ES2248927T3 - Procedimiento para obtener acido l-dihidroorotico y uso del mismo. - Google Patents
Procedimiento para obtener acido l-dihidroorotico y uso del mismo.Info
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Abstract
Un procedimiento para obtener ácido L- dihidroorótico por cromatografía que comprende las etapas de: a) obtener una columna que comprende material de intercambio aniónico estable con la presión; b) cargar la columna con una solución de la muestra que incluye ácido L-dihidroorótico; c) llevar a cabo la cromatografía; d) eluir el ácido L-dihidroorótico con una solución de elución que contiene una mezcla de agua y base; llevándose a cabo dicho procedimiento a una presión de 1, 1 MPa a 40 MPa.
Description
Procedimiento para obtener ácido
L-dihidroorótico y uso del mismo.
La invención se refiere a un procedimiento para
obtener ácido L-dihidroorótico (en lo sucesivo
"L-DHO") por cromatografía en un material de
intercambio aniónico en una mezcla de agua y base, a una presión de
1,1 MPa a 40 MPa. El procedimiento se puede usar para investigar la
actividad in vitro e in vivo de la
N-(4-trifluorometilfenil)-5-metilisoxazol-4-carboxamida,
N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxicrotonamida
y compuestos similares.
El L-DHO se puede determinar por
un procedimiento cromatográfico en gel de sílice con posterior
formación de derivado por vía química y determinación colorimétrica
Kesner, L., Aronson, F.L., Silverman, M., Chan, P.C., Clin.
Chem 21/3 (1975) 353). Otro método convierte el
L-DHO por vía enzimática en el ácido orótico
mediante la ácido
L-dihidroorótico-deshidrogenasa (en
lo sucesivo "DHODH") preparada a partir de hígado de rata, y
después de formación de derivado por vía química, detecta el orotato
por cambios colorimétricos (Rogers, L.E., Nicolaisen, K.,
Experientia 28/10 (1972) 1259). Las desventajas de estos
métodos son la interferencia de otros materiales en las soluciones
fisiológicas complejas. Además, los procedimientos mencionados
requieren mucho tiempo debido a la preparación laboriosa de la
muestra y por lo tanto no se pueden aplicar en el análisis rutinario
en estudios clínicos grandes.
En un intento de proporcionar procedimientos de
separación y aislamiento mejores para obtener el ácido
L-dihidroorótico, ahora se ha encontrado que éste se
puede obtener por cromatografía del L-DHO en una
mezcla de agua y base en un material de intercambio aniónico y una
presión de 1,1 MPa a 40 MPa. El procedimiento se puede usar para la
determinación cuantitativa del L-DHO en lisatos de
células, suero de mamíferos y suero humano. Dicho procedimiento es
muy reproducible, sensible y está validado.
La invención, como se explica en las
reivindicaciones, logra el objetivo mediante un procedimiento
cromatográfico que comprende las etapas de:
a) obtener una columna que comprende material de
intercambio aniónico estable con la presión;
b) cargar la columna con una solución de la
muestra que incluye ácido L-dihidroorótico;
c) llevar a cabo la cromatografía;
d) eluir el ácido
L-dihidroorótico con una solución de elución que
contiene una mezcla de agua y base;
llevándose a cabo dicho procedimiento a una
presión de 1,1 MPa a 40 MPa.
La expresión material de intercambio aniónico
estable con la presión significa, por ejemplo, materiales tales como
polímero macroporoso (2.000) de divinilbenceno/etilvinilbenceno o un
polímero microporoso de polivinilbencilamonio reticulado con
divinilbenceno o mezclas de los mismos que se modifican con
alcanol-amonio cuaternario; o polímero macroporoso
de cloruro de vinilbencilo/divinilbenceno, o polímero de
polietilimino reticulado; o sílice modificada con
poli-trimetil-amonio; o
poli(estireno-divinilbenceno)trimetilamonio.
Se prefieren particularmente los siguientes
productos:
Columnas de intercambio aniónico Ion Pac AS 11,
CarboPac PA 1 o CarboPac MA 1, suministradas por Dionex Corporation,
Idstein, Alemania,
GROM-SIL, Anión fuerte, o
GRGM-SIL, Anión débil; suministrados por Grom P 1000
SAX, Ionospher SA o Chrompack PA; suministrado por Chrompack,
PRP-X100 o RCX-10
suministrado por Hamilton.
La solución elegida contiene una mezcla de agua y
base. Las bases adecuadas se obtienen de metales alcalinos o metales
alcalinotérreos, tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico,
hidróxido magnésico o hidróxido cálcico. La concentración de la base
es de 1 mmol/l a aproximadamente 200 mmol/l, basado en el agua como
disolvente, preferiblemente de 2 mmol/l a aproximadamente 120
mmol/l, se prefiere particularmente 100 mmol/l. La temperatura
durante el procedimiento cromatográfico es de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 50ºC, preferiblemente de aproximadamente 15ºC a
aproximadamente 30ºC, se prefiere particularmente de
aproximadamente 19ºC a aproximadamente 25ºC. La presión de trabajo
durante la cromatografía es sustancialmente constante. La
cromatografía se puede llevar a cabo usando diferentes presiones,
por ejemplo, la cromatografía se puede llevar a cabo a una presión
de 1,10 10^{6} Pa (1,1 MPa) a 40 10^{6} Pa (40 MPa), en
particular de 4,1 MPa a 5,5 MPa. Los caudales del eluyente son de
aproximadamente 0,2 ml/min a aproximadamente 3 ml/min,
preferiblemente 1 ml/min.
La carga de las columnas, cromatografía, y
elución del L-DHO se lleva a cabo por métodos
convencionales de la técnica conocidos. Una elución adecuada es
aquella en la que la elución presenta un gradiente de la
concentración de la base con el tiempo, preferiblemente con un
desarrollo lineal. Este gradiente de concentración se puede aplicar,
por ejemplo, con una concentración de base baja (cero en el caso
límite) presente en la elución al inicio de la elución, y mediante
aumento de la concentración de base durante el procedimiento de
elución. De esta forma se puede lograr una separación
particularmente eficaz del L-DHO en muestras
obtenidas de suero o lisatos celulares. Un gradiente de base
preferido varía de cerca del 1% de NaOH (100 mmol/l) y 99% de agua
(al inicio de la elución) a aproximadamente 60% de NaOH y 40% de
agua (al final de la elución), siendo el intervalo particularmente
preferido de aproximadamente 1% de NaOH y 99% de agua (al inicio de
la elución) a aproximadamente 15% de NaOH y 75% de agua (al final de
la elución). El gradiente de agua y base cambia de una forma lineal
de 2,5 min a aproximadamente 14 min, y de 14 min a aproximadamente
25 min, donde el gradiente es distinto durante estos 2 periodos de
tiempo.
Se puede lograr una elución particularmente
adecuada usando una concentración de base baja al inicio del
procedimiento de separación de aproximadamente 1% durante un periodo
de tiempo de 2,5 minutos. El resultado es la elución de la mayor
parte del material que interfiere de la matriz biológica de la
columna. La separación del analito se logra mediante el aumento
lento del gradiente hasta aproximadamente 23% de base dentro de un
periodo de tiempo de 14 minutos de tiempo de análisis total.
