JP4189124B2 - L−ジヒドロオロト酸を得るための方法およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、約1.1MPaないし約40MPaの圧力下での塩基水混合物中の陰イオン交換物質上のクロマトグラフィーによってL−ジヒドロオロト酸(以下“L−DHO”)を得るための方法に関する。この方法は、N−(4−トリフルオロメチルフェニル)−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキサミド、N−(4−トリフルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−ヒドロキシクロトンアミドおよび類似の化合物の試験管内および生体内活性を研究するために使用することができる。
【0002】
L−DHOは、シリカゲルクロマトグラフィー手順後に化学的誘導体化および比色測定を行うことによって決定することができる[Kesner、L.、Aronson、F.L.、Silverman、M.、Chan、P.C.、Clin.Chem 21/3(1975)353]。もう1つの方法は、L−DHOを、ラットの肝臓から調製したL−ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ(以下“DHODH”)によって酵素作用でオロト酸に変換し、化学的誘導体化後に、比色的変化によってオロテート(orotate)を検出する[Rogers、L.E.、Nicolaisen、K.、Experientia 28/10(1972)1259]。これらの方法の不利な点は、複雑な生理的溶液中のその他の物質の妨害である。その上、上述の手順は、面倒な試料調製のため非常に時間がかかり、そのため大規模な臨床研究における日常分析に対して適応できない。
【0003】
L−ジヒドロオロト酸を得るための改良された分離および単離方法を提供するための努力の中で、このたび、これを、陰イオン交換物質上、圧力約1.1MPaないし約40MPaでの塩基水混合物中のL−DHOのクロマトグラフィーによって達成できることが見出された。この方法は、細胞溶解産物、哺乳類血清およびヒト血清中のL−DHOの定量のために使用することができる。上記の方法は、高度に再現性があり、鋭敏であり、そして有効である。
【0004】
特許請求の範囲で説明したとおり、本発明は、次の工程:
a) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し;
b) このカラムにL−ジヒドロオロト酸を含む試料溶液を装填し;
c) クロマトグラフィーを実施し;
d) L−ジヒドロオロト酸を塩基水混合物を含む溶離液で溶離すること;
より成り、この方法を約1.1MPaないし約40MPaの圧力下で実施する、クロマトグラフィー法によって目的を達成される。
【0005】
圧力安定性陰イオン交換物質という用語は、例えばアルカノール第四級アンモニウムで変性させた、マクロポウラス
ジビニルベンゼン/エチルビニルベンゼン重合体またはミクロポウラスのジビニルベンゼンで架橋したポリビニルベンジルアンモニウム重合体またはそれらの混合物類;または塩化ビニルベンジル/ジビニルベンゼンマクロポウラス重合体;または架橋ポリエチルイミノポリマー;またはプロピル−トリメチル−アンモニウムで変性させたシリカ;またはポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)トリメチルアンモニウムのような物質を意味する。
【0006】
下記の製品が特に好ましい:
ディオネクス・コーポレーション(Dionex Corporation)、イドシュタイン(Idstein)、ドイツ、によって供給されるイオンパック(Ion Pac)AS11、カーボパック(CarboPac)PA1またはカーボパックMA1陰イオン交換カラム、
グロム(Grom)によって供給されるグロム−シル(GROM−SIL)、ストロング・アニオン(Strong Anion.)またはグロム−シル(GROM−SIL)、ウィーク・アニオン(Weak Anion.)、
クロムパック(Chrompack)によって供給されるP 1000 SAX、イオノスファー(Ionospher)SAまたはクロムパックPA、
ハミルトン(Hamilton)によって供給されるPRP−X100またはRCX−10。
【0007】
溶離液は、塩基水混合物を含む。適当な塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムまたは水酸化カルシウムのようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属から誘導される。塩基の濃度は、溶媒としての水に基づいて、1ミリモル/lないし約200ミリモル/l、好ましくは2ミリモル/lないし約120ミリモル/l、特に好ましくは100ミリモル/lである。
