DE69831752T2

DE69831752T2 - Verfahren zur herstellung von l-dihydroorotsäure und seine anwendung

Info

Publication number: DE69831752T2
Application number: DE69831752T
Authority: DE
Inventors: Ulrike Milbert; Robert Bartlett; Eric Ruuth; Claude Fudali
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2018-12-09
Also published as: AR016430A1; US6545006B1; PL341205A1; ES2248927T3; HUP0004510A1; DK1036319T3; DE69831752D1; ID24807A; WO1999030146A1; CN1237345C; AU1877599A; ATE305610T1; EP1036319B1; EP1036319A1; HK1033171A1; KR20010032978A; RU2228932C2; KR100700906B1; CZ20002134A3; PL194068B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von L-Dihydroorotsäure (im Nachstehenden „L-DHO" bezeichnet) durch Chromatographie an einem anionischen Austauschmaterial in einem Basen-Wasser-Gemisch unter einem Druck von 1,1 MPa bis 40 MPa. Das Verfahren kann verwendet werden, um die in-vitro- und in-vivo-Aktivität von N-(4-Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid, N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamid und ähnliche Verbindungen zu untersuchen.
L-DHO kann durch ein Kieselgel-Chromatographieverfahren mit anschließender chemischer Derivatisierung und colorimetrischer Bestimmung (Kesner, L., Aronson, F.L., Silverman, M., Chan, P.C., Clin. Chem 21/3 (1975) 353) bestimmt werden. Ein weiteres Verfahren wandelt L-DHO enzymatisch zu Orotsäure durch L-Dihydroorotsäuredehydrogenase (im Nachstehenden „DHODH"), hergestellt aus Rattenleber, um und weist nach chemischer Derivatisierung Orotat durch colorimetrische Veränderungen nach (Rogers, L.E., Nicolaisen, K., Experientia 28/10 (1972) 1259). Die Nachteile von diesen Verfahren sind die Störung von anderen Materialien in komplexen physiologischen Lösungen. Außerdem sind die erwähnten Verfahren auf Grund von arbeitsaufwändiger Probenherstellung sehr zeitraubend und deshalb für Routineanalysen in großen klinischen Studien nicht anwendbar.
Bei der Bemühung zur Bereitstellung von verbesserten Trennungs- und Isolierungsverfahren zur Gewinnung von L-Dihydroorotsäure wurde nun gefunden, dass dieselben durch Chromatographie von L-DHO in einem Basen-Wasser-Gemisch an einem anionischen Austauschmaterial und bei einem Druck von 1,1 MPa bis 40 MPa erzielt werden können. Das Verfahren kann für die quantitative Bestimmung von L-DHO in Zelllysaten, Säugerserum und Humanserum verwendet werden. Das Verfahren ist sehr reproduzierbar, empfindlich und verlässlich.
Die Erfindung, wie in den Ansprüchen erläutert, löst die Aufgabe durch ein chromatographisches Verfahren, umfassend die Schritte von:

a) Bereitstellen einer Säule, umfassend druckstabiles anionisches Austauschmaterial;
b) Beladen der Säule mit einer Probenlösung, die L-Dihydroorotsäure einschließt;
c) Ausführen von Chromatographie;
d) Eluieren der L-Dihydroorotsäure mit einer eluierenden Lösung, enthaltend ein Basen-Wasser-Gemisch;

