CZ299968B6 - Zpusob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografií a použití tohoto zpusobu - Google Patents

Zpusob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografií a použití tohoto zpusobu Download PDF

Info

Publication number
CZ299968B6
CZ299968B6 CZ20002134A CZ20002134A CZ299968B6 CZ 299968 B6 CZ299968 B6 CZ 299968B6 CZ 20002134 A CZ20002134 A CZ 20002134A CZ 20002134 A CZ20002134 A CZ 20002134A CZ 299968 B6 CZ299968 B6 CZ 299968B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dho
dihydroorotic acid
serum
chromatography
cells
Prior art date
Application number
CZ20002134A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20002134A3 (cs
Inventor
Milbert@Ulrike
Bartlett@Robert
Ruuth@Eric
Fudali@Claude
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland Gmbh filed Critical Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Publication of CZ20002134A3 publication Critical patent/CZ20002134A3/cs
Publication of CZ299968B6 publication Critical patent/CZ299968B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

Pri zpusobu získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografie zahrnuje a) prípravu chromatografické kolony s náplní anexového materiálu odolného vuci tlaku, b) nanesení vzorku s obsahem kyseliny L-dihydroorotové na kolonu, c) provedení chromatografiea d) eluci kyseliny L-dihydroorotové elucním cinidlem tvoreným smesí báze a vody, pricemž se tento proces provádí za tlaku 1,1 až 40 MPa. Použití tohoto zpusobu je pro provedení diagnostického testu,pro stanovení inhibitoru dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové a pro stanovení kyseliny dihydroorotové pri monitorování aktivity inhibitoru uvedené dehydrogenázy.

Description

Způsob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografií a použití tohoto způsobu
Oblast techniky
Vynález se tyká způsobu získání kyseliny L-dihydroorotové (dále J.-Dl 10“) chromatografií a použití tohoto způsobu, i r i Dosavadní stav techn iky
L-DHO může byt stanovena chromatografií na silikagelu. následnou chemickou derivatizaeí a kolorimetrickým stanovením (Kesner L„ Aronson f. 1.. Silverman M.. Chán P. C„ Clin, Chein, 21/3, 353 (1975)). Podle jiné metody se L Dl 10 převede enzymaticky na kyselinu orotovou působením dehydrogenázy kyseliny L-dihydroorotové (v dalším textu „DUO Díl·'), připravené z krysích jater, a po chemické derivatizaeí se získaný orotát detekuje kolorimetricky (Rogers
I,. L„ Nicolaiscn K„ Lxperientia 28/10. 1259 (1972)), Nevýhodou těchto metod jc, že při nich interferují jiné látky, přítomné ve složitých fyziologických roztocích. Navíc jsou uvedené metody velmi zdlouhavé, protože příprava vzorků je pracná, a nehodí sc proto pro rutinní analýzu při velkých klinických studiích.
Podstat a vyná 1 ezu
Předmětem vynálezu je způsob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografií. vyznačený tím, že chromatografie zahrnuje
a) přípravu chromatografické kolony s náplní anexového materiálu odolného vůči tlaku,
b) nanesení vzorku s obsahem kyseliny L-dihydroorotové na kolonu, .ui c) provedení chromatografie a
d) elucí kyseliny L-dihydroorotové elučnírn činidlem tvořeným směsí báze a vody, přičemž se tento proces provádí za tlaku 1.1 až 40 MPa.
Výhodně se jako báze použije hydroxid sodný. Výhodně se jako anexový materiál odolný vůči tlaku použije divinylbcnzen/elhylvinylbenzcnový polymer nebo polyvinylbenzylamoniový polymer zesítěný divinylbenzenem nebo jejích směsi, které jsou modifikovány alkanolkvartémim amoniem. Výhodně se proces provádí za tlaku 4.1 až 5,5 MPa. Výhodně se eluce směsí báze a vody provádí za použití časového gradientu koncentrace báze, který' má výhodně lineární průběh. Výhodně se kyselina L-dihydroorotová detekuje vodivostním detektorem.
Předmětem vynálezu je rovněž použití uvedeného způsobu pro provedení diagnostického testu.
Předmětem vynálezu je rovněž použití uvedeného způsobu pro stanovení inhibitorů dehydrogená45 zy kyseliny dihydroorotové. kterými výhodně jsou N^4-( trifluormethyl- fenyl) 5-methylizoxazol-4-karboxamid. Brequinar, N-(4 -trifluonnethylfenyl)-2-kyan-3-hydroxyhepl-2-en -6inkarboxamid, (4-kyanfenyl)amid kyseliny 2-kyan-3-cyklopropyI-3 -hydroxyakrylové nebo N-( 4-trifluormethy Ifeny l)-2-kyan-3-hydroxykrotonamid,
Předmětem vynálezu je rovněž použití uvedeného způsobu pro stanovení kyseliny dihvdroorotovč při monitorování aktivity inhibitorů dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové.
Pojem tlaku odolný anexový materiál znamená například materiál jako je makroporézní (2000 Λ) divinylbenzcn/ethylvinylbenzcnový polymer nebo mikroporézní polyvinylbenzylamoniový pólyCZ 299968 B6 mer. síťovaný divinylbenzenem. nebo jejich směsi, které jsou modifikovány aikanolovými kvartérnírni amoniovými sloučeninami, nebo makroporézní vinylbenzylehlorid/divinylbenzenový polymer, nebo síťovaný polyethyliminopolymer, nebo silika, modifikovaná propyltrímethylamoniem, nebo poly(styren divinylbenzenjtrimethylamonium.
Preferovány jsou zvláště následující produkty:
Ion Pac AS 11, CarboPac PA 1 nebo CarboPae ΜΑ 1 anexovč kolony, dodávané firmou Dionex Corporation, Idstein. Německo, io
GROM-SIL, Strong Anion. nebo GROM-S1L, Weak Anion, dodávané firmou Grom.
P 1000 SAX. lonospher SA nebo Chrompack PA. dodávané firmou Chrompack.
PRP-X100 nebo RC X10. dodávané firmou Halmiton.
Eluční roztok obsahuje směs báze a vody. Vhodné jsou báze alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid horečnatý' nebo hydroxid vápenatý. Koncentrace báze se pohybuje od 1 do přibližně 200 mmol/litr. vztaženo na vodu jako roz2d pouštčdlo, s výhodou od 2 do přibližně 120 mmol/litr, nejvýhodněji 100 mmol/litr.
Teplota při chromatograEickém procesu se pohybuje od přibližně 0 do přibližně 50 ( . s výhodou od přibližně 15 do přibližně 30 °C, nejvýhodnčji od přibližně 19 do přibližně 25 °C. Pracovní tlak během chromatografie se prakticky nemění. Chromatografie sc může provádět při různých tla25 cích, například při tlaku od přibližně 1,1 x 10ťí Pa (1.1 MPa) do přibližně 40 x 106 Pa (40 MPa), zvláště od 4,1 do 5,5 MPa. Průtoková rychlost se pohybuje od přibližně 0,2 do přibližně 3 ml/min. a s výhodou je l ml/min. Aplikace na kolonu, chromatografie a eluce L-DHO se provádí běžně známými technikami. Vhodné eluce jsou eluce s časovým gradientem koncentrace báze, nejlépe s lineárním gradientem. Tento koncentrační gradient se například uplatní tím způso30 bem, že se začne s nízkou koncentrací báze (v limitním případě s nulovou koncentrací) a koncentrace se potom v průběhu elueního pochodu zvyšuje. Tímto způsobem je možno dosáhnout zvláště účinného oddělení L-DHO vc vzorcích, připravených ze séra nebo z buněčných lyzátů. Preferovaný gradient báze se pohybuje od přibližně 1 % NaOH (100 mmol/litr) a 99 % vody (na začátku eluce) až do přibližně 60 % NaOH a 40 % vody (na konci eluce), přičemž výhodný gra35 dient je od přibližně 1 % NaOH a 99 % vody (na začátku eluce) až do přibližně 15 % NaOH a 75 % vody (na konci eluce). Koncentrační gradient báze se mění lineárně od 2,5 minut až do přibližně 14 minut a dále od 14 minut do přibližně 25 minut, přičemž strmost gradientově křivky je v těchto dvou časových úsecích rozdílná,
Zvláště vhodné eluce je možno dosáhnout, když se na začátku použije nízké koncentrace báze (přibližně 1 %) po dobu asi 2,5 minut. Výsledkem je, že se z kolony eiuuje většina interferujícího materiálu z biologické matrice, Analyl se pak rozdělí pomalým zvyšováním koncentrace na přibližně 23 % báze během přibližně 14 minut analýzy. Pak se koncentrace báze zvýší na přibližně 60 % během 4 minut, aby se vymyl silně vázaný materiál. Koncentrace 60 % báze by se neměla použít déle než 6 minut. Pak se kolona reekvilibruje 1% roztokem báze ve vodě. Další analýza se začne po 45 minutách celkové doby analýzy. Voda, použitá k přípravě směsi shází, musí být dcionizovaná a odplyněna. Separační pochod podle předloženého vynálezu se provádí na koloně. Během celé chromatografie na anexu se teplota s výhodou udržuje konstantní a chromatografie se může provádět v širokém rozmezí teplot. Preferované rozmezí teplot je od přibližně -10 °C do přibližně 50 °C. zvláště od přibližně 15 C do přibližně 25 °C.