Después, la concentración de base se aumenta a aproximadamente 60%
en 4 min para permitir la elución del material fuertemente unido. La
base al 60% no debe aplicarse durante más de 6 min hasta que se
lleve a cabo el reequilibrado con mezcla de agua y base al 1%. El
siguiente análisis se inicia después de 45 min de tiempo de análisis
total. El agua del gradiente de agua y base debe ser desionizada y
desgasificada.
El procedimiento de separación de acuerdo con la
invención se produce en un procedimiento en columna. La temperatura,
que preferiblemente se mantiene constante durante la cromatografía
de intercambio aniónico, puede variar en un amplio intervalo. Un
intervalo de temperatura preferido es de aproximadamente -10ºC a
aproximadamente 50ºC, en particular de aproximadamente 15ºC a
aproximadamente 25ºC.
La elución del L-DHO se produce
de 10 a 12 min después de iniciar el gradiente. El tiempo del
experimento del procedimiento de elución es de 13 min a 25 min. El
L-DHO se detecta mediante un detector de
conductividad, tal como el modelo DC20 de Dionex Coorporation. Con
el fin de minimizar el desplazamiento de los valores iniciales y
disminuir la conductividad de fondo, se puede usar un inhibidor de
la regeneración aniónica, tal como el modelo ASRS-I,
4 mm de Dionex Coorporation.
El procedimiento de acuerdo con la invención es
adecuado en particular para la cromatografía analítica, pero también
se puede usar para cromatografía preparativa, especialmente cuando
el procedimiento de acuerdo con la invención se lleva a cabo con un
sistema de cromatografía en columna de alta presión (HPLC)
preparativa. La expresión "cromatografía preparativa" significa
un procedimiento de purificación con el objetivo de obtener, y no
simplemente analizar, productos puros. La cantidad de los productos
puros puede variar dentro de límites amplios, por ejemplo de 1 mg a
1000 g, preferiblemente entre 50 mg y 500 mg.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
puede usar para detectar cambios en las concentraciones intracelular
y extracelular de L-DHO debido a la inhibición de la
ácido dihidroorótico-deshidrogenasa
(DHO-DH). La enzima DHO-DH es
responsable de la conversión del ácido
L-dihidroorótico en ácido orótico durante la
síntesis nueva de pirimidina. La inhibición de la
DHO-DH conduce a la acumulación de
L-DHO. El procedimiento de acuerdo con la invención
se puede usar para preparar un ensayo de diagnóstico. El
procedimiento de acuerdo con la invención se puede usar para
determinar la actividad de los inhibidores de la
DHO-DH. Son inhibidores de la
DHO-DH, por ejemplo, la
N-4-(trifluorometilfenil)-5-metilisoxazol-4-carboxilamida,
Brequinar,
N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxihept-2-en-6-ino-carboxamida,
2-ciano-3-ciclopropil-3-(ácido
hidroxiacrílico)-(4-cianofenil)-amida
o
N-(4-trifluoro-metilfenil)-2-ciano-3-hidroxicrotonamida.
El procedimiento de acuerdo con la invención se puede usar para
determinar las concentraciones de L-DHO en plantas,
líneas celulares, animales y seres humanos. La determinación de
L-DHO se puede usar para controlar la actividad de
inhibidores de DHO-DH en plantas, mamíferos y seres
humanos.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
describe con detalle en los siguientes ejemplos. Salvo que se
indique lo contrario, los datos de porcentajes son en peso.
Los productos químicos y reactivos se adquirieron
donde se indica a continuación:
| Carbonato sin NaOH ni KOH | Baker, Holanda |
| Ácido L-Dihidroorótico (L-DHO) | Sigma, Munich |
| HClO_{4} | Riedel de Haen, Seelze |
| Eosina, cloroformo | Riedel de Haen, Seelze |
| Medio RPMI 1640 | Gibco,. Eggenstein |
| Suero de ternero fetal (FCS) | Bio Whitaker, Verviers, Bélgica |
El agua desionizada debía desgasificarse con
helio antes de usar.
El sistema de HPLC consistía en los siguientes
instrumentos:
\vskip1.000000\baselineskip
| Equipamiento | Modelo | Fabricante |
| Módulo de acondicionamiento del disolvente | SCM 400 | Thermo separation products (TSP) |
| Bomba de gradiente binario | P 2000 | TSP |
| Autoinyector con bucle de 20 \mul | AS 3000 | TSP |
| Interfase | SP 4510 | TSP |
| Cambiador AD | SN 4000 | TSP |
| Detector de conductividad | CD 20 | Dionex |
| Inhibidor de la autorregeneración aniónica | ASRS-I 4 mm | Dionex |
| Estabilizador de detección | DS 3-1 | Dionex |
| PC | EI 20, Flex Scan, F 563-T | Escon |
| Impresora | Desk Jet 550 C | Escon |
| Software | PC 1000 | TSP |
En todos los experimentos se usó material de
Peek.
La separación cromatográfica se llevó a cabo con
una columna de intercambio aniónico de 250 x 4 mm D.I. IonPac AS 11
(tamaño de partículas 13 \mum; P/N 044076, Dionex) equipada con
una precolumna de 50 x 4 mm D.I. IonPac AG 11 (tamaño de partículas
13 \mum; P/N 044078, Dionex). Adicionalmente, se instaló una
columna aniónica trampa ATC-1 (P/N 037151, Dionex)
entre la bomba de gradiente y la válvula de inyección. Con el fin de
minimizar el desplazamiento de los valores iniciales y disminuir la
conductividad de fondo se instaló el inhibidor
ASRS-I que funciona a 300 mA. El intervalo del
detector se fijó en 10 \muS. El autoinyector se enfrió a 14ºC,
pero el análisis se llevó a cabo a temperatura ambiente. La fase
móvil estaba compuesta de NaOH 100 mM (A) y agua desionizada y
desgasificada (B). Con este sistema se produjo el siguiente
gradiente:
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo (min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 1 | 99 |
| 2,5 | 1 | 99 |
| 14 | 23 | 77 |
| 18 | 60 | 40 |
| 24 | 60 | 40 |
| 26 | 1 | 99 |
| 45 | 1 | 99 |
El caudal era 1 ml/min, el tiempo del experimento
era 45 min.
Se preparó una solución madre patrón disolviendo
1 mg de L-DHO en 1 ml de agua. Se congelaron partes
alícuotas de 400 \mul a -20ºC. La estabilidad de estas soluciones
estaba garantizada durante al menos 4 semanas. Se añadieron
cantidades definidas de la solución madre a los lisatos celulares y
al suero humano y de rata, y se hizo el ensayo para evaluar la
linealidad entre el aumento de la señal y la concentración de
L-DHO enriquecido. Se investigaron la precisión y
exactitud del método usando muestras de control de calidad (CC) con
un contenido de L-DHO en el intervalo de
concentración bajo, medio y alto de la curva lineal de
señal/concentración.
Las células Jurkat se obtuvieron de ATCC (TIB
182) y se cultivaron como se describe en 1.5.1.1.
Se sembraron 5 x 10^{5} células Jurkat/ml y se
hicieron crecer durante 24 horas en medio RPMI 1640 y suero de
ternero fetal al 10% (FCS). Las células se mezclaron en medio
reciente para la lisis celular y se calculó la cantidad de células y
el porcentaje de células muertas por microscopía vital con eosina.
Después de 24 horas, el número de células había aumentado
1,6-1,8 veces con menos de 7% de células muertas.