Der Begriff druckstabiles anionisches Austauschmaterial bedeutet beispielsweise Materialien, wie makroporöses (2 000 Å) Divinylbenzol/Ethylvinylbenzolpolymer oder ein mikroporöses Polyvinylbenzylammoniumpolymer, vernetzt mit Divinylbenzol oder Gemischen davon, die mit Alkanol-quaternärem Ammonium modifiziert sind; oder Vinylbenzylchlorid/Divinylbenzol-makroporöses Polymer; oder vernetztes Polyethyliminopolymer; oder Siliziumdioxid, modifiziert mit Propyltrimethylammonium; oder Poly(styrol-divinylbenzol)trimethylammonium.
Die nachstehenden Produkte sind besonders bevorzugt:
Ion Pac AS 11, CarboPac PA 1 oder CarboPac MA 1 Anionenaustauschsäulen, bezogen von Dionex Corporation, Idstein, Deutschland,
GROM – SIL, starkes Anion, oder GROM – SIL, schwaches Anion; bezogen von Grom P 1000 SAX, Ionospher SA oder Chrompack PA; bezogen von Chrompack PRP-X100 oder RCX-10, bezogen von Hamilton.
Die Elutionslösung enthält ein Basen-Wasser-Gemisch. Geeignete Basen sind abgeleitet von Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Magnesiumhydroxid oder Calciumhydroxid. Die Konzentration der Base ist 1 mMol/l bis etwa 200 mMol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, vorzugsweise 2 mMol/l bis etwa 120 mMol/l, besonders bevorzugt ist 100 mMol/l.
Die Temperatur während des Chromatographieverfahrens ist etwa 0°C bis etwa 50°C, vorzugsweise etwa 15°C bis etwa 30°C, besonders bevorzugt etwa 19°C bis etwa 25°C. Der Arbeitsdruck während der Chromatographie ist im Wesentlichen konstant. Die Chromatographie kann unter Verwendung von verschiedenen Drücken ausgeführt werden; beispielsweise kann die Chromatographie unter einem Druck von 1,1 × 10⁸ Pa (1,1 MPa) bis 40 × 10⁶ Pa (40 MPa), insbesondere von 4,1 MPa bis 5,5 MPa, ausgeführt werden. Die Elutionsmittelfließgeschwindigkeiten sind von etwa 0,2 ml/min bis etwa 3 ml/min, vorzugsweise 1 ml/min.
Die Beladung der Säulen, Chromatographie und Elution von dem L-DHO findet durch bekannte, herkömmliche technische Verfahren statt.
Eine geeignete Elution ist jene, worin die Elution einen Zeitgradienten der Basenkonzentration, vorzugsweise mit einem linearen Verlauf, zeigt. Dieser Konzentrationsgradient kann beispielsweise durch eine niedere Basenkonzentration (null im Grenzfall), die bei der Elution am Beginn der Elution vorliegt, und durch Erhöhen der Basenkonzentration während des Elutionsverfahrens angewendet werden. Es ist auf diese Weise möglich, eine besonders wirksame Trennung von der L-DHO in Proben, abgeleitet von Serum oder Zelllysaten, zu erreichen. Ein bevorzugter Basengradient variiert von nahe 1% NaOH (100 mMol/l) und 99% Wasser (am Beginn der Elution) bis etwa 60% NaOH und 40% Wasser (am Ende der Elution), wobei der besonders bevorzugte Bereich etwa 1% NaOH und 99% Wasser (am Beginn der Elution) bis etwa 15% NaOH und 75% Wasser (am Ende der Elution) ist. Der Basen-Wasser-Gradient wird in einer li nearen Weise von 2,5 Minuten bis etwa 14 Minuten und von 14 Minuten bis etwa 25 Minuten verändert, wobei das Abfallen des Gradienten während dieser 2 Zeiträume verschieden ist.
Eine besonders geeignete Elution kann durch Anwenden einer niedrigen Basenkonzentration am Beginn des Trennverfahrens von etwa 1% für einen Zeitraum von etwa 2,5 Minuten erreicht werden. Das Ergebnis ist Eluieren von dem Meisten des störenden Materials von der biologischen Matrix von der Säule. Die Abtrennung des Analyten wird durch langsames Erhöhen des Gradienten bis etwa 23% der Base innerhalb eines Zeitraums von 14 Minuten Gesamtanalysenzeit erreicht. Dann wird die Basenkonzentration auf etwa 60% innerhalb 4 Minuten erhöht, um die Elution von stark gebundenem Material zu erlauben. 60% Base sollten für nicht länger als 6 Minuten angewendet werden, bis erneute Gleichgewichtseinstellung durch 1% Basen-Wasser-Gemisch erfolgt. Die nächste Analyse beginnt nach 45 Minuten Gesamtanalysenzeit.
Das Wasser in dem Basen-Wasser-Gradienten wurde des-ionisiert und entgast.
Das Abtrennungsverfahren gemäß der Erfindung findet in einem Säulenverfahren statt. Die Temperatur, die vorzugsweise während der anionischen Austauschchromatographie konstant gehalten wird, kann innerhalb eines breiten Bereichs variiert werden. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist etwa –10°C bis etwa 50°C, insbesondere etwa 15°C bis etwa 25°C.
Die Elution von L-DHO findet von 10 Minuten bis 12 Minuten nach dem Beginn des Gradienten statt. Die Versuchszeit des Elutionsverfahrens ist 13 min bis 25 min. Die L-DHO wird durch einen Leitfähigkeitsdetektor, wie ein Modell CD20 von Dionex Cooperation, nachgewiesen. Um die Grundlinienverschiebung zu minimieren und die Hintergrundleitfähigkeit zu senken, kann ein Anionenselbstregenerierungssupressor, wie Modell ASRS-I, 4 mm, von Dionex Cooperation, angewendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders für analytische Chromatographie geeignet, kann jedoch auch für prä parative Chromatographie, insbesondere, wenn das erfindungsgemäße Verfahren mit einem präparativen Hochdruck-Flüssigchromatographiesäule-(HPLC)-System ausgeführt wird, verwendet werden. Der Begriff „präparative Chromatographie" bedeutet ein Reinigungsverfahren mit dem Ziel der Gewinnung und nicht nur Analyse von reinen Produkten. Die Menge der reinen Produkte kann innerhalb breiter Grenzen, beispielsweise 1 mg bis 1000 g, vorzugsweise zwischen 50 mg und 500 mg, variieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um Veränderungen in intrazellulären oder extrazellulären L-DHO-Konzentrationen auf Grund der Inhibierung von Dihydroorotsäuredehydrogenase (DHO-DH) nachzuweisen. Das Enzym DHO-DH ist für die Umwandlung von L-Dihydroorotsäure zu Orotsäure während der De-novo-Pyrimidinsynthese verantwortlich. Die Inhibierung von DHO-DH führt zur Akkumulation von L-DHO. Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Herstellung eines diagnostischen Assays verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Bestimmen der Aktivität von DHO-DH-Inhibitoren verwendet werden. DHO-DH-Inhibitoren sind beispielsweise N-4-(Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxylamid, Brequinar, N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxyhept-2-en-6-in-carboxamid, 2-Cyano-3-cyclopropyl-3-hydroxyacrylsäure-(4-cyanophenyl)-amid oder N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamid. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Bestimmen von L-DHO-Konzentrationen in Pflanzen, Zelllinien, Tieren und Menschen verwendet werden. L-DHO-Bestimmung kann verwendet werden, um Aktivität von DHO-DH-Inhibitoren in Pflanzen, Säugern und Menschen zu verfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird genauer in den folgenden Beispielen beschrieben. Sofern nicht anders ausgewiesen, betreffen Prozentsatzdaten das Gewicht.
Beispiel 1
1.1. Chemikalien und Reagenzien