【0008】
クロマトグラフィー手順中の温度は、約0℃ないし約50℃、好ましくは約15℃ないし約30℃、特に好ましくは約19℃ないし約25℃である。クロマトグラフィー中の操作圧力は、事実上一定である。クロマトグラフィーは、異なる圧力を使用して実施することができ、例えばクロマトグラフィーは、約1.1 106Pa(1.1MPa)ないし約40 106Pa(40MPa)、特に4.1MPaないし5.5MPaの圧力下で実施することができる。溶離剤の流量は、約0.2ml/分ないし約3ml/分、好ましくは1ml/分である。
カラムの装填、クロマトグラフィー、およびL−DHOの溶離は、公知の一般的な技法によって行う。
【0009】
適当な溶離は、その溶離が、好ましくは直線状の、塩基濃度の時間勾配を示すものである。この濃度勾配は、例えば、この溶離の最初の溶離には低塩基濃度(極限の場合にはゼロ)が存在することによって、そして溶離プロセス中塩基濃度を増大させることによって適用することができる。このようにして、血清または細胞溶解産物由来の試料中のL−DHOの特に有効な分離を達成することが可能である。好ましい塩基勾配は、ほぼ1%NaOH(100ミリモル/L)および99%水(溶離の最初)から約60%NaOHおよび40%水(溶離の終わり)まで変化し、特に好ましい範囲は、約1%NaOHおよび99%水(溶離の最初)から約15%NaOHおよび75%水(溶離の終わり)までである。塩基水勾配は、2.5分から約14分までそして14分から約25分まで、直線状に変化させられ、ここでこの勾配の傾斜は、これらの2期間中で異なっている。
【0010】
特に適する溶離は、この分離プロセスの最初に約1%という低塩基濃度を約2.5分の間使用することによって達成することができる。その結果、このカラムの生物学的マトリックスからの妨害物質のほとんどが溶離される。分析物の分離は、14分の全分析時間内に勾配を約23%の塩基までゆっくり増大させることによって達成することができる。次に、塩基濃度を4分内に約60%まで増大させて、強く結合している物質を溶離する。60%の塩基は、再平衡化が1%塩基水混合物によって行われるまで、6分以内の間適用されなくてはならない。次の分析は、全分析時間45分の後に開始される。
【0011】
塩基水勾配中の水は、脱イオン化され、そして脱気されなくてはならない。
本発明に従う分離法は、カラム法で行われる。温度(好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー中一定に保たれる)は、広い範囲内で変えることができる。好ましい温度範囲は、約−10℃から約50℃まで、特に約15℃から約25℃までである。
【0012】
L−DHOの溶離は、勾配の開始の10分ないし12分後に起こる。溶離プロセスの操作時間は、13分から25分までである。L−DHOは、ダイオネクス・コオペレーション(Dionex Cooperation)からの型CD20のような導電率検出器によって検出される。基準線シフトを最小にし、バックグラウンド導電率を低下させるために、ダイオネクス・コオペレーションからの型ASRS−1、4mmのような陰イオン自己再生抑制器を使用することができる。
【0013】
本発明に従う方法は、特に分析用クロマトグラフィーに適するが、しかしまた、特に本発明に従う方法を分取高速液体クロマトグラフィーカラム(HPLC)システムを用いて実施するときは、分取クロマトグラフィーについて使用することもできる。“分取クロマトグラフィー”という用語は、純粋な生成物を、得ることを目的とし、単に分析するだけではない精製法を意味する。純粋な生成物の量は、広い範囲内で、例えば1mgから1000gまで、好ましくは50mgと500mgとの間で、変動することができる。
【0014】