Eluce L-DHO nastává od 10 do 12 minut po začátku gradientu a doba eluce je od 13 do 25 minut. L-DHO se detekuje vodivostním detektorem, jako je například model CD20 firmy Dionex Cooperation. Aby sc minimalizoval posun základní linie a snížilo vodivostní pozadí.
CZ 299968 R6 může se použil „anion šelf regenerátor suppressor. jako například model ASRS-I. 4 mm. od firmy Dionex Cooperation.
Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný pro analytickou chromatografií, ale může se použít i pro preparativní chromatografií, zvláště pokud se způsob podle vynálezu provádí za použití systému preparativní vysokotlaké kapalinové ehromatografic (HPLC). Termín „preparativní chromatografie znamená purifíkaění proces, jehož účelem je získat čisté produkty a nikoliv je jenom analyzovat. Množství čistých produktů se může pohybovat v širokém rozmezí, například od 1 mg do 1000 mg. s výhodou mezi 50 a 500 mg.
Způsob podle vynálezu se může použít k detekci zmčn íntracelulárních nebo extracelulárních koncentrací L-DHO v důsledku inhibice dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové (DIIO-DH). Enzym DHO- DII je odpovědný za přeměnu kyseliny L-dihydroorolové na kyselinu orotovou během de novo syntézy pyrimidinu. Inhibice DHO-DH vede ke hromadění L DUO. Způsob podle vynálezu se může použít pro přípravu diagnostického testu. Může se též použít pro stanovení aktivity inhibitorů DIIO-DH. Inhibitory DHO-DH jsou například N-4-(triťluormethylfenyl)-5-methylizoxazol-4-karboxamid, Brequinar, N-(4-trifiuormethylfenyl) 2-kyan 3hydroxyhept-2 en-ó-in-karboxamid, (4-kyanfenyl)amid kyseliny 2 kvau-3-cyklopropvl-3 hydroxyakrylové, nebo N-(4-trifluormeth>Ifenyl) 2-kyan 3-hydroxykrotonamid. Způsob podle vynálezu může být rovněž, použit pro určení koncentrací í-DHO v rostlinách, buněčných liniích, i ve zvířatech nebo lidských materiálech.
Způsob podle vynálezu je podrobně popsán v příkladech, uvedených níže. Pokud není uvedeno jinak, procentní údaje se vztahují na hmotnostní procenta.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
1.1. Chemikálie a činidla
Použité chemikálie a činidla jsou produkty následujících firem:
Uhličitanu prostý NaOH a KOH Kyselina E-díhydroorotová (L-DHO) HC1O4
Losin, chloroform
RPM1 1640 medium
Eetální telecí sérum (FCS)
Baker, Holandsko
Sigma, Mnichov
Riedel de Haen, Seelzc
Riedel de Haen, Seelze
Gibeo, Eggenstein
Bio Whitaker, Verviers, Belgie
Deionizované voda se před použitím odplyní heliem.
- Ϊ CZ 299968 Bó
1.2, Chromatografické vybavení
HPLC chromatografíe sc provádí s použitím těchto přístrojů:
Zařízení Model | Výrobce
Směšovací modul SCM 400 Tne rmo 3 epa ra z i or. Products (T$P)
Binární gradientova pumpa P 2000 TS?
Autosampler 3 20 pl smyčkou AS 3000 TSP
Interface SP 4510 TSP f
AD měnič SN 4000 TSP
Vodívc-stni detektor CD 20 Dionex
! „Anion šelf regenerating 1supDressor ASRS-l 4 mm [Dionex !
jStabilizátor detekce í ....... . DS 3-1 Dionex
jřC Ξ1 20, Flex Scan, F 563-T Fscon
Tiskárna Desk Jet 550 c Escon
Software PC 1000 TSP
Pokusy sc provádí se špičkovým materiálem.
1.3, Podmínky HPLC
Chromatografické dělení se provádí na koloně o rozměrech 250 x 4 mm vnitřního průřezu, plněm né anexem lonPac AS 11 (velikost částic 13 μηι: P/N 044076, Dionex), opatřenou předkolonkou o rozměrech 50 x 4 mm vnitrního průřezu, s náplní lonPac AG 11 (velikost částic 13 pm: P/N
044078, Dionex). Navíc se mezi gradientovou pumpu a nástřikový ventil připojí an ionty zachycují kolona A íC—I (P/N 037151, Dionex). Aby se minimalizoval posun nulové linie a snížila se vodivost pozadí, instaluje se ASRS-I supressor, pracující při 300 mA. Rozsah detektoru sc nastalá ví na 10 pS. Autosampler se chladí na 14 °C. ale samotná analýza sc provádí při teplotě místnosti. Mobilní fáze se skládá ze 100 mM NaOH (A) a deionizované a odplyněné vody (B). S těmito dvěma složkami se vytvoří následující gradient:
-4CZ 299968 B6
Čas (min) A (%) B <%)
0 1 99
2,5 1 99
14 23 77
13 60 40
24 60 40
26 1 99
45 1 99
Průtoková rychlost je I ml/min; trvání 45 minut.
1.4. Standardy a vzorky pro kontrolu kvality s
Standardní zásobní roztok se připraví rozpuštěním 1 mg I-DIK) v 1 ml vody. Alikvoty o objemu 400 μΙ se zmrazí na 20 °C. Stabilita těchto roztoků je zaručena nejméně po 4 týdny. Definovaná množství zásobního roztoku se přidají k buněčným lyzátům a k lidskému nebo zvířecímu séru a podrobí se analýze, aby se vyhodnotila linearita mezi zvětšením signálu a koncentrací přidané ío l.-DHO. Přesnost a správnost metody se sleduje pomocí QC („quality eontrol“) vzorků s obsahem E DUO v nízkém, středním a vysokém koncentračním pásmu křivky lineární závislosti signál/koneentrace.
1.5. Příprava vzorků
1.5.1. Buňky
Buňky Jurkat se získají od ATCC (TIB 182) a kultivují se způsobem, popsaným v části 1.5.1.1.
1.5.1,1. Podmínky kultivace tkáňové kultury
Buňky Jurkat se vysejí při 5 x 107ml a nechají se růst 24 hodin v prostředí RPMI 1640 s 10% fetálním telecím sérem (FCS). Buňky se spojí v čerstvém médiu pro buněčnou lýzi. a množství buněk a procento mrtvých buněk se stanoví vitální mikroskopií pomocí cosinu. Po 24 hodinách vzroste počet buněk 1.6-1.8 krát, přičemž počet mrtvých buněk je menší než 7 %. Buňky Jurkat pro stanovení L- DUO mají dělicí poměr 1,6-1,8 během 24 hodin a mrtvých buněk je měně než 7 %.