Chemikalien und Reagenzien wurden wie nachstehend ausgewiesen bezogen:

Carbonat-freies	Bader, Holland
NaOH und KOH
L-Dihydroorotsäure	Sigma, München
(L-DHO)
HClO₄	Riedel de Haen, Seelze
Eosin, Chloroform	Riedel de Haen, Seelze
RPMI 1640 Medium	Gibco, Eggenstein
Fötales Kalbsserum (FCS)	Bio Whitaker, Verviers,
	Belgien

Desionisiertes Wasser musste durch Helium vor der Verwendung entgast werden.
1.2. Chromatographische Ausrüstung
Das HPLC-System bestand aus den nachstehenden Instrumenten:
Das Peakmaterial wurde innerhalb der gesamten Versuche verwendet.
1.3. HPLC-Bedingungen
Die chromatographische Abtrennung wurde mit einer 250 × 4 mm I.D. IonPac AS 11 Anionenaustauschsäule (Teilchengröße 13 μm; P/N 044076, Dionex), ausgerüstet mit einer IonPac AG 11, 50 × 4 mm I.D. Vorsäule (Teilchengröße 13 μm; P/N 044078, Dionex), ausgeführt. Zusätzlich wurde eine Anionenfallensäule ATC-1 (P/N 037151, Dionex) zwischen der Gradientenpumpe und dem Einspritzventil installiert. Um die Grundlinienverschiebung zu minimieren und die Hintergrundleitfähigkeit zu senken, wurde der ASRS-I-Suppressor installiert, der bei 300 mA betrieben wurde. Der Bereich des Detektors ist mit 10 μS ausgewiesen. Der Autosampler wurde auf 14°C gekühlt, jedoch die Analyse selbst wurde bei Raumtemperatur ausgeführt. Die mobile Phase war aus 100 mM NaOH (A) und desionisiertem und entgastem Wasser (B) zusammengesetzt. Mit dem System wurde der nachstehende Gradient erzeugt:
Die Fließgeschwindigkeit war 1 ml/min; Versuchszeit war 45 min.
1.4. Standards und Qualitätskontrollproben
Eine Standardstammlösung wurde durch Auflösen von 1 mg L-DHO in 1 ml Wasser hergestellt. Aliquote Mengen von 400 μl wurden auf –20°C gefroren. Die Stabilität von diesen Lösungen wurde für mindestens 4 Wochen garantiert. Definierte Mengen der Stammlösung wurden zu den Zelllysaten und zu Human- oder Rattenserum gegeben und zum Bewerten der Linearität zwischen dem Anstieg des Signals und der festgesetzten L-DHO-Konzentration bewertet. Die Präzision und Genauigkeit des Verfahrens wurden durch Anwenden von Qualitätskontroll-(QC)-Proben mit einem L-DHO-Gehalt in dem unteren, dem mittleren und dem hohen Konzentrationsbereich der Signal/Konzentrations-Linearitätskurve untersucht.
1.5. Probenzubereitungen
1.5.1. Zellen
Jurkat-Zellen wurden von ATCC (TIB 182) erhalten und wie in 1.5.1.1. beschrieben gezüchtet.
1.5.1.1 Gewebskulturbedingungen
Jurkat-Zellen wurden bei 5 × 10⁵/ml angesetzt und 24 Stunden in RPMI 1640 Medium und 10%igem fötalem Kalbsserum (FCS) gezüchtet. Die Zellen wurden in frischem Medium zur Zelllyse vereinigt und die Menge der Zellen und der Prozentsatz an toten Zellen durch Vital-Mikroskopie mit Eosin berechnet. Nach 24 Stunden hatten sich Zellzahlen um 1,6–1,8-fach innerhalb weniger als 7% toter Zellen erhöht. Jurkat-Zellen, die zur L-DHO-Bestimmung genommen wurden, hatten ein Proliferationsverhältnis von 1,6–1,8-fach in 24 Stunden und weniger als 7% tote Zellen.
1.5.1.2 Herstellung von Zelllysaten
Zellen wurden in einem definierten Mediumvolumen suspendiert und die Zelldichte der Proben wurde über Vitalmikroskopie unter Verwendung von Eosin bestimmt. Etwa 10 × 10⁶ Zellen wurden entfernt, mit 5 Minuten-Zentrifugation bei 350 × G pelletisiert und der Überstand wurde verworfen. Die Lyse der Zellen wurde durch Resuspendieren des Zellpellets in 500 μl 1,2M HClO₄ ausgeführt. Dieses Gemisch wurde in 2,0 ml Eppendorf-Safe-Lock-Becher (Sicherheitsverschlussbecher) überführt und das Protein wurde nach 2 Minuten Hochgeschwindigkeitszentrifugierung ausgefällt. Der Überstand wurde vollständig entfernt, in Glasfläschchen überführt und nach Zusatz von 500 μl Chloroform sorgfältig vermischt durch 2 Minuten Vortexbehandlung. Zelllipide wurden durch Chloroform, gefolgt von 10 Minuten Zentrifugierung (1502 G) bei 10°C extrahiert. Der gereinigte Überstand wurde in 2 ml Eppendorf-Bechern gesammelt und bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Für die HPLC-Analyse wurden 100 μl dieses Überstands mit 30 μl 6M KOH neutralisiert. Nach Schütteln für etwa 5 s wurden die Proben auf Eis für etwa 30 Minuten gelagert. Anschließend wurden sie 5 min bei 15 000 U/min zentrifugiert. Von dem klaren Überstand wurden 20 μl für die HPLC-Analyse verwendet.
1.5.2. Serum
