při pokojové teplotě v požadovaném objemu. Pomocí injekční stříkačky a 0,2 μιη Acrodisku se roztok zfiltruje pro zajištění čistoty a inkubuje na vodní lázni při 40 °C. Viz sekce 5b.

4. Příprava proteinoidních nosičů:

a. V objemovém poměru 1 : 1 se smísí roztok proteinoidů a roztok insulinu a tak se zajistí požadovaný finální objem.

b. Rychle se přidá zfiltrovaný roztok proteinoidů k roztoku insulinu při 40 °C a za mírného konstantního míchání.

Příklad 14: Způsob přípravy proteinoidních nosičů s obsahem erythropoietinu

Zapouzdření lidského erythropoietinu (EPO) do proteinoidních nosičů bylo prováděno stejným způsobem, který je popsán v příkladu 13. EPO byl získán od Genetic Institute (Cambridge, MA, USA, nyní je dostupný od Amgen Corp., Thousand Oaks, CA, USA). Pro přípravu proteinoidního nosiče s obsahem EPO byl použit roztok proteinoidů GlnAspTyrPhe (1:1:1:1 molárně ve výchozí reakční směsi) a roztok 150 μg/ml EPO v 1,7 N kyselině citrónové s 1 % gumy.

Příklad 15: Hodnocení Proteinoidního nosiče obsahujícího erythropoietin

V tomto příkladu byl hodnocen proteinoidní nosič, připravený podle příkladu 14 pomocí testů na krysách.

Krysám o hmotnosti 150 až 200 g byl intramuskulární injekcí za účelem anestezie dodán ketamin (8,5 mg/kg) a thorazin (3,75 mg/kg). Poté jim byl podán orálně jednak nezapouzdřený a jednak zapouzdřený erythropoietin. 8 fr. nelatonový katetr byl zaveden esofagem až po značku 10 cm. Testované a kontrolní vzorky pak byly nabírány do stříkačky a vstřikovány katetrem. Zvířata byla držena ve svislé poloze a roztok byl uváděn do krysího žaludku. Výsledky experimentu jsou shrnuty na obr. 10 až 12.

Erythropoietinové experimentální kombinace:

Várka Dávka Počet krys Poznámka

kontrola	15	0/4	hladovění 15 hod
25K3K	15	0/4	přístup k podestýlce
254<3K	15	2/4	podávání
kontrola	15	0/2	' hladovění 36 hod
25K3K	15	0/2	5% sacharoza
254<3K	15	1/4	bez podestýlky
270K	15	1/3	podávání
270G	15	3/3
kontrola	15	1/5	hladovění 24 hod
264CP	15	1/4	přístup k podestýlce
270G	15	1/6	podávání
kontrola	10	0/5	hladovění 24 hod
270G	10	3*/6	bez podestýlky
kontrola	30	0/3	hladovění 24 hod
kontrola	60	1/4	bez podestýlky
270G	30	1/3	přímá injekce do žaludku
kontrola	50	0/3
kontrola+
pepsin	50	0/4	Přímá injekce do střeva
270G	50	2/4
270G+
pepsin	50	0/4
kontrola	100	1/5	několik dávek
270G	100	1/5	(5 dávek po intervalech
I.V.	50	2/2	při t = 1/2 hod)
S.C.	50	2/2	podáno žalud, trubicí

* u krys se objevila pěna u nozder

Obr. 10 ukazuje hladiny erythropoietinu (EPO) zjištěné v krysím séru odebraném krysám, kterým byl podáván GlnAspTyrPhe proteinoidní nosič se zapouzdřeným EPO (15 mg EPO/kg tělesné hmotnosti) a zapouzdřeným EPO (15 mg EPO/kg tělesné hmotnosti) po časových intervalech t = 0,5, 1 a 2 hod. Hladiny erythropoietinu v séru byly stanoveny pomocí soupravy Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Výsledky ukazují, že hladiny EPO v séru byly u krys, kterým byl podáván proteinoidní nosič s obsahem, byly relativně vyšší ve všech časových odstupech ve srovnání s krysami (kontrola), které dostaly nezapouzdřenou stejnou látku. V čase t = 2 hod zůstaly hodnoty EPO v séru krys, kterým byl podáván erythropoietin zapouzdřený v proteinoidním nosiči, asi na hodnotě 300 pg/ml, zatímco kontrolní krysy měly v séru hodnoty nezjistitelné.

Obr. 11 ukazuje hodnoty u krys, kterým byl podán bud erythropoietin (50 μg/kg) nebo GluAspTyrPhe (molání poměr Glu : Asp : Tyr : Phe uváděných do reakční směsi byl 1 : 1 : 1 : 1) proteinoidní nosič se zapouzdřeným erythropoietinem (50 μg/kg) přímo do dvanácterníku. Koncentrace erythropoietinu v séru byly opět stanovovány shora zmíněnou enzymovou soupravou. Výsledky ukazují, že hladiny EPO v séru při podání zapouzdřeného erythropoietinu okamžitě vzrostly rychlostí asi 50 pg/ml za hodinu a to v průběhu dvou hodin. Naproti tomu kontrola s nezapouzdřeným EPO měla vrchol 1 hodinu po podání (100 pg/ml) a pak okamžitě poklesla na asi 50 pg/ml na konci dvouhodinového intervalu.

Obr. 12 ukazuje hodnoty u krys, kterým byl orálně podán bud’ proteinoid GluAspTyrPhe (molání poměr Glu : Asp : Tyr : Phe uváděných do reakční směsi byl 1:1:1:1) nebo proteinoidní nosič se zapouzdřeným erythropoietinem (100 ^g/kg) nebo obdržely subkutánní injekci 2 ^g/kg nebo 10 μg/kg. Koncentrace erythropoietinu v séru byly opět stanovovány shora zmíněnou enzymovou soupravou. Výsledky ukazují (krysy *640 až 645), že hladiny EPO v séru při podání zapouzdřeného erythropoietinu vzrostly a to v průběhu dvou hodin ve srovnání s nezapouzdřeným materiálem.

Výsledky získané v tomto příkladu dokazují, že zapouzdření do proteinoidů výrazně zlepšuje možnost orálního podávání EPO.

Příklad 16: Příprava proteinoidního nosiče s obsahem kalcitoninu

Zapouzdřený lososí kalcitonin v proteinoidním nosiči byl získán stejným způsobem jako v příkladu 13. Kalcitonin, peptidický hormon, který má vliv především na kosti a na nižší koncentraci vápníku v séru, byl získán od fy Sandoz. Proteinoidní nosiče s obsahem kalcitoninu byly připraveny smísením vodného roztoku s obsahem GlnAspTyrPhe (1:1:1:1 pro aminokyseliny, vstupující do reakce) o koncentraci 100 mg/ml s roztokem kalcitoninu o koncentraci 150 μg/ml kalcitoninu v 1,7 N roztoku kyseliny citrónové s 1 % akáciové gumy, analogicky, jako je popsáno v příkladu 13. Účinnost zapouzdřeného kalcitoninu byla asi 40 %. Koncentrace kalcitoninu byla stanovena HPLC po rozpuštění proteinoidního nosiče v 60% vodném acetonitrilu.

Příklad 17: Hodnocení proteinoidních nosičů obsahujících kalcitonin na opicích

V tomto příkladě se hodnotí proteinoidní nosiče s obsahem kalcitoninu připravené podle příkladu 16 na opicích rodu cynomolgus. Samci opic rodu cynomolgus o hmotnosti 4 až 5 kg byli přes noc vyhladověni, podrobeni anestézii (asi 10 mg/kg ketaminu HC1) a umístěni do křesla pro omezení ohybu pro primáty. Nasogastrickou cestou byla každé ze čtyř podána jedna dávka kalcitoninu na proteinoidním nosiči (0,25 mg/kg tělesné hmotnosti). Dávkování se vypočetlo na základě hmotnosti, zjišťované ráno před podáním přípravku. Cévním katetrem byly pak za účelem stanovení kalcia v séru odebírány vzorky krve v hodinových intervalech, počínaje časem t = 0 před podáním přípravku a bylo ukončeno 7 hodin po podání. Jako měřítko farmakologické odezvy byla zjištěna hypokalcemická odezva, která následovala po orálním podání kalcitoninu. Koncentrace vápníku v séru byly stanovovány známou o-kresolftaleinovou komplexonovou metodou.

Obr. 13 ukazuje odezvu u opic cynomolgus, která následovala po naso-gastrickém podání zapouzdřeného kalcitoninu. Byly pozorovány signifikantní změny proti normální hodnotě. Šest hodin po podání klesly koncentrace vápníku o 13 ug/ml. Signifikantní farmakologická odezva byla patrná ještě 7 hodin po podání proteinoidních nosičů s obsahem kalcitoninu.

Příklad 18: Hodnocení proteinoidních nosičů s obsahem kalcitoninu na krysách

V tomto příkladu byly připraveny proteinoidní nosiče jako v příkladu 16 a byly hodnoceny vyhladovělých samcích krys Spraque Dawley o hmotnosti 100 až 150 g. Proteinoidní nosiče s obsahem kalcitoninu a samotný kalcitonin byly podány jednak orální cestou a jednak intraduodenální injekcí. Krysy byly rozděleny do následujících pokusných skupin:

1. Proteinoidní nosiče s obsahem kalcitoninu:

tělesné hmotnosti orálně (3 krysy).

2. Proteinoidní nosiče s obsahem kalcitoninu:

μ9 kalcitoninu/kg tělesné hmotnosti intraduodenálně (3 krysy).

3. Kalcitonin: 60 μg kalcitoninu/kg tělesné hmotnosti orálně (3 krysy) (kontrola).

4. Kalcitonin: 3 μg kalcitoninu/kg tělesné hmotnosti intraduodenálně (3 krysy) (kontrola).

Orální podávání se provádí dávkami. Proteinoidní nosiče s obsahem kalcitoninu byly připraveny těsně před podáváním. Skupiny 1 a 2 dostaly každá vhodnou dávku proteinoidní suspenze nosiče. Skupiny 3 a 4 obdržely nezapouzdřený kalcitonin (žádné proteinoidní nosiče). Pro testování byly odebírány krysám 0,5 ml vzorky z ocasní tepny před podáním (čas 0) alh, 2 ha 3 h po podání. Sérum z krevních vzorků bylo uchováváno při -20 °C pro stanovení koncentrace vápníku.

Obr. 14 ukazuje křivku závislosti koncentrace vápníku v séru na čase pro orálně podávaný zapouzdřený a nezapouzdřený kalcitonin u krys. Experimentální výsledky u krys demonstrují výrazné zvýšení farmakologické odezvy (t.j. snížení hladin vápníku v krevním séru) při podání zapouzdřeného kalcitoninu oproti samotnému v kontrolním provedení. Jednu hodinu po podání klesla u zapouzdřeného kalcitoninu o 23 μΐ/ml a o 6,5 u nezapouzdřeného v kontrolní skupině. Dále byly odezvy závislé na dávce (data nejsou uvedena). Výsledky intraduodenální injekce zapouzdřeného a nezapouzdřeného kalcitoninu ukazuje obr. 15. Výsledky demonstrují časově závislý pokles hladin vápníku v séru pro zapouzdřený kalcitonin. Kontrolní skupina nemá žádnou odezvu. Jednu hodinu po podání zapouzdřeného kalcitoninu klesla koncentrace vápníku o 18 |ig/ml, zatímco nezapouzdřený kalcitonin byl nezměněn.

Výsledky, získané v tomto příkladu a v příkaldu 17, že zapouzdření do proteinoidního nosiče silně zlepšuje orální příjem kalcitoninu. Data také ukazují, že soustava pro orální podávání není typově závislá.

Příklad 19: Příprava a hodnocení proteinoidního nosiče s obsahem Faktoru IX

Faktor IX je krevní koagulační proenzym závislý na vitaminu K a má molekulovou hmotnost 56 000. Nedostatkem tohoto faktoru, známým jako hemofilie B, trpí v průměru 1 ze 25 000 mužů. Dodnes se léčí tato porucha intravenózni aplikací Faktoru IX, nověji je uváděna v podrobnostech náhrada tohoto způsobu subkutánními injekcemi. (Thompson 1986 Blood, vol. 67(3), Str. 565 až 572).

Zapouzdření faktoru IX (FIX) v proteinoidních nosičích bylo provedeno podle postupu, popsaného v Příkladu 13, míšením (1:1 obj.) roztoku 100 mg/ml Proteinoidú GluAspTyrPhe (molární poměr kyselin vstupujících do reakce 1:1:1:1) v deionizované vodě a vodného roztoku FIX. Odděleně byly připraveny dvě suspenze proteinoidních nosičů a hodnoceny in vivo postupem, popsaným v příkladech 20 a 21.