1.54.2. Příprava buněčných lyzátu
Buňky se suspendují v definovaném objemu média a jejich hustota se stanoví vitální mikroskopií s použitím cosinu. Přibližně 10 x 10'’ buněk se odebere a peletuje sc 5- minutovou centrifugací při 350 x g a supernatant se vylije. Eý/e buněk se provede resuspenzí buněčné pelety v 500 μΙ l,2MHC10i. Tato směs se přenese do 2,0ml Eppendorfových zkiimaveček s bezpečnostním víčkem a protein se srazí vysokorychlostní centrifugací po dobu 2 minut. Supernatant se úplně odstraní, přenese se do skleněných vialek a po přidání 500 μΐ chloroformu se důkladně promíchá vířivým pohybem. Celulámí lipidy se extrahují chloroformem a následnou centrifugací (1502 x g) při 10°C po dobu 10 minut. Přečištěný supernatant se shromáždí ve 2nil Eppendorfových zkumavečkách a do použití se uchovává při teplotě -20 °C. Pro HPLC analýzu sc 100 μΐ super40 natantu neutralizuje 30 μΐ 6 M KOH. Vzorky se třepou přibližně 5 vteřin a nechají se stát v ledu po dobu 30 minut. Pak se centritůgují po dobu 5 minut při 15 000 ot/min, Pro UPEC analýzu se pak použije 20 μΙ čirého supernatantu.
, s CZ 299968 B6
1.5.2. Sérum
Aby se zredukoval obsah proteinů, přidá se 200 μ] séra k filtru Mierocon (10 000 D. model 10. s kód 42407. Amicon) a centrifuguje se po dobu 30 minut při 13 000 otáčkách za minutu (rpm).
Filtrát má objem přibližně 150 μΐ a obsahuje analyzovanou I.-DHO. Z této kapaliny se použije 20 μΐ pro analýzu HPLC.
1.6, Kvantitativní stanovení in
Velikost píku analytu se stanoví integrátorem. Kalibrační křivky sc získají vynesením naměřených velikostí píku (y) proti koncentraci analytu v různých biologických matricích. Vážená lineární regrese (l/y) se použije ke zpětnému výpočtu koncentrace L. Dl 10 ve standardních vzorcích i ve vzorcích „quality control Společný korelační koeficient R se získá pomocí PROČ
GLM na základě analýz kovariančního modelu s použitím vážícího faktoru.
1.7, Stabilita
V tabulce I jsou uvedeny údaje o stabilitě analytu při teplotě -20 °C v buněčných ly/áteeh 2d a vzorcích séra po 2-3 cyklech zmrazení/tání jednoho vzorku. Za uvedených podmínek byla
L-DHO v buňkách Jurkat stabilní přinejmenším 4 týdny. Pozorovaný více než 10% vzrůst koncentrace v některých vzorcích krysího séra a v jednom vzorku lidského sera po několika cyklech zmrazení/tání není možno vysvětlit a ukazuje to. že v takových případech se přesnost obecně snižuje až na 15 % a v nejhorším případě až na 29 %. Z těchto důvodů je možno konstatoval, že v krysím a lidském séru je L -DUO s určitostí stálá pouze přinejmenším I týden.
tabulka 1
3o Stabilita v buněčných Ivzáteeh a v sérech při -20 °C (n = 1)
Doba (dny) Koncentrace 1 20 ug/ml Zbytek {%) 1 Koncentrace 2 100 pg/ml Zbytek (%)
Buňky Jurkat
0 19,34 100 100,05 100
7 19,28 99,7 99,09 99,0
14 n.d. n.d. 115,32 115,3
29 19,98 103,3 99,35 99,3
-6 CZ 299968 B6
Tabulka I (pokračování)
Doba (hodiny) Koncentrace 1 5 pg/ml Zbytek (%) Koncentrace 2 20 pg/ml Zbytek (%)
Krysi sérum {
0 I 4,30 ί í | 100 i j 19,94 1 100 |
7 4,52 105,1 19,62 se,4
14 4,81 111,9 -1 20,93 1 Ί 105,0
21 L_.____ 5, 55 129,1 | 22, 38 112,2
Lidské sérum
0 4,67 100 20,22 100
8 4,81 103,0 20,33 10 0,3
65 4,87 104,3 23,20 1 114,1
Zbytek (%) je procento koncentrace v porovnání s počáteční analýzou, n.d, - neurčeno,
Aby se simulovaly podmínky, vc kterých se nacházejí vzorky, když čekají v aulosampleru na analýzu, určí se jejich stabilita během 18 hodin při 14 °C. K buněčným lyzátům se proto přidá roztok L-DHO a pak $e knim přidá 30 μΐ 6M ΚΟΗ/ΙΟΟμΙ lyzátu před začátkem analýzy. Vzorky sčr se rovněž dopují a pak sc deproteinují. jak je popsáno v odstavci 1.5.2.
io Jakje viděl z tabulky 2, obsah L-DHO v buněčných vzorcích se za těchto podmínek mírně sníží, maximálně az o přibližně 7 %. V sérových vzorcích je za těchto podmínek analyt stálý. Proto se připravuje pouze tolik vzorků pro HPLC, aby maximální doba čekáni v aulosampleru byla kratší než 18 hodin.
-7C7. 299968 B6
Tabulka 2, Stabilita během 18 hodin při 14 °C (η = 1)
Doba (hodiny) Koncentrace 1 20 pg/tnl Zbytek (%) Koncentrace 2 100 pg/ml Zbytek (%)
Buňky Jurkat
0 19,96 100 100,02 100
16 13,60 93, ?. 1 97,43 97,4
Doba (hodiny) |Koncentrace 1 5 pg/ml Zbytek (%) , Koncentrace 2 20 pg/ml ----1 Zbytek (%)
Krysí sérum
0 4,61 100 19,99 1 100 I
13 4,96 107,6 ; 20,53 102,7 j 1
Lidské sérum
0 3,34 100 18,78 :oo j
18 3,37 i Γ-- 100,9 22,09 117,6 |
1.8. Selektivita
Srovnání chromatogramu samotných lyzátů buněk Jurkat s odpovídajícími chromalogramy buněčných lyzátu. ke kterým bylo přidáno 59 pg l-DHO/ml, ukazuje existenci malého píku při 11,983 min, což je tentýž retenční čas, jaký má L O1IO. Je vysoce pravděpodobné, že tento pík je důsledkem přirozeného obsahu analytu v těchto buňkách. Rovněž jc možno pozorovat, že po působení KOH na buněčné lyzáty sc pík L-DHO rozštěpí na dva píky. Působení KOU jc však io nutné, aby se neutralizoval kyselý buněčný lyzát před HPLC analýzou. Za popsaných podmínek dává vyhodnocení velikosti tohoto druhého píku (retenční čas 11.954 min) zlepšené výsledky co se týče linearity a reprodukovatclnosti.
Rovněž v případě krysího a lidského séra byl nalezen pík stejného retenčního času, jako má Κι? DHO. Předpokládá se, že to ukazuje přirozený obsah L 4)110 v organizmu. Analýza přinejmenším 10 různých vzorků obou specií ukazuje, že přirozený obsah L-DHO je pod detekčním limitem I pg/ml.
1.9, Linearita
Linearita stanovení se vyhodnotí pomocí pěti kalibračních křivek pro buněčné vzorky a různé sérové vzorky. Připravené vzorky se analyzují pět dní za sebou. Koncentrace L-DHO je v rozmezí 1.5 150 pg/ml (buněčné lyzáty) a l-30pg/ml (sérové vzorky). Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 3-5. Pro určení regresní přímky byly použity výšky píků. Na této bázi se zpětně
2s vypočetly odpovídající koncentrace různých standardu, jak je uvedeno v tabulkách.
-8CZ 299968 B6
Tabulka 3
Linearita určení L-DHO v lyzáteeh buněk Jurkat
Po přidání L-DHO byly vzorky vystaveny působení 30 μΙ 6 Μ KOH a pak jednou analyzovány jak je popsáno v odd. 1 „3.
> Den .3 '··.·. : Koncentrace (ug/ml) Směrnice •y-iniereept í . .· r . |
',ϊΒς;:; •-5022 ortbo’- W-1 3 0 ' TTÍNigT 0? ÁýO/TV''“ .....