Um den Proteingehalt zu vermindern, wurden 200 μl Serum zu einem Microconfilter (10 000 D, Modell 10, Code 42407, Amicon) gegeben und 30 min bei 13 000 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert. Der Durchfluss bestand aus etwa 150 μl und enthält den Analyten L-DHO. Von dieser Flüssigkeit wurden 20 μl für die HPLC-Analyse verwendet.
1.6. Quanitifizierung
Der Integrator bestimmte die Peakhöhe des Analyten. Eichkurven wurden erhalten durch Auftragen der gemessenen Peakhöhen (y) gegen die Analytenkonzentration in verschiedenen biologischen Matrizes. Gewichtete lineare Regression (1/y) wurde verwendet, um die L-DHO-Konzentration in Standardproben sowie in Qualitätskontrollen zurückzurechnen. Der übliche Korrelationskoeffizient R wurde durch PROC GLM, bezogen auf die Analyse des Kovarianzmodells unter Verwendung des Wägefaktors, bereitgestellt.
1.7. Stabilität
Tabelle 1 zeigt die Stabilitätsdaten des Analyten bei –20°C in Zelllysaten und Serumproben nach 2–3 Gefrier/Auftauzyklen von einer Probe. L-DHO war unter den vorstehend erwähnten Bedingungen in Jurkat-Zellen über einen Zeitraum von mindestens 4 Wochen stabil. Die nachgewiesene Erhöhung in der Konzentration von einigen Rattenserumproben und einer Humanserumprobe nach einigen Auftauzyklen von mehr als 10% kann nicht erklärt werden und zeigt, dass die Genauigkeit in solchen Fällen bis zu 15% im Allgemeinen und bis zu 29% im schlechtesten Fall vermindert sein kann. Aus diesen Gründen kann nur mitgeteilt werden, dass bei Ratten- und Hu manserumproben L-DHO letztendlich für nur mindestens 1 Woche stabil ist. Tabelle 1: Stabilitätsdaten in Zelllysaten und Serum bei –20°C (n = 1)
Der Rückstand (%) ist ein Prozentsatz der Konzentration, verglichen mit der Anfangsanalyse.
n.d. = nicht bestimmt
Um die Bedingungen der Proben zu simulieren, wenn sie in dem Autosampler auf die tatsächliche Analyse warten, wurde die Stabilität während 18 h bei 14°C bestimmt. Aus dem Grund wurden die Zelllysate versetzt und dann mit 30 μl 6M KOH/100 μl Lysat vor dem Beginn der Analyse behandelt. Entsprechend wurden die Serumproben versetzt und dann, wie in 1.5.2. beschrieben, deproteinisiert.
Wie in Tabelle 2 ersichtlich werden kann, ist der L-DHO-Gehalt leicht in Zellen unter diesen Bedingungen bis zu einem Maximum von etwa 7% vermindert. In Serumproben ist der Analyt unter diesen Bedingungen stabil. Aus diesen Gründen nur wurden so viele HPLC-Proben hergestellt, dass die maximale Länge des Aufenthalts in dem Autosampler unter 18 h war. Tabelle 2: Stabilität für 18 h bei 14°C (n = 1)
1.8. Selektivität
Der Vergleich von nicht versetzten Jurkat-Zelllysaten mit entsprechenden Chromatogrammen, unter Verwendung von Zelllysaten, die mit 50 μg L-DHO/ml versetzt wurden, zeigte, dass es einen kleinen Peak bei 11,983 min gab, was die gleiche Retentionszeit wie L-DHO ist. Es ist sehr nahe liegend, dass sich dieser Peak aus dem natürlichen Gehalt des Analyten in diesen Zellen ergibt. Zusätzlich kann ersichtlich werden, dass sich auf Grund der Behandlung der Zelllysate mit KOH der L-DHO-Peak in zwei Peaks spaltet. Die KOH-Behandlung jedoch ist wesentlich, um das saure Zelllysat vor der HPLC-Analyse zu neutralisieren. Es konnte gezeigt werden, dass unter den beschriebenen Bedingungen die Entwicklung der zweiten Peakhöhe (Retentionszeit (RT) = 11,954 min) angewendet werden kann, um verbesserte Ergebnisse bezüglich Linearität und Reproduzierbarkeit zu erhalten.
Auch im Fall von Ratten- und Humanserum wurde ein Blindwert mit der gleichen Retentionszeit wie L-DHO gefunden. Es wird vermutet, dass sich dies auf den natürlichen L-DHO-Gehalt des Organismus bezieht. Die Bestimmung von mindestens 10 verschiedenen Proben von beiden Arten zeigte, dass der natürliche L-DHO-Gehalt unter der Nachweisgrenze von 1 μg/ml war.
1.9. Linearität
Die Linearität der Bestimmung wurde an fünf Eichkurven für die Zelllinie und verschiedenen Serumproben bewertet. Die Proben wurden hergestellt und an fünf verschiedenen Tagen mit L-DHO-Konzentrationen im Bereich von 1,5–150 μg/ml (Zelllysate) und 1–30 μg/ml (Serumproben) laufen lassen. Die Ergebnisse werden in Tabellen 3–5 gezeigt. Für die Bestimmung der Regressionslinie wurde die Peakhöhe verwendet. Basierend auf den entsprechenden Konzentrationen der verschiedenen Standards wurde es, wie in verschiedenen Tabellen ausgewiesen, zurückberechnet.
Tabelle 3 Linearität von L-DHO-Bestimmungen in Jurkat-Zelllysaten
Nach Versetzen wurden die Proben mit 30 μl 6M KOH behandelt und dann einmal, wie in 1.3. beschrieben, analysiert.