本発明に従う方法は、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ(DHO−DH)の阻害による細胞内または細胞外L−DHO濃度の変化を検出するために使用することができる。酵素DHO−DHは、初めからのピリミジン合成中のL−ジヒドロオロト酸のオロト酸への変換の原因となるものである。DHO−DHの阻害によりL−DHOの蓄積が起こる。本発明に従う方法は、診断用検定の調製物のために使用することができる。本発明に従う方法は、DHO−DH阻害剤の活性を決定するために使用することができる。DHO−DH阻害剤は、例えばN−4−(トリフルオロメチルフェニル)−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキシルアミド、ブレキナール(Brequinar)、N−(4−トリ−フルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−ヒドロキシヘプタ−2−エン−6−イン−カルボキサミド、2−シアノ−3−シクロプロピル−3−ヒドロキシアクリル酸−(4−シアノフェニル)−アミドまたはN−(4−トリフルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−ヒドロキシクロトンアミドである。本発明に従う方法は、植物、細胞系、動物およびヒトにおけるL−DHO濃度を決定するために使用することができる。L−DHO決定は、植物、哺乳類およびヒトにおけるDHO−DH阻害剤の活性を監視するために使用することができる。
本発明に従う方法を、以下の実施例において詳細に説明する。他に指示しないかぎり、百分率データは、重量に関連する。
【0015】
実施例1
【0016】
1.2. クロマトグラフィー装置
HPLCシステムは、下記の機器より成っていた:
【0017】
【表1】
ピーク(peek)物質を、これらの実験を通して使用した。
【0018】
1.3. HPLC条件
クロマトグラフィー分離は、イオンパック(IonPac)AG11 50×4mm I.D.プレカラム[粒径13μm;P/N 044078、ダイオネクス]を装備した250×4mm I.D.イオンパックAS11陰イオン交換カラム[粒径13μm;P/N 044076、ダイオネクス]を用いて実施した。さらに、陰イオントラップカラムATC−1[P/N 037151、ダイオネクス]を勾配ポンプと注入バルブとの間に取り付けた。基準線シフトを最小にし、バックグラウンド導電率を低下させるために、300mAで作動するASRS−1抑制器を取り付けた。検出器の領域は、10μSにセットした。オートサンプラーを14℃に冷却したが、分析自体は、室温で実施した。移動相は、100mM NaOH(A)および脱イオンおよび脱気水(B)から成っていた。この系を使用すると下記の勾配を得た:
時間 ( 分 ) A ( % ) B ( % )
0 1 99
2.5 1 99
14 23 77
18 60 40
24 60 40
26 1 99
45 1 99
流量は、1ml/分であり;操作時間は、45分であった。
【0019】
1.4. 標準および品質管理試料
標準原液は、1mgのL−DHOを1mlの水に溶解させることによって製造した。400μlずつのアリコートを−20℃で凍結させた。これらの溶液の安定性は、少なくとも4週間保証された。この原液の所定量を、細胞溶解産物およびヒトまたはラット血清に加えて、シグナルの増大とスパイクしたL−DHO濃度との間の直線性を評価するために検定した。この方法の精密度および正確度は、シグナル/濃度直線性曲線の低、中および高濃度領域のL−DHO含量をもつ品質管理(QC)試料を使用することによって調査した。
【0020】
1.5.試料調製
1.5.1.細胞
ジャーカット細胞は、ATCC(TIB 182)によって得て、1.5.1.1.で説明するように培養した。
【0021】
1.5.1.1.組織培養条件
ジャーカット細胞を5×105/mlで接種して、RPMI 1640培地および10%ウシ胎仔血清(FCS)中で24時間成長させた。細胞を細胞溶解産物用の新しい培地中にプールして、細胞の量および死亡細胞の百分率をエオシンを用いる生体顕微鏡検査法によって計算した。24時間後に細胞数は、1.6〜1.8倍に増加し、死亡細胞は7%よりも少なかった。L−DHO決定用に採取したジャーカット細胞は、24時間で増殖率1.6〜1.8倍および7%よりも少ない死亡細胞を有していた。
【0022】
1.5.1.2.細胞溶解産物の製造
細胞を、所定の培地体積中に懸濁させて、試料の細胞密度を、エオシンを使用する生体顕微鏡検査法によって決定した。約10×106の細胞を取り出して、350×gで5分の遠心分離によってペレット化し、上澄みを捨てた。この細胞ペレットを500μlの1.2M HCLO4中に再懸濁させることによって細胞の溶解を行った。この混合物を2.0mlエッペンドルフ(Eppendorf)セーフ−ロックキャップ(safe-lock caps)中に移し、タンパク質を2分の高速遠心分離によって沈殿させた。上澄みを完全に取り出して、ガラスバイアル中に移し、500μlのクロロホルムを添加した後、2分間渦動させる(vortexing)ことによって完全に混合した。10℃で10分間遠心分離(1502g)した後、細胞脂質をクロロホルムによって抽出した。精製した上澄みを2mlエッペンドルフ−キャップ中に集めて、次に使用するまで−20℃で貯蔵した。HPLC分析用には、100μlのこの上澄みを30μlの6M KOHで中和した。約5秒間震盪させた後、この試料を氷上で30分間貯蔵した。その後これらを15000rpmで5分間遠心分離した。透明な上澄みから20μlをHPLC分析のために使用した。
【0023】
1.5.2.血清
タンパク質含量を減少させるために200μlの血清をマイクロコン(Microcon)フィルター[10000D、型10、コード42407、アミコン(Amicon)]に加えて、13000回転毎分(rpm)で30分間遠心分離した。貫流物(flow through)は、約150μlより成り、分析物L−DHOを含有する。この液体から20μlをHPLC分析のために使用した。
【0024】
1.6.定量化
積分器は、分析物のピーク−高さを決定した。校正曲線は、異なる生物学的マトリックスにおける測定されたピーク高さ(y)対分析物濃度をプロットすることによって得た。重みつき線形回帰(1/y)は、標準試料ならびに品質対照におけるL−DHO濃度を逆算するために使用した。共通相関係数(common correlation coefficient)Rは、重みづけ因子を使用する共分散モデルの分析に基づくPROC GLMによってもたらされた。
【0025】
1.7.安定性
表1は、1つの試料の2〜3回の凍結/融解サイクル後の、細胞溶解産物および血清試料中での−20℃での分析物の安定性データを示す。L−DHOは、ジャーカット細胞中での上記の条件下で、少なくとも4週間にわたって安定であった。数回の融解サイクル後に検出された、いくつかのラット血清試料および1つのヒト血清試料の濃度の10%より多い増大は、説明できず、そしてそのような場合における正確度は、一般には15%まで、そして最悪では29%まで低下させ得ることを示す。これらの理由で、ラットおよびヒトの血清試料ではL−DHOは、少なくとも1週間だけは明確に安定であることだけは述べることができる。
【0026】
【表2】
【0027】
試料がオートサンプラー内で実際の分析を待っているときの試料の状態を模倣するために、14℃で18時間の間の安定性を測定した。そのため、細胞溶解産物は、スパイクした後、分析の開始前に30μlの6M KOH/100μl溶解産物で処理した。相応して、血清試料は、スパイクした後、1.5.2.に記載したように除タンパクした。
【0028】
表2において見ることができるように、L−DHO含量は、これらの条件下で細胞においては最大約7%までわずかに減少する。血清試料においては、分析物は、これらの条件下で安定である。これらの理由だけのために、非常に多くのHPLC試料が調製されて、オートサンプラー中の滞在の最大長さは、18時間未満であった。
【0029】
【表3】
【0030】
1.8.選択性
スパイクしていないジャーカット細胞溶解産物を、50μg L−DHO/mlでスパイクした細胞溶解産物を使用した相当するクロマトグラムと比較すると、L−DHOと同一の保持時間である11.983分に小さなピークがあることを示した。このピークがこれらの細胞中の分析物の自然含量の結果であることは、非常に可能性がある。さらに、細胞溶解産物をKOHで処理したためにL−DHOピークが2つのピークに分裂することは、考えることができる。しかしながらKOH処理は、HPLC分析前に酸性細胞溶解産物を中和するために必須である。上記した条件下では、2番目のピーク高さ[保持時間(RT)=11.954分]の評価は、直線性および再現性に関して改良された結果を得るために使用できることが示された。
【0031】
またラットおよびヒトの血清の場合にも、L−DHOと同一保持時間を持つ空試験値が見出された。これは、その有機体の自然L−DHO含量を反映していることが考えられる。両方の種の少なくとも10の異なる試料の測定は、自然L−DHO含量が検出限度1μg/mlよりも低かったことを示している。
【0032】
1.9.直線性
測定の直線性を、上記細胞系および上記の異なる血清試料についての5つの校正曲線に関して評価した。試料は、調製して、別々の5日に1.5〜150μg/ml(細胞溶解産物)および1〜30μg/ml(血清試料)の範囲のL−DHO濃度を使用して操作した。結果を表3〜5に示す。回帰線の決定のためにはピーク高さを使用した。それを基にして相当する異なる標準の濃度を、別の表に示すように逆算した。
【0033】
【表4】
【0034】
【表5】
【0035】
【表6】
【0036】
これらの表で見ることができるように、各々の場合の直線性が証明された。これは、個々の相関係数“r”に反映されており、この値は、すべての場合に>0.99である。別々の5日に得た濃度曲線に対する平均線形回帰線は、各表に記載され、勾配が最大変動6.7%で十分に再現性があったことを示している。
【0037】
逆算した標準濃度は、平均で6.5%より小さいC.V.を示し、その値の高い正確度を示した。0.99よりも高い共通相関係数Rは、この方法の非常に高い精密度および再現性を表す。
【0038】
1.10.定量化の限度
これらの結果に基づいて、ジャーカット細胞における定量化の限度は、1.5μg/mlである。ラットおよびヒト血清試料においては、1μg/mlのL−DHOを検出することができる。これらの濃度でスパイクした試料は、シグナル対ノイズ比、少なくとも1:3を示した。
【0039】
1.12.正確度および精密度
別々の5日の3つの異なる濃度でのL−DHOの反復測定の正確度および精密度を、表6〜8に要約する。
正確度は、加えたL−DHO量に対する測定されたL−DHO量の%差異(回収率)として表す。C.V.(%)として表された日内精密度は、1つの試料を1日に2回測定したときに得られた2つの値を使用して計算した。日間精密度もまた、C.V.(%)として表し、別々の5日の各対照試料の平均測定値を使用して計算した。
【0040】
【表7】
【0041】
【表8】
【0042】
【表9】
【0043】
ここに示した結果は、ほとんどの場合において対照値は最大で+/−10%の変動で測定されたこと、およびそのためこの方法は非常に正確であることを示している。1つの場合にだけジャーカット細胞測定における回収率がこの値とは少し異なっていた(−11.7%)。この効果は、12%という高い日内変動によって説明することができる。ジャーカット細胞、ラットまたはヒト血清における日内精密度は、各々5%、7%および10%よりも低かった。研究したすべてのマトリックスにおける日間精密度は、非常に低く、6.0%よりも小さいC.V.を有していた。これは、得られた結果が非常に再現性があり、精密であることを示す。
【0044】
実施例2
2.1.組織培養条件:
− 血清を含まない培地の調製:イスコブ(Iscove)粉末培地[バイオクロム(Biochrom)]を、18.95g NaCl、11.43g NaHCO3、700mg KCl、10ml 35%NaOH溶液、および0.5ml 1Mメルカプトエタノール溶液[リーデル・ド・ハーン]で補充した10リットルの2度蒸留した水に溶解させ、無菌濾過した。1リットルの調製したイスコブ(Iscove)培地に、使用前に、32mgヒトホロ−トランスフェリン、1gウシアルブミンおよび1.5ml脂質[シグマ]を加えた。
【0045】
− 細胞培養:A20.2.J細胞を、対数細胞増殖での膨張培養において血清を含まない培地(37℃、5%CO2)中で培養した。検定のために採取した細胞は、24時間で2.2倍の増殖速度を有していた。死亡細胞の百分率は、<8%であった(3)。
【0046】
− EP−0529500に記載されたようにして製造したN−(4−トリフルオロメチル)−2−シアノ−3−ヒドロキシ−クロトンアミド(本明細書中ではこの後A771726)での細胞の処理。A771726を2回蒸留水(aqua bidest)(10mM)に溶解させ、血清を含まない培地中でさらに希釈した。次に細胞に適当な量のA771726を与えて、37℃、5%CO2でインキュベートした。
【0047】
2.2.DHO測定のための細胞−溶解産物の調製:
調製した細胞を所定の培地体積および細胞密度において再懸濁させた。期待されたDHO含量に依って、100〜5000万個の間の細胞を取り出して、ペレット化し(5分、350×g)、そして上澄みを捨てた。500μlの1.2M HClO4を加えることによって細胞を溶解させた。溶解産物を2mlのエッペンドルフセーフ−ロック−キャップ内に移して、タンパク質を2分間の高速遠心分離によって沈殿させた。酸性化した溶解産物を完全に取り出して、ガラスバイアル内に移し、500μlのクロロホルムを添加した後に、2分間渦動させることによって完全に混合した。10分間の冷遠心分離(1502×g;10℃)に続いて細胞脂質を抽出した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)測定まで−20℃で貯蔵するために、精製した上澄みを2mlのエッペンドルフキャップ内に集めた。
【0048】
2.3.DHOのHPLC測定:
クロマトグラフィー分離は、実施例1に記載したように実施した。導電率検出器の領域は、10μSにセットした。分析は、室温で実施した。移動相は、100mM NaOH(A)および水(B)から成っていた。この系を使用して下記の勾配を得た:
時間 ( 分 ) A ( % ) B ( % )
0 1 99
2.5 1 99
14 8 92
22 8 92
28 60 40
32 60 40
34 1 99
49 1 99
流量は、1ml/分であり;操作時間は、49分であった。
【0049】
2.4.結果
A771726とともにインキュベートしたA20.2.J細胞は、増加した細胞内DHO量を有した(表9〜11)。表9に示される結果は、DHO−水準は、抽出された細胞の数と直接相関したことを証明する。
【表10】
A20.2.J細胞を、5μMのA771726でで処理し、24時間培養(37℃、5%CO2)してから、DHO抽出のために調製した(n=3)。
【0050】
細胞培養法を最適化し、そして最良の細胞/A771726モル比を決定するために、変化する密度のA20.2.J細胞をA771726(5μM)とともにインキュベートした。試料を異なる時点で回収して、DHO−濃度を測定した(表10)。DHO−濃度が抽出された細胞の量と直接相関した(表9参照)という事実のため、後の実験のためにDHO−濃度をμg/mlで10×106細胞まで補外した。DHO−水準の最良の直線状の増加は、密度1×106細胞/mlで見出された。この細胞密度を使用して、A771726とともにインキュベートした細胞における細胞内DHO−水準の時間依存増加を研究した。検出できるDHO量は、薬剤濃度に関係無く、インキュベーションの1時間後に測定することができた(表11)。直線状増加は、6時間後に測定されたDHOの最大量で記録された(表11)。この期間の後、それ以上のDHOの増加はなく、飽和が観察された。
【0051】
【表11】
種々の量のA20.2.J−細胞を、上に示した期間、A771726(5μM)とともにインキュベートして、その細胞内DHO−濃度を各試料点で測定した。(*すべての値を10×106細胞まで補外した)(n=2)。
【0052】
【表12】
100万のA20.2.J−細胞/mlを、変化する濃度のA771726とともにインキュベートして、異なる時点でそれらの細胞内DHO−濃度を測定した。データは、1000万細胞まで補外したμg/ml DHO±SDとして示した(0〜4時間=n=2、7時間=n=4)。
【0053】
A771726を用いたA20.2.J腫瘍細胞のインキュベーションの結果、DHO−DH阻害によるL−DHOの迅速な蓄積が起こった。細胞内L−DHO−濃度は、細胞数と相関し、そして時間依存性であった。L−DHOの監視は、患者におけるA771726免疫調節活性に対する代理マーカーである。
【0054】
実施例3
動物:体重160〜200gのオスのウィスター−ルイス(Wistar-Lewis)ラット[モールガード・ブリーディング・センター社(Mollegaard Breading Center Ltd.)、エイビー(Ejby)、DK]。
【0055】
アジュバント関節炎:この疾患は、ウィスター−ルイスラットの尾の基部に、0.1mlのフロイントアジュバント(1mlの重、白色パラフィン油中に懸濁させた6mgのスメグマ菌)[メルク(Merck)、ダームシュタット]を注射することによって誘発された。病理学的症状は、一般に、疾患誘発後10ないし14日で現れる。
【0056】
薬剤処理:薬剤を1%カルボキシメチルセルロース(COMC)中に懸濁させた。健康な動物(n=18)およびアジュバント罹患(n=18)ラット(病気の9日目)に、5日間1日に2回(7:30時および13:30時)、すなわち時点:0時間、6時間、24時間、30時間、48時間、54時間、72時間、78時間、96時間で、10mg/kgのN−4−(トリフルオロメチルフェニル)−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキサミド、本明細書中で以後レフルノミド(leflunomide)を経口的に与えた。(表12参照)。0時間の時点で、罹患グループと罹患していないグループとの両方からの3匹の動物を犠牲にして、基準線水準を測定した。追加の3匹の健康な動物および3匹の罹患動物を5日間偽薬(COMC単独)で処理した。
【0057】
サンプリング:1グループ当たり3匹の動物を各サンプリング時点で犠牲にした。血清および脾細胞を3時間、7時間、27時間、51時間、75時間、および99時間で採取した(表12参照)。7時間の値を除いて、試料は、最終の薬剤適用の3時間後に採取した。7時間の値は、2番目の投与の1時間後に採取した。偽薬で処理した動物からの試料は、0時間(n=3)および99時間(n=3)の時点で採取した。
【0058】
【表13】
【0059】
試料の調製:
− 心臓穿刺によって集めた血液を4℃で30分間貯蔵した後、3000rpmで10分間遠心分離した。血清を分離して、エッペンドルフ−キャップ内に−20℃で貯蔵した(3)。HPLC分析の前に、凍結した血清を融解させ、タンパク質を除去するために、200μlの血清をマイクロコンフィルター[型10、コード42407、アミコン]に加え、13000rpmで30分間遠心分離した。
【0060】
− 脾臓を採取して(n=3)、L−DHO分析のためにプールした。掻き裂き(ステンレス鋼ストレーナを通過させること)によって分離した細胞を0.17MのNH4Clで処理して赤血球を溶解させた。5000万の脾臓細胞プログループ(pro group)のアリコートを製造して、遠心分離用のキャップ内に入れ、上澄みを捨てた。細胞ペレットに、不変混合下で、500μlの1.2M HClO4溶液を加えて細胞を溶解させ、2分間遠心分離した。酸性細胞溶解産物を完全にガラスバイアルに移し、500μlのクロロホルムを加えて、渦動(Vortex)ミキサーで2分間混合した。細胞脂質を遠心分離(10分、1502×gおよび10℃)によって沈殿させた。上澄みを2mlのキャップに入れて、−20℃で貯蔵した。
【0061】
A771726血清濃度の測定は、以下のように実施した:
血清試料を室温にして、渦動ミキサーを使用して完全に混合した。この血清をピペット(200μl)でエッペンドルフキャップ内に移し、内標準(A771726、400μlのアセトニトリル中2μg)を加えた。次にこれらのチューブを渦動ミキサー中で混合し、10分間2500rpm(室温)で遠心分離した。HPLC分析用に、上澄み(400μl)をバイアルに移し、水(400μl)を加えて、混合した。HPLC条件は以下のとおりであった:ハードウェアは、TSP P2000ポンプ、TSP AS1000オートサンプラー、TSP SP4270積分器、およびTSP UV100 UV−検出器より成っていた。検出は、292nm波長で行った。移動相は、650mlメタノール[クロマソルブ(CHROMASOLV)]、2,42g臭化テトラブチルアンモニウム、および350ml 0.05M酢酸アンモニウムより成っていた。流量は、0.5ml/分であった。1cmの逆相(R2)ガードカラムを伴うクロンパック・スフェリソルブ(CHROMPACK Spherisorb)ODS−2 10cmカラムを使用した。100μlをカラム内に注入し、操作時間は、7分間であった。
【0062】
L−DHO−濃度のHPLC測定:クロマトグラフィー分離は、実施例1に記載したように実施した。導電率検出器の領域は、10μSにセットし;分析は、室温で実施した。移動相は、100mM NaOH(A)および水(B)より成っていた。この系を使用して下記の勾配を得た:
血 清
時間 ( 分 ) A ( % ) B ( % )
0 1 99
2.5 1 99
14 23 77
18 60 40
24 60 40
26 1 99
45 1 99
【0063】
脾細胞
時間 ( 分 ) A ( % ) B ( % )
0 1 99
2.5 1 99
14 8 92
22 8 92
28 60 40
32 60 40
34 1 99
49 1 99
流量は、1ml/分であった。
【0064】
健康なラットおよび罹患ラットは、両者ともに、レフルノミドの経口投与後に、増加した細胞(表13)および血清(表14)L−DHO濃度を有していた。この増加は、これらの動物において測定したA771727血清濃度と相関していた(表15)。最初に、経口薬剤投与の3時間後に、A771726は、アジュバント罹患ラットでは濃度約26μg/ml、そして罹患していないラットでは31μg/mlに達した。これらの値は、2回目の投薬の1時間後(7時間)にピークに達したが、罹患ラットおよび罹患していないラットの両方においてこの実験の間7ないし12μg/mlの間の値まで下がった。罹患動物は、これらの濃度に達するのに51時間かかり、一方罹患していないラットは、27時間後にすでにそれに達していた(表15)。A771726血清濃度は、アジュバント罹患齧歯動物および罹患していない齧歯動物の血清中のL−DHO−濃度と相関していた。実験の間約5μg/mlに平衡していたL−DHO−血清濃度に反して、脾細胞中に見出されたL−DHOの量は、99時間後に検出限度(1.5μg/ml)未満に下がった。
【0065】
【表14】
動物は、上記のように、レフルノミドまたは偽薬で処理し、脾臓を取り出し(n=3)、プールした。プールした脾細胞を二重反復して検定した。DL=検出限度(1.5μg/ml);
【0066】
【表15】
【0067】
【表16】
動物は、上記のように、レフルノミドまたは偽薬で処理し、血液を採取して、調製し、そして検定した。L−DHO血清濃度は各動物について各々測定した。
DL=検出限度(1.5μg/ml);
【0068】
【表17】
【0069】
【表18】