Suspenze A proteinoidního nosiče obsahovala 50 mg/ml proteinoidú a 500 U/ml FIX (FIX je dostupný od American Red

Cross, Rockville, Marylend, USA) v roztoku s obsahem 4 % kyseliny octové, 2 % akáciové gumy, 0,2 % PEG 14 (dostupný od Union Carbide, Danbury, CN, USA)14 mmol/1 CaCl₂ při pH 3,81.

Suspenze B proteinoidního nosiče obsahovala 50 mg/ml proteinoidu a 116 U/ml FIX v roztoku s obsahem 3,8 % kyseliny octové, 1,5 % akáciové gumy, 0,15 % PEG 14, 11 mmol/1 CaCl₂ při pH = 4,58.

Stabilita přípravků na bázi proteinoidního nosiče se zapouzdřeným FIX byla testována krátkodobou zkouškou in vitro. Přípravek (t.j. proteinoidní nosič se zapouzdřeným FIX) byl zkoumán optickým mikroskopem a dále podroben analýze laserovou světelnou difrakční matodou. Alikvotní podíly suspenze přípravku byly odebírány po 30 min. po dobu 1,5 hodiny. Z nich byl přípravek izolován odstředěním při 4 500 Xg a rozpuštěn v APTT pufru (0,05 mol/1 histidinu, 0,01 mol/1 NaCl, 0,1 % hovězího sérového albuminu a 0,01 % TWEEN-40, pH = 7,47) aby se uvolnil rozpustný FIX a proteinoid. Kvantitativní stanovení aktivity FIX pomocí APTT bylo provedeno u všech FIX standartů (0,025, 0,05 a 0,1 U/ml) a prázdmého proteinoidního nosiče v suspenzi pro kontrolu. Soupravy pro APTT zkoušku jsou komerčně dostupné, např. Sigma Diagnostics (St Louis, MO, USA).

Na základě shora uvedených analýz bylo zjištěno, že proteinoidní nosiče se zapouzdřeným FIX mají větší stabilitu pokud jsou získávány z roztoků při vyšším pH, např. 4,9.

Dále bylo zjištěno, že účinnost zapouzdření je asi 20 % volných FIX jednotek a úrovně aktivity zůstávají konstantní alespoň 1,5 hodiny při skladování proteinoidních pelet s obsahem FIX při cca 4 °C.

Příklad 20: Hodnocení proteinoidních nosičů s obsahem FIX (A) na krysách.

V tomto příkladu byla suspenze A proteinoidnho nosiče, připravená způsobem jako v příkladu 19, hodnocena na samcích krys Sprague Dawley (průměrná hmotnost 300 g). Vypočtená množství suspenze byla odstředěna při 4500Xg a získané pelety nosiče s obsahem FIX byly resuspendovány v témže pufru pro podávání zvířatům. Krysy byly rozděleny do dvou skupin následovně:

1. Orální proteinoidní nosiče s obsahem FIX (FIX kuličky PO): 2709 jednotek FIX/kg tělesné hmotnosti intragastrické podání (4 krysy).

2. Intravenozní FIX (bez proteinoidního nosiče) (FIX IV): 200 jednotek/kg tělesné hmotnosti intravenozní podání injekcí (32 krys) 0,7 ml v 0,11 NaCl - 0,02 mol/1 citronanu sodného, pH 6,58 nitrožilní injekcí do ocasu.

Suspenze a roztoky proteinoidních nosičů s obsahem FIX byly připraveny bezprostředně před podáním. Jeden ml krve byl odebrán od každé krysy těsně před podáním (čas 0) a pak lh, 2ha4hpo podání, ke vzorku krve byl přidán citrátový antikoagulant a plasma byla uchovávána při -70 °C.

Vzorky plasmy byly podrobeny upravenému APLL testu s použitím FIX koagulované deficitní plasmy (Souprava pro test je dostupná od Ortho Diagnosis, Raritan, New Jersey, USA). Změny ve srážecích dobách byly vypočteny jako rozdíly oproti základní hodnotě (0 h). Data jsou vynesena na obr. 16. Jedná se o průměrné hodnoty pro každou skupinu. Hodnoty pod základní hodnotou ukazují na přítomnost exogenního FIX.

Jak vyplývá z obr. 16, dostalo se do krve signifikantní množství při orálním podávání proteinoidních nosičů s obsahem FIX. Relativní hodnota v plasmě je u skupiny s FIX na nosiči sice nižší, ale projevené změny ve srážecích časech při 0,5, 1,0 a 2,0 hodinách jsou pozoruhodné. Takových hodnot se dosáhne orálním podáním čtrnáctinásobku dávky IV. Dále jsou tyto výsledky zajímavé zejména proto, že Faktor IX je v kyselém prostředí nestabilní protein, a jeho střední doba života je zhruba menší než jedna hodina při 37 °C při pH 5,0. Proteinoidní nosiče s obsahem FIX byly při tomto experimentu získávány při pH = 3,81 a zapouzdřilo se 14,8 % jednotek aktivního FIX. Výsledky potvrzují, že proteinoidní nosiče s obsahem FIX přetrvávají v zažívacím traktu a usnadňují tak orální podávání.

Příklad 21: Hodnocení proteinoidních nosičů s obsahem FIX (A) na krysách.

V tomto příkladu byla suspenze B proteinoidnho nosiče s obsahem FIX připravená způsobem jako v příkladu 19, hodnocena na samcích krys Sprague Dawley (průměrná hmotnost 300 g). Resuspendované nosiče s obsahem FIX byly připraveny stejně jako v příkladu 20. Krysy byly rozděleny do tří skupin následovně:

1. Orální proteinoidní nosiče s obsahem FIX (FIX kuličky PO): 1006 jednotek FIX/kg těles, hmotn. intragastrické podání (5 krys).

2. Intravenozní FIX (bez proteinoidního nosiče) (FIX IV): 185 jednotek/kg tělesné hmotnosti intravenozní podání injekcí (3 krysy) 0,7 ml v 0,11 NaCl - 0,02 mol/1 citronanu sodného, pH 6,58 nitrožilní injekce do ocasu.

3. Intravenozní FIX (bez proteinoidního nosiče) (FIX nezapouzdřebný PO): 2760 jednotek/kg těl. hmot. intragastrické podání (4 krysy) 1,0 ml FIX v slaném roztoku s obsahem 3,8 % kyseliny octové, pH = 6,85

Suspenze a roztoky proteinoidních nosičů s obsahem FIX byly připraveny bezprostředně před podáním. Vzorky plasmy byly získány a analyzovány stejně jako v příkladu 20. Změny ve srážecích dobách byly vypočteny jako rozdíly oproti základní hodnotě (0 h). Data jsou vynesena na obr. 17. Jedná se o průměrné hodnoty pro každou skupinu. Hodnoty pod základní hodnotou ukazují na přítomnost exogenního FIX. Proteinoidní nosiče s obsahem FIX byly při tomto experimentu získávány při pH = 3,81 a zapouzdřilo se 14,8 % jednotek FIX.

Jak je vidět z obr. 17, přestože orální dávky jsou pouze pětinásobkem IV dávek, bylo pozorováno signifikantní dodání účinné látky organismu. Navíc nativní FIX (pH = 6,85) podaný v dávce rovné patnáctinásobku IV dávky nezpůsobil sám o sobě (bez nosiče) žádné měřitelné změny v exogenním FIX v plasmě.

Z výsledků tohoto příkladu a příkladu 20 plyne, že orální podávání FIX lze dosáhnout cestou použití proteinoidních nosičů. Tyto proteinoidní nosiče dostatečně chrání FIX při průchodu zažívacím traktem a dopraví FIX do krevního oběhu.

Příklad 22: Příprava proteioidních nosičů s obsahem alfa-interferonu (IFN)

Tento příklad je zaměřen na zhodnocení schopnosti proteinoidních nosičů chránit před enzymatickým štěpením za napodobených podmínek zažívacího traktu. Stabilita IFN na nosiči in vitro byla testována v simulované žaludeční kapalině (SGF), obsahující pepsin v 0,08 N HC1 a simulované střevní kapalině (SIF), obsahující pankreatin ve fosfátovém pufru. Reakční činidla a test stability jsou popsány v United States Pharmacopoeia (vol. XXII, 1990, str. 1788 a 1789) .

Příprava proteinoidních nosičů s obsahem IFN:

Zapouzdření IFN v proteinoidním nosiči bylo provedeno stejným způsobem jako v příkladu 13. Alfa-IFN je dostupný z komerčních zdrojů. Jedním komerčně dostupným IFN produktem je Roferon-A (Hoffman LaRoche). Pro přípravu proteinoidního nosiče s obsahem IFN byl použit roztok proteinoidů GlnAspTyrPhe (1:1:1:1 molárně ve výchozí reakční směsi) a roztoku IFN v 1,7 N kyselině citrónové s 5 % želatiny. Zapouzdřený přípravek obsahoval 80 mg/1 proteinoidů, 600 μg/ml IFN, 0,6 N kyselinu citrónovou a 2,5 % želatiny a měl pH = 3,0.

Zkouška stability IFN na proteinoidním nosiči v SGF:

SGF (2 ml) byl přidán 1 ml suspenze proteinoidního nosiče s obsahem IFN. Roztok byl inkubován při 40 °C za třepání a po přidání SGF byl odebrán alikvotní díl jak je popsáno v U.S Pharmacopoeia dle citace shora. Ekvivalentní objem roztoku stopperu (pepstatin A) ve fosfátovém pufru, byl ihned přidán v alikvotním množství po každém odběru do vzorku, aby se zastavilo enzymatické štěpení a otevřely se proteinoidní nosiče. Koncentrace IFN ve všech vzorcích pak byla stanovena HPLC. Pro srovnání byly měřeny stability samotného IFN v SGF. Bylo to prováděno stejné, jak je uvedeno shora, jen bez nosičeů. Jako další kontrola byla stanovena stabilita IFN na proteinoidním nosiči v 0,08 N HC1.

Zkouška stability proteinoidních nosičů s obsahem IFN v SIF:

Do 1 ml IFN na proteinoidním nosiči myly přidány 2 ml SIF a roztok byl inkubován při 40 oC za třepání. Vzorky byly odebírány postupně jak je popsáno v U.S. Pharmacopoeia viz citace shora. Ekvivalentní objem roztoku stopperu (pepstatin A) ve fosfátovém pufru, byl ihned přidán v alikvotním množství po každém odběru do vzorku, aby se zastavilo enzymatické štěpení a otevřely se proteinoidní nosiče. Koncentrace IFN ve všech vzorcích pak byla stanovena HPLC.

Pro porovnání byl stejný postup proveden se samotným IFN ve SIF. Bylo použito 600 μς IFN v 0,85 N kyselině citrónové nebo 0,01 M fosfátovém pufru. K 1 ml roztoku IFN byly přidány 2 ml SIF. Analýza a odběr vzorků byly stejné jako u zapouzdřeného IFN, jak je uvedeno shora.

Výsledky a diskuse (a) Chránící účinky proteinoidních nosičů v SGF:

Jak ukazuje obr. 18, po uplynutí 1 hodiny od SGF inkubace zůstává zhruba 50 % IFN nedotčeno. Po 6 hodinách inkubace v SGF je to asi 20 % nedegradovaného IFN. Dle očekávání samotný IFN (bez proteinoidního nosiče) byl úplně rozložen pepsinem v SGF za 20 minut.

Další kontrola byla provedena se samotným IFN v 0,08 N HCl. IFN samotný byl v HC1 bez pepsinu (0,08 HCl) stabilní.Došlo pouze ke slabému poklesu po 2 hodinách inkubace. Pokus ukazuje, že IFN byl dosti stabilní i v HCl při pH do 1,2 až po dobu šesti hodin (obr. 19).

Výsledky ukazují, že proteinoidní nosiče mohou zpomalit pepsinové trávení IFN, zatímco samotný IFN nemůže v žaludku zůstat neporušený déle než 20 minut. Tato pozorování demonstrují chránící schopnost proteinoidních nosičů vůči enzymatickému trávení a proti proteinům přítomným v žaludku.

(b) Chránící účinky Proteinoidových nosičů v SIF:

IFN na proteinoidnchí nosičích, znázorněných na obr. 20 byl v SIF mnohem stabilnější než samotný IFN (bez proteinoidů). Samotný IFN se úplně štěpil při pH 7,4 do 10 minut inkubace s SIF. Asi 70 % IFN na proteinoidním nosiči přetrvává po 6 hodinách v SIF, což dokládá stabilizační účinek proteinoidních nosičů.