r = 0,9995

Tabelle 4 Linearität von L-DHO-Bestimmungen in Rattenserum
Nach Versetzen wurde das Serum von den Proteinen, wie in 1.5.2. beschrieben, gereinigt.

r = 0,9959

Tabelle 5 Linearität von L-DHO-Bestimmungen in Humanserum
Nach Versetzen wurde das Serum von Proteinen, wie in 1.5.2. beschrieben, gereinigt.

r = 0,9986·Standardkonzentration (μg/ml) – nicht bestimmt

Wie in diesen Tabellen ersichtlich werden kann, war die Linearität in jedem Fall erwiesen. Dies wird auf die jeweiligen Korrelationskoeffizienten „r" zurückgeführt, die in allen Fällen > 0,99 sind. Die mittlere lineare Regressionslinie für die an 5 verschiedenen Tagen erhaltenen Konzentrationskurven wird in jeder Tabelle beschrieben und zeigt, dass der Anstieg mit einer maximalen Variation von 6,7% sehr gut reproduzierbar war.
Die zurückgerechneten Standardkonzentrationen zeigten im Mittelwert ein C.V. von weniger als 6,5%, was die hohe Genauigkeit der Werte zeigt. Der übliche Korrelationswert r von mehr als 0,99 drückt die sehr hohe Präzision und Reproduzierbarkeit des Verfahrens aus.
1.10. Quantifizierungsgrenze
Bezogen auf diese Ergebnisse, ist die Quantifizierungsgrenze in Jurkat-Zellen 1,5 μg/ml. In Ratten- und Humanserumproben kann 1 μg/ml L-DHO nachgewiesen werden. Versetzte Proben bei dieser Konzentration zeigten ein Signal zu Geräusch-Verhältnis von mindestens 1:3.
1.12. Genauigkeit und Präzision
Genauigkeit und Präzision von wiederholten Bestimmungen von L-DHO bei drei verschiedenen Konzentrationen an fünf verschiedenen Tagen wird in Tabelle 6–8 zusammengefasst. Die Genauigkeit wird als der Prozent Unterschied von gefundener zu zugegebener Menge an L-DHO (Wiedergewinnung) ausgedrückt. Die Intra-Tag-Präzision, ausgedrückt als C.V. (%) wurde unter Verwendung der zwei Werte, die erhalten werden, wenn eine Probe zweimal am Tag gemessen wurde, berechnet. Die Inter-Tag-Präzision wurde auch wie C.V. (%) ausgedrückt und wurde unter Verwendung des Durchschnitts für Werte von jeder Kontrollprobe an 5 verschiedenen Tagen berechnet.
Tabelle 6:
Genauigkeit und Präzision in Jurkat-Zelllysaten nach Versetzen und anschließender Neutralisation mit 30 μl 6M KOH. n = 2 bedeutet, dass eine Zelllysatprobe mit der entsprechenden Konzentration versetzt und zweimal gemessen wurde.
Tabelle 7:
Genauigkeit und Präzision in Rattenserum nach Versetzen und anschließender Deproteinisierung; n = 2 bedeutet, dass eine Serumprobe mit der entsprechenden Konzentration versetzt und zweimal gemessen wurde.
Tabelle 8:
Genauigkeit und Präzision in Humanserum nach Versetzen und anschließender Deproteinisierung; n = 2 bedeutet, dass eine Serumprobe mit der entsprechenden Konzentration versetzt und zweimal gemessen wurde.
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass in den meisten Fällen die Kontrollwerte ± 10% Variation bei einem Maximum aufwiesen und dass das Verfahren deshalb sehr genau ist. Nur in einem Fall unterschied sich die Wiedergewinnung in Jurkat-Zellenbestimmungen etwas von jenem Wert (–11,7%). Dieser Effekt kann durch die hohe Inter-Tag-Variation von 12% erklärt werden. Die Inter-Tag-Präzision in Jurkat-Zellen, Ratte- oder Humanserum war niedriger als 5%, 7% bzw. 10%. Die Inter-Tag-Präzision in allen untersuchten Matrizes war sehr niedrig mit einem C.V. von weniger als 6,0%. Dies zeigt, dass die erhaltenen Ergebnisse sehr stark reproduzierbar und präzise sind.
Beispiel 2
2.1. Gewebskulturbedingungen:

– Herstellung von serumfreiem Medium: pulverisiertes Iscove-Medium (Biochrom) wurde in 10 Litern bidestilliertem Wasser, ergänzt mit 18,95 g NaCl, 11,43 g NaHCO₃, 700 mg KCl, 10 ml 35%ige NaOH-Lösung und 0,5 ml 1M Mercaptoethanollösung (Riedel de Haen), gelöst und steril filtriert. Zu einem Liter hergestelltem Iscove-Medium wurden vor der Anwendung 32 mg Human-Holotransferrin, 1 g Rinderalbumin und 1,5 ml Lipide (Sigma) gegeben.
– Zellkultur: A20.2.J-Zellen wurden in serumfreiem Medium (37°C, 5% CO₂) in einer Expansionskultur bei logarithmischem Zellwachstum gezüchtet. Die Zellen, die für das Assay genommen werden, hatten eine 2,2-fache Proliferationsrate in 24 h. Der Prozentsatz an toten Zellen war <8% (3).
– Behandlung von Zellen mit N-(4-Trifluormethyl)-2-cyano-3-hydroxy-crotonamid, hergestellt wie in EP-0 529 500, anschließend A77 1726, beschrieben. A77 1726 wurde in bidestilliertem Wasser (10 mM) gelöst und in serumfreiem Medium weiter verdünnt. Den Zellen wurde dann die geeignete Menge an A77 1726 zugegeben und bei 37°C und 5%igem CO₂ inkubiert.