Las células Jurkat cogidas para la determinación de
L-DHO tenían una tasa de proliferación de
1,6-1,8 veces en 24 horas, y menos de 7% de
células
muertas.
muertas.
Las células se suspendieron en un volumen de
medio definido, y la densidad de células de las muestras se
determinó por microscopía vital usando eosina. Se separaron
aproximadamente 10 x 10^{6} células, se sedimentaron por
centrifugación de 5 min a 350 x g y después se descartó el líquido
sobrenadante. La lisis de las células se hizo volviendo a suspender
el sedimento de células en 500 \mul de HClO_{4} 1,2 M. Esta
mezcla se transfirió a tubos Eppendorf de 2,0 ml con tapones
herméticos y la proteína se precipitó mediante 2 min de
centrifugación a alta velocidad. Se separó completamente el líquido
sobrenadante, se transfirió a viales de vidrio y después de añadir
500 \mul de cloroformo se mezcló bien mediante 2 minutos de mezcla
vortical. Los lípidos celulares se extrajeron con cloroformo después
de 10 minutos de centrifugación (1502 g) a 10ºC. Se recogió el
líquido sobrenadante purificado en tubos Eppendorf de 2 ml con
tapones y se almacenaron a -20ºC hasta su uso posterior. Para el
análisis de HPLC, se neutralizaron 100 \mul de este líquido
sobrenadante con 30 \mul de KOH 6 M. Después de agitar durante
aproximadamente 5 s, las muestras se almacenaron en hielo durante 30
min. Después se centrifugaron durante 5 min a 15.000 rpm. Del
líquido sobrenadante transparente se usaron 20 \mul para el
análisis de HPLC.
Con el fin de reducir el contenido de proteína,
se añadieron 200 \mul de suero a un filtro Microcon (10.000 D,
modelo 10, código 42407, Amicon) y se centrifugó durante 30 min a
13.000 revoluciones por minuto (rpm). El flujo completo consistía en
aproximadamente 150 \mul y contenía el analito
L-DHO. De este líquido se usaron 20 \mul para el
análisis de HPLC.
El integrador determinó la altura de pico del
analito. Las curvas de calibración se obtuvieron representando
gráficamente las alturas de los picos medidas (y) frente a la
concentración de analito en las diferentes matrices biológicas. La
regresión lineal ponderada (1/y) se usó para volver a calcular la
concentración de L-DHO en muestras patrón, así como
en controles de calidad. El coeficiente de correlación R habitual,
se proporcionó con PROC GLM basándose en un análisis del modelo de
covarianza usando el factor ponderación.
La Tabla 1 muestra los datos de estabilidad del
analito a -20ºC en lisatos celulares y muestras de suero después de
2-3 ciclos de congelación/descongelación de una
muestra. El L-DHO era estable en las condiciones
antes mencionadas en células Jurkat en un periodo de al menos 4
semanas. El aumento de concentración detectado en algunas muestras
de suero de rata y una muestra de suero humano después de varios
ciclos de descongelación de más de 10% no se puede explicar, y
muestra que la exactitud en dichos casos se puede reducir hasta un
15% en general y hasta un 29% en el peor de los casos. Por estas
razones, sólo se puede declarar que en muestras de suero de rata y
humano, el L-DHO es claramente estable sólo durante
al menos 1 semana.
| Tiempo (días) | Concentración 1 | Residuo (%) | Concentración 2 | Residuo (%) |
| 20 \mug/ml | 100 \mug/ml | |||
| Células Jurkat | ||||
| 0 | 19,34 | 100 | 100,05 | 100 |
| 7 | 19,28 | 99,7 | 99,09 | 99,0 |
| 14 | n.d. | n.d. | 115,32 | 115,3 |
| 29 | 19,98 | 103,3 | 99,35 | 99,3 |
| Tiempo (h) | Concentración 1 | Residuo (%) | Concentración 2 | Residuo (%) |
| 5 \mug/ml | 20 \mug/ml | |||
| Suero de rata | ||||
| 0 | 4,30 | 100 | 19,94 | 100 |
| 7 | 4,52 | 105,1 | 19,62 | 98,4 |
| 14 | 4,81 | 111,9 | 20,93 | 105,0 |
| 21 | 5,55 | 129,1 | 22,38 | 112,2 |
| Suero humano | ||||
| 0 | 4,67 | 100 | 20,22 | 100 |
| 8 | 4,81 | 103,0 | 20,38 | 100,8 |
| 65 | 4,87 | 104,3 | 23,20 | 114,7 |
| Residuo (%) es un porcentaje de la concentración comparado con el análisis inicial. | ||||
| n.d. = no determinado |
Con el fin de simular las condiciones de las
muestras cuando están esperando en el autoinyector el análisis real,
se determinó la estabilidad durante 18 h a 14ºC. Para hacer esto los
lisatos celulares se enriquecieron y se trataron con 30 \mul de
KOH 6 M/100 \mul de lisato, antes de iniciar el análisis. De la
misma forma, se enriquecieron las muestras de suero y después se
quitaron las proteínas como se describe en 1.5.2.
Como puede verse en la Tabla 2, el contenido de
L-DHO disminuye ligeramente en las células en estas
condiciones hasta un máximo de aproximadamente 7%. En las muestras
de suero el analito es estable en estas condiciones. Por estas
razones se preparó sólo un número de muestras para el HPLC de forma
que el periodo máximo de permanencia en el autoinyector estuviera
por debajo de 18 h.
| Tiempo (h) | Concentración 1 | Residuo (%) | Concentración 2 | Residuo (%) |
| 20 \mug/ml | 100 \mug/ml | |||
| Células Jurkat | ||||
| 0 | 19,96 | 100 | 100,02 | 100 |
| 18 | 18,60 | 93,2 | 97,43 | 97,4 |
| Tiempo (h) | Concentración 1 | Residuo (%) | Concentración 2 | Residuo (%) |
| 5 \mug/ml | 20 \mug/ml | |||
| Suero de rata | ||||
| 0 | 4,61 | 00 | 19,99 | 100 |
| 18 | 4,96 | 107,6 | 20,53 | 102,7 |
| Suero humano | ||||
| 0 | 3,34 | 100 | 18,78 | 100 |
| 18 | 3,37 | 100,9 | 22,09 | 117,6 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La comparación de los lisatos de células Jurkat
no enriquecidos con los correspondientes cromatogramas de lisatos de
células enriquecidos con 50 \mug de L-DHO/ml
mostró que hay un pequeño pico a 11,983 min, que es el mismo tiempo
de retención que el del L-DHO. Es muy probable que
este pico provenga del contenido natural de analito en estas
células. Adicionalmente, se puede ver que debido al tratamiento de
los lisatos celulares con KOH, el pico de L-DHO se
desdoble en dos picos. Sin embargo, el tratamiento con KOH es
fundamental con el fin de neutralizar el listo celular ácido antes
del análisis de HPLC. Se podría mostrar que en las condiciones
descritas la evaluación de la altura del segundo pico (tiempo de
retención (RT) = 11,954 min) se puede usar para conseguir mejores
resultados en términos de linealidad y reproducibilidad.
También en el caso de suero de rata y humano se
encontró un valor del blanco con el mismo tiempo de retención que el
L-DHO. Se supone que esto refleja el contenido
natural de L-DHO del organismo. La determinación de
al menos 10 muestras diferentes de ambas especies muestra que el
contenido natural de L-DHO era inferior al límite de
detección de 1 \mug/ml.