動物は、上記のように、レフルノミドまたは偽薬で処理し、血液を採取して、調製し、そして検定した。A771726血清濃度は各動物について各々測定した;
【0070】
経口適用したレフルノミドは、生体内で非常に急速にA771726に変換される。A771726は、レフルノミドの活性な代謝産物である[米国特許第5,679,709号]。アジュバント罹患または罹患していないラットのいずれかをレフルノミドとともにインキュベートすると、それらの血清および脾細胞内にL−DHOの迅速な蓄積が起こった。L−DHO濃度は、A771726の血液血清濃度と相関していて、この結果生体内でのこの分子によるDHO−DHの活発な抑制を証明した。ヒトの臨床研究においては、L−DHO監視は、患者におけるレフルノミドの免疫調節活性に対する代理マーカーであることができる。
Claims (10)
- 次の工程:
a) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し;
b) 上記カラムにL−ジヒドロオロト酸を含む試料溶液を装填し;
c) クロマトグラフィーを実施し;
d) L−ジヒドロオロト酸を、塩基水混合物を含有する溶離液で溶離すること;
より成り、この方法を約1.1MPaないし約40MPaの圧力下で実施するクロマトグラフィーによるL−ジヒドロオロト酸を得るための方法。 - 塩基が水酸化ナトリウムである、請求項1に記載の方法。
- 圧力安定性陰イオン交換物質がアルカノール第四級アンモニウムで変性させた、ジビニルベンゼン/エチルビニルベンゼン重合体、またはジビニルベンゼンで架橋したポリビニルベンジルアンモニウム重合体、またはその混合物である、請求項1に記載の方法。
- 圧力が約4.1MPaないし約5.5MPaである、請求項1に記載の方法。
- 塩基水混合物の溶離が、塩基濃度の時間勾配を示す、請求項1に記載の方法。
- 塩基濃度の時間勾配が、直線状である請求項5記載の方法。
- L−ジヒドロオロト酸を導電率検出器によって検出する、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- L−ジヒドロオロト酸を含有する診断用検定の調製物を製造する方法であって、
次の工程:
a) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し;
b) 上記カラムにL−ジヒドロオロト酸を含む試料溶液を装填し;
c) クロマトグラフィーを実施し;そして
d) L−ジヒドロオロト酸を、塩基水混合物を含有する溶離液で溶離すること;
より成り、この方法を約1.1MPaないし約40MPaの圧力下で実施する方法。 - ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤の活性を測定するための方法であって、次の工程:
a)ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を細胞と共にインキュベートし;
b)前記細胞から、細胞脂質を抽出し;
c) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し;
d) 上記カラムに前記細胞脂質を含む試料溶液を装填し;
e) クロマトグラフィーを実施し;
f) L−ジヒドロオロト酸を、塩基水混合物を含有する溶離液で溶離し、ここで前記カラムの操作圧力は、約1.1MPaないし約40MPaであり;
g) 前記L−ジヒドロオロト酸濃度を測定し;そして
h) 前記L−ジヒドロオロト酸の測定濃度からジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼの
活性を決定する;
ことから成る上記方法。 - ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤が、N−4(トリフルオロメチルフェニル)−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキサミド、ブレキナール、N−(4−トリ−フルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−ヒドロキシヘプタ−2−エン−6−イン−カルボキサミド、2−シアノ−3−シクロプロピル−3−ヒドロキシアクリル酸−(4−シアノフェニル)−アミドおよびN−(4−トリフルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−ヒドロキシクロトンアミドから選択される少なくとも一つの阻害剤である、請求項9に記載の方法。
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