Samotný IFN je o něco stabilnější v SIF při pH = 3 než při pH = 7,4. Po 6 hodinách inkubace v SIF přetrvalo asi 10 % IFN. Stabilita IFN v SIF při pH = 3 je důsledkem snížení enzymatické aktivity ve střevních reakcích vlivem nízkého pH.

Příklad 23: Hodnocení Proteinoidních nosičů obsahujících heparin testy na krysách

Tento příklad byl zaměřen na aplikace, kdy jsou proteinoidní nosiče užitečné pro chránící účinek nebo (1) proteinoidy (rozpustné proteinoidy, nikoliv v podobě nosičů) mohou být použity a kdy (2) jsou možné i alternativní metody zapravování do nosičů.

Příprava proteinoidních nosičů s obsahem heparinu:

Zapouzdření heparinu v proteinoidních nosičích bylo provedeno jako v příkladu 12. Byl použit heparin (USP grade), který je obchodně dostupný, například ho dodává Eli Lilly (Indianopolis, USA). Byly připraveny proteinoidní nosiče s obsahem heparinu podle postupů z příkladu 12 s použitím obj. poměru 1:1 roztoku 150 mg/ml proteinoidú GluAspTyrPheOrn_{0 5} (molární poměr přidávaných aminokyselin 1:1:1:1:0,5) v demineralizované vodě a 250 mg/ml vodného heparinového roztoku s obsahem 1,7 N kyseliny citrónové a 0,5 % akáciové gumy. Suspenze proteinoidního nosiče s obsahem heparinu pak byla dialyzována proti roztoku kyseliny octové jak je popsáno v příkladu 12. Heparinové proteinoidní nosiče pak byly odstředěny při 4800Xg 15 minut a byl stanoven celkový heparinanalýzou pelet a supernatantu modifikovanou metodou s Azurem A (Gundry et al. Amer.J of Surgery (1984) vol. 148, str. 191 až 194). Proteinoid byl testován měřením absorbance při 294 nm roztoku vzorku v 0,1 mol/1 NaOH.

Příprava heparinem naplněných prázdných proteinoidních nosičů

Prázdné proteinoidní nosiče byly připraveny podle téhož postupu jako je popsán pro heparinové proteinoidní nosiče jen bez heparinu.Lyofylizované prázdné proteinoidní nosiče byly resuspendovány v 0,85 N kyselině citrónové a 0,5% gumě s obsahem 20 mg/ml heparinu. Množství spolu s nosičem izolovaného heparinu bylo měřeno jak je popsáno shora.

Experimentální postup:

Krysím samcům Spaque Dawley o hmotnosti asi 350 g byl orálně nebo intraduodenálně (ID) podáván: lyofylizovaný heparin na proteinoidních nosičích, heparinem naplněné prázdné proteinoidní nosiče, proteinoid/heparin ve vodě, heparin v 0,85 N kyselině citrónové a 0,5% gumě a konečně samotný heparin ve vodě. Ve všech orálních i ID experimentech byl poměr heparin:proteinoid konstantní. Při testech orálních se použili celkové dávky heparinu 100 mg/kg tělesné hmotnosti a u ID podávání to bylo 50 mg/kg. Dávka proteinoidů byla 40 mg/kg pro orální podání a 20 mg/kg pro ID injekce. Objem dávek byl přibližně 0,3 až 0,5 ml. Přibližně po 0,5 ml byly postupně odebírány od každé krysy krevní vzorky z ocasní tepny, a to nejprve těsně před dávkou (čas 0) a pak polh, 2ha4hod podání dávky. Sérum z krevních vzorků bylo skladováno při -20 °C pro stanovení heparinu.

Výsledky a diskuse:

Výsledky ukazují, že samotný heparin, stejně jako směs rozpustného proteinoidů s heparinem (obojí ve vodě, podáváno orálně nebo ID vstříknutím) se neabsorbuje z gastrointestinálního traktu v množství dostatečném ke zvýšení APTT hodnot (obr. 21). Heparin v kyselině citrónové způsobil určité zvýšení hodnot APTT, ale pouze pokud byl odán přímo do dvanácterníku.

Heparin zapouzdřený v proteinoidních nosičích (zkráceně též heparin na nosiči) poskytl vysoké hodnoty APTT, což znamená zvýšenou absorpci heparinu i při orálním podávání stejně jako při přímém podávání do dvanácterníku (obr. 22 a 23). Přestože prázdný proteinoid nasycený heparinem poskytl nízké hodnoty (23), došlo při jeho aplikaci k určitému zvýšení hodnot oproti kontrale. Oba typy proteinoidních nosičů poskytují lepší hodnoty, než heparin s kyselinou citrónovou.

Výsledky z tohoto příkladu ukazují, že pro zvýšení absorpce heparinu je nutná specifická struktura proteinoidního nosiče, nebot rozpustný proteinoid takovou měřitelnou aktivitu neprojevuje.

Příklad 24: Příprava a hodnocení proteinoidního, nosiče s obsahem Ml

V tomto příkladu se připravují proteinoidní nosič se zapouzdřeným antigenem chřipkového viru.

Příprava Proteinoidního nosiče se zapouzdřeným Ml:

Zapouzdření (neboli enkapsulace) Ml v proteinoidních nosičích bylo provedeno jako v příkladě 13. Protein Ml, hlavní vnitřní složka chřipkového viru, byl získán přečištěním prasečí chřipkové vakciny dodávané Drug Directorate, Health Protection Branch, Bureau of Biologics,

Otawa, Ontario, Kanada. Vakcina byla připravena ve vysokém výtěžku rekombinantním kmenem X-53Aa, který odvozuje HA a NA od rodičovského kmene A/NJ/11/(H1N1) a jehož vnitřní proteiny, mezi které patří Ml, od druhého rodičovského kmene A/PR/8/34 (R.B.Couc et al (1983) Ann.Rev. Microbiol., vol. 37, str.

529 až 549 a B.R.Murphy (1982) Infec.Immun., vol. 36, str.

1102 až 1108). Ml bylo čištěno podle Khan et al (1982)

J.Clin.Microbiol., vol. 16, str. 813 až 820). Ml na proteinoidních nosičích bylo připraveno míšením (při 40 °C) stejných objemů vodného roztoku lOOmg/ml proteinoidu GluAspTyrPhe v deionizované vodě a roztoku 10 mg/ml proteinu Ml v 1,7 N kyselině citrónové a 5 % arabské gumy (pH = 2). Finální koncentrace Ml v suspenzi byla 1,0 mg/ml.

Příprava proteinoidních nosičů obsahujících HA-NA a nezapouzdřených antigenů:

HA-NA antigeny byly izolovány podle Gallaghera et al. (1984) J.Clin.Microbiol., vol. 20, str. 80 až 93. Chřipkový virus (A/PR/34) byl odstřeďován při 90 000 G po dobu 60 minut. Virová peleta byla solubilizována 0,05 M acetatovým pufrem (pH = 7,0) s obsahem 7,5 % oktylglukosidu a poté ještě jednou odstředěna za týchž podmínek. Získaný supernatant, obsahoval asi 90 % HA a 10 % NA, jak bylo zjištěno SDS-PAGE.

Proteinoidní nosiče s obsahem HA-NA byly připraveny stejným způsobem jako u Ml ale místo Ml se použilo HA-NA. Finální koncentrace HA-NA v suspenzi byla tedy 1,0 mg/ml.

Prázdné proteinoidní nosiče byly připraveny stejným postupem jen s tím rozdílem, že místo roztoku Ml/kyselina citronová/guma se použil roztok l,7Nkyselina citronová/guma.

Nezapouzdřené antigeny, t.j. Ml a HA-NA, byly rozpuštěny v 1,7 N kyselině citrónové, 10 mg/ml arabské gumy na stejné finální koncentrace 1 mg/ml.

Postup při provádění testů:

Krysí samci plemena Spraque Dawley (o hmotnosti asi 350 g) byly použity pro experimenty, při kterých jim byly podávány převážně orálně testované přípravky. Byly vytvořeny čtyři skupiny po pěti krysách v každé skupině (subkutánní kontrolní skupina obsahovala 4 krysy). Skupině 1 byly podány orálně dávky 1 mg proteinoidních nosičů se zapouzdřeným proteinem Ml na 1 krysu (1 ml). Skupině 2 byly podány dávky 1 mg na krysu prázdnéhoproteinoidního nosiče. Skupině 3 byly podány dávky 1 mg nezapouzdřeného Ml na krysu v 1 ml a Skupině 4 bylo subkutánné (SC) vstříknuto 20 μg Ml na krysu v 0,3 ml. Od každé krysy byly z ocasu odebírány vzorky krve (300 μΐ), a to první odběr těsně před podáním dávky a další po 1, 2, 3 a 4 hodinách po podání dávky (pro zkoušku na antigen) a 14, 28 a 42 dní po podání dávky (pro zkoušku na protilátky). Roztoky pro subkutánní kopntrolu Ml v TRIS (bez SDS) měly koncentraci 167 μg/ml. Roztoky HA-NA pro subkutánní dávku byly připraveny stejným způsobem jen místo TRIS - SDS pufru byl použit fosfátový pufr se solankou.

Tatáž imunizace a stejný odběrový harmonogram byly pak použity pro podávání HA-NA na proteinoidním nosiči s následující úpravou: všechny krysy dostaly zesilující orální dávku HA-NA na proteinoidním nosiči 42 dní po první orální dávce a krevní vzorky byly opět odebrány 14 dní po zesilující dávce.

Stanovení specifických anti-Ml a anti-HA-NA IgG byla prováděna methodou ELISA, popsanou Khanem et al (1982) J.Clin.Microbiol., vol. 16, str. 813 až 820.

Výsledky a diskuse:

Pokusy stanovit antigeny v plasmě byly neúspěšné. Ml antigen nemohl být v krysí plasmě zjištěn ani v jednom vzorku 1 až 4 h po dávce, ani u subkutánní kontroly.

Vzorky plasmy od krys, které dostaly prázdný nosič neobsahovaly žádný prokazatelný titr protilátek, a to ani proti Ml ani proti HÁ-NA antigenům, přičemž měřeno bylo metodou ELISA (tabulka 8). Podle očekávání krysy, kterým bylo podáno 25 μg bud Ml nebo HA-NA antigenů (s FCA) subkutánně vytvořily dosti intenzivně protilátky o titru v rozmezí 54 000 až 330 000 v případě Ml a 176 750 až 909 000 v případě HA.NA (tabulka 8).

Plasmové vzorky od tří krys z pěti, kterým byly podány dávky Ml na proteinoidním nosiči ukázaly průkaznou primární odezvu na antigen Ml. Všechny tři krysy měly titry v rozmezí od 760 do 2150 již 14 dní po podání dávky, ve srovnání s hodnotami pod 30 u všech krys, které dostaly nezapouzdřené Ml. (tabulka 8). Titry ve skupině, která obdržela proteinoidní nosiče, vzrostly na 1150 až 5200 za 42 dní (obr. 24).

Čtyři ze šesti krys, imunizovaných nezapouzdřeným HA-NA vykázaly antiHA-NA IgG odezvu o titru v rozmezí 3 400 až 17 675, zatímco dvě dvě ze šesti krys, kterým byl podán HA-NA na proteinoidním nosiči vykázaly také signifikantní odezvu (obr. 25). Titry vzrostly ve srovnání s kontrolou osmkrát. U několika krys se také projevilo zesílení druhou dávkou HA-NA na proteinoidním nosiči vysokými titry, u většiny se signifikantní zvýšení těchto titrů neprojevilo.

Výsledky ukazují, že jedna dávka Ml na proteinoidních nosičích byla schopna indukovat výraznou IgG odezvu na Ml už dva měsíce po dávce, zatímco tatáž dávka Ml bez nosiče nepůsobí tvorbu žádných protilátek. Podobně jedna dávka HA-NA na proteinoidních nosičích indukuje odezvu u 33 % krys, použitých ke zkoušce. Tato odezva byla až osmkrát větší než u krys, kterým se podalo HA-NA nezapouzdřené.

Tabulka 8

TITRY ΑΝΤΙ - M - PROTEINOVÝCH PROTILÁTEK V SÉRU KRYS, KTERÝM BYL PODÁVÁN M - PROTEINOID VE SROVNÁNÍ S NEOSETŘENOU KONTROLOU

DÁVKOVÁNÍ	KRYSA #	14 DENNÍ TITR	28 DENNÍ TITR	42 DENNÍ TITR
orálně M protein	197	<30	<30	<30
nezapouzdřený	198	<30	<30	<30
lmg/krysa	199	<30	<30	<30
	200	<30	<30	35
	201	<30	<30	5 5
prázdný nosič	203	<30	<30	82
	204	<30	<30	70
	205	<30	<30	60
	206	<30	<30	86
	207	<30	<30	45
M na proteinoidním	209	<30	<30	64
nosiči 1 mg/krysa	210	2,150	820	5,200
celkové	211	860	430	1,150
	212	760	1,850	3,000
	213	<30	<30	62
subkut. kontrola	215	40,000	62,000	330,000
0,025 mg/krysa	217	34	8,000	54,000
ve FCA	218	430	8,000	125,000
	219	270	6,600	78,000

Várky proteinoidů

	Tepl.	Doba	Hodnocení	Várka
e. v. #AA	Složení	Přísada	st. C	(hod)	Kuliček		(mol.)
085	3	GLU ASPW ILEU	....	170	3.0	INS5 MT1	0.0
086	3	GLU ASP2 VAL	—	170	3.0	INS4 ΜΤ0 HEPO		0.0
087	3	GLU ASP LEU		170	3.0	INS5 MT3 HEP5		0.0
088	2	GLU2 ASP2 DQU	SEE	HEHO	0.0			0.0
089	2	GLU2 ASP2 DQU	...	170	3.0	INS5 HTO	0.0
090	3	GLU2 ASP2 VAL		170	3.0	INS3 HTO HEP1		0.0
091	3	GLU ASP LEU	...	170	3.0	INS2 HT1	0.0
092	3	GLU ASP THR	...	170	3.0	INS2 HTO	0.0
093	4	GLU2 ASP2 VAL PRO	...	170	3.0	INS2 HT2	0.0
094	3	GLU ASP CYS-H	...	170	3.0	INS1 HT1	0.0
096	4	PRO SER THR CYS	...	170	3.0			0.0
096	3	GLU ASP VAL2	...	170	3.0	INS3 HTO HEP4		0.0
097	3	GLU ASP VAL		170	3.0	INS2 HT1	0.0
098	3	GLU ASP CYC-H	...	170	3.0	INS4 HT1	0.0
099	2	GLU2 ASP2 DQU	—	170	3.0	INS4		0.0
186-CP	4	PYGLU ASP TYR PHE	PA	176	4.0	INSO HT4 HEP5		0.3
199-CP	4	GLU ASP TYR PHE	H20	100	99.0	HTO INSO HEPO		0.0
202A-CP	4	GLU2.4 ASP2 VAL2 GLY		170	4.0	INS3 HTO	0.6
202B-CP	4	GLU2.4 ASP2 VAL2 GLY	—	170	4.0	HTO INS3		0.6
206A-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	4.5	INS4 HT4 HEP3		0.6
206B-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	4.5			0.6
2060 3K	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	4.5			0.6
207A-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	10.0	INS5 HT4 HEP4		2.0
207E-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	10.0	HTS INS4 HEP4		2.0
211A-CP	4	GLU ASP-VAL LYSFB	SULFA	190	4.3	INS5 HT5 HEP5 W		0.3
211B-CP	4	GLU ASP-VAL LYSFB	SULFA	190	4.5			0.3
212A-CP	3	GLU-TYR PHE	SULFA	185	5.0	INS4 HT3 HEP4		0.3
212B-CP	3	GLU2-TYR PHE	SULFA	185	5.0			0.3
214-CP	3	GLU LYSFB-ARG	SULFA	180	7.0	INSO HTO HEPO		0.0
223-CP	4	LYSFB2 ARG2 LEU PGLU	SULFA	180	8.0	INSO HTO HEP2		0.3
227A-CP	2	VAL2 GLY2	SULF	180	1.5	INSO HTO HEPO		0.1
227B-CP	2	VAL2 GLY2	SULFA	180	1.5	HTO INSO HEPO		0.1
228A-CP	3	VAL2 GLY2 PGLU	SULF	130	2.5	INSO HTO HEPO		0.1
228B-CP	3	VAL2 GLY2 PGLU	SULFA	180	2.5	HTO INSO HEPO		0.1
248 -CP	3	GLU ASP LEU	...	190	4.0	INS3 HTO HEPa		0.0
265A-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL	155	4.0	INS4 HT4 HEP5		1.0
265B	4	GLU ASP-TYR PHE	SULPOLANE	155	4.0			1.0
265C					.0			.0
296A-CP	4	GLU LYSH PHE ASP	SUL-H	180	3.0	INS4 HT2 HEPO		0.6
296B-CP	4	GLU LYSH PHE ASP	SUL-H	180	3.0			0.6
298 -CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	190	1.5	INS1a HT3 HEP4		0.5
301 -CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL	175	8.0	INS4 HT2 HEP3		2.0
302 -CP	4	GLU ASP-TYR PHE	BHePO	190	1.5	INS4 HT2 HEP3		0.3
308 -CP	4	GLU ASP TYR PHE	BHP	170	1.0	INS4 HT4 HEP4		0.3
309 -CP	4	-GLU1.3 ASP1.3 TYR PH31.3 SULPOLANE	190	1.5	INSRaMT3oaHEP4a		0.3
310 -CP	4	GLU ASP TYR PHE	SULPOLANE	190	4.0	INS4 HT2 HEP5		1.0

Poznámka: a = amorfní o = olej * = proměnlivá teplota změna času varu

Várky proteinoidů

e.v.	»AA		Přísada	Teplota st. C	Doba (hodí	Hodnocení Kuliček	Várka fmol.l
033	2	GLU ASP2 EQU	—-	130	1.5		0.0
039	3	ASP2 ARG ILEU	—	170	0.0	HTO	0.0
040	2	GLU2 ASP2 EQU	—	17S	3.0		0.0
041	2	GLU2 ASP2 EQU	PA	170	3.0		0.0
04Z	2	GLU ASP2 EQU	GLYC	170	3.0	HTO	0.0
043	2	GLU2 ASP2 EQU	GLYC	170	3.0	1NS4 HT4	0.0
044	2	GLU2 ASP2 EQU	GLYC	170	3.0	HTO	0.0
046	2	GLU2 ASP2 EQU	PA	170	3.0	HTI	0.0
046	2	GLU2 ASP2 EQU	GLYC	190	6.0	HTO	0.0
047	2	GLU2 ASP2 EQU	PA	190	6.0	HTO	0.0
043	2	GLU2 ASP2 EQU	—	190	6.0	HTO	0.0
049	2	GLU2 ASP2 EQU	—	190	3.0	HTO	0.0
OSO	2	GLU2 ASP2 EQU	—	170	3.0	HTO	0.0
051	2	GLU2 ASP2 EQU	—	170	6.0		0.0
062	2	GLU2 ASP2 EQU	—	170	6.0	HTO	0.0
053	2	GLU2 ASP2 EQU	—	170	4.0	INSO HTO	0.0
054	2	GLU2 ASP2 EQU	—	200	3.5	INS4 HTO	0.0
055	2	GLU2 ASP2 EQU	—	150	3.5	HT-VERY SH	0.0
056	2	GLU2 ASP2 EQU	—	110	4.3	HTO	0.0
057	2	GLU 2 ASP2 EQU	—	150	3.5	HTO	0.0
058	2	GLU 2 ASP2 EQU	—	180	5.0		0.0
059	2	GLU 2 ASP2 EQU	—	150	3.0	INSO HTO	0.0
060	2	GLU2 ASP2 EQU	—	160	3.0	HT3	0.0
061	2	glu2 asp2 εαυ	—	165	3.0	HT . NO AM	0.0
062	2	GLU2 LEU	—	170	3.0	HTO	0.0
063	2	GLU2 ASP2 EQU	—	170	3.0		0.0
064	2	GLU2 LEU	—	170	3.0	IHS2 HTO	0.0
065	3	GLU2 ASP2 LEU	—	170	3.0	INS5 HEPO H	0.0
066	2	GLU2 GLY	—	170	3.0	HTO	0.0
067	2	ASP2 LEU	—	165	3.0		0.0
068	2	ASP2 LEU	—		0.0		0.0
069	2	GLU2 ASP2 OQU	—	170	3.0	INNS5 3, A	0.0
070	3	GLU2 ASP2 LEU	—	170	6.0	HE	0.0
071	3	GLU ASP3 LEU	—	170	2.6		0.0
072	2	GLU ASP2 DQU	—	170	3.0	INSO HTO	0.0
073	3	GLU ASP PRO	—	170	4.0	INSO MTO HEPO	0.3
074	2	GLU2 ASP2 DQU	—	170	3.0	INSO	0.0
076	2	GLU2 ASP2 OQU	—	170	3.0	HT3 NO ΑΜ0	0.0
077	2	GLU2 ASP2 DQU	....	170	4.5	INS5	0.0
078	2	GLU2 ASP2 OQU	—	170	4.0	INS5	0.0
079	4	GLU ASP PRO LYS3	—	170	4.5	LOST BATOH	0.0
OSO	3	GLU2 ASP2 ILEU	—	170	4.0	INS4 HTO HEPO	0.0
081	2	ARG LYS OQU	—	170	3.0		0.0
082	2	GLU ASP2 DQU	—	170	4.0	INS4 HT3	0.0
033	3	GLU ASP2 ILEU	—	170	6.0	INS4 HT1 HEP4	0.0
034	3	GLU2 ASP2 ILEU		170	3.0	INS4 HT3	0.0

Poznámka: a = amorlní o 3 olej = proměnlivá teplota = změna času varu

Várky proteinoidů

	Teplota	Doba	Hodnocení	Várka
Č. v.	#AA	Složení	Přísada	at. C	lhod)	kuliček	(mol.)
311-CP	4	-GLU2 LYSH2 PHE2 ASP	SULFA	190	1.7	IN04o MT3o HEP3	1.7
312-CP	4	-GLU2 LYSH2 PHE2 ASP	SULFA	190	0.7	INS4 MT2 HEP4a	17.9
313-CP	4	-GLU2 LYSH2 PHE2 ASP	SULFA	180	3.0	INS3 MT3 HEP3ao	0.6
314-CP	4	-ASP TYR PHE PGLU	SULFO	190	2.5	INS2a MT4aHEP4a	0.6
315-CP	4	GLU ASP-VAL LYSHB	SULFO	190	4.0	INS4 MT4 HEP3	0.3
316-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFO	180	21.0	INS4 MT3 HEPa	0.3
317-CP	4	GLN-ASP TYR PHE	SULFA	175	4.0	INS5 MT5 HEP5	0.3
318-CP	5	GLU2 ASP2 TYR2 PHE2 ORN	SULFA	180 +	.0	MT1 INS4 HEP3a	1.0
319-CP	4	-TYR PHE ASP PGLU	SULFA	190	2.5	INS4aHT4 HEP4a	0.3
320-CP	4	-TYR PHE PGLU ASP	SULFO	190	1.5	INS4aHT4 HEP4	0.3
321-CP	5	GLU2 ASP2 TYR2 PHE2 ORN	SULFO	180 +	3.0	INS3aHT2aHEP4a	1.0
322-CP	4	GLU2 LYSH2 PHE2 ASP-	SULFO	192	1.2	INS2 MT2 HEP2	0.6
323-CP	4	GLU ASP TYR PHE-	SULFO	190	.0	A8ORT	16.0
324-CP	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO	190	3.0	INS4 MT4 HEP5a	2.0
325-CP	5	GLU2 ASP2 TYR2 PHE2 ORN	SULFO	180 +	3.0	INS5a MT2a HEP	1.0
326-CP	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO	190	6.5	INS3a HTOa HEP3	16.0
327-CP	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO	190	4.0	lNS4a HT5a HEP3	17.0
328-CP	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO	190	3.0	INS5a MT3aHEP3a	17.0
328-7a	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO		.0	INS3a HTOa HEP4	.0
329-CP	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO	175	6.5	INS5a HT3a HEP5	1.0
33O-CP	2	ASP PHE	SULFO	180	3.0	INSOa HT1a HEPO	0.5
331-CP	2	ASP2 PHE	SULFO	180	3.0	INSOa HTOa HEPO	0.5
332-332	2	ASP3 PHE	SULFO	180	3.0	INS3aHT1aHEPOc	0.5
333-7A	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO	190	5.0	INS2aHT4a HEP5a	17.0
334-7OV	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO	190	5.0	INS4aHT5a HEP4a	17.0
335-CP	2	-ASP PHE2	SULFO	180	3.0	INS1aHT2aHEP1a	0.5
336-11	5	-GLU2 ASP2 TYR2 PHE2 ORN	SULFO	180	.0	INS3a HT3a HEP4	2.0
337-337	2	-ASP2 TYR	SULFO	180	6.5	INS2aHT0cHEP0c	0.5
338-CP	2	-ASP TYR	SULFO	180	3.0	INSO HTO HEPO	1.0
339-CP	2	-ASP3 TYR	SULFO	180	3.0	INSOa HTO HEPO	0.5
340	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO		.0		1.5
341	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO		.0		17.0
342 342	2	-ASP TYR2	SULFO		.0	INSOHTOHEPO	0.5
342-CP	2	•ASP TYR2	SULFO		.0	INSOa HT2 HEPO	0.5
343	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO		.0		17.0
344	4	-GLU ASP TYR PHE	SULFO		.0		2.0
348-CP	2	-ASP2 PHE	SULFO		.0	INSOa HTO HEPO	.0
346-CP	4	-GLN ASP TYR PHE	SULFO		.0	INSOaHT1aHEP2a	.0
347	4	-GLU2 ASP2 TYR5 PHE5	SULFO		.0		.0
348	2	-ASP2 PHE	SULFO		.0		.0
349	2	-PHE ASP2	SULFO		.0		.0
350	2	-ASP2 PHE	SULFO		.0		.0
351 351	3	-GLU2 TYR PHE	SULFO		.0	INS3aHT2aHEP3a	.0
352	5	-GLU2 ASP2 TYR2 PHE2 ORN	SULFO		.0		.0
353	5	-GLU2 ASP2 TYR2 PHE2 ORN	SULFO		.0		.0

Poznámka: a = amorfní o = olej = proměnlivá teplota

4- = změna oasu varu

ΊΟ

Várky protalnoidů

g.v. 296-CP	#AA 1	Složení ASP	Přísada SUL-H	Teplota «t, C 180	Doba lhod) 1.5	Hodnocení kuliček INS2aHT2aHEP3oa	Várka Imol.) 0.3
297-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	190	1.5	INS2a HT4a HEP3	0.5
299-CP	4	GLU LYS PHE ASP	SUL-H	190	1.7	INS5 HT4 HEP2	0.6
3OO-CP	5	GLU ORN ASP LYS PHE		180	3.0	INS3 HT3 HEP3	0.3
303-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	175	8.0	INS4 HT2 HEP3a	2.0
304-CP	5	GLU ASP-TYR PHE ORNO.5	SUL-H	180	3.0	INS4 HT2 HEP3	2.0
305	4	-PGLU ASP.5TYR PHE	SUL		0.0	INS3 HT2 HEP3	0.3
306-CP	4	-GLU ASP.5TYR PHE	SUL		0.0	INS3aHT2aHEP2a	0.3
307-CP	4	GLN ASP TYR PHE	SULFO	175	4.0	INS4o HT4 HEP4o	0.3
					.0		.0
000					.0		.0
001	2	GLU2 ASP2 EQU		170	4.0		0.0
002	2	GLU ASP EQU	—	149	0.0		0.0
003	2	GLU ASP EQU		163	0.0		0.0
004		0		204	0.0		0.0
005	2	GLU ASP EQU		176	3.0		0.0
006	2	GLU ASP EQU	—	154	3.0		0.0
007	2	GLU ASP EQU		196	2.0		0.0
008	2	GLU ASP EQU		154	3.6		0.0
009	2	GLU2 ASP2 EQU		192	3.0		0.0
010	2	GLU2 ASP2 EQU		163	4.0		0.0
011	2	GLU2 ASP2 EQU		160	5.0		0.0
012	2	GLU2 ASP2 EQU		154	4.0		0.0
013	2	GLU2 ASP2 EQU		176	4.0		0.0
014	2	GLU2 ASP2 EQU		174	3.5		0.0
016	2	GLU2 ASP2 EQU	—	170	3.5		0.0
017	2	GLU2 ASP2 EQU		170	3.5		0.0
018	2	GLU2 ASP2 EQU		170	3.5		0.0
019	2	GLU ASP EQU		180	3.5		0.0
020	2	GLU2 ASP2 EQU		180	4.5	HT	0.0
021	2	GLU2 ASP2 EQU		180	3.5		0.0
022	2	GLU2 ASP2 EQU		180	3.5		0.0
023	2	GLU2 ASP2 EQU	—	180	3.3		0.0
024	2	GLU2 ASP2 EQU	.....	175	3.3		0.0
025	2	GLU2 ASP2 EQU		175	3.0		0.0
026	3	GLU2 ASP2 ASPG		175	3.0		0.0
027	3	GLU2 ASP2 SER	.....	195	5.0		0.0
028	2	GLU2 ASP2 EQU		175	3.5		0.0
029	2	GLU2 ASP2 EQU		175	3.5		0.0
031	2	GLU2 ASP2 EQU		170	3.3		0.0
032	2	GLU2 ASP2 EQU		170	3.5	HTO	0.0
033	2	GLU2 ASP2 EQU		175	3.0	HTO	0.0
034	2	GLU2 ASP2 EQU		180	0.0	HTO	0.0
035	2	GLU2 ASP2 EQU			0.0	HTO	0.0
036	2	GLU2 ASP2 DQU		175	3.6	HTO	0.0
037	2	GLU2 ASP2 EQU		175	21.0		0.0

Poznámka: a = amorfní o = olej = proměnlivá teplota + = zněna času varu

Várky proteinoidu

δ.v.	#AA	Složení	Přísada	Teplota st. C	Doba (hod)	Hodnocení kuliček		Várka (mol.)
249 <3K	4	GLU2LEU2LYSH2PGLU		180	3.0	INSO HTO HEPO		0.1
250 <3K	5	PGLUARGH2LYS2LEUASP2		180	3.0	INSO HTO HEPO		0.1
251 <3K	4	GLU2ASP2TYR5-PHES	SUL-H	180	3.0	INS4 HT4 HEP2		0.1
252-CP	4	(GLU + ASPIVAL LYS	170	3.0	INS1	HT2 HEP1	0.0
253-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	180	4.5	INS1 HTO HEPO		2.0
253	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	180	10.0	INS4 HT4 HEP4		1.0
254-CP	5	GLU2ASP2-TYR2PHE20RN	SUL-H	180	8.5	INS4 HT4 HEP4		0.1
255-CP	5	GLU ASPTYR-PHE ORN	SUL-H	180	3.0	INS2 HT4 HEP4		0.3
256-CP	4	GLU2LYSH2PHE2PGLU	—	180	3.0	INSO HTO HEPO		0.1
257-CP	4	GLU ASP ARGH ORNH		180	3.0	INSO HTO HEPO		0.0
258 <3K	3	GLU ASP ARGH	—	180	3.0	INS1 HT1 HEPO		0.0
259 3K	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	180	3.0	INS3 HT3 HEP3		0.3
260 3K	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	180	2.5	INS2 HT3 HEP2		0.3
261-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	180	3.0	INSO HTO HEPO		0.3
252-CP	4	GLU ORNH ASP LYSFB	SUL-H	180	3.5	INSO HT1 HEP4		0.3
263-CP	4	GLU LYSH2 PHE2 ASP		190	3.0	INS3 HT3 HEPO		0.3
254-CP	4	GLU LYSH2 PHE2 ASP		180	3.2	INS5 HT3 HEP4		0.4
266-CP	4	GLU2 LYSH2 PHE2 ASP		180	3.0	INS4 HT4 HEP4		0.3
267-CP	3	GLU LYSFB ASP LYSFB	SUL-H	180 +	3.0	INSa HTo HEPo		0.3
268	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	190	2.5	INSO HTO HEPO		0.3
269-CP	4	GLU ORNH ASP-LYSFB	SUL-H	180	4.0	INSc HTc HEPc		0.3
270-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SUL-H	180	1.5	INS5 HT4 HEPO		1.5
271	3	GLU LYSHFB-PHE	SUL-H	190	1.5	INS3aHT4oHEP4o		0.0
272-CP	4	GLU2 LEU2 LYSH2 TYR1		180	3.0	INSc HT1 HEP4		0.1
273-CP	4	GLU2 LEU2 LYSH2 PHE1		180	3.0	INS2aHT2 HEP2,a		0.1
274-CP	4	GLU LEU ARG TYR		180	3.0	INSc HTc HEPc		0.1
275-CP	4	GLU ARGH-TYR	SUL	190	1.5	INSc HTc HEPc		0.3
276-CP	4	GLU2 LEU2 ARQ2 PHE		180	3.0	INS3 HT3 HEP4		0.1
277-CP	3	GLU LYS TYR	SUL-H	190	1.5	INSc HTc HEP4o		0.3
278-CP	3	GLU LYS PHE	SUL-H	190	1.5	INSc HTc HEP4		0.3
279-CP	3	GLU LYS ALA		190	1.5	INSc HTc HEPc		0.3
280-CP	4	GLUGLUASPGLUTYRGLPHE	SUL-H	190	1.5	INS4 HT3 HEP4		0.4
281-CP	4	GLU1 ASP1 TYR2.5-PHE2.5	SUL-H	180	3.0	INS4 HTa HEP2a		1.0
282-CP	3	GLU2 LYS5 HEP2		190	1.5	INSO HTO HEP2		0.3
283-CP	4	GLU2 LYS5 PHE5 TYR2		190	1.5	INSO HTO HEP3		0.1
284	5	GLU2ASP2-TYR2PHE20RN	SUL-H	180	3.0	INSRaHT4oHEP2a		1.0
285-CP	2	GLU(2X) ASPI2X)		180	3.0	INSc HTc HEPc		0.3
285-CP	2	GLU ASP12X)		180	2.5	INSc HTc HEPc		0.3
287-CP	2	GLU PHE	180	3.5	INS3 HT2 HEP3	0.3
288-CP	3	GLU ORN PHE		180	3.0	INSc HTc HEPc		0.3
289 290-CP	2 3	GLU ARG GLU ARG PHE	180	1.0 180	3.0	INS2 HT2 HEP2	0.3	0.3
291-CP	3	GLU LYS PHE	SUL-H	190	1.5	INS4 HT3o HEP4o		0.3
292-CP	5	GLU ASP ARG ORN PHE	SUL-H	180	3.0	INSO HTO HEPO		0.3
293-CP	4	GLU ASP ARG ORN PHE	SUL-H	180	3,0	INS3 HT3 HEP3		0.3
294-CP	4	GLU2 LYSH2 PHE2 ASP		180	3.0	INS3 HT4 HEP4		0.3

Poznámka: a = amorfní o = olej = proměnlivá teplota + = změna času varu

Várky proteinoidů

Č.v.	#AA	Složeni	Přísada	Teplota st. C	Doba (hod)	Hodnocení kuliček	Várka (mol.)
192-CP	3	GLU LYSFB ASP		195	3.0	INS4 HTO	0.3
193 >6K	4	(GLU-ASP) TYR PHE	PA	175	4.0	HTO HEPO	0.3
194-CP	3	GLU LYSFB ASP	TRIGL	195	3.0	INS1 HTO HEP2	0.3
195-CP	3	GLU ASP VAL2		170	3.2	INS2 HT1 HEPO	0.3
196-CP	4	GLU ASP TYR PHE	PA	175	4.2	INS2 HT5 HEP4	1.0
197-CP	4	GLU ASP TYR PHE	SUL	175	2.7	INS2 HTE HEP5	0.3
198-CP	3	GLU LYSFB ASP		195	3.2	INS3	1.0
200-CP	3	GLU LYSH ASP	PA	185	3.0	INS4 HTO HEPO	0.3
201-CP	3	GLU LYSFB ASP	SULFA	195	3.0	INS4 HTO HEP3	0.3
203-CP	4	GLU ASP VAL LYS	—	170	3.0	INS5 HT5 HEP	0.3
204-CP	3	GLU LYS ASP	—	185	3.0	INS4 HTO HEPO	0.3
206-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	3.7	INS4 HTO	0.8
208	3	GLUH LYSH ASPH	NaHCO&HEOH	80	8.0	INSO HTO HEPO	0.0
209-CP	4	GLU ASP-VAL LYS	SULFA	170	3.2	INS4 HT4 HEP3 W	0.3
210-CP	4	GLU ASP-VAL LYSFB	SULFA	170	3.0	INS4 HT4 HEP3	2.0
213-CP	3	GLU-LYS HIS	SULFA	180	3.0	INSO HTO HEPO	0.3
215-CP	3	GLU ASP GLY2		180	5.5	INS3 HTO HEPO	0.3
216-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	3.0	INS4 HT4 HEP4	2.0
217	3	GLUASPLYSIDIETSTER)	HEOH/ET3N	75	29.0		0.0
218-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	175	.0	INSO HTO HEPO A	0.3
219-CP	3	QLU-LYS-LEU	SUL/P0C13	180 +	8.5	INS2 HTO HEP2	0.3
220-CP	4	GLU ASP-TYR PHE	SULFA	180	20.5	INS4 HT4 HEP5	0.3
221-CP	3	-ASP2 TYR PHE	SULFA	180	22.0	INS2 HTO HEPO	0.3
222-CP	3	-LYSFB2 ARG2 LEU	SULFA	180	4.0	INSO HTO HEP2	0.3
224-CP	4	GLU ASP-TYR PHE-	SU/PA	180	6.0	INS3 HTO HEPO	0.3
225-CP	3	PRO-SER TYR	SULF	180	3.5	INS2 HTO HEPO	0.3
226 <3K	4	GLU ASP TYR PHE	SULF	180	4.0	INS3 HT4 HEP3	0.3
229 <3K	4	•GLU ASP TYR PHE	SULF	180	5.5	INS3 HTO HEPO	0.3
230-CP	2	GLU TYR		180	4.0	INS4 HTO HEPO	0.3
231-CP	3	GLU LYSFB PHE	SULF	180	3.5	INS2 HTO HEPO	0.3
232-CP	3	GLU LEU ARQ	—	180	4.0	INSO HTO HEPO	0.3
233-CP	3	GLU LEU LYSH	.....	180	4.0	INSO HTO HEPO	0.3
234-CP	4	IGLÚ ASP TYR PHE)	SULF	150	27.0	INS3 HTO HEPO	0.3
23S-CP	4	-IGLÚ ASP) TYR10PHE10	SULF	180	22.0	INSO HTO HEPO	0.0
236-CP	3	GLU TYR LYSHCL		180	2.0	INSO HTO HEPO	0.3
237 <3K	4	GLU2 LEU2 LYSH2 ASP		180	3.0	INSO HTO HEPO	0.1
238 <3K	4	GLU ASP TYRŠ PHE5	SULF	180	3.0	INSO HTO HEPO	0.1
239-CP	3	-GLU ASP LEU	SUL-H	190	1.0	INS3 HTO HEPO	0.0
240-CP	3	-IGLÚ ASP) LEU	SUL-H	170	4.0	INS4 HTO HEPO	0.0
241 <3K	3	-IGLÚ ASP) LEU	SUL-H	190	5.0	INS3 HTO HEPO	0.0
242-CP	3	IGLÚ ASP LEU)	SUL-H	170	2.5	INSO HTO HEPO	0.1
243-CP	5	PGLU2ASPARG2GLY2LEU		180	3.0	INSO HTO HEPO	0.1
244-CP	3	IGLÚ ASP) LEU		190	2.5	INSO HTO HEPO	0.0
245-CP	3	IGLÚ ASP) LEU	—	170	1.0	INS3 HT1 HEPO	0.0
246 <3K	5	GLU2 LYSHW PHE2 ASP		180	6.0	INS4 HT4 HEP4	0.0
247-CP	3	GLU ASP LEU		170	5.0	INSO HTO HEPO	0.0

Poznámka: a = amorfní o s olej proměnlivá teplota = změna čaeu varu

- 73 Várky proteinoidů

Č.v.	#AA	Složení	Přísada	Teplota st. C	Doba (hodí	Hodnocení kuliček	Várka (mol,
146	3	GLU ASP LYSFB	PPA	186	6.0	HTO	0.0
146	3	GLU ASP VAL2	PPA	170	3.6	INS2 HTO	0.0
147	4	GLU ASP PHE ALA		170	3.0	INS4 HT3 HEP4	0.0
148	4	GLU ASP TYR PHE	PA	170	3.0	HTO HEP4	0.0
149	3	GLU ASP PHE2		170	3.0		0.0
150	4	GLU ASP LEU PHE	, PA	170	24.0	HTO HEPO	0.0
151	4	GLU ASP TYR PHE	PA	170	6.0	INS4 HT4 HEP4	0.0
152	4	GLU ASP TYR PHE	PA	170	5.0		0.0
153	3	GLU LYSFB PHE	PA	170	24.0		0.0
154	4	GLU ASP TYR PHE	PA	170	4.0		0.0
156	3	GLU2 TYR PHE	PA	170	4.0	INS4 HT5 HEP3	0.0
156	3	GLU4 LYS2 PHE		170	6.0	INSO HTO HEPc	0.0
157	3	GLU2 TYR LEU	PA	170	5.0	INS2 HT1 HEOP	0.0
158	3	GLU2 PHE LEU	PA	175	5.0	INS4 HTO HEP4	0.0
159	3	GLU3 PHE TYR	PA	175	5.0	INS4 HT4 HEP4	0.0
160	4	GLU6 LYS2 PHE TYR	PA	170	6.0	INSa HTo HEPc	0.0
161	4	GLU4 PHE2 TYR2 CYS	PA	170	4.0	INS4 HT HEP	0.0
162	3	GLU2 TYR PHE	PA	170	6.5	INS3 HTO HEP2	0.0
163	3	GLU2 PHE TYR	PA	170	5.0	INS3 HT2 HEP3	0.0
164	3	GLU2 PHE TYR	PA	170	5.0	INS4 HT4 HEP4	0.0
165	4	GLU2 ASP PHE2 TYR2	PA	170	3.0	INS 3 HTO HEPO	0.0
166	3	GLU LYSFB PGLU	PA	170	7.0		0.0
167	4	GLU ASP TYR PHE	PA	170	6.5		0.0
168	3	GLU ASP LYSFB	PPA	185-t-	72.0	HTO	0.0
169	3	GLU ASP LYSFB	PPA	185	72.0	HTO	0.0
170	3	GLU ASP LYSFB		195	7.0	HTS	0.0
171	3	GLU LSYHCL ASP	H.OIL	180	7.0	HTO	0.0
172	4	GLU ASP TYR PHE	PA	170	6.0	HT1	0.0
173	3	GLU LYS ASP	MINERÁL 0.	185	3.0	ABORT	0.3
174 >6K	3	GLU LYS ASP	GLYCERIN	185	3.0	INS2 HT1 HEP3	0.3
175 >6K	4	GLU ASP TYR PHE	PA	172	3.5		1.0
176 >6K	3	GLU LYS2 LYS		180	3.0	INSO HTO HEPO	0.3
177 >6K	3	GLU ARG ASP		180	3.2	INSO HT2 HEPO	0.3
178 >6K	3	GLU LYS ASP		190	3.2	INSO HTO HEP1	0.1
179 >6K	4	GLU ASP TYR PHE	PA	176	4.0		1.0
180 >6K	4	GLU ASP TYR PHE	PA	175	7.0	See Notes.	1.0
181 >6K	3	GLU LYS ASP		185	3.0	INSO HTO	0.3
182 >6K	4	GLU ASP TYR PHE	PA	175	3.7	HT1 HEP1	0.3
183	4	PGLU ASP TYR PHE	PA	175	4.0	A8ORT-RETRY	0.3
184-CP	4	GLU ASP TYR PHE	PA	175	3.5	HT2 HEP4	0.3
185-CP	4	GLU ASP TYR PHE	PA	176	4.2	INS HT4 HEP4	1.0
187	3	ASP TYR PHE	PA	170	.0	ABORT	0.3
188-CP	3	ASP TYR PHE	PA	150	21.2	INSO HTO HEPO	0.3
189-CP	4	GLU ASP TYR PHE	PA	176	4.0	HT4 HEP5	1.0
190-CP	4	GLU ASP TYR PHE	PA	175	4.0	HTS HEP4	1.0
191-CP	3	ASP2 TYR PHE	PA	150	24.0	HTO HEPO	0.3

Poznámka: a » amorfní o = olej * = proměnlivá teplota + = změna času varu

Várky proteinoidú

g.v.	£AA	Složeni	PKeada	Teplota »t, C	Doba (hod)	Hodnocení kuliček	Várka (mol·!
019	2	GLU2 ASP2 EQU	—	170	2.5		0.0
100	3	GLU ASP VAL2		170	3.0		0.0
101	3	GLU ASP VAL2		170	3.0		0.0
102	3	GLU ASP VAL2	—	170	3.0		0.0
103	4	GLU ASP GLY VAL		170	3.5	INS4	0.0
104	4	GLU ASP VAL LEU		170 ’	3.5	INS4 HT2 HEP5	0.0
10S	3	GLU ASP GLY2		180	4.0	INS4 HT2	0.0
106	4	GLU ASP VAL LEU		170	5.0		0.0
107	4	GLU2 ASP2 GLY VAL2	....	170	3.0	INSS	0.0
108	4	GLU2 ASP2 GLY VAL2		170	4.0	INS4 NO AMORPHO	0.0
109	4	GLU2 ASP2 GLY VAL2		170	4.0	INS4 HT1	0.0
110	4	GLU2 ASP2 GLY2 VAL	—	170	3.5		0.0
111	5	GLU ASP GLY VAL CYS	—	170	3.0		0.0
112	4	GLU ASP GLY PHE	—	170	4.0	INS4 HT3 HEP4	0.0
113	4	GLU ASP VAL2 GLY		170	3.0	INS2 HTO	0.0
114	3	GLU ASP VAL	—	170	3.0	INS4 HTO	0.0
115	3	GLU VAL TYR	—	170	4.0		0.0
116	4	GLU ASP VAL LYS	—	170	4.0		0.0
117	3	GLU VAL TYR	—	170	3.0	INSS	0.0
118	2	GLU TYR		170	3.5	INSS HTO HEPO	0.0
119	2	GLU2 ASP2 EQU		170	3.5	INSS HT1	0.0
120	3	GLU ASP TYR	—	170	4.5	INSO HTO EPO	0.0
121	4	GLU ASP TYR PHE		170	4.0	INSS HT3 HEP4	0.0
122	4	GLU ASP VAL TYR	—	170	3.0	INS3 HTO HEPO	0.0
123	1	GLU		170	4.5	CAN'T DRY	0.0
124	3	GLU TYR VAL		170	3.5	INS4 HT3 HEP3	0.0
125	3	PGLU VAL TYR		170	3.5	'NS3 HT2	0.0
126	4	GLU ASP VAL2 GLY		170	4.0	INS1	0.0
127	4	GLU2 ASPA VAL2 PHE		170	4.0	INS3 HT2 HEP4	0.0
128	2	GLU2 ASP2 EQU		170	3.5	HTO	0.0
129	2	GLU2 ASP2 EQU		VARY	4.0	INS3 HTO	0.0
130	2	GLU2 ASP2 EQU	—	220	3.0	INSS HTO	0.0
131	2	GLU2 LYSFB		185	3.0	INS1 HTO	0.0
132	3	GLU ASP LYSFB		185	3.0	INS3 HT2 HEP2	0.0
133	3	GLU ASP LYSFB	PA	180	6.2	INS5 HT1 HEP2	0.0
134	4	GLU ASP LYS VAL	PA	185	3.0		0.0
135	3	GLU ASP LYSFB	GLYC	185	6.5	INS1 HT1	0.0
136	2	GLU2 ASP2 DQU		155	3.0	HTO	0.0
137	5	GLU2ASP2LEU THY VAL		185	4.0	INSO HTO	0.0
138	4	GLU ASP VAL THY		185	4,5	INS1 HT3	0.0
139	4	GLU ASP VAL TYR	PPA	160 +	72.0	INS2 HT3	0.0
140	3	GLU ASP LYSFB	PPA	120 +	72.0	INSS HT2 HEP4	0.0
141	3	GLU LYSFVYNPEPagaqp		185	6.0		0.0
142	3	GLU ASP LYSFB	PPA	120 +	72.0	INS1 HT1	0.0
143	3	GLU VAL TYR	—	170	3.0	INS2 HT2	0.0
144	4	GLU2 ASP2 GLY VAL2	—	170	3.0	INS1 HT1	0.0
350	5	-(GLU ASP TYR PHEI2 ORN	SULFOLANE	.0		.0

Vysvětlivky k tabulkám:

Hodnoceni kuliček: 0 - Spatná 5 = nejlepil

INT = Insulin

MT s prázdná mikrokulička

HEP = heparin

Sul-M	- auifoian pro lákahká použiti
Sulfa	= Sud a Sul - Sulfolan
PA	= kytelina foeforečná
Equ	= equiancia
GLYC	= glycerin
TRIGL	= triglym
PPA	= kyeatina polyfosforečná
M.Oil	= minerál o. = minerální olej

- 75 IEF Tabulky

Rozdělení proteinoidů, pKa a složení Chemické základní složení pro mikrokuličky ODS

mater. ID č. amp	složení	V c. frakce kuliček	rozsah PH kuliček	Hodnoc. kuliček IEF	Hodn. matrice kuliček	Max UV č. frakce	Max UV pH
202B	Glu2.4 Asp2Val2GLy°	no spher	—	-	INS4 HTO HEP3	-	—
210>1K	Glu Asp Val Lys	14-20	2.3-4.4	2-3	INS4 HT4 HEP3	14-19	4.4-3.0
213 > 1 k	Glu LysFP HisFB	16-19	1.7-2.1	2	INSO HTO HEPO	11-16	7.6-2.1
218<3k	Glu Asp Tyr Phe	18-20	3.2-2.7	2	INSO HTO HEPO	1-7	12.2-9.3
129	Glu Asp Equ	10-18	2.5-4.4	3	INS3 HTO	15-18	2.9-2.5
214>1k	Glu LysFB Arg	no spher	-	--	INSO HTO HEPO	1-4	11.8-9.2
176	Glu2 LysFB2 LysFP	no sphere	--	-	INSO HTO HEPO	5-6	9-8.6
222-cp	Arg2 LysFB2 LysFB	21-47	9.9-11.7	27	INSO HTO HEP2	2-6	8.5-11.5
220 B	Glu2.4 Ap 2 Val2 Gly	8-12	3.3-5	2,1-2	INS4 HTO HEP3	8-12	5-3.3
222-cp	Arg2 LysFB2 Law pGlu	1	10.3	2-3	INSO HTO HEP2	1	10.3
223-cp	Arg 2 LysFB2 Leu pGlu	1-5	9.0-12	2	INSO HTO HEP2	3	10.7
170a	Glu Asp LysFB	16-20	2.3-5.0	2-3	HTS	16-20	5-2.3
2163K	Glu Asp Tyr Phe(sul)	14-20	2.4-3.9	2	INS4 HT4 HEP2	14-17	3.9-2.8
125	pGlu Val Tyr	13-20	2.7-3.6	1-2	INS3 HT2	14-20	3.2-2.7
228-H2)	sul Val2 Gly2 pGlu	no spher	-	-	INSO HTO HEPO	9-13	5-3.4
228-AB	sul Val2 Gly2 pGlu	no spher	-	-	INSO HTO HEPO	16-18	3.8-3.3
177	Glu Asp Arg	14-10	5.2-3.9	2-3	INSO HT2 HEPO	14-19	5.2-3.9
118	Glu Tyr	12-14	5.2-6.0	1-2	INS5 HTO HEPO	12-19	6-4.2
153	Glu LysFB PHe	no sphere	-	--		8-9	9.1-10.2
131	Glu2 Lys	no sphere	-	-	INS1 HTO	14-17	4.3-3.6
162	Glu2 Tyr Phe	16-17	4.1-3.7	2-3	INS3 HTO HEP2	16-17	4.1-3.7
156	Glu4 Lys2 Phe	no spher	-	-	INSO	20	4.5
124	Glu Val Tyr	no spher	-	-	INS4 HT3	13-14	3.7-3.5
210>1K	Glu Asp Lys Val 0	12-20	3.6-3.1	1-2	INS4 HT4 HEP3	12-19	3.6-3.2
156	Glu4 Lys2 Phe	14-17	3.6-3.1	2	INSO	14	3.6
231	Glu Lye Phe sul	no spher	-	-	INS2 HTO HEP3	18	9.1
232	Glu Leu Lys	no spher	-	--	INSO HTO HEP2	6	10.9
233	Glu Leu Arg	no spher	-	-	INSO HTO HEP2	9	10
blank	2% ampholytes	-	-	--	-	--	-
216<3k	Glu Asp sul Tyr Phe	14-20	4.1-2.6	2	INS4 HT4 HEP4	18-20	3-2.6
230>1k	Glu Tyr	13-20	3.9-3	3	INS4 HT4 HEPO	15-20	3.3-3
170a	Glu Asp LysFB	15-20	3.9-2.2	2	HT5	18-19	3.3-2.6
236-cp	Glu Tyr Lys-HC1	19-20	3.0	0-1	INS2 HTO HEPO	19-20	3
216<3k	Glu Asp sul TyrPhe °	14-20	4.1-2.6	2	INS4 HT4 HEP4	20	2.2
216<3k	Glu Asp sul Tyr Phe	16-20	3.9-2.3	1.2	INS4 HT4 HEP4	20	2-3
237-cp	Glu2 Leu2 Lys2 Asp	no spher	-	-	INSO HTO HEPO	9-12	4.6-4
243-cs	pGluArg2Ly82LeuAsp	no spher	-	-	INSO HTO HEPO	15-17	8.5-7
246-cs	Glu2 LysH2 Phe2 Asp	17-20	4.1-2.2	2-3	INS4 HT4 HEP4	17-20	4.1-2.2
250-cs	pGluArg2LysH2LeuAsp2	no spher	--	-	INSO HTO HEPO	11-14	8-6.8
2493K	Glu2 Leu2 LysH2 pGlu	no spher	-	-	INSO HTO HEPO
254-cp	GluAspsulTyrPhe0rn.5	18	5.4-2.5	2	INS3 HT4 HEP4	14-20	3.7-2.1
253-cp	Glu Asp sul Tyr Phe	18-20	3-4	2	INSO HTO HEPO	1,4,19-20	11.5,3-3.5
235<3k	GluAspsulTyr10Phe10	18-20P	2.6-3.2	1-2	INSO HTO HEPO	1-3	11
256-cp	Glu2 LysH2 Phe2 pGlu	13-20	3.7-4.0	1-2	INSO HTO HEPO	2-5, 14-20	2.7-4,7-10
238 <3K	GluAspsulTyr5Phe5	no spher	-	--	INS1 HT3 HEP4	2	11.4
255-CP	Glu Asp TyrsulPheOrn	13-20	5.3-3.1	2	INS1 HT3 HEP4	1-6, 19-20	11-9.3.6-3
251 <3K	Glu2 Asp2sulTyr5Phe5	16-20	5.5-3.3	2	INS4 HT4 HEP4	17-20	5.8-3.8

-76Rozdělení proteinoidů, pKa a složení Chemické základní složení pro mikrokuličky ODS

č. mater.	složení	č.	rozsah	Hodnoc.	Hodn. matrice	Max UV	Max
ID		frakce	pH	kuliček	kuliček	č. frakce	UV
č. amp		kuliček	kuliček	EEF			pH

47	257-CP	Glu Asp ArgH OmH	no spher	--	-	INSO HTO HEPO	19-20	5-3
48	257-CP	Glu Asp ArgH OmH1	no spher	-	-	INSO HTO HEPO	15-17	8-9-8.5
49	258 >3K	Glu Asp ArgH	no spher	_/	-	INSO HTO HEPO	1,17-20	9.8,4-2.5
50	262-CP	Glu Om Asp LysFB	11-18	6.8-3.5	2	INSO HT1 HEP4	15	4.8
51	262-FILT	Glu Om Asp LysFB	4-11	7.7-5.4	1-2	insO ntl hep4	1-2.12-20	9.4.6-1.8
52	267-cp	Glu LysFB Asp LyeBP	no spher	-	--	INSa Hto HEPo	14-20	6.3-3.8
53	268-cp c	Glu Asp sul Tyr Phe	15-20	4.5-2.34	2-3	INS4oHT4oHEP4a	1-10,18-20	12-2.5
54	269-cp	Glu OmH Asp LysFB	17-20	2.91-1.4	1	INSc HTc HEPo	4,7,9	9-7.5
55	273-cp	Glu Leu LysH Phe	17-20	3-1.2	1-2	INS2a MT2 HEP2a	19	2
56	272/273	Glu Leu LysH	no spher	--	-	-	3-9,13-15	9.8.5,8-8
57	276	Glu Leu Arg Phe	12-18	3.57-1.4	1-2.2	INS2 HT2 HEP3	1-7,17-20	9-6,1.5-1
58	274	Glu Leu Arg Tyr	no spher	-	-	INSc HTc HEPc	16-20	4.14-1.4
59	272	Glu Leu LysH Tyr	no spher	--	-	INSc HTc HEPc	1-2	9.4-9.3
60	274A	Glu Leu Arg	no spher	-	-	-	all frac.	--
61	278	Glu Lys Phe sul	16-20	4.8-3.5	1-2	INSc HTc HEP4	all frac.	-
62	284E	Glu Asp Tyr Phe sul Om	14-20	3.8-2.1	1-2	INS4o HT4o HEP3	15-20	3.3-2.1
63	287-CP	Glu Phe	10-20	3.55-2.3	2	INS3 HT2 HEP3	18-20,1-7	2.4-2.3,8
64	284-E	Glu2 Asp2 Tyr2 Phe2 Om	14-20	3.95-1.6	2 w/oll	INS4a HT4a HEP2a	3-8	2.3-7.76
65	288-cp	Glul Omn Phe	no spher	--	-	INSc HTc HEPc	17-20	2.7-1.02
66	293-cp	Glu Asp sul Tyr Phe	1-8	1.9-3.9	1-2	INS1 HT2 HEP1a
67	290-cp	Glu Arg Phe	1-7	1.05-3.8	1-2	INS1 HT1 HEP1	18-20	12.1-12.6
68	292-cp	Glu Asp Arg	no spher	-	-	INS HT HEP	16-20	3.19-1.5
69	300-cp	Glu Om Asp Lys Phe	15-19	4.05-1.5	1-1	INS3 HT3 HEP37	all frac.	--
70	297-cp	GLU ASP SUL TYR PHE	1-7	2.38-4.15	2-3	INS2 HT4 HEP	1-2	2.38-2
71	301 < 3J	GLU ASP SUL TYR PHE	-	-	-	INS4 HT2 HEP3	1-20	-
72	303	GLU ASP SUL TYR PHE1-8	2.83-3.76	2-3		INS4 HT2 HEP3a	1-3.18-20	2.88/1
73	299	GLU2 LYS2 PHE2 ASP	1-7	1.13-3.82	1	INS4a HT4 HEP2a	3-7	1.58-3
74	305	PGLU ASP.5 TYR PHE	1-12	2.12-4.20	2-3	INS3 HT2 HEP3	11-20	5.54-1
75	307-CP	GLN ASP TYR PHE	1-9	2.43-4.48	2-3	INS4o HT4 HEP4a	1-13	2.43-7.0
76	305	PGLU ASP.5 TYR PHE	1-6	2.05-5.56	2-3	INS3 HT2 HEP3	4-7	3.3-7.0
77	124/156	GLU TYR VAL/GLU2 LYS2 PHE	-	-	-	14 H3 H3/10H0H0	1	10.58
78	223-CP	LYS-ARG LEU PGLU				INSO HTO HEP2
79	319-CP	SUL-U TYR PHE ASP PGLU	1-10	2.28-5.3	2-3o	INS4a HT4h EP4a	2-8,19-20	2.3-4.12
80	314-CP	SUL-TYR PHE ASP PGLU	1-11	1.93-5.30	2	lNS2a HT4a HEP4a	18	8.95
81	320-CP	SUL TYR PHE PGLU ASP	1-7	2.12-4.4	2a	INS2a HT4a HEP4A	,6-20	9.3-10.25
81	188>6K	ASP2 TYR PHE	1-6	1.85-5	Oa	INSOHTOHEPO	18-20	12-12.5
82	286-CP	GLU ASP	14-16	2.38-2.02	PARTICLES	INSCHTCHEPC	14-18	2.38
83	288/188	ASP2 TYR PHE/GLU ORN PHE	14-17	4.9-3.1	1.2	INSCHTCHEPC	17-19	3.1-1.65
84	66	GLU2 GLY	-	-	-	HTO	16-19	2.85-2.55
35	O112-2A	GLU ASP TYR PHE	1-10	3.17-13.48	1.0-1	INS5a HT3a HEP3a	14.2	9.20,3.32

o i iu I +

Q < ^P « X Ξ o <0

CM O

LO CL «

<*> β to x to co

CM a

Ý o CO (Q <0 o r- O.

Ó « ’τ «

CO a c

II

Testováni kuliček externí připravených proteinoidů o o y o « X £ (9 <

o co O o + co

CM « <0 o. CM O » CO a •7 , , o

O β i θ' β I CO a co cm o :

(0 J ί

O) . c o ♦5 » _ e « I K Q X o

e l ! CO

CO cm : :

a co

CM <9 !

CO 9 co

CM 9 , x CM 9 S O (O co

CM n

CM

CO O. .17 cm « : cm « : ó

0» . c o ♦3 (O _ <0 « x a Q a.

© . c o w ω a « X OC Q x © . © ©

CO CO CO '3 w _ 3 ii ’C ω βοχβοχββχ XQa.XQa.XO ο.

© . c o w (A a ® x X Q a

				Z X 0	z X o
tu	LU	tu	UI	tu	LU	IXI	Uf
X	X	X	X	X	X	X	X
X	X	X	X	X	X	X	X
X	X	X	X	X	X	X	X
>	>	>	>	>	>	>	>
H	H	H	H	l··	H	H	H
X	X	X	X	X	X	X	X
X	x	co	co	co	co	co	co
<	<	<	<	<	<	<	<
3	3	3	3	3	3	□	3
u	u	u	u	-J	.J
a	□	O	O	O	O	o	□

O <

x co

CM

LL

T“

O o

CL

X

LU

O	l>	X		¢3	10
<	<	<		<	<
co	CO	<0	r*	X	X
»“	r-		<		r*
X	X	X	co	X	X
T~	CM	co		10	10
CM	CM	CM	CM	CM	CM
u.	LL	u.	u.	U.	u.
r“	r“		Γ“	t“	r“
O	O	Τ-	r	O	O
o	0	Ο	0	O	0
X	X	X	X	X	X
X	X	X	X	X	X
tu	IU	tu	LU	LU	tu
r·	r*	T“	Γ	t~	r
9)	X	X	X	X	X

91EHIPOO1F26B1SA2A GLU ASP TYR PHE - Rating 2-3 2-3 3 3-4 2 2-3 3-4 <

o x 5 LU ^U x

IO .

Mel Ί· tn a

OJ » i

Mel Mel tn í o ! «i a í t e

Testováni kuliček externě připravených proteinoidů <

< X 10 * <

<

* tn *t e I 10 í ! 10

O i 10 tn e <*) a «ta! Na

Na! N

0>

e tn e in e I

M (M e ΐ «t e I t e I co a

a rt fó a , >9 , lO o { !

O) a

«

OJ

O) a

e oj a

co oj . c o w (0 a a X O

X

o.

.c

Ό a

X o

(0 a

O oj c

o a

a

O

OJ .

C 0 M3 a a ® X X O o.

Ό a

X υ

a a

O

X

Q.

.C o

(0 a

Q .

c O ‘«3 (0 a a X O .C 'w a

X o

a a

O

X

o.

LU	IU	Ul	tu	LU	LU	Ul	LU
X	X	X	z	X	X	X	X
a.	X	X	0.	X	X	X	X
X	X	X	ce	X	X	X	X
>	>	>	>	>	>	>	>
j-	H	H	Ι-	H	»-	H	H
Δ.	X	X	α.	X	X	X	X
<Λ	co	co	M	co	co	co	co
<	<	<	<	<	<	<	<
3	3	3	Z	3	3	3	3
-j	-J	-J		-J	-J
O	□	<5	(9	O	O	0	O

N	N	σ)		Π	C0
O	O	Ο	ο	ο	ο
X	a	X	X	X	X
«t
	Τ-	Τ-	Τ-	Τ-	Τ-
0	Ο	Ο	Ο	Ο	Ο
X	X	X	X	X	X
r-	Τ-		Τ-	Τ-	Τ-
0	Ο	0	Ο	Ο	Ο
0	0	0	Ο	0	Ο
X	X	X	X	X	X
<	<	<	<	<	<
h-	Η	Η	Η	Η	h-
Q	O	Ο	Ο	υ	ο
	τ-	Γ-		Τ	τ—
X	9	X	X	X	X

«t

O a

«t

O o

X

O o

Q, <

o r·

X

O o

(X í

a

T“

X

91CTAPOO1FO14BO4 GLU ASP TYR PHE - Rating 3 3-4 5 4-5 o

<0 β co

CN <9 o

CO 0

LA

O

CO β «o

LA β

co

Testováni kuliček externě připravených proteinoidů o

u

Lj

C9

X

O

O (0

V O co β co cn co « o

Ί* 0

CO to t

CO

CN β

CO

CN (0 α (9 o + <

<

LA <

u

LA

O

CO to CN <0 <0 co 0 <o í °w co 0 co ™

O) CN <0 <0 _ ' O

CN O

CN <9

CO

CN

CO

CN <0 co

CN <0

W . c o ® X tt Q o.

		o>		o		9
O .		,s		£		c .		O>
£ O		0 ®		’£ O		'£ O		c
*£ ω 0 »	X	s. S	X	0 (0 X ®	X	α » X ·	X	*£ 0
X o	X	CN Q	X	O	X	Q	X	X
		IA		LA		O
{		CO				d		s

® ^x O x o . c o w ΙΛ _ 0 ® X X Q X o> .

£ O '£ 0 _, 0 ® X X Q X

UJ

X

Os

X >

H

X co <

□

O

UJ

Z

X

X >

H

X co <

Ώ

O

X	X	X	X
co	co	co	<0
<	<	<	<
CN	CN	CN	CN
UJ	UJ	UJ	UJ
Z	X	Z	Z
X	X	X	X
CN	CN	CN	CN
X	Z	Z	Z
co	CO	<0	co
>	>	>	>
_l	-J	-J	-i
CN	CN	CN	CN
□	□	3	3
_J	_J	-J	_J
O	O	O	O

P*

O <

co r· ca o

CN

U.

T”

O o

x

X

UJ (0 co <

r03

LA

CN

X

O

O

X r“

X

UJ

O oo

CN r~

O x

r·

O o

X <

H

O

O co o

o

LA

O o

X

O

O

X

X <

o

Φ o

X co o

o

X

O tt o

o

X

91CTAPOOQFO11BO1 GLU ASP TYR PHE ORN - Rating

O á O ω z £ o

ΙΑ β v ® <*) α

ΙΛ co «

d>

o

Testováni kuliček externě připravených proteinoidú

O

O ϋ Q ω z z □

O O + <

<

U>

<

o

ΙΛ

CO z

a.

Ifl O

4 in β

ia o ia 4 β í 4 » * ! 4 I IA i

ΙΛ

LA

Q

O

IA «

1A

CO <Ň O

CO cs

O

C α

£

0) □

u <0

Q

Z

a.

r* j

β £

O

O <0 «

O z

a.

o .£ o

o <0 «

O ©

.£ «

£

O «

«

O

Z

a.

LU	LU	LU	LU
Z	Z	Z	Z
£	CL	a.	£
£	£	£	£
>	>	>	>
ί-	H	H	H
α.	£	£	£
<Λ	w	W
<	<	<	<
Z	z	Z	Z
U	«J		.J
O	o	O	α

	Τ-	Τ-	r~
0	Ο	Ο	O
00	CO	GQ	tt
co	θ’	xf	*r
r-	Τ-	Τ-	Τ-
O	Ο	Ο	Ο
LU	LU	u.	£
Τ-	Τ-	r-
Ο	Ο	o	O
0	O	o	0
£	£	£	£
<	<	<	<
H	H	H
O	O	O	O
r·	τ-	ί-	τ-
Φ	0)	Φ	Φ

i

i cr

-v

t cn

	o o
tří	o

Claims (31)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Proteinoid obsahující peptidový polymer vybraný ze skupiny, zahrnující:

   (i) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fenylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a gluxamin.

   (ii) pepxidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fenylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin a z alespoň jednoho třetího monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující lysin, arginin a ornithin, přičemž proteinoid musí tvořit mikrokuličky a/nebo mikrokapsle a musí být rozpustný ve zvoleném rozmezí pH.
2. 2 Proteinoid podle nároku 1, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 250 do asi 2 400.
3. 3. Proteinoid podle nároku 2, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 250 do asi 400.
4. 4. Proteinoid podle nároku 1, který obsahuje asi 2 až 20 aminokyselinových zbytků.
5. 5. Proteinoid podle nároku 4, který má 2 až 8 aminokyselinových zbytků.
6. 6. Proteinoid podle nároku 1, který je v kyselém prostředí rozpustný a jako druhý monomer obsahuje skupinu, vybranou ze zbytků kyseliny glutamové, pyroglutamové, aspartové a glutaminu a jako třetí monomer skupinu, vybranou ze skupiny, zahrnující lysin, arginin a ornithin.
7. 7. proteinoid podle nároku 7, který je rozpustný v zásaditém prostředí a jako druhý monomer obsahuje zbytek, vybraný ze skupiny zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin.
8. 8. Proteinoidní nosič, vyznačující se tím, že obsahuje proteinoid, který obsahuje (i) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fenylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin.

   (ii) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fenylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin a z alespoň jednoho třetího monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující lysin, arginin a ornithin, přičemž proteinoid musí tvořit mikrokuličky a/nebo mikrokapsle a musí být rozpustný ve zvoleném rozmezí pH.
9. 9. Proteinoidní nosič podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje proteinoidní mikrokuličky.
10. 10. Proteinoidní nosič podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje proteinoidní mikrokapsle.
11. 11. Proteinoidní nosič podle nároku 8, vyznačující se tím, že je rozpustný v kyselém prostředí a jako druhý monomer obsahuje zbytek, vybraný ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin a jako třetí monomer obsahuje zbytek, vybraný ze skupiny zahrnující lysin, arginin a ornithin.
12. 12. Proteinoidní nosič podle nároku 8, vyznačující se tím, že je rozpustný v zásaditém prostředí a jako druhý monomer obsahuje zbytek, vybraný ze skupiny zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin.
13. 13. Proteinoidní nosič podle nároku 8, vyznačující se tím, že jeho částice mají průměr rovný nebo menší než 10 pm.
14. 14. Proteinoidní nosič podle nároku 8, vyznačující se tím, že dále obsahuje zapouzdřenou látku.
15. 15. Proteinoidní nosič podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedenou zapouzdřenou látkou je vonná přísada, kosmetická látka, barvivo nebo ve vodě rozpustný vitamin.
16. 16. Proteinoidní nosič podle nároku 14, vyznačující se tím, že zapouzdřenou látkou je biologicky aktivní složka.
17. 17. Proteinoidní nosič podle nároku 16, vyznačující se tím, že biologicky aktivní přísadou je alespoň jedna látka ze skupiny, zahrnující antigen, monoklonální protilátku, kalcitonin, erythropoietin, alfa interferon, heparin, insulin, růstový hormon, atriální přírodní faktor, faktor IX a interleukin-II.
18. 18. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje biologicky aktivní složku zapouzdřenou v proteinoidní mikrokuličce nebo mikrokapsli z polymeru, obsahujícího (i) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fenylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin.

    (ii) peptidické polymery, vyrobené z alespoň jednoho prvního monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující tyrosin a fenylalanin a z alespoň jednoho druhého monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin a z alespoň jednoho třetího monomeru, vybraného ze skupiny, zahrnující lysin, arginin a ornithin, přičemž proteinoid musí tvořit mikrokuličky a/nebo mikrokapsle a musí být rozpustný ve zvoleném rozmezí pH.
19. 19. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že druhý monomer je zvolený ze skupiny, zahrnující lysin, arginin a ornithin.
20. 20. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že proteinoid je rozpustný v zásaditém prostředí a jako druhý monomer obsahuje zbytek, vybraný ze skupiny zahrnující kyselinu glutamovou, pyroglutamovou, aspartovou a glutamin.
21. 21. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že účinná složka je ze skupiny, zahrnující antigen, monoklonální protilátku, kalcitonin, erythropoietin, alfa interferon, heparin, insulin, růstový hormon, atriálni přírodní faktor, faktor IX a interleukin-II.
22. 22. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje orálně podávatelnou formu kalcitoninu.
23. 23. Farmaceutický přípravek podle nároku 22, vyznačující se tím, že dále obsahuje proteinoid ve formě mikrokuliček a/nebo mikrokapslí.
24. 24. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku ve formě vhodné pro orální podávání.
25. 25. Farmaceutický přípravek podle nároku 24, vyznačující se tím, že dále obsahuje proteinoid ve formě mikrokuliček nebo mikrokapslí.
26. 26. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje erythropoietin ve formě, vhodné pro orální podávání.
27. 27. Farmaceutický přípravek podle nároku 26, vyznačující se tím, že dále obsahuje proteinoid ve formě mikrokuliček nebo mikrokapslí.
28. 28. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje orálně podávatelný alfa interferon.
29. 29. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že dále obsahuje proteinoid ve formě mikrokuliček nebo mikrokapslí.
30. 30. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje v orálně podávatelné formě Faktor IX.
31. 31. Farmaceutický přípravek podle nároku 30, vyznačující se tím, že dále obsahuje proteinoid va formě mikrokuliček nebo mikrokapslí.