La linealidad de la determinación se evaluó en
cinco curvas de calibración para la línea celular y las diferentes
muestras de suero. Se prepararon las muestras y se llevaron a cabo
los experimentos en cinco días diferentes, y con concentraciones de
L-DHO en el intervalo de 1,5-150
\mug/ml (lisatos celulares) y 1-3 \mug/ml
(muestras de suero). Los resultados se muestran en las Tablas
3-5. Para determinar la recta de regresión se usó la
altura de los picos. Basándose en esto, se volvieron a calcular las
correspondientes concentraciones de los diferentes patrones como se
indica en las diferentes tablas.
Después de enriquecimiento, las muestras se
trataron con 30 \mul de KOH 6 M y después se analizaron una vez
como se describe en 1.3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Día | Concentración (\mug/ml) | Pendiente | Corte-y | r | |||||
| 1,5 | 6 | 10 | 50 | 100 | 150 | ||||
| 1 | 1,78 | 5,54 | 9,09 | 49,80 | 102,46 | 149,09 | 1317,54 | -258,17 | 0,9995 |
| 2 | 1,90 | 5,14 | 9,54 | 50,77 | 100,22 | 150,20 | 1324,84 | 204,79 | 0,9995 |
| 3 | 1,86 | 5,24 | 9,46 | 51,18 | 99,91 | 150,07 | 1295,48 | 302,48 | 0,9996 |
| 4 | 1,85 | 5,34 | 9,39 | 51,45 | 100,97 | 148,71 | 1306,08 | 833,68 | 0,9996 |
| 5 | 1,86 | 5,26 | 9,53 | 50,98 | 100,07 | n.d. | 1318,67 | 530,19 | 0,9993 |
| Día | Concentración (\mug/ml) | Pendiente | Corte-y | r | |||||
| 1,5 | 6 | 10 | 50 | 100 | 150 | ||||
| Media | 1,85 | 5,30 | 9,40 | 50,80 | 100,73 | 149,52 | 1312,52 | 322,59 | |
| S.D. | 0,04 | 0,15 | 0,19 | 0,63 | 1,05 | 0,73 | 11,69 | 404,93 | |
| C.V. | 2,3 | 2,8 | 2,0 | 1,2 | 1,0 | 0,5 | 0,9 | 125,5 | |
| (%) | |||||||||
| R = 0,9995 |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de enriquecimiento, se eliminaron las
proteínas del suero como se describe en 1.5.2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Día | Concentración (\mug/ml) | Pendiente | Corte-y | r | ||||
| 1 | 5 | 10 | 20 | 30 | ||||
| 1 | 1,05 | 4,48 | 10,10 | 22,10 | 28,61 | 15334 | -4719,83 | 0,9966 |
| 2 | 1,16 | 4,59 | 8,60 | 21,07 | 30,97 | 17559 | -4630,68 | 0,9960 |
| 3 | 1,07 | 4,64 | 9,81 | 20,07 | 30,45 | 17674 | -3175,63 | 0,9995 |
| 4 | 1,11 | 4,62 | 9,54 | 19,27 | 31,65 | 18322 | -4296,53 | 0,9981 |
| 5 | 1,06 | 4,81 | 9,99 | 18,89 | 31,40 | 17738 | -829,00 | 0,9985 |
| Media | 1,09 | 4,63 | 9,61 | 20,28 | 30,62 | 17325,40 | -3530,33 | |
| S.D. | 0,05 | 0,12 | 0,60 | 1,32 | 1,21 | 1151,65 | 1630,62 | |
| C.V. | 4,2 | 2,6 | 6,3 | 6,5 | 4,0 | 6,7 | 46,19 | |
| (%) | ||||||||
| R = 0,9959 |
Después de enriquecimiento, se eliminaron las
proteínas del suero como se describe en 1.5.2.
| Día | Concentración (\mug/ml) | Pendiente | Corte-y | r | ||||
| 1 | 5 | 10 | 20 | 30 | ||||
| 1 | 0,90 | 5,17 | 11,30 | 19,41 | 29,42 | 13498 | 2930,30 | 0,9980 |
| 2 | 0,99 | 4,87 | 10,12 | 21,51 | 28,68 | 15663 | 477,61 | 0,9982 |
| 3 | 0,94 | 4,94 | 11,29 | 19,41 | 29,59 | 14328 | 1367,80 | 0,9982 |
| 4 | 1,01 | 4,77 | 10,32 | 20,82 | 29,15 | 15777 | 1771,98 | 0,9992 |
| Día | Concentración (\mug/ml) | Pendiente | Corte-y | r | ||||
| 1 | 5 | 10 | 20 | 30 | ||||
| 5 | 1,01 | 4,81 | 10,10 | 20,86 | 29,28 | 15216 | 1612,77 | 0,9993 |
| Media | 0,97 | 4,91 | 10,62 | 20,40 | 29,23 | 14896,4 | 1632,09 | |
| S.D. | 0,05 | 0,16 | 0,61 | 0,95 | 0,35 | 967,46 | 881,47 | |
| C.V. | 5,2 | 3,2 | 5,8 | 4,6 | 1,2 | 6,5 | 54,01 | |
| (%) | ||||||||
| R = 0,9986 *concentración patrón (\mug/ml) -no determinado |
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede verse en estas tablas, se demostró la
linealidad en cada caso. Esto se refleja en los coeficientes de
correlación individuales "r", que en todos los casos son
>0,99. En cada tabla se describe la recta de regresión lineal de
la media para las curvas de concentración obtenidas en 5 días
diferentes, y se muestra que la pendiente era muy reproducible con
una variación máxima de 6,7%.
Las concentraciones patrón que se volvieron a
calcular presentaban como media un C.V. menor de 6,5% mostrando una
alta precisión de los valores. El valor de correlación común R mayor
que 0,99 expresa la gran precisión y reproducibilidad del
método.
Basándose en estos resultados el límite de
cuantificación en células Jurkat es 1,5 \mug/ml. En las muestras
de suero de rata y humano se puede detectar 1 \mug/ml de
L-DHO. Las muestras enriquecidas con esta
concentración mostraron una relación de señal a ruido de al menos 1
: 3.
La exactitud y precisión de las determinaciones
repetidas del L-DHO con tres concentraciones
diferentes y en cinco días diferentes se resumen en las tablas
6-8. La exactitud se expresa como el % de la
diferencia de la cantidad encontrada y añadida de
L-DHO (recuperación). La precisión en un mismo día
expresada como el C.V. (%) se calculó usando los dos valores que se
obtuvieron cuando una muestra se midió dos veces en un día. La
precisión entre distintos días también se expresó como el C.V. (%) y
se calculó usando los valores medios encontrados de cada muestra de
control en 5 días diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Exactitud | Precisión | ||||
| control | Día | n | Media | Recuperación | C.V. (%) | C.V. (%) |
| (\mug/ml) | encontrada (\mug/ml) | (%) | En un día | Entre días | ||
| 1 | 2 | 20,10 | +0,5 | 1,4 | ||
| 2 | 2 | 19,20 | -4,0 | 1,3 | ||
| 20 | 3 | 2 | 19,40 | -2,8 | 3,9 | 2,9 |
| 4 | 2 | 19,51 | -2,5 | 2,2 | ||
| 5 | 2 | 18,55 | -7,2 | 1,3 |
| Muestra | Exactitud | Precisión | ||||
| control | Día | n | Media | Recuperación | C.V. (%) | C.V. (%) |
| (\mug/ml) | encontrada (\mug/ml) | (%) | En un día | Entre días | ||
| 1 | 2 | 69,12 | -1,3 | 0,1 | ||
| 2 | 2 | 69,13 | -1,2 | 0,8 | ||
| 70 | 3 | 2 | 73,69 | +5,3 | 0,2 | 2,8 |
| 4 | 2 | 71,52 | +2,2 | 1,1 | ||
| 5 | 2 | 69,64 | -0,5 | 0,9 | ||
| 1 | 2 | 123,21 | -5,2 | 2,8 | ||
| 2 | 2 | 114,78 | -11,7 | 12,0 | ||
| 130 | 3 | 2 | 135,21 | +4,0 | 0,2 | 6, 0 |
| 4 | 2 | 126,89 | -2,4 | 1,4 | ||
| 5 | 2 | 122,43 | -5,8 | 4,1 |
| Muestra | Exactitud | Precisión | ||||
| control | Día | n | Media | Recuperación | C.V. (%) | C.V. (%) |
| (\mug/ml) | encontrada (\mug/ml) | (%) | En un día | Entre días | ||
| 1 | 2 | 7,68 | -4,0 | 0,4 | ||
| 2 | 2 | 7,73 | -3,4 | 1,0 | ||
| 8 | 3 | 2 | 7,83 | -2,2 | 2,1 | 3,0 |
| 4 | 2 | 7,43 | -7,1 | 1,0 | ||
| 5 | 2 | 8,06 | +0,7 | 0,6 | ||
| 1 | 2 | 14,53 | -3,1 | 6,8 | ||
| 2 | 2 | 14,73 | -1,8 | 1,3 | ||
| 15 | 3 | 2 | 14,26 | +5,0 | 0,1 | 1,8 |
| 4 | 2 | 14,85 | -1,0 | 0,4 | ||
| 5 | 2 | 14,88 | -0,8 | 0,9 | ||
| 1 | 2 | 24,98 | -0,1 | 2,5 | ||
| 2 | 2 | 25,83 | +3,3 | 1,3 | ||
| 25 | 3 | 2 | 25,43 | +1,7 | 0,6 | 3,7 |
| 4 | 2 | 24,31 | -2,8 | 2,0 | ||
| 5 | 2 | 26,81 | +7,2 | 0,2 |
| Muestra | Exactitud | Precisión | ||||
| control | Día | n | Media | Recuperación | C.V. (%) | C.V. (%) |
| (\mug/ml) | encontrada (\mug/ml) | (%) | En un día | Entre días | ||
| 1 | 2 | 7,77 | -2,9 | 0,7 | ||
| 2 | 2 | 7,84 | -2,0 | 15,5 | ||
| 8 | 3 | 2 | 7,43 | -7,1 | 10,9 | 3,8 |
| 4 | 2 | 7,17 | -10,4 | 2,1 | ||
| 5 | 2 | 7,80 | -2,5 | 1,2 | ||
| 1 | 2 | 13,88 | -7,5 | 0,9 | ||
| 2 | 2 | 14,00 | -6,7 | 8,5 | ||
| 15 | 3 | 2 | 15,10 | +0,6 | 1,5 | 6,0 |
| 4 | 2 | 15,13 | +0,8 | 7,2 | ||
| 5 | 2 | 16,03 | +6,8 | 12,8 | ||
| 1 | 2 | 26,56 | +6,2 | 3,4 | ||
| 2 | 2 | 23,77 | -4,9 | 0,7 | ||
| 25 | 3 | 2 | 24,80 | -0,8 | 4,7 | 4,2 |
| 4 | 2 | 25,46 | +1,8 | 7,8 | ||
| 5 | 2 | 24,54 | -1,9 | 0,2 |
Los resultados presentados aquí muestran que en
la mayoría de los casos los valores del control se encontraron con
una variación de +/-10% como máximo, y que por lo tanto el método es
muy exacto. Sólo en un caso la recuperación en las determinaciones
de las células Jurkat difería ligeramente de este valor (-11,7%).
Este efecto se puede explicar por la alta variación en un mismo día
de 12%. La precisión en un mismo día en las células Jurkat, suero de
rata o humano era inferior a 5%, 7% y 10% respectivamente. La
precisión entre distintos días en todas las matrices investigadas
era muy baja con un C.V. menor que 6,0%. Esto muestra que los
resultados obtenidos son muy reproducibles y precisos.
- Preparación del medio sin suero: Se disolvió
medio Iscove en polvo (Biochrom) en 10 litros de agua bidestilada
complementada con 18,95 g de NaCl, 11,43 g de NaHCO_{3}, 700 mg de
KCl, 10 ml de solución de NaOH al 35%, y 0,5 ml de solución de
mercaptoetanol 1 M (Riedel de Haen) y se esterilizó por filtración.
A un litro de medio Iscove preparado se añadieron 32 mg de
holotransferrina humana, 1 g de albúmina bovina y 1,5 ml de lípidos
(Sigma) antes de usar.
- Cultivo de células: Se cultivaron células
A20.2.J en medio sin suero (37ºC, CO_{2} al 5%) en un cultivo de
propagación hasta el crecimiento celular logarítmico. Las células
que se cogieron para los ensayos tenían una tasa de proliferación de
2,2 veces en 24 h. El porcentaje de células muertas era <8%
(3).
- Tratamiento de la célula con
N-(4-trifluorometil)-2-ciano-3-hidroxi-crotonamida
preparada como se describe en el documento
EP-0529500, en lo sucesivo A77 1726. Se disolvió A77
1726 en agua bidestilada (10 mM) y se diluyó más con medio sin
suero. Después se les dio a las células la cantidad adecuada de A77
1726 y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5%.
Las células preparadas se volvieron a suspender
en un volumen de medio y con densidad celular definidos. Dependiendo
del contenido de DHO esperado, se sacaron entre 1-50
millones de células, se sedimentaron (5 min, 350 x g) y se descartó
el líquido sobrenadante. Las células se lisaron por adición de 500
\mul de HClO_{4} 1,2 M. Los lisatos se transfirieron a tubos
Eppendorf de 2 ml con tapones herméticos, y se precipitó la proteína
por centrifugación a alta velocidad 2 min. Los lisatos acidificados
se separaron completamente, se transfirieron a viales de vidrio, y
después de añadir 500 \mul de cloroformo, se mezclaron
completamente mediante 2 min de mezcla vortical. Se extrajeron
lípidos celulares después de 10 min de centrifugación en frío (1502
x g; 10ºC). Los líquidos sobrenadantes purificados se recogieron en
tubos Eppendorf de 2 ml con tapones para almacenarlos a -20ºC hasta
la determinación por cromatografía líquida de alta presión
(HPLC).
La separación cromatográfica se llevó a cabo como
se describe en el ejemplo 1. El intervalo del detector de
conductividad se fijó en 10 \muS. El análisis se llevó a cabo a
temperatura ambiente. La fase móvil estaba compuesta de NaOH 10 mM
(A) y agua (B). Con este sistema se produjo el siguiente
gradiente:
| Tiempo (min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 1 | 99 |
| 2,5 | 1 | 99 |
| 14 | 8 | 92 |
| 22 | 8 | 92 |
| 28 | 60 | 40 |
| 32 | 60 | 40 |
| 34 | 1 | 99 |
| 49 | 1 | 99 |
El caudal era 1 ml/min; el tiempo del experimento
era 49 min.
Las células A20.2.J incubadas con A77 1726 tenían
cantidades mayores de DHO intracelular (Tablas
9-11). Los resultados representados en la Tabla 9
demuestran que los niveles de DHO se correlacionaban directamente
con el número de células extraídas.
\vskip1.000000\baselineskip
| Células (x 10^{6}) | Concentración de DHO (\mug/ml \pm SD) | |
| Experimento 1 (E10B) | Experimento 2 (E14) | |
| 1 | 14,08 \pm 2,40 | 11,75 \pm 0,23 |
| 2 | 19,51 \pm 6,47 | 28,27 \pm 0,79 |
| 4 | 53,58 \pm 3,50 | 57,20 \pm 2,76 |
| 6 | 73,01 \pm 1,49 | 85,38 \pm 2,33 |
| 8 | 99,89 \pm 5,96 | 107,02 \pm 3,47 |
| 10 | 113,37 \pm 4,24 | 128,73 \pm 1,95 |
Se trataron células A20.2.J con A77 1726 5 \muM
y se cultivaron durante 24 horas (37ºC, CO_{2} al 5%) y después se
prepararon para la extracción de DHO (n = 3).
Para optimizar los métodos de cultivo celular y
determinar la mejor relación célula/molaridad de A77 1726, se
incubaron diferentes densidades de células A20.2.J junto con A77
1726 (5 \muM). Se extrajeron muestras en diferentes puntos de
tiempo, y se determinaron las concentraciones de DHO (Tabla 10).
Debido al hecho de que las concentraciones de DHO se correlacionaban
directamente con la cantidad de células extraídas (véase la Tabla
9), para los siguientes experimentos las concentraciones de DHO se
extrapolaron a 10 x 10^{6} células en \mug/ml. El mejor aumento
lineal del nivel de DHO se encontró con una densidad de 1 x 10^{6}
células/ml. Usando esta densidad celular, se estudió el aumento de
los niveles de DHO intracelular dependientes del tiempo en células
incubadas con A77 1726. Se podían determinar cantidades detectables
de DHO después de 1 hora de incubación, independientes de la
concentración de fármaco (Tabla 11). Se registró un aumento lineal
con la cantidad más alta de DHO determinada después de 6 h (Tabla
11). Después de este periodo de tiempo se observó una saturación sin
aumento adicional de DHO.
\vskip1.000000\baselineskip
| Incubación | Concentración de DHO (\mug/ml) media \pm SD | ||
| Tiempo (h) | 1 x 10^{6} | 2 x 10^{6} | 3 x 10^{6} |
| células/ml | células/ml | células/ml | |
| 1 | 6,25 \pm 0,42 | 5,47 \pm 0,10 | 5,63 \pm 0,19 |
| 4 | 33,06 \pm 2,26 | 26,36 \pm 0,42 | 19,39 \pm 1,87 |
| 7 | 60,07 \pm 0,01 | 42,31 \pm 1,07 | 28,79 \pm 0,34 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron diferentes cantidades de células
A20.2.J junto con A77 1726 (5 \muM), durante los periodos de
tiempo dados antes, y se determinaron las concentraciones de DHO
intracelulares para cada muestra (*todos los valores extrapolados a
10 x 10^{6} células) (n = 2).
\vskip1.000000\baselineskip
| Incubación | Concentración de DHO (\mug/ml) media \pm SD | ||
| Tiempo (h) | A77 1726 | A77 1726 | A77 1726 |
| (5 \muM) | (10 \muM) | (25 \muM) | |
| 0 | 2,73 \pm 0,10 | 2,73 \pm 0,10 | 2,73 \pm 0,08 |
| 1 | 9,20 \pm 0,09 | 8,5 \pm 0,39 | 15,05 \pm 0,26 |
| 2 | 24,03 \pm 1,15 | 20,74 \pm 1,43 | 26,06 \pm 0,20 |
| 4 | 59,48 \pm 0,72 | 58,65 \pm 2,06 | 50,21 \pm 1,54 |
| 7 | 87,54 \pm 1,58 | 82,65 \pm 4,50 | 114,89 \pm 3,61 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron un millón de células A20.2.J/ml
junto con diferentes concentraciones de A77 1726 y se determinaron
sus concentraciones de DHO intracelular en diferentes puntos de
tiempo. Los datos se dan como \mug/ml de DHO \pm SD extrapolado
a diez millones de células (0-4 h = n = 2, 7 h = n =
4).
La incubación de células tumorales A20.2.J con
A77 1726, dio como resultado la rápida acumulación de
L-DHO debido a la inhibición de la
DHO-DH. Las concentraciones de L-DHO
intracelular se correlacionaban con el número de células y dependían
del tiempo. El seguimiento del L-DHO es un marcador
sustituto para la actividad inmunomoduladora de A77 1726.
Animales: Ratas macho
Wistar-Lewis (Mollegaard Breading Center Ltd. Ejby,
DK) con un peso corporal de 160-200 g.
Artritis inducida por adyuvante: La enfermedad se
indujo por inyección de 0,1 ml de adyuvante de Freund (6 mg de
Mycobacterium smegmatis suspendidos en 1 ml de parafina
blanca dura) (Merck, Darmstadt) en la raíz de la cola la colas de
las ratas Wistar-Lewis. Los síntomas patológicos en
general aparecieron entre 10 y 14 días después de inducir la
enfermedad.
Tratamiento con fármaco: Los fármacos se
suspendieron en carboximetilcelulosa (COMC) al 1%. Se administraron
a animales sanos (n = 18) y ratas con enfermedad inducida por
adyuvante (n = 18) (día 9 del trastorno) 10 mg/kg p.o. de
N-4-(trifluorometilfenil)-5-metilisoxazol-4-carboxamida,
en lo sucesivo leflunomida dos veces al día (7:30 h y 13:30 h)
durante 5 días, es decir en los puntos de tiempo: 0 h, 6 h, 24 h, 30
h, 48 h, 54 h, 72 h, 78 h, 96 h, (véase la tabla 12). En el punto de
tiempo 0 h, se sacrificaron 3 animales tanto del grupo enfermo como
del no enfermo, para determinar los niveles de los valores
iniciales. Se trataron 3 animales sanos y 3 enfermos adicionales con
placebo (solo COMC) durante 5 días.
Toma de muestras: Se sacrificaron tres animales
por grupo en cada punto de tiempo de toma de muestra. Se cogieron
suero y esplenocitos a las 3 h, 7 h, 27 h, 51 h, 75 h y 99 h (véase
la tabla 12). Con la excepción del valor de 7 h, las muestras se
cogieron tres horas después de la última aplicación de fármaco. El
valor de 7 h se cogió una hora después de la segunda administración
de dosis. Se tomaron muestras de los animales tratados con placebo
en los puntos de tiempo de 0 h (n = 3) y 99 h (n = 3).
| Hora: | 0 | 3 | 6 | 7 | 24 | 27 | 30 | 48 | 51 | 54 | 72 | 75 | 78 | 96 | 99 | ||||
| Fármaco | |||||||||||||||||||
| (p.o.) | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | ||||||||||
| Toma de | |||||||||||||||||||
| muestra | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | \uparrow | ||||||||||||
- La sangre recogida por punción cardiaca se
almacenó durante 30 min a 4ºC y después se centrifugó durante 10 min
a 3000 rpm. Se separó el suero y se almacenó en tubos Eppendorf con
tapones a -20ºC (3). Antes del análisis de HPLC, el suero congelado
se descongeló, con el fin de separar las proteínas, se añadieron 200
\mul de suero en un filtro Microcon (modelo 10, código 42407,
Amicon) y se centrifugaron durante 30 min a 13.000 rpm.
- Se cogieron los bazos (n = 3) y se juntaron
para analizar el L-DHO. Las células separadas por
filtración (pasándolas por un filtro de acero inoxidable), se
trataron con NH_{4}Cl 0,17 M, para producir la lisis de los
eritrocitos. Se prepararon partes alícuotas de 50 millones de
células de bazo por grupo, se pusieron en tubos tapados para la
centrifugación, y se descartó el líquido sobrenadante. Al sedimento
de células se añadieron, con mezcla permanente, 500 \mul de una
solución de HClO_{4} 1,2 M para producir la lisis de las células y
se centrifugó durante 2 min. El lisato celular ácido se transfirió
completamente a viales de vidrio, se añadieron 500 \mul de
cloroformo y se mezcló durante 2 min con un mezclador vortical. Los
lípidos celulares se hicieron precipitar por centrifugación (10 min
1502 x g y 10ºC). El líquido sobrenadante se puso en tubos con tapón
de 2 ml y se almacenaron a -20ºC.
La determinación de las concentraciones de A77
1726 en el suero se llevó a cabo como sigue: las muestras de suero
se llevaron a temperatura ambiente y se mezclaron completamente
usando un mezclador vortical. El suero se pipeteó (200 \mul) en
tubos Eppendorf con tapón y se añadió el patrón interno (A77 1726, 2
\mug en 400 \mul de acetonitrilo). Después los tubos se
mezclaron en un mezclador vortical y se centrifugaron a 2500 rpm
(temperatura ambiente) durante 10 minutos. Para el análisis de HPLC
el líquido sobrenadante (400 \mul) se transfirió a un vial y se
añadió agua (400 \mul) y se mezcló. Las condiciones de HPLC eran
las siguientes: El hardware consistía en una bomba TSP P2000, un
autoinyector TSP AS1000, un integrador TSP SP4270, y un detector de
UV TSP UV100. La detección se hizo a una longitud de onda de 292 nm.
La fase móvil consistía en 650 ml de metanol (CHROMASOLV), 2,42 g de
bromuro de tetrabutilamonio, y 350 ml de acetato amónico 0,05 M. El
caudal era 0,5 ml/min. Se usó una columna CHROMPACK Spherisorb
ODS-2 de 10 cm con una columna de seguridad (R2) de
fase inversa de 1 cm. Se inyectaron 100 \mul en la columna y el
tiempo del experimento fue 7 min.
Determinación de las concentraciones de
L-DHO por HPLC: La separación cromatográfica se
llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1. El intervalo del
detector de conductividad se fijó a 10 \muS; el análisis se llevó
a cabo a temperatura ambiente. La fase móvil estaba compuesta de
NaOH 100 mM (A) y agua (B). Con este sistema se produjeron los
siguientes gradientes:
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo (min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 1 | 99 |
| 2,5 | 1 | 99 |
| 14 | 23 | 77 |
| 18 | 60 | 40 |
| 24 | 60 | 40 |
| 26 | 1 | 99 |
| 45 | 1 | 99 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo (min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 1 | 99 |
| 2,5 | 1 | 99 |
| 14 | 8 | 92 |
| 22 | 8 | 92 |
| 28 | 60 | 40 |
| 32 | 60 | 40 |
| 34 | 1 | 99 |
| 49 | 1 | 99 |
El caudal era 1 ml/min
Tanto las ratas sanas como las enfermas tienen un
aumento de las concentraciones de L-DHO celular
(Tabla 13) y en el suero (Tabla 14) después de la administración
oral de leflunomida. Este aumento se correlacionaba con las
concentraciones de A77 1726 en el suero determinadas en estos
animales (Tabla 15). Inicialmente, 3 horas después de la
administración de fármaco por vía oral, la concentración de A77 1726
alcanzó una concentración de aproximadamente 26 \mug/ml en ratas
con enfermedad inducida por adyuvante y 31 \mug/ml en ratas no
enfermas. Estos valores alcanzaron su máximo una hora después de la
segunda dosificación (7 h), pero disminuyeron a valores entre 7 y 12
\mug/ml durante el experimento tanto en las ratas enfermas como en
las no enfermas. Los animales enfermos tardaron 51 h en alcanzar
estas concentraciones, mientras que las ratas no enfermas los
alcanzaron después de 27 h (Tabla 15). Las concentraciones en el
suero de A77 1726 se correlacionaban con las concentraciones de
L-DHO en el suero de roedores con enfermedad
inducida por adyuvante y no enfermos. Al contrario que las
concentraciones de L-DHO en el suero, que se
equilibraron a aproximadamente 5 \mug/ml durante la duración del
experimento, la cantidad de L-DHO encontrada en los
esplenocitos disminuyó por debajo del límite de detección (1,5
\mug/ml)
después de 99 h.
después de 99 h.
| Ratas con enfermedad | ||||||||
| inducida por adyuvante | Ratas no enfermas | |||||||
| Tiempo | Valor | Media | SD | SD | Valor | Media | SD | SD |
| [Horas] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] |
| 0 | <L.D. | <L.D. | ||||||
| (Placebo) | <L.D. | <L.D. | <L.D. | <L.D. | ||||
| 5,81 | 5,09 | |||||||
| 3 | 4,60 | 5,21 | 0,60 | 11,52 | 6,31 | 5,70 | 0,61 | 10,70 |
| 13,00 | 16,77 | |||||||
| 7 | 11,22 | 12,11 | 0,89 | 7,35 | 14,87 | 15,82 | 0,95 | 6,01 |
| 16,28 | 8,69 | |||||||
| 27 | 16,84 | 16,56 | 0,28 | 1,69 | 10,25 | 9,47 | 0,78 | 8,24 |
| 51 | 3,63 | 1,84 | ||||||
| 3,97 | 3,80 | 0,17 | 4,47 | 2,34 | 2,09 | 0,25 | 11,96 | |
| 75 | 2,58 | 1,92 | ||||||
| 2,71 | 2,65 | 0,06 | 2,26 | 2,24 | 2,08 | 0,16 | 7,69 | |
| <L.D. | <L.D. | |||||||
| 99 | <L.D. | <L.D. | <L.D. | <L.D. | ||||
| Placebo | <L.D. | <L.D. | ||||||
| (99) | <L.D. | <L.D. | <L.D. | <L.D. |
Los animales se trataron con leflunomida o
placebo, se sacaron los bazos (n = 3) y se juntaron como se ha
descrito. Los esplenocitos juntados se ensayaron por duplicado. L.D.
= límite de detección (1,5 \mug/ml).
| Ratas con enfermedad | |||||||||
| inducida por adyuvante | Ratas no enfermas | ||||||||
| Tiempo | Rata | Valor | Media | SD | SD | Valor | Media | SD | SD |
| [Horas] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | |
| 1 | <L.D. | <L.D. | |||||||
| 0 | 2 | <L.D. | <L.D. | <L.D. | <L.D. | ||||
| (Placebo) | 3 | <L.D. | <L.D. | ||||||
| 1 | 7,85 | 11,92 | |||||||
| 3 | 2 | 9,66 | 8,52 | 0,99 | 11,70 | 10,88 | 11,13 | 0,67 | 6,30 |
| 3 | 8,05 | 10,60 | |||||||
| 1 | 19,55 | 20,29 | |||||||
| 7 | 2 | 17,00 | 17,54 | 1,81 | 10,30 | 18,14 | 18,66 | 1,45 | 7,80 |
| 3 | 16,06 | 17,54 |
| Ratas con enfermedad | |||||||||
| inducida por adyuvante | Ratas no enfermas | ||||||||
| Tiempo | Rata | Valor | Media | SD | SD | Valor | Media | SD | SD |
| [Horas] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | |
| 1 | 19,73 | 8,22 | |||||||
| 27 | 2 | 15,95 | 16,45 | 3,06 | 18,60 | 8,42 | 8,43 | 0,21 | 2,50 |
| 3 | 13,67 | 8,64 | |||||||
| 1 | 3,06 | 4,87 | |||||||
| 51 | 2 | 3,68 | 3,27 | 0,36 | 11,00 | 4,77 | 4,55 | 0,46 | 10,20 |
| 3 | 3,06 | 4,02 | |||||||
| 1 | 5,38 | 4,60 | |||||||
| 75 | 2 | 4,45 | 5,14 | 0,61 | 11,90 | 4,17 | 4,33 | 0,23 | 5,40 |
| 3 | 5,60 | 4,23 | |||||||
| 1 | 5,48 | 5,67 | |||||||
| 99 | 2 | 5,48 | 5,02 | 0,41 | 8,30 | 6,64 | 5,75 | 0,85 | 14,80 |
| 3 | 4,68 | 4,95 | |||||||
| Placebo | 1 | <L.D. | <L.D. | ||||||
| (99) | 2 | <L.D. | <L.D. | <L.D. | <L.D. | ||||
| 3 | <L.D. | <L.D. |
Los animales se trataron con leflunomida o
placebo, y se cogió, preparó y ensayó la sangre como se ha descrito
antes. Se determinaron las concentraciones de L-DHO
en el suero para cada animal individualmente. L.D. = límite de
detección (0,5 \mug/ml);
\vskip1.000000\baselineskip
| Ratas con enfermedad | |||||||||
| inducida por adyuvante | Ratas no enfermas | ||||||||
| Tiempo | Rata | Valor | Media | SD | SD | Valor | Media | SD | SD |
| [Horas] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | |
| 1 | 0,0 | 0,0 | |||||||
| 0 | 2 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | ||
| (Placebo) | 3 | 0,0 | 0,0 | ||||||
| 1 | 26,8 | 32,0 | |||||||
| 3 | 2 | 27,2 | 26,33 | 1,17 | 4,45 | 30,6 | 30,7 | 1,21 | 3,92 |
| 3 | 25,0 | 29,6 | |||||||
| 1 | 44,1 | 47,7 | |||||||
| 7 | 2 | 45,2 | 42,3 | 4,11 | 9,71 | 49,4 | 47,9 | 1,46 | 3,04 |
| 3 | 37,6 | 46,5 | |||||||
| 1 | 21,3 | 10,2 | |||||||
| 27 | 2 | 22,0 | 19,7 | 3,34 | 16,92 | 9,9 | 9,6 | 0,74 | 7,65 |
| 3 | 15,9 | 8,8 |
| Ratas con enfermedad | |||||||||
| inducida por adyuvante | Ratas no enfermas | ||||||||
| Tiempo | Rata | Valor | Media | SD | SD | Valor | Media | SD | SD |
| [Horas] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | solo | [\mug/ml] | [\mug/ml] | [%] | |
| 1 | 9,1 | 7,8 | |||||||
| 51 | 2 | 10,2 | 9,2 | 1,00 | 10,93 | 8,7 | 7,4 | 1,48 | 19,97 |
| 3 | 8,2 | 5,8 | |||||||
| 1 | 9,0 | 6,7 | |||||||
| 75 | 2 | 7,3 | 9,9 | 3,09 | 31,34 | 9,4 | 8,1 | 2,35 | 16,70 |
| 3 | 13,3 | 8,2 | |||||||
| 1 | 12,0 | 14,6 | |||||||
| 99 | 2 | 11,9 | 12,2 | 0,38 | 3,11 | 11,4 | 12,7 | 2,67 | 13,08 |
| 3 | 12,6 | 12,2 | |||||||
| 1 | 0,0 | 0,0 | |||||||
| Placebo | 2 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | ||
| (99) | 3 | 0,0 | 0,0 |
Los animales se trataron con leflunomida o
placebo, y se cogió, preparó y ensayó la sangre como se ha descrito
antes. Se determinaron las concentraciones de A77 1726 en el suero
para cada animal individualmente.
La leflunomida aplicada por vía oral se convirtió
muy rápido en A77 1726 in vivo. A77 1726 es el metabolito
activo de la leflunomida (documento US 5.679.709). La incubación de
ratas con enfermedad inducida por adyuvante o no enfermas con
leflunomida dio como resultado la rápida acumulación de
L-DHO en el suero y esplenocitos. La concentración
de L-DHO se correlacionó con las concentraciones en
el suero de A77 1726, demostrando así la supresión activa de la
DHO-DH mediante esta molécula in vivo. En los
estudios clínicos humanos, el seguimiento del L-DHO
puede ser un marcador sustituto de la actividad inmunomoduladora de
la leflunomida en pacientes.
Claims (10)
1. Un procedimiento para obtener ácido
L-dihidroorótico por cromatografía que comprende las
etapas de:
a) obtener una columna que comprende material de
intercambio aniónico estable con la presión;
b) cargar la columna con una solución de la
muestra que incluye ácido L-dihidroorótico;
c) llevar a cabo la cromatografía;
d) eluir el ácido
L-dihidroorótico con una solución de elución que
contiene una mezcla de agua y base;
llevándose a cabo dicho procedimiento a una
presión de 1,1 MPa a 40 MPa.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la base es hidróxido sódico.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el material de intercambio aniónico
estable con la presión es un polímero de
divinilbenceno/etilvinilbenceno o un polímero de
polivinilbencilamonio reticulado con divinilbenceno o mezclas de los
mismos que se modifican con alcanol-amonio
cuaternario.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la presión es de 4,1 MPa a 5,5 MPa.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la elución de la mezcla de base y agua
presenta un gradiente de la concentración de la base con el tiempo,
preferiblemente con un desarrollo lineal.
6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido
L-dihidroorótico se detecta con un detector de
conductividad.
7. El uso del procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para preparar un ensayo de
diagnóstico.
8. El uso del procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para determinar los
inhibidores de la ácido
dihidroorótico-deshidrogenasa.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que el
inhibidor de la ácido dihidroorótico-deshidrogenasa
es la
N-4-(trifluorometilfenil)-5-metilisoxazol-4-carboxilamida,
Brequinar,
N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxihept-2-en-6-ino-carboxamida,
2-ciano-3-ciclopropil-3-(ácido
hidroxiacrílico)-(4-cianofenil)-amida
y/o
N-(4-trifluoro-metilfenil)-2-ciano-3-hidroxicrotonamida.
10. El uso de la determinación del ácido
L-dihidroorótico para el seguimiento de la actividad
de los inhibidores de la ácido
dihidroorótico-deshidrogenasa.
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