1 1 l 1.78 | 5.54 1 1 9.05 : ί 49.80 1 102.46 i 143.09 1317.54’ | -253.17 i 0.SS95 'i
2 l 1.90) 5.14 i 1 9.54 i 50.77 í 100.22 I 150,20 1324.841 204.73 J 0.9995
3 I 1.86 I 5.24 ! 9.46 i í 51.18 I 1 99.91 ptSO.Q? 1295.48 ; S 302.43 I 0.S996
4 i 1.85 | 5.34 9.33 51.45 | 100.37 t 143.71 1306.08 l 833.63 | 0.55S5
5 í 1.85 ( 5.26 j 9.53 50.98 | i 100.07 l n.d. 1318.67)’ 530.19 i 0.5393 i
Průměri 1.85 i 5.30 9,40 > I 50.80 | I 100.73 I 149.52 1312.52) 322.59 ) )
S.D. I 0.04 | 0.15 0.19 ' | 0 63 | 1.05 ! 0.73 11.69 ( 404.93 j )
c.v. i23 i 2.3 ' 2.0 1.2 1.0 0.5 O.S ! 125.5 i i
LTA í i i !
R=0.9S95.
‘Tabulka 4
Linearita určení L-DHO v krysím séru
Po přidání L-DHO bylo sérum zbaveno proteinů způsobem popsaným v odd. 1.5.2.
' Den 5 iii 5'7; Koncentrace (pg/ml)' PSí Směrnice ý-ínterccpt
:.T:Cuii2Cr
1 t. —. - 1.05 4.48 10.10 22.10 i 28.61 15334 -4719.33 I 0.9565 j
2 1.16 4.59 8.60 21.07 | 30.97 17559 -4630.68 l 0.9SSQ '
3 1.07 4.64 9.81 20.07 I 30.45 17674 I -31/5.63 i 0.S995
4 1.11 4.62 9.54 19.27 I 31.65 18322 | -4256.53 i 0.9981
5 t 1.06 | 4.31 I 9.99 18.39 i 31.40 17738 i -829.00 i 0.9985
Průměr ί 1.09 1 I 4.63 I l 9.61 20,23 30.62 17325.4 0 -OOjJ JJ ί
S.D. 0.05 i 0.12 0.60 i 1.32 1.21 1151.65 ; 1530.62
C.V. (%) 4.2 ř I 2-5 6.3 I 6.5 4.0 6.7 46.1S j j i i
R=0.SG59
-9CZ 299968 B6
Tabulka 5
Linearita určení L-DHO v lidském séru
Po přidání L-DHO bylo sérum zbaveno proteinů způsobem popsaným v odd. 1.5.2,
'Den · j: 7..4 : -/- -- /,. Koncentrace (ρς/mí) ·- 30- Směrnice ‘' ý-intércepí | [o % Λ·:Ί /---5/77 ! '-/o·/'- f
η-:; ú: ÍTlL -aicpz,-· .-20.....
1 ! o.so í 5.17 I | 11.30 | 19M1 [ 29.42 13493 l 2230.30 : 3.SSS0 |
2 I 0.93 ! 4.57 | [ 10.12 ! 21,51 ! 28.63 15653 ! 477.51 1 i 0 2252 j
3 I 0.94 | 4.94 i 11.29 i 19.41 25.55 14326 ; 4 367.60 i 0 9332 ,
ί f 1.01 l 4.77 í 10.32 ! 20.82 l 29.15 15777 i 1771.93 } 0.3992 I
l 1.01 ! 4,31 í 10.10 i 2Q.S6 1 29.23 15216 | 16J2.77 1 0 S9S3
Průměr: G 37 | 4.91 1 10.62 t 20.40 í 29.23 14336.4 ! 1552.09 1 i
S.D. ί 0.05 í 0.16 i 0.61 i 0,95 1 0.35 £67.45 1 824 4? ' ________I
C.V. ! 5.2 3.2 5.S j 4.6 j 1.2 6.5 54.0 i i , Π 1
(%) ! i I i !_______ J
R 0,9986, * standardní koncentrace (pg/ml), - nestanoveno, SD = směrodatná odchylka
Jak je vidět z těchto tabulek, ve všech případech jc prokázána linearita. Odráží se to v individuálních korelačních koeficientech ..r, které jsou ve všech případech vvšší než 0,99. V každé tabulce je udána střední regresní přímka pro koncentrační křivky, získané během pěti dnů, a je zřejmé, že její směrnice je velmi dobře reprodukovatelná a má maximální odchylku 6,7 %.
Zpětně vypočítané standardní koncentrace vykazují v průměru hodnoty C.V, menší než 6,5% a svědčí tak o vysoké přesnosti nalezených hodnot. Korelační koeficient R, který je vyšší než 0,99. vyjadřuje vysokou správnost a reprodukovatelnost této metody.
1.10. Limit stanovení
Z uvedených výsledků plyne, že limit stanovení u buněk Jurkat je 1,5 pg/ml. Ve vzorcích krysího a lidského séra je možno detekovat I pg/ml L DUO. Vzorky, ke kterým byla přidána L-DHO, vykazují při těchto koncentracích poměr signál/šum přinejmenším 1:3.
1.12. Přesnost a správnost
Přesnost a správnost opakovaných stanovení L DUO při třech různých koncentracích během pěti dnů jsou shrnuty v tabulkách 6-8. Přesnost je vyjádřena jako % rozdílu mezi nalezeným a přidaným množstvím L-DHO. Denní správnost jc vyjádřena jako C.V. (%) a je vypočtena s použitím dvou hodnot, získaných dvěma měřeními jednoho vzorku v jeden den. Mezidenní správnost je rovněž vyjádřena jako C.V. {%) a je vypočtena s použitím průměrných nalezených hodnot pro každý kontrolní vzorek po pět dnů.
- 10C7. 299968 B6
Tabulka 6
Přesnost a správnost v lyzáteeh buněk Jurkat po přidání L-DHO a následné neutralizaci 30 μ] 6 M KOH; n - 2 znamená, žc k jednomu vzorku buněčného lyzátu byla přidána odpovídající koncentrace t -DHO a vzorek byl měřen dvakrát.
Kontr. vzorek (ug/ml) Den n Přesnost Správnost
Průměr (μα/ml) Odchylka (%) ,c.v.(%) denní c.v.' mezidenní |
1 2 20.10 ί +0.5 1.4 |
2 2 19.20 | -4.0 1.3 í t
20 3 : 2 13.40 ί -2.8 3.9 I 2.3
4 ! 2 19.51 i -2.5 2.2 [
5 i 2 18.55 I -7.2 1.3 I I
1 2 69.12 I -1.3 C.1 ! i
2 2 63.13 1 -1.2 0.8 i
70 3 2 73.69 | +5.3 0.2 1 2 8 J
Γ 4 2 71.52 ί +2.2 1.1 I i I
! 5 2 69.64 Ϊ -0.5 0.9 l l
! 1 ! 2 123.21 j -5.2 2.8
2 ! 2 114.73 í -11.7 12.0
130 3 2 135.21 I +4.0 0.2 6.0
4 Z 126.83 I -2 4 1.4 i
i 5 2 122.43 ! -5.8 4.1 I I
Tabulka 7 io Přesnost a správnost v krysím séru po přidání L-DHO a následné deproteinaei; n = 2 znamená, žc k jednomu vzorku séra byla přidána odpovídající koncentrace L- DIK) a bvl měřen dvakrát.
Kcntr. vzorek (gg/ml) Den n Přesnost Správnost
Průměr (pg/mO Odchylka (%) denní C.V. !%) mezidenní
I 1 ! í 2 7.58 i -4.0 0.4
! 2 ! 2 7.73 i -3.4 1.0
8 3 2 7.83 I -2.2 2.1 i 3.0
4 2 7.43 i -7.1 1.0 Ί
5 2 8.05 ! +0.7 0.6 í
I 1 ) I 2 14.53 i -3.1 6.8 i
2 i I 2 14.73 i í -1.8 1.3
1 o r 3 I l 2 14.25 I To 0.1 1.3 i
r 4 ! ! 2 14.85 í -1.0 0.4 I
5 I I 2 14.83 | -0.8 0.9 )
1 2 24.98 | i -0.1 2.5
2 2 25.83 j +3.3 1.3
25 3 2 25.43 i + 1.7 0.6 3.7
4 I í 2 24.31 -2.8 2.0
5 ! í 2 26.31 +7.2 0.2 i
- 11 CZ 299968 Ró
Tabulka 8
Přesnost a správnost v lidském séru po přidání L-DHO a následné deproteínaei; n - 2 znamená, že k jednomu vzorku séra byla přidána odpovídající koncentrace L-DHO a byl měřen dvakrát.
Kcntr. Den n Přesnost - III - ---- ~ -1 Správnost
vzorek Průměr Occhyíka c.v, (%)
(gg/mí) (ug/ml) (%) denní mezicenní
1 2 7.77 I -2.9 0.7
2 2 7.84 j -2.0 15.5
3 3 I ! 2 7.43 -7.1 10.9 3.8
4 I 2 7.17 -10.4 2.1
Z 1 I 2 7.80 ! -2.5 1.2
1 2 13.8S -7.5 0.9
2 2 14.00 -5.7 8.5 i 1
15 3 t 2 15.10 ±0.6 1.5 ] s.o
4 I 2 15.13 ±0.8 7.2
5 i 2 16.03 í -6.3 12.3
I 1 2 26.55 I ±6.2 3.4 ' í
: 2 2 23.77 -4.3 0.7 : í
25 3 2 24.80 -0.3 4 7 í 4.2 j
í 4 2 25.46 ±1.8 7.8 i
1 í r' O 2 24.54 1 -1.9 0,2 . i 1
Uvedené výsledky ukazují, že ve většině případů mají kontrolní hodnoty odchylku maximálně ± 10 %, a že tato metoda je tudíž velmi přesná. Pouze v jednom případě n buněk Jurkat nalezená hodnota mírně převyšuje tuto odchylku (-11,7 %). Může to být vysvětleno vysokou denní hodnotou 12 %. Denní správnost u buněk Jurkat jc nižší než 5 %, u krysího sera je nižší než 7% a u lidského séra nižší než 10 %. Mezidenní správnost ve všech sledovaných případech je nižší než 6,0 %. Ukazuje to. že získané výsledky jsou vysoce rcprodukovatelné a jejich správnost je velká.
Příklad 2
2.1. Tkáňové kultury'
Příprava séraprostého prostředí: Práškové médium Iscove (Biochrotn) se rozpustí v 10 litrech redestilované vody, obsahující 18,95 g NaCl, 11.43 gNaHCO-;, 700 mg KCh 10 ml 35%ního roztoku NaOH a 0,5 ml I M roztoku merkaptoethanolu (Riedel de Haen), a sterilně se /filtruje. K jednomu litru takto připraveného média Iscove se před použitím přidá 32 mg lidského holotransferrinu. I g hovězího albuminu a 1,5 ml lipidů (Sigma).
Buněčná kultura: Buňky A20.2.J se kultivují v séraprostém médiu (37 °C. 5 % CO2) v expanzní kultuře za podmínek logaritmického růstu buněk. Použité buňky mají dělicí rychlost 2,2 za 24 hodin. Procento mrtvých buněk je menší než 8 % (3).
Působení N-(4-trifluormethyl)-2 -kyan-3 Hiydroxykrotonarn idu (v dalším A77 1726) na buňky: Látka A77 1726 se připraví podle patentového spisu EP 0 529 500. rozpustí se v redestilované vodě (10 mM) a dále se zředí séraprostým médiem. Vhodné množství Λ77 1726 sc pak přidá k buňkám a ty se inkubují při 37 °C a 5 % CO>.
- i >.
CZ 299968 BÓ
2,2, Příprava buněčných lyzátů pro stanovení E-DHO
Připravené buňky se resuspendují v určeném objemu média na určenou hustotu buněk. Podle očekávaného obsahu DHO se odebere 1-50 milionů buněk, které se poletují (5 min, 350 x g) ? a supernatant se zlikviduje. Buňky se podrobí lýze působením 500 μ| 1,2 M IICIO4. Lyzáty se přemístí do Eppendorfovýeh zkumaveěek s bezpečnostními víčky a protein se odstraní vysokorychlostní centrifugaeí (2 min). Okyselené lyzáty se kvantitativně přenesou do skleněných via lek, přidá se k nim 500 μΐ chloroformu a směs se důkladně promíchá na Vortexu (2 minuty). Tím se extrahují eelulární lipidy. Směs se podrobí centrifugaeí za chladu (10 minut. 1502 x g, 10 °C). io Takto přečištěné supematanty se uchovávají v 2ml Eppendorfovýeh zkumavečkáeh při -20 °C až do HPLC analýzy.
2.3. UPEC stanovení L -DHO
Cliromatografícká separace sc provede stejně jako je popsáno v příkladu 1. Rozsah vodivostního detektoru se nastaví 11a 10 pS. Analýza sc provádí při teplotě místnosti. Mobilní fáze se skládá z 100 mM NaOH (A) a vody (B). Tyto dvě složky se použiji v následujících gradientu:
Čas (min) A (%) B (%)
0 1 99
2,5 1 99
14 8 92
22 8 92
28 60 40
32 60 40
34 1 99
49 1 99
Průtok ! ml/min, doba analýzy 49 min.
2.4. Výsledky
Buňky A20.2.J při inkubaci se sloučeninou A77 1726 mají zvýšený obsah intracelulární l.-DHO (tabulky 9-11). Výsledky, uvedené v tabulce 9 ukazují, že obsah E-DHO přímo koreluje s počtem extrahovaných buněk.
Tabulka 9
Korelace koncentrace intraeelulární L-DHO a počtu buněk kultivovaných s A77 1726
Buňky Koncentrace L-DHO (pg/ml ± SD) i
(x 105)
1 1 Pokus 1 (E10B) Pokus 2 (E14) 1
ž 14,08 + 2,40 11,75 ± 0,23 j
2 19,51 ± 6,47 1 25,27 ± 0,79
rt 4 53,58 + 3,50 i [ 57,2012,75 ' i
5 73,01 ± 49 ! ί Γ i 1 85,38+2,33 1
3 í i 99,89 + 5,96 i 107,02 + 3,47 i j
10 113,37 ± 4,24 123, 73 ± 1,95 !
Buňky A20.2.J se smíchají s 5 μΜ sloučeniny A77 1726, kultivují se 24 hodin (37 °C, 5 % (OJ a pak se připraví pro extrakci L DUO (n = 3).
Aby se optimalizovaly kultivační metody a stanovil se nejlepší molární poměr buňka/A77 1726, inkubují se různé hustoty buněk A20.2.J spolu s A77 1726 (5μΜ). V různých okamžicích se io odeberou vzorky a stanoví se koncentrace L DIK) (tabulka 10). Protože koncentrace 1- DUO jsou přímo úměrně množství extrahovaných buněk (viz tabulku 9). v dalších pokusech se extrapolují koncentrace L-DHO v μΙ/ml na 10 x IO6 buněk/ml. Nejlepší lineární vzrůst úrovně IDHO je při hustotě 1 x 10* buněk/ml. Tato hustota se použije pro studium časové závislosti intracelulárních hladin v buňkách inkubovaných se sloučeninou A77 1726. Detekovatelna množství
L Dl IO je možno nalézt po jednohodínové inkubaci, nezávisle na koncentraci sloučeniny (tabulka 11). Vzrůst koncentrace jc lineární, s největším množstvím I-DHO po 6 hodinách (tabulka 11). Pak nastane perioda nasycení, bez dalšího vzrůstu obsahu L-DI IO.
Tabulka 10
Hustota buněk a časová závislost vzrůstu koncentrací intraeelulární 1-DHO
Doba inkubace (h) Koncentrace L-DHO ^g/mi) průměr ± SD
lxlO6 buněk/ml 2xlOfi buněk/ml 3χ10δ buněk/ml
1 6,25 ± 0,42 5,47 ± 0,10 5,63 ± 0,19
4 33,06 + 2,26 26,36 + 0,42 19,39 + 1,87
/ 60,07 ± 0,01 42,31 ± 1,07 23,79 + 0,34
- 14CZ 299968 Bó
Různá množství buněk A20.2.J se inkubují spolu se sloučeninou Λ77 1726 (5 μΜ) po udanou dobu. a pro každý vzorek se stanoví koncentrace intracelulámí I.-DHO (všechny hodnoty jsou extrapolovány na 10 χ 106 buněk) (n - 2).
Tabulka II
Časová závislost vzrůstu koncentrací intracelulámí L-DHO
1 Doba inkubace (h) Koncentrace 1 L-DHO (gg/ml) j i průměr ± SD !
A77 1726 (5 uM) ' i ί A77 1726 (10 μΜ) A77 1726 (25 μΜ)
0 1 2,73 i o,io 2,73 ± 0,10 .2,7 3 ± 0,08
1 1 ( 9,22 ± 0,03 8,5 ± 0,39 15,05 ± 0,26
2 24,03 + 1,15 i 20,74 ± 1,43 1 26,06 ± 0,20
1 4 ! 59,48 i 0,72 58,65 ± 2,06 50,21 ± 1,54
í 7 87,54 i 1,58 82, 65 ± 4,50 114,89 ± 3,61
Buňky A20.2.J (1 milion/ml) se inkubují spolu s různými koncentracemi sloučeniny A77 1726 a stanoví se koncentrace intracelulámí L-DHO v různých okamžicích. Hodnoty jsou udávány jako pg/ml L-DHO ± SD a jsou extrapolovány na deset milionů buněk (0 - 4 hodiny: n = 2,7 hodin: n = 4), i5 Inkubace tumorových buněk A20.2J se sloučeninou A77 1726 vede k rychlé akumulaci L-DHO v důsledku inhibice Dl IO-DH.
Intracelulámí koncentrace L Dl 10 korelují s počtem buněk a jsou závislé na čase. Monitorování L-DI10 je náhradní markér pro imunomodulační aktivitu sloučeniny A77 1726 u pacientů.
Příklad 3
Zvířata: Krysí samci Wistar-Lewis (Mollegaard Breading Center Ltd.. Fjby. Dánsko) o tělesné hmotnosti 160-200 g.
Adjuvantní artritida: Vyvolá sc injekcí OJ ml Frcundova adjuvans (suspenze 6 mg Mycobaclerium smegmatis v 1 ml těžkého bílého parafinového oleje; Merck. Darmstadt) do kořene ocasu krys Wistar Lewis. Patologické změny se obvykle projeví mezi 10. a 14. dnem po injekci.
Podávání: Sloučeniny se suspendují v 1% karboxy methy leelu lóže (COMC). Zdravým zvířatům (η 18) a zvířatům, kterým bylo podáno adjuvans (9. den po projevení poruchy: η = 18). se orálně podává 10 mg/kg N—4—(trifluormethylfenyl)- 5-methylizoxazol- 4-karboxamidu (dále leflunomid) dvakrát denně (7:30 h a 13:30 h) po dobu pěti dnů, tedy v čase 0 h, 6 h. 24 h, 30 h. 48 h.
54 h. 72 h, 78 h a 96 h (viz tabulku 12). V čase 0 h sc zabijí tři zdravá a tři nemocná zvířata, aby sc stanovily hodnoty pozadí. Dalším třem zdravým a třem nemocným zvířatům se podává po pět dnů pouze placebo (COMC).
- lšCZ 299968 B6
Odebírání vzorku: V každém časovém bodě se zabijí Iři zvířata z každé skupiny. Odebere se sérum a splenocyty při 3 li. 7 h, 27 li, 51 h. 75 li a 99 li (viz tabulku 12). Vzorky se berou tři hodiny po posledním podání sloučeniny, s výjimkou hodnoty pro 7 h, kdy se vezmou jednu hodinu po druhém podání. Vzorky od kry s. jimž by lo podáno placebo, se vezmou v 0 h (n ” 3) a v 99 li (n = š 3).
Tabulka 12 io Podáníl efl u n om id u a časy odebrán í vzork ů
Hodina; 0 3 6 7 24 27 30 48 5 1 54 72 75 73 95
Podáni (p.o.) -p p Odběr vzorků 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 . 7 í
Příprava vzorků: Krev. získaná punkcí srdce, se uchovává 30 minut při 4 °C a pak se centrituguje 10 minut při 3000 ot/min. Sérum se oddělí a uchovává se v Eppendorfovych zkumavečkách při -20 °C (3). Před HPLC analýzou se sérum rozmrazí a 200 μΐ séra se přidá k filtru Microcon i? (model 10, kód 42407, Amicon) a ccntriluguje se 30 minut při 13 000 ot/min.
Sleziny se vyjmou (n = 3) a spojí pro HPLC analýzu L-DHO. Buňky se oddělí průchodem nerezovým filtrem a přidá sc k nim 0.17 M NH-iCI, aby se lyžovaly ervtrocyty. Připraví se alikvóty 50 milionů slezinných buněk na skupinu, vloží se do zkumaveček a podrobí se ccnlrifugaci.
2o Supernatant se zlikviduje. K získané buněčné peletě se přidá za stálého míchání 500 μΙ 1,2 M roztoku IICIO4, aby se lýzovaly buňky, a pak se odstřeďuje po dobu 2 minut. Kyselý buněčný lyzát se kvantitativně přenese do skleněných vialek, přidá se 500 μΐ chloroformu a mixuje se po dobu 2 minut v mixéru Vortex. Cclulární lipidy se odstraní centrifugací (10 min, 1502 x g, 10 °C). Supernatant se přenese do 2ml zkumaveček a uchovává se při -20 °C.
Stanovení koncentrací sloučeniny A77 1726 v séru: Vzorky séra se ohřejí na teplotu místnosti a pečlivě se promíchají v mixeru Vortex. Sérum se napipetuje (200 μ|) do Eppendorfovych zkumaveček a přidá se vnitřní standard (sloučenina Λ77 1726; 2 pg ve 400 μΙ acetonitrilu). Po mixování v mixéru Vortex se směs odstřeďuje při 2500 ot/min po dobu deseti minut při teplotě místnosti. Pro HPLC analýzu se 400 pl supernatantu přenese do via Iky, přidá se 400 μΙ vody a směs se zamíchá. Podmínky analýzy HPLC jsou následující: hardware sestává z pumpy TSP P2000, aulosampleru TSP AS 1000. integrátoru TSP SP4270 a UV detektoru TSP UV100. Detekce se provádí při vlnové délce 292 nm. Mobilní fáze sestává z 650 ml methanolu (CHROMASOI.V), 2,42 g tetrabuty lamon ium-bromidu a 350 ml 0,05 M oetanu amonného. Průtoková rychlost je 0,5 ml/min. Chromatografie se provádí na lOcin koloně CHROMAPACK Spherisorb ODS-2 s předkolonkou (l cm) s reverzní fází (R2). Na kolonu se aplikuje 100 μΙ a analýza trvá 7 min.
HPLC1 stanovení koncentrace L-DHO: Chromatografická separace se provede stejně, jako v příkladu 1. Rozsah vodivostního detektoru se nastaví na 10 pS. Analýza se provádí při teplotě místnosti. Mobilní fáze se skládá z 100 mM NaOH (A) a vody (B). Tyto dvě složky se použijí v následujícím gradientu:
-16CZ 299968 Bó
Sérum:
Čas (min) A (%) B (%)
0 1 99
2,5 1 X 99
14 23 77
18 60 40
24 60 40
25 1 99
45 1 99
Splenocyty:
Čas (min) A (%) B (%)
0 1 99
2,5 1 99
14 s 92
22 8 92
28 60 40
32 60 40
34 1 99
49 1 99
Průtok jc 1 ml/min.
Po orálním podání leflunomidu mají zdravá i nemocná zvířata zvýšenou koncentraci celulární (tabulka 13) i sérové (tabulka 14) L-DHO. Tento vzrůst koreluje s koncentrací sloučeniny A77 1726 v séru těchto zvířat (tabulka 15). Zpočátku, po 3 hodinách po orálním podání leflunoio midu. dosáhne koncentrace sloučeniny A77 1726 asi 26 pg/ml u krys. kterým bylo podáno adjuvans. a 31 pg/ml u zdravých krys, l yto hodnoty kulminují 1 hodinu po druhém podání (7 li), ale pak se sníží na hodnoty mezi 7 až 12 pg/ml po dobu celého pokusu, a to u zdravých i nemocných krys. U nemocných zvířat se této hodnoty dosáhne za 51 hodin, zatímco u zdravých krys již po hodinách (tabulka 15). Koncentrace sloučeniny A77 1726 v séru korelují s koncentracemi l i? DHO v séru zdravých krys i těch, kterým bylo podáno adjuvans. V protikladu ke koncentracím
1-DHO v séru. které se během pokusu ustálí na přibližně 5 pg/ml, obsah L-DHO, nalezený ve splenoeytcch, klesne po 99 hodinách pod detekční limit (1.5 pg/ml).
2(1
7 _
Tabulka 13
Koncentrace L-DHO ve splenocytech (50 \ 10'* buněk) u krys. kterým byl podán leflunomid
....... NemocnéVr/sy Zdravé krysy
Č2S l (hod) Hodnota Průměr [μα/ιτ.ί] SD [μα/ml] SD [%] Hodnota Průměr ímo/ml] SD j Lg/míjl SD ! % ]
0 (Placsbo) < D.L < D.L. < D.L. < D.L. < D.L. < D.L
n o 5.81 4.60 52, 1 0.6Q 11.52 5.09 6.31 í i [ 5.70 i i : 0.61 1070
1 13.00 11.22 12.11 0.89 7.35 1677 14.37 j i 15.82 0.95 1 6.01
27 15.28 15.34 16.55 0.28 1.69 8.59 10.25 ! 9,47 0.73 í 8.24
51 3.63 1.84 I j
3,97 3.80 1 0.17 4.47 2.34 2.09 | 0.25 11.96
75 2.58 1.92 1
271 2.65 0.06 2.26 2 24 2.08 ! 0.16 I 7.69
99 < D.L. < D.L < D.L í < D.L. < D.L. < D.L ! I
Placebo (99) < D.L <D.L. < D.L. < D.L, < D.L. < D.L.
Zvířatům se podá leflunomid nebo placebo, sleziny se odstraní {n = 3) a spojí, jak je popsáno výše. Spojené splcnocyty se analyzují dvojmo. D.L. = detekční limit (1,5 pg/ml).
SD = směrodatná odchylka.
C'Z 299968 (36
Tabulka 14
Koncentrace L DHO v séru krys, kterým byl podán leflunomid
iNemccné krysy Zdravé krysy
Čas Krysa Hodnota ' Průměr SD SD Hodnota Průměr SD SD
(bod) [μα/ιπΠ [%] Lg/m4 fpc/míi 741
1 < DL. i I I < D.L i
0 2 < DL, < DL. 1 I <D.L. i < D.L. I
(rtaceoo) 3 < D.L < DL. í 1
1 7.85 1 I 11.92 ί
3 2 9.56 8.52 0.59 : i 11.70 10.83 ! ir 13 0.57 6.30
3 8,05 1 10.60 ‘
f 19.55 i 20.29
7 ? 17.00 i : 17.54 1.31 10.30 18.14 18.66 1.45 7.80
3 16.06 | 17.54
; i 13,73 | I i 1 3,22
1 z/ ! i 2 15.95 16.45 3.05 13,50 8.42 3.43 H O 1 2.50
l 3 13.57 3.64 1
[ 1 3.06 4.87 1
51 2 3.63 3.27 0.36 , ! 11.co 4,77 4.55 i 0,46 : 10.20
i 3 3.06 I í 1 4.02 t
I I 1 5.33 i i i 4.60
75 2 4:45 5.14 0.31 11.90 4.17 4,33 0.22 j 5.40
3 5,60 4.23
4 1 5.43 I 5.67 ’ t
99 2 4.89 5.02 0.41 3.30 6.64 í 5,75 0.S5 1 14,30
3 4.68 i I I 4.95
Placado 1 < DL j i I ř < D.L i
(59) 2 <D.L < DL. I ( i j < D.L DL
i 3 < DL i I i I i I < D.L 1 ΐ 1
Zvířatům se podá leflunomid nebo placebo. Krev se odebere, zpracuje a analyzuje, jak je popsáno výše. Koncentrace L-DHO v séru se stanovují pro každé zvíře individuálně.
D.L. “ detekční limit (0,5 pg/ml). SD - směrodatná odchylka.
(1
Tabulka 15
Koncentrace sloučeniny A77 1726 v séru krys. kterým byl podán leflunomid
Nemocné krysy Zdravs 5 krysy
Čas (beč) Krysa Hodnota Průměr [pg/mlj SD [pg/mi] SD (%] Hodnota I Průměr [ug/mi] SD ? [μα/mlj j SD
1 0.0 0.0 i
0 2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 | 0.0
(Fláceco) 3 0.0 0.0 j
1 25.8 32.0 1
3 2 27.2 25.33 1,17 4.45 30.6 30.7 1.21 3.92
3 25.0 29.6
1 44.1 47.7
7 2 45.2 42.3 4.11 9.71 49.4 47.9 1.46 3.04
3 37.6 I 46.5
1 21.3 ! i i I t 10.2 1
27 2 22.0 19.7 I : 3.34 i 16.92 9.9 9.5 0.74 7.55
3 15.9 t I 8.8 i : r 1
1 9.1 7.3 1
51 2 10.2 9.2 1.00 10.93 8.7 7.4 ' ! 1.48 1 19.97
3 6.2 5.5 ! 1 1 I l
1 9.0 6.7 i 1 i
75 2 7.3 9,9 3.03 31.34 9,4 8.1 1 1.35 16.70
3 13.3 8.2
‘1 12.0 14.6 !
99 2 11.9 12.2 0.38 3.11 11.4 12.7 1 67 13.OS
7 w 12.6 12.2 I
Placebo 1 0.0 0.0 i
(95) 2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
3 0.0 0.0 1 í
? Zvířatům se pod leflunomid nebo placebo. Krev se odebere, zpracuje a analyzuje, jak je popsáno výše. Koncentrace sloučeniny A77 1726 v séru se stanovují pro každé zvíře individuálně. SD = směrodatná odchylka.
Perorálnč podaný leflunomid sc in vivo velmi rychle přeměňuje na sloučeninu A77 1726. která je io aktivním metabolitem leflunomidu (viz patentový spis US 5 679 709). Po podání leflunomidu (viz patentový spis US 5 679 709). Po podání Icílunomidu dojde jak u zdravých krys. tak u kry s, kterým bylo podáno adjuvans, k rychlé akumulaci l-DHO v séru i ve splenocytech. Koncentrace L-DHO koreluje s koncentracemi sloučeniny A77 1726 v krevním séru a ukazuje tak na aktivní potlačení DHO-DH molekulovou této látky in vivo. V klinických studiích na lidech může být i? monitorování L-DHO náhradním markérem pro imunomodulační aktivitu leflunomidu u pacientů.

Claims (10)

1. Způsob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografii. vyznačeny tím. že chromatografie zahrnuje
a) přípravu chromatografické kolony s náplní anexového materiálu odolného vůči tlaku, κι b) nanesení vzorku s obsahem kyseliny L-dihydroorotové na kolonu.
e) provedení chromatografie a
d) eluci kyseliny L-dihydroorotové elučním činidlem tvořeným směsí báze a vody.
přičemž se tento proces provádí za tlaku 1.1 až 40 MPa.
2. Způsob podle nároku I. vyznačený t í m , žc se jako báze použije hydroxid sodný.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím. že se jako anexový materiál odolný vůči tlaku použije divinylbenzen/ethvlvinylbenzenový polymer nebo polyvinylbenzylamoniový poly20 mer zesílený divinylbenzenem nebo jejich směsi, které jsou modifikovány alkanolkvartérním amoniem.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se proces provádí za tlaku 4,1 až 5.5 MPa.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se eluce směsí báze a vody provádí za použití časového gradientu koncentrace báze, který má výhodně lineární průběh.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, v y z n a č e n ý t í ni, že se kyselina L-dihydro50 orotová detekuje vodivostním detektorem.
7. Použití způsobu podle některého z nároků I až 6 pro provedení diagnostického testu.
8. Použití způsobu podle některého z nároků 1 až 6 pro stanovení inhibitorů dehydrogenázy 55 kyseliny dihydroorotové,
9. Použití podle nároku 8, při kterém je inhibitorem dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové N-4-(tr i tluormethyl feny l)-5-met hyl i soxazol -4-karboxam id, Brequinar. N-(4-trifluornicthylfenyl) -2-kyan-3-hydroxyhept-2-en-6-inkarbo\amid. (4-kyanfenyl)amid kyseliny 2-kyan-3lo cyklopropyl-3-hydroxyakrylové nebo N-(4-trifluormethyIfeny l)-2-kyan-3-hydroxykrotonamid.
10. Použití způsobu podle některého z nároků I až 6 pro stanovení kyseliny dihydroorotové při monitorování aktivity inhibitorů dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové.
CZ20002134A 1997-12-11 1998-12-08 Zpusob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografií a použití tohoto zpusobu CZ299968B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97121848A EP0933633A1 (en) 1997-12-11 1997-12-11 Process for obtaining L-dihydroorotic acid and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20002134A3 CZ20002134A3 (cs) 2000-10-11
CZ299968B6 true CZ299968B6 (cs) 2009-01-07

Family

ID=8227782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002134A CZ299968B6 (cs) 1997-12-11 1998-12-08 Zpusob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografií a použití tohoto zpusobu

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6545006B1 (cs)
EP (2) EP0933633A1 (cs)
JP (1) JP4189124B2 (cs)
KR (1) KR100700906B1 (cs)
CN (1) CN1237345C (cs)
AR (1) AR016430A1 (cs)
AT (1) ATE305610T1 (cs)
AU (1) AU747993B2 (cs)
BR (1) BR9813559A (cs)
CA (1) CA2315326A1 (cs)
CZ (1) CZ299968B6 (cs)
DE (1) DE69831752T2 (cs)
DK (1) DK1036319T3 (cs)
ES (1) ES2248927T3 (cs)
HK (1) HK1033171A1 (cs)
HU (1) HUP0004510A3 (cs)
ID (1) ID24807A (cs)
PL (1) PL194068B1 (cs)
RU (1) RU2228932C2 (cs)
TR (1) TR200001671T2 (cs)
WO (1) WO1999030146A1 (cs)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1411373A (zh) * 1999-12-16 2003-04-16 特瓦制药工业有限公司 制备来氟米特的新方法和新晶形的来氟米特
CN104582694B (zh) * 2012-05-29 2018-10-02 线粒体科学公司研究所 二氢乳清酸去氢酶抑制剂
US10708575B2 (en) 2012-06-25 2020-07-07 Sharp Kabushiki Kaisha Display system with diffuse and specular reflective modes
US9679506B2 (en) 2012-06-25 2017-06-13 Sharp Kabushiki Kaisha Multiple function display system
CN102787147B (zh) * 2012-08-31 2014-10-08 南京工业大学 一种酶法制备l-二氢乳清酸的方法
US10699612B2 (en) 2014-10-27 2020-06-30 Sharp Kabushiki Kaisha Display system with specular reflective mode
CN112305097A (zh) * 2020-09-30 2021-02-02 辰欣药业股份有限公司 一种特立氟胺片有关物质的检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2773872A (en) * 1954-04-12 1956-12-11 Merck & Co Inc Dihydroorotic acid
HU178201B (en) * 1977-08-05 1982-03-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for producing substituted orto-acids and dihydro-orto-acids and derivatives thereof
DE19539638A1 (de) * 1995-10-25 1997-04-30 Hoechst Ag Die Verwendung von Isoxazol- und Crotonsäureamidderivaten zur Behandlung von Krebserkrankungen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R. DANIEL ER AL.: ANAL. BIOCHEM. vol. 239, no.2, 1996, pages 130-135, XP002097532 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE69831752D1 (de) 2006-02-09
PL341205A1 (en) 2001-03-26
JP4189124B2 (ja) 2008-12-03
CN1237345C (zh) 2006-01-18
ATE305610T1 (de) 2005-10-15
RU2228932C2 (ru) 2004-05-20
US6545006B1 (en) 2003-04-08
JP2001526387A (ja) 2001-12-18
EP1036319B1 (en) 2005-09-28
PL194068B1 (pl) 2007-04-30
HK1033171A1 (en) 2001-08-17
EP1036319A1 (en) 2000-09-20
KR20010032978A (ko) 2001-04-25
HUP0004510A1 (hu) 2001-04-28
BR9813559A (pt) 2000-10-10
TR200001671T2 (tr) 2000-11-21
WO1999030146A1 (en) 1999-06-17
ID24807A (id) 2000-08-24
KR100700906B1 (ko) 2007-03-29
AU1877599A (en) 1999-06-28
EP0933633A1 (en) 1999-08-04
CZ20002134A3 (cs) 2000-10-11
DK1036319T3 (da) 2006-01-16
DE69831752T2 (de) 2006-06-22
HUP0004510A3 (en) 2003-05-28
AU747993B2 (en) 2002-05-30
AR016430A1 (es) 2001-07-04
CN1281550A (zh) 2001-01-24
ES2248927T3 (es) 2006-03-16
CA2315326A1 (en) 1999-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Humpage et al. Comparison of analytical tools and biological assays for detection of paralytic shellfish poisoning toxins
Qu et al. Determination of serotonin, catecholamines and their metabolites by direct injection of supernatants from chicken brain tissue homogenate using liquid chromatography with electrochemical detection
JP4834771B2 (ja) ヘモグロビン消化用試薬
Riaz et al. Effect of high dose thiamine on the levels of urinary protein biomarkers in diabetes mellitus type 2
EP4103946B1 (en) In-vitro diagnosis of histamine intolerance syndrome
CZ299968B6 (cs) Zpusob získání kyseliny L-dihydroorotové chromatografií a použití tohoto zpusobu
Ingles et al. Estimation of biogenic amines in foods
Al-Asmari et al. Direct determination of ethyl glucuronide and ethyl sulfate in postmortem urine specimens using hydrophilic interaction liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry
CN112485442A (zh) 一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用
Xiao et al. Mass spectrometric analysis of the N-glycoproteome in statin-treated liver cells with two lectin-independent chemical enrichment methods
Evans et al. LC/MS analysis of NAD biosynthesis using stable isotope pyridine precursors
WO2005010168A2 (en) Method and system for detecting chloramphenicol
Chang et al. Rapid and sensitive determination of fentanyl in dog plasma by on-line solid-phase extraction integrated with a hydrophilic column coupled to tandem mass spectrometry
Hotchkiss Jr et al. Isolation of oligogalacturonic acids up to DP 20 by preparative high-performance anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection
Fujita et al. Preliminary characterization of glutathione S-transferases that accumulate in callus cells of pumpkin (Cucurbita maxima Duch.)
CN101936948A (zh) 血清多肽的质谱检测方法
MXPA00005274A (en) Process for obtaining l-dihydroorotic acid and use thereof
Chou et al. Polymeric benzotriazole reagent for the off-line high-performanceliquid chromatographic derivatization of polyamines and related nucleophiles in biological fluids
Botana et al. Determination of saxitoxin, tetrodotoxin and common phycotoxins
Burdaspal Bioassay and chemical methods for analysis of paralytic shellfish poison
Kitts Laboratory methodology for shellfish toxins
Tsai et al. Changes in RNA species during differentiation of fiber types in skeletal muscle
CN116355037A (zh) 无患子总皂苷缓冲液及其应用
Eangoor Development of a Rapid, Sensitive and Reliable Clinical Diagnostic Test to Measure Paralytic Shellfish Toxins in Human Matrices
Salvage et al. Radioimmunoassay of cytidine 3′, 5′-monophosphate: development and application of specific assay

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20091208