2.2. Herstellung von Zelllysaten für DHO-Bestimmung:
Hergestellte Zellen wurden in einem definierten Mediumvolumen und Zelldichte resuspendiert. In Abhängigkeit von dem erwarteten DHO-Gehalt, wurden zwischen 1–50 Millionen Zellen entfernt, pelletisiert (5 min, 350 × G) und der Überstand verworfen. Die Zellen wurden lysiert durch Zugeben von 500 μl 1,2M HClO₄. Die Lysate wurden in 2 ml Eppendorf-Safe-Lock-Becher (Sicherheitsverschlussbecher) überführt und das Protein mit 2 min Hochgeschwindigkeitszentrifugierung ausgefällt. Die angesäuerten Lysate wurden vollständig entfernt, in Glasfläschchen überführt und nach Zusatz von 500 μl Chloroform sorgfältig vermischt durch 2 Minuten Vortexbehandlung. Zelllipide wurden nach 10 Minuten Kaltzentrifugierung (1502 G; 10°C) extrahiert. Die gereinigten Überstände wurden in 2 ml Eppendorf-Bechern zur Lagerung bei –20°C gesammelt bis zur Hochdruck-Flüssig-Chromatographie-(HPLC)-Bestimmung.
2.3. HPLC-Bestimmung von DHO:
Die chromatographische Trennung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Der Bereich des Leitfähigkeitsdetektors wurde auf 10 μS eingestellt. Die Analyse wurde bei Raumtemperatur ausgeführt. Die mobile Phase war aus 100 mM NaOH (A) und Wasser (B) zusammengesetzt. Mit dem System wurde der nachstehende Gradient hergestellt:
Die Fließgeschwindigkeit war 1 ml/min; Versuchszeit war 49 min.
2.4. Ergebnisse
A20.2.J-Zellen, inkubiert mit A77 1726, hatten erhöhte Mengen an intrazellulärer DHO (Tabellen 9–11). Die in Tabelle 9 angeführten Ergebnisse zeigen, dass DHO-Spiegel direkt mit der Zahl der extrahierten Zellen korrelierten. Tabelle 9: Korrelation von intrazellulären DHO-Konzentrationen und Anzahl der Zellen, die mit A77 1726 gezüchtet wurden
A20.2.J-Zellen wurden mit 5 μM A77 1726 behandelt und 24 Stunden (37°C, 5% CO₂) gezüchtet und dann für die DHO-Extraktion (n = 3) zubereitet.
Um die Zellkulturverfahren zu optimieren und das beste Zelle/A77 1726-Molaritätsverhältnis zu bestimmen, wurden variierende Dichten von A20.2.J-Zellen, zusammen mit A77 1726 (5 μM), inkubiert. Die Zellen wurden bei verschiedenen Zeitpunkten abgezogen und DHO-Konzentrationen bestimmt (Tabelle 10). Auf Grund der Tatsache, dass DHO-Konzentrationen direkt mit der Menge an extrahierten Zellen korrelierten (siehe Tabelle 9), wurden für die nachstehenden Versuche DHO-Konzentrationen auf 10 × 10⁶ Zellen in μg/ml extrapoliert. Der beste lineare Anstieg des DHO-Spiegels wurde mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml gefunden. Unter Anwendung dieser Zelldichte wurde die Zeit, in Abhängigkeit von der Erhöhung der intrazellulären DHO-Spiegel in Zellen, die mit A77 1726 inkubiert wurden, untersucht. Nachweisbare Mengen an DHO konnten nach 1 Stunde Inkubation, unabhängig von der Arzneistoffkonzentration (Tabelle 11) bestimmt werden. Eine lineare Erhöhung wurde mit der größten Menge an DHO, bestimmt nach 6 h (Tabelle 11), registriert. Nach diesem Zeitraum wurde eine Sättigung ohne weitere Erhöhung von DHO beobachtet. Tabelle 10: Zelldichte und zeitabhängige Erhöhung von intrazellulären DHO-Konzentrationen:
Verschiedene Mengen an A20.2.J-Zellen wurden zusammen mit A77 1726 (5 μM) für die vorstehend angegebenen Zeiträume inkubiert und deren intrazelluläre DHO-Konzentrationen für jeden Probenpunkt bestimmt. (* Alle Werte extrapoliert auf 10 × 10⁶ Zellen) (n = 2). Tabelle 11: Die zeitabhängige Erhöhung von intrazellulären L-DHO-Konzentrationen:
Eine Million A20.2.J-Zellen/ml wurden, zusammen mit variierenden Konzentrationen von A77 1726 und deren intrazellulären DHO-Konzentrationen, die bei verschiedenen Zeitpunkten bestimmt wurden, inkubiert. Die Daten werden als μg/ml DHO ± SD, extrapoliert auf zehn Millionen Zellen (0 – 4 h = n = 2, 7 h = n = 4), angegeben.
Inkubation von A20.2.J-Tumorzellen mit A77 1726 ergab schnelle Akkumulation von L-DHO auf Grund von DHO-DH-Inhibierung. Die intrazellulären L-DHO-Konzentrationen korrelierten mit der Zellzahl und waren zeitabhängig. L-DHO-Verfolgen ist ein Surrogatmarker für A77 1726 Immunomodulierungsaktivität bei Patienten.
Beispiel 3
Tiere: Männliche Wistar-Lewis-Ratten (Mollegaard Breading Center Ltd. Ejby, DK) mit einem Körpergewicht von 160–200 g.
Adjuvans Arthritis: Die Erkrankung wurde durch Injizieren von 0,1 ml Freund'schem Adjuvans (6 ml Mycobacterium smegmatis, suspendiert in 1 ml schwerem, weißem Paraffinöl (Merck, Darmstadt)), in die Schwanzwurzel von Wistar-Lewis-Ratten induziert. Pathologische Symptome treten im Allgemeinen zwischen 10 und 14 Tagen nach Krankheitsauslösung auf.
Arzneistoffbehandlung: Arzneistoffe wurden in 1%iger Carboxymethylcellulose (COMC) suspendiert. Gesunde Tiere (n = 18) und Adjuvans-erkrankte (n = 18) Ratten (Tag 9 der Störung) wurden 10 mg/kg p.o. N-4-(Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid, anschließend Leflunomid zweimal täglich (7:30 und 13:30) für 5 Tage; d.h. bei Zeitpunkten: 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h, 54 h, 72 h, 78 h, 96 h (siehe Tabelle 12), gegeben. Zum Zeitpunkt 0 Stunden erkrankten 3 von zwei Gruppen und nicht erkrankte Gruppen wurden geopfert, um die Grundlinienspiegel zu bestimmen. Weitere 3 gesunde und 3 erkrankte Tiere wurden mit Placebo (nur COMC) für 5 Tage behandelt.
Probennehmen: Drei Tiere pro Gruppe wurden bei jedem Probennahmezeitpunkt geopfert. Serum und Splenozyten wurden bei 3 h, 7 h, 27 h, 51 h, 75 h und 99 h (siehe Tabelle 12) genommen. Mit Ausnahme des Werts von 7 h, wurden die Proben drei Stunden nach der letzten Arzneistoffapplikation genommen. Der Wert 7 h wurde eine Stunde nach dem zweiten Dosieren genommen. Proben der Placebo behandelten Tiere wurden bei den Zeitpunkten 0 h (n = 3) und 99 h (n = 3) genommen. Tabelle 12: Verabreichung von Leflunomid und Gewebsprobenahmezeitpunkte
Herstellung der Proben:

– Blut, gesammelt durch Herzpunktur, wurde 30 min bei 4°C gelagert und dann 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Serum wurde abgetrennt und in Eppendorf-Bechern bei –20°C (3) gelagert. Vor HPLC-Analyse wurde das gefrorene Serum aufgetaut, und, um die Proteine zu entfernen, wurden 200 μl Serum zu einem Microconfilter (Modell 10, Code 42407, Amicon) gegeben und 30 min bei 13 000 U/min zentrifugiert.
– Die Milzen wurden entnommen (n = 3) und zur L-DHO-Analyse vereinigt. Die Zellen, die durch Zerlegen (Durchleiten durch ein Edelstahlsieb) getrennt wurden, wurden mit 0,17 M NH₄Cl zur Lyse der Erythrozyten behandelt. Aliquote Mengen von 50 Millionen Milzzellen pro Gruppe wurden hergestellt, in Becher zur Zentrifugierung gegeben und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde unter permanentem Mixen zu 500 μl einer 1,2 M HClO₄-Lösung zur Lyse der Zellen gegeben und 2 min zentrifugiert. Das saure Zelllysat wurde vollständig zu Glasfläschchen überführt, 500 μl Chloroform zugesetzt und 2 min mit einem Vortexmischer vermischt. Zelluläre Lipide wurden durch Zentrifugierung (10 min 1502 × G und 10°C) ausgefällt. Der Überstand wurde in 2 ml-Becher gegeben und bei –20°C gelagert.

Die Bestimmung von A77 1726 Serumkonzentrationen wurde wie nachstehend durchgeführt:
Serumproben wurden auf Raumtemperatur gebracht und sorgfältig unter Anwendung eines Vortexmischers vermischt. Das Serum wurde in Eppendorf-Becher pipettiert (200 μl) und der innere Standard (A77 1726, 2 μg in 400 μl Acetonitril) zugegeben. Die Röhrchen wurden dann in einem Vortexmischer vermischt und bei 2500 U/min (Raumtemperatur) für 10 Minuten zentrifugiert. Zur HPLC-Analyse wurde der Überstand (400 μl) in ein Fläschchen überführt und Wasser (400 μl) zugegeben und vermischt. Die HPLC-Bedingungen waren wie nachstehend: Die Hardware bestand aus einer TSP P2000 Pumpe, einem TSP AS1000 Autosampler, einem TSP SP4270 Integrator und einem TSP UV100 UV-Detektor. Die Detektion war bei 292 nm Wellenlänge. Die mobile Phase bestand aus 650 ml Methanol (CHROMASOLV), 2,42 g Tetrabutylammoniumbromid und 350 ml 0,05 M Ammoniumacetat. Die Fließgeschwindigkeit war 0,5 ml/min. Eine CHROMPACK Spherisorb ODS-2 Säule von 10 cm mit einer 1 cm Umkehrphasen(R2)-Guardsäule wurde verwendet. 100 μl wurden in die Säule gespritzt und die Laufzeit war 7 Minuten.
HPLC-Bestimmung von L-DHO-Konzentrationen: Die chromatographische Trennung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Der Bereich des Leitfähigkeitsdetektors wurde auf 10 μS eingestellt. Die Analyse wurde bei Raumtemperatur ausgeführt. Die mobile Phase war aus 100 mM NaOH (A) und Wasser (B) zusammengesetzt. Mit dem System wurden die nachstehenden Gradienten erzeugt:
Serum Splenozyten
Die Fließgeschwindigkeit war 1 ml/min.
Sowohl gesunde als auch erkrankte Ratten hatten erhöhte zelluläre (Tabelle 13) und Serum-(Tabelle 14) L-DHO-Konzentrationen nach oraler Verabreichung von Leflunomid. Diese Erhöhung korrelierte mit den A77 1727-Serumkonzentrationen, die in diesen Tieren (Tabelle 15) bestimmt wurden. Anfänglich erreichte 3 Stunden nach oraler Verabreichung A77 1726 eine Konzentration von etwa 26 μg/ml in Adjuvanserkrankten Ratten und 31 μg/ml in nicht erkrankten Ratten. Diese Werte zeigten einen Peak eine Stunde nach dem zweiten Dