CN116355037A - 无患子总皂苷缓冲液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无患子总皂苷缓冲液及其应用，所述无患子总皂苷缓冲液包含以下用量的原料组分：质量体积浓度为1‑200g/L的无患子总皂苷、质量体积浓度为5‑9g/L的无机盐、0.05‑2mmol/L的金属离子配位剂和0.05‑0.2mol/L的缓冲试剂，余量为水；所述无患子总皂苷缓冲液的pH值为7.0‑7.6。在应用方面，本发明提供了一种采用所述无患子总皂苷缓冲液在膜蛋白质复合物和超级复合物提取和纯化中的应用。本发明所述无患子总皂苷缓冲液能够实现在提取和纯化膜蛋白质复合物和超级复合物的同时，保护其原始结构和功能的完整性。

Description

无患子总皂苷缓冲液及其应用

技术领域

本发明涉及生命科学和生物工程技术领域，具体涉及一种无患子总皂苷缓冲液及其在膜蛋白质复合物和超级复合物提取和纯化中的应用。

背景技术

膜蛋白质复合物和超级复合物在生物的生命活动中起非常重要的作用，它们具有分子量大、疏水性强、离体后容易解离或聚沉的特点。为了从细胞或生物组织中提取出疏水性强的膜蛋白质复合物和超级复合物，必然要使用表面活性剂或类表面活性剂，但这又会导致这些复合物解体，得到的不是想要的复合物而是它们的碎片。这极大地限制了膜蛋白质复合物和超级复合物的制备和研究。由此看来，膜蛋白质复合物和超级复合物的提取与维持其体外完整性之间存在矛盾。

当前，用于膜蛋白质复合物和超级复合物提取的缓冲液主要是由洋地黄苷(digitonin，DIG)、十二烷基麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside，DDM)或者TritonX-100(TX)制备而成的缓冲液，例如：10-80g/LDIG(或20-60g/LDDM或20-60g/LTX)、100mmol/LTris、100mmol/LSorbitol，pH7.4。其中效果最佳的为含有洋地黄苷的缓冲液。这些缓冲液被用来裂解细胞质膜或细胞器的膜，从而将膜蛋白质复合物或超级复合物从疏水性膜上提取下来。后续利用非变性凝胶电泳(BluenativePAGE)对提取的蛋白质样品进行分离和检测，或者利用分子排阻层析对提取的蛋白质样品进行分离以收集到纯净的蛋白质复合物或超级复合物。在分子排阻层析中，这些缓冲液也用于充当纯化用的洗脱缓冲液。

上述含有洋地黄苷、十二烷基麦芽糖苷和TritonX-100的三种缓冲液虽然都能提取膜蛋白质复合物和超级复合物，但同时容易导致超级复合物的解体。相对来说，含有十二烷基麦芽糖苷、TritonX-100的缓冲液比含有洋地黄苷的缓冲液更易导致膜蛋白质复合物和超级复合物解体。以提取线粒体氧化磷酸化超级复合物为例，这个系统包含了4种呼吸链复合物和一种ATP合酶，是生命科学领域中最难提取的膜蛋白质超级复合物之一。当采用含有十二烷基麦芽糖苷、TritonX-100的缓冲液提取线粒体的膜蛋白质时，只能得到游离的复合物单体，这曾经使人们误认为线粒体氧化磷酸化系统中的复合物是以游离的形式分布在线粒体内膜上的。而采用含有洋地黄苷的缓冲液提取线粒体的膜蛋白质时，得到了由呼吸链超级复合物(含有2种或3种呼吸链复合物单体)和5种复合物单体组成的混合物。这个发现导致了线粒体随机碰撞模型的提出，认为五种复合物单体与随机组合的超级复合物共存于线粒体内膜上。至今为止，全世界都没有在体外获得由所有5种氧化磷酸化复合物组成的超级复合物。但是，近来的线粒体内膜脊电镜结构显示这5种复合物是空间邻近的。这给线粒体研究领域提出了一个相当重要的问题，究竟复合物单体与随机组合的超级复合物构成了氧化磷酸系统的终极结构，还是存在现有条件下无法获得的更高级的超级复合物？当前，利用洋地黄苷提取和纯化线粒体氧化磷酸化超级复合物已达到了行业极限，仍然无法克服膜蛋白质复合物和超级复合物的提取与维持其体外完整性之间的矛盾。

综上所述，需要开发一种无患子总皂苷缓冲液及其在膜蛋白质复合物和超级复合物提取和纯化中的应用，以实现在提取和纯化膜蛋白质复合物和超级复合物的同时，保护其原始结构和功能的完整性。

发明内容

本发明目的在于提供一种无患子总皂苷缓冲液及其应用，具体技术方案如下：

在第一方面，本发明提供了一种无患子总皂苷缓冲液，包含以下用量的原料组分：质量体积浓度为1-200g/L的无患子总皂苷、质量体积浓度为5-9g/L的无机盐、0.05-2mmol/L的金属离子配位剂和0.05-0.2mol/L的缓冲试剂，余量为水；所述无患子总皂苷缓冲液的pH值为7.0-7.6。

可选的，所述无患子总皂苷为来自于无患子属植物的果皮的皂苷；所述无患子总皂苷的质量体积浓度为1-100g/L。

可选的，所述金属离子配位剂包括乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸或乙二胺四乙酸。

可选的，所述缓冲试剂包括三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲液或N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸或4-羟乙基哌嗪乙磺酸或N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸。

可选的，所述无机盐包括NaCl或KCl。

可选的，所述无患子总皂苷缓冲液的pH值为7.3-7.5。

在第二方面，本发明提供了一种采用所述无患子总皂苷缓冲液在膜蛋白质复合物和超级复合物提取中的应用。

可选的，所述蛋白质复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质复合物；所述超级复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质超级复合物。

在第三方面，本发明提供了一种采用所述无患子总皂苷缓冲液在膜蛋白质复合物和超级复合物纯化中的应用。

可选的，所述蛋白质复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质复合物；所述超级复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质超级复合物。

应用本发明的技术方案，至少具有以下有益效果：

本发明中所述无患子总皂苷缓冲液，采用所述缓冲试剂稳定所述缓冲液的pH值为7.0-7.6，避免影响膜蛋白质复合物和超级复合物的表面电荷分布而出现的解聚情况；采用所述无机盐能够起到调节所述缓冲液的离子强度，促进膜蛋白质复合物和超级复合物被提取；采用所述金属离子配位剂能够配位掉金属蛋白酶的辅酶，从而避免膜蛋白质复合物和超级复合物被降解；采用所述无患子总皂苷能够与膜蛋白质复合物和超级复合物的外部疏水区域结合，增加其表面的亲水性，从而促进其被提取；本发明组合使用所述缓冲试剂、无机盐、金属离子配位剂和无患子总皂苷，能够实现在提取和纯化膜蛋白质复合物和超级复合物的同时，保护其原始结构和功能的完整性。本发明中所述无患子总皂苷缓冲液的应用效果使得其在今后的蛋白质相互作用、药物研发和药物筛选等研究领域中有着重大的应用价值。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明实施例1中的无患子总皂苷(SASS)缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图2是对比例1中的洋地黄苷(DIG)缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图3是对比例2中的十二烷基麦芽糖苷(DDM)缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图4是对比例3中的TritonX-100(TX)缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

其中，在图1-4中的Oxidativephosphorylationsupercomplexes表示氧化磷酸化超级复合物；

图5为无患子总皂苷(SASS)缓冲液、洋地黄苷(DIG)缓冲液、十二烷基麦芽糖苷(DDM)缓冲液和TritonX-100(TX)缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的色谱峰P1和P2的Bluenative PAGE分析；其中，箭头指示氧化磷酸化超级复合物；

图6为无患子总皂苷(SASS)缓冲液、洋地黄苷(DIG)缓冲液、十二烷基麦芽糖苷(DDM)缓冲液和TritonX-100(TX)缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的色谱峰P1和P2中氧化磷酸化超级复合物组分的Westernblot鉴定；

图7是图6中线粒体5种复合物I-V在无患子总皂苷(SASS)缓冲液、洋地黄苷(DIG)缓冲液、十二烷基麦芽糖苷(DDM)缓冲液和TritonX-100(TX)缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的两个色谱峰P1和P2中的含量分布；

其中，在图6-7中的NDUDS2(CI)、SDHA(CII)、UQCRC2(CIII)、MTCO2(CIV)和ATP5F1A(CV)分别代表线粒体5种复合物I-V；

图8是由实施例1中5)测定的氧消耗速率结果；

图9是由对比例1-3中5)测定的氧消耗速率结果；

图10是由实施例1中6)和对比例1-3中6)测定的复合物V的ATP水解酶活性结果；

图11是对比例4中的缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图12是对比例5中的缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图13是对比例6中的缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图14是对比例7中的缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图15是实施例2中的缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图16是实施例3中的缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图；

图17是实施例4中的缓冲液提取的线粒体蛋白质样品的分子排阻色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1)准备无患子总皂苷缓冲液

所述无患子总皂苷缓冲液的组成如下：质量体积浓度为46g/L的无患子总皂苷(简写为SASS，来自于无患子属植物的果皮的皂苷)、质量体积浓度为9g/L的无机盐NaCl、0.05mmol/L的金属离子配位剂乙二胺四乙酸、0.05mol/L的缓冲试剂三羟甲基氨基甲烷、余量为水；所述无患子总皂苷缓冲液的pH值为7.4。

2)采用所述无患子总皂苷缓冲液提取线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物

提取步骤如下：

首先，分别取四份等质量的线粒体，选择其中一份线粒体(另外三份线粒体分别用于对比例1-3中的提取实验)按照1:40(w/v)加入冰上预冷处理后的所述无患子总皂苷缓冲液；其次，在涡旋振荡器上混匀约2-4秒钟，再置于25-37℃水浴中温浴10-30分钟；然后，在温度设置为10℃、转速为12000rpm条件下，离心10min；最后，收集上清液，即为含线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物的线粒体裂解液。

3)采用所述无患子总皂苷缓冲液纯化线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物

纯化方案如下：

对线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物的纯化在Waters1525系统上进行；具体的，首先，将实施例1的2)中提取的所述线粒体裂解液加载到7.5mm*600mm的Seplife6FF色谱柱(10-4000kDa)中；其次，采用无患子总皂苷缓冲液作为洗脱液进行分离纯化，同时维持色谱柱的温度为12℃，流速设定为0.75mL/min；然后，利用紫外检测器测定280nm下的色谱峰，并逐一收集；最后，将收集到的色谱峰P1和P2利用超滤管((截留分子量10kDa)分别浓缩至相同体积(记为浓缩色谱峰P1和P2)，以备后用。

4)对280nm下收集到的两个浓缩色谱峰P1和P2，利用Westernblot分析其是否含有被纯化的线粒体氧化磷酸化超级复合物。

分析方案如下：

首先，将浓缩色谱峰P1和P2与分子量标准品利用SDS-PAGE电泳分离；

其次，参考在标准蛋白质分子量条带，根据待测样品蛋白质的分子量，将可能含有该蛋白质的凝胶切下；

然后，通过电泳转印到PVDF膜上；

随后，将PVDF膜分别与抗NDUDS2(CI)、SDHA(CII)、UQCRC2(CIII)、MTCO2(CIV)和ATP5F1A(CV)五种复合物I-V的代表性亚基的特异性抗体孵育；

最后，与辣根过氧化物酶偶连的二抗孵育后，利用底物化学发光底物进行显影。

5)采用安捷伦SeahorseXF24测定氧化磷酸化复合物或超级复合物的氧消耗速率

氧消耗速率测定方案如下：

首先，分别取包含50μL氧化磷酸化超级复合物的浓缩色谱峰P1(约28μg蛋白质)和100μL浓缩色谱峰P2(约118μg蛋白质)，并将二者加入到450μL分析溶液(pH7.4,包含100mmol/L磷酸盐缓冲液,3.5g/LBSA,20g/L无患子总皂苷,100μmol/LCytochromeCand70μmol/LcoenzymeQ10)中；

其次，记录加入NADH(75μL,1.53mmol/L)前后所述分析溶液内的氧气浓度。

6)测定氧化磷酸化复合物或超级复合物中复合物V的活性

活性测定方案如下：

首先，分别取60μL包含氧化磷酸化超级复合物的浓缩色谱峰P1和60μL包含氧化磷酸化复合物的浓缩色谱峰P2，并将二者分别加入至两个200μL反应液(25mmol/LTris,pH7.8,150mmol/LNaCl,5mmol/LATP,5mmol/LMgCl₂和20g/L无患子总皂苷)中，37℃水浴10hr；

其次，在转速为12000rpm离心5min，取200μL上清液与60μL显色液(包含0.8mol/Lsulfateacid,1％(w/v)sodiumdodecylsulfate,1％(w/v)ammoniummolybdateand50mmol/LVitaminC)混合后,37℃水浴30min；

最后，利用酶标仪(multiskanFC,Thermofisher)测定620nm下的复合物V的ATP水解酶吸光值。

7)采用非变性凝胶电泳实验(BluenativePAGE,BN-PAGE)测试实施例1色谱峰P1对应的蛋白质分子量

具体实验过程如下：

利用30％的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储液和缓冲液，制备3.5％-16％的连续浓度梯度分离胶，pH为8.6；再在分离胶上制备3％的浓缩胶，pH6.8。分别取40μL的浓缩色谱峰P1和P2，加入5uLG-250溶液(5％G250,NaCl50mmol/L,Imidazole50mmol/L,6-aminohexanoicacid2mmol/L,EDTA1mmol/L,pH7.0)和5uL50％甘油，并吸打均匀，获得电泳样品。将电泳槽整体置于冰水中，让电泳在低温下进行。然后将200ml阴极液B1(TRICINE50mmol/L,Imidazole7.5mmol/L，考马斯亮蓝0.02％(w/v))倒入负极电泳槽中，将200ml阳极液(Imidazole25mmol/L)倒入正极电泳槽中。取40uL电泳样品上样，恒压120V电泳40min后，去除阴极液B1吸出，再加入200ml阴极液B2(TRICINE50mmol/L,Imidazole7.5mmol/L，考马斯亮蓝0.002％(w/v))于负极电泳槽。250V恒压电泳1h。电泳结束后，将凝胶剥离，扫描。

对比例1：

1)准备洋地黄苷缓冲液

所述洋地黄苷缓冲液的组成如下：质量体积浓度为46g/L的洋地黄苷、质量体积浓度为9g/L的无机盐NaCl、0.05mmol/LEDTA和0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为水；所述洋地黄苷缓冲液的pH值为7.4。

2)采用所述洋地黄苷缓冲液提取线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物，提取步骤同实施例1中2)。

3)采用所述洋地黄苷缓冲液纯化线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物，纯化方案同实施例1中3)。

4)对280nm下收集到的两个浓缩色谱峰P1和P2，利用Westernblot分析其是否含有被纯化的线粒体氧化磷酸化超级复合物，分析方案同实施例1中4)。

5)采用安捷伦SeahorseXF24测定氧化磷酸化复合物或超级复合物的氧消耗速率，测定方案同实施例1中5)。

6)测定氧化磷酸化复合物或超级复合物中复合物V的活性，测定方案同实施例1中6)。

7)采用非变性凝胶电泳实现(BluenativePAGE,BN-PAGE)测试对比例1色谱峰P1对应的蛋白质分子量，具体实验过程同实施例1中7)。

对比例2：

1)准备十二烷基麦芽糖苷缓冲液

所述十二烷基麦芽糖苷缓冲液的组成如下：质量体积浓度为20g/L的十二烷基麦芽糖苷、质量体积浓度为9g/L的无机盐NaCl、0.05mmol/LEDTA和0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为水；所述十二烷基麦芽糖苷缓冲液的pH值为7.4。

2)采用所述十二烷基麦芽糖苷缓冲液提取线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物，提取步骤同实施例1中2)。

3)采用所述十二烷基麦芽糖苷缓冲液纯化线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物，纯化方案同实施例1中3)。

4)对280nm下收集到的两个浓缩色谱峰P1和P2，利用Westernblot分析是否含有被纯化的线粒体氧化磷酸化超级复合物，分析方案同实施例1中4)。

5)采用安捷伦SeahorseXF24测定氧化磷酸化复合物或超级复合物的氧消耗速率，测定方案同实施例1中5)。

6)测定氧化磷酸化复合物或超级复合物中复合物V的活性，测定方案同实施例1中6)。

7)采用非变性凝胶电泳实现(BluenativePAGE,BN-PAGE)测试对比例2色谱峰P1对应的蛋白质分子量，具体实验过程同实施例1中7)。

对比例3：

1)准备TritonX-100缓冲液

所述TritonX-100缓冲液的组成如下：质量体积浓度为26g/L的TritonX-100、质量体积浓度为9g/L的无机盐NaCl、0.05mmol/LEDTA和0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为水；所述TritonX-100缓冲液的pH值为7.4。

2)采用所述TritonX-100缓冲液提取线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物，提取步骤同实施例1中2)。

3)采用所述TritonX-100缓冲液纯化线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物，纯化方案同实施例1中3)。

4)对280nm下收集到的两个浓缩色谱峰P1和P2，利用Westernblot分析其是否含有被纯化的线粒体氧化磷酸化超级复合物，分析方案同实施例1中4)。

5)采用安捷伦SeahorseXF24测定氧化磷酸化复合物或超级复合物的氧消耗速率，测定方案同实施例1中5)。

6)测定氧化磷酸化复合物或超级复合物中复合物V的活性，测定方案同实施例1中6)。

7)采用非变性凝胶电泳实现(BluenativePAGE,BN-PAGE)测试对比例3色谱峰P1对应的蛋白质分子量，具体实验过程同实施例1中7)。

由实施例1和对比例1-3的上述各实验结果知：

参见图1-4，由实施例1中2)提取出的线粒体氧化磷酸化超级复合物(是由五种复合物组成，而其中四种复合物I-IV组成了呼吸链，负责电子传递并消耗氧气，如果缺少其中一种则无法进行电子传递和氧消耗；复合物V(也称ATP合酶)在体内则合成ATP，在体外则水解ATP)，通过凝胶过滤层析得到色谱峰P1和P2；其中，参见图5，由非变性凝胶电泳显示色谱峰P1对应的蛋白质分子量极大，电泳时的迁移率非常低，极有可能是氧化磷酸化超级复合物；而色谱峰P2是由多个不同低分子量的成分组成的混合物。这证明，由实施例1中2)提取出的线粒体氧化磷酸化超级复合物为超大分子量复合物，且能够被色谱分离和收集。

参见图6-7，由实施例1中4)利用Westernblot分析检测色谱峰P1和色谱峰P2中五种氧化磷酸化超级复合物的分布结果发现，在色谱峰P1中几乎含有线粒体中的所有五种氧化磷酸化超级复合物(复合物I至复合物V)。因此，可以证实色谱峰P1中包含的成分是为氧化磷酸化超级复合物；相反，在色谱峰P2中所含有的氧化磷酸化超级复合物非常少。以上结果说明，利用所述无患子总皂苷缓冲液能够从线粒体中提取并纯化出氧化磷酸化超级复合物，且其结构完整性不受破坏。

相比之下，参见图1-4，由洋地黄苷、十二烷基麦芽糖苷或TritonX-100制备成的缓冲液提取的线粒体经过凝胶过滤层析后，也得到了两个色谱峰P1和P2，但是这三种样品色谱峰P1的吸光值只有所述无患子总皂苷缓冲液提取线粒体样品色谱峰P1的四分之一，证明其中所含超大分子量成分较少，大部分超大分子量成分被解体成了小分子碎片，且在色谱峰P2中洗脱下来。

参见图6-7，Westernblot鉴定结果显示，洋地黄苷、十二烷基麦芽糖苷或TritonX-100缓冲液裂解的线粒体样品的色谱峰P1中不能检测到完整的氧化磷酸化超级复合物，而这个超级复合物的碎片出现在色谱峰P2中。这说明，含有洋地黄苷、十二烷基麦芽糖苷或TritonX-100的缓冲液虽然提取了氧化磷酸化超级复合物，但同时也导致它的结构发生了严重的解体。

参见图8，由实施例1中5)测定的氧消耗速率结果显示，从无患子总皂苷缓冲液提取的线粒体中被纯化出的色谱峰P1具有较强的氧消耗速率，证明其含有四种复合物I-IV，而色谱峰P2的氧消耗速率几乎为零，这证明线粒体的复合物I-IV都集中在了色谱峰P1的氧化磷酸化超级复合物中，与Westernblot鉴定结果一致。

相反，参见图9，由洋地黄苷缓冲液、十二烷基麦芽糖苷缓冲液或TritonX-100缓冲液提取的线粒体中被纯化出的色谱峰P1的氧消耗速率几乎为零，虽然色谱峰P2表现出了一定的氧消耗速率，但是它的氧消耗速率比无患子总皂苷缓冲液纯化出的氧化磷酸化超级复合物的氧消耗速率低得多(参见图8)。这说明，洋地黄苷缓冲液、十二烷基麦芽糖苷缓冲液或TritonX-100缓冲液提取线粒体膜蛋白质氧化磷酸化超级复合物的同时，破坏了氧化磷酸化超级复合物的结构，产生了复合物I-IV组成的较低分子量的碎片，而致使氧消耗速率降低或消失，这也与Westernblot鉴定结果一致。

参见图10，由实施例1中6)测定的复合物V的ATP水解酶活性分析显示，无患子总皂苷缓冲液提取的线粒体中被纯化出的色谱峰P1的ATP水解酶的活力比它的色谱峰P2高出2倍多。这表示色谱峰P1里的氧化磷酸化超级复合物包含了整个线粒体的绝大部分复合物V，这同样与Westernblot鉴定结果一致。

相反，由洋地黄苷缓冲液、十二烷基麦芽糖苷缓冲液或TritonX-100缓冲液提取的线粒体中被纯化出的色谱峰P1的ATP水解酶活性非常低，而它们的色谱峰P2的ATP水解酶活性相对较高，这提示复合物V主要位于色谱峰P2中，与Westernblot鉴定结果一致。

由图8-10分析的氧化磷酸化超级复合物结果表明，相比于洋地黄苷缓冲液、十二烷基麦芽糖苷缓冲液或TritonX-100缓冲液，实施例1采用的无患子总皂苷缓冲液能够提取和纯化出具有生物学活性的氧化磷酸化超级复合物，这侧面表明其结构的完整性。而对比例1-3采用的洋地黄苷缓冲液、十二烷基麦芽糖苷缓冲液或TritonX-100缓冲液能够使氧化磷酸化超级复合物发生解体，其碎片的生物学活性证实了这种解体作用的存在。

在上述实施例1和对比例1-3的基础上，本发明还做了对比例4-7，用于研究无患子总皂苷缓冲液中主要成分的缺失对线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物提取的影响。

对比例4：

与实施例1不同的是，不使用缓冲试剂三羟甲基氨基甲烷。

对比例5：

与实施例1不同的是，不使用无机盐NaCl。

对比例6：

与实施例1不同的是，不使用金属离子配位剂乙二胺四乙酸。

对比例7：

与实施例1不同的是，不使用无患子总皂苷。

参见图1和图11-14，相比于对比例4-7的结果发现，由实施例1采用无患子总皂苷缓冲液提取氧化磷酸化超级复合物的效果最好，产量最高；而其中任何成分的缺失都会造成氧化磷酸化超级复合物产量的降低或消失，且影响的强度从大到小依次为，无患子总皂苷、缓冲试剂、无机盐和金属离子配位剂。

在上述实施例1的基础上，本发明还做了实施例2-4，用于研究不同组分的无患子总皂苷缓冲液对线粒体氧化磷酸化复合物或超级复合物提取的影响。

实施例2：

与实施例1不同的是，所述缓冲试剂由三羟甲基氨基甲烷替换为磷酸盐缓冲液。

实施例3：

与实施例1不同的是，所述金属离子配位剂由乙二胺四乙酸替换为乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸。

实施例4：

与实施例1不同的是，所述无机盐由NaCl替换为KCl。

参见图1和图15-17，本发明由实施例1-4中的组分配制的无患子总皂苷缓冲液提取氧化磷酸化超级复合物的效果相当，产量相近。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.无患子总皂苷缓冲液，其特征在于，包含以下用量的原料组分：质量体积浓度为1-200g/L的无患子总皂苷、质量体积浓度为5-9g/L的无机盐、0.05-2mmol/L的金属离子配位剂和0.05-0.2mol/L的缓冲试剂，余量为水；所述无患子总皂苷缓冲液的pH值为7.0-7.6。

2.根据权利要求1所述的无患子总皂苷缓冲液，其特征在于，所述无患子总皂苷为来自于无患子属植物的果皮的皂苷；所述无患子总皂苷的质量体积浓度为1-100g/L。

3.根据权利要求1所述的无患子总皂苷缓冲液，其特征在于，所述金属离子配位剂包括乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸或乙二胺四乙酸。

4.根据权利要求1所述的无患子总皂苷缓冲液，其特征在于，所述缓冲试剂包括三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲液或N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸或4-羟乙基哌嗪乙磺酸或N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸。

5.根据权利要求1所述的无患子总皂苷缓冲液，其特征在于，所述无机盐包括NaCl或KCl。

6.根据权利要求1所述的无患子总皂苷缓冲液，其特征在于，所述无患子总皂苷缓冲液的pH值为7.3-7.5。

7.一种采用如权利要求1-6任意一项所述的无患子总皂苷缓冲液在膜蛋白质复合物和超级复合物提取中的应用。

8.根据权利要求7所述的无患子总皂苷缓冲液膜在蛋白质复合物和超级复合物提取中的应用，其特征在于，所述蛋白质复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质复合物；所述超级复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质超级复合物。

9.一种采用如权利要求1-6任意一项所述的无患子总皂苷缓冲液在膜蛋白质复合物和超级复合物纯化中的应用。

10.根据权利要求9所述的无患子总皂苷缓冲液在膜蛋白质复合物和超级复合物纯化中的应用，其特征在于，所述蛋白质复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质复合物；所述超级复合物包括细胞或细胞器的膜蛋白质超级复合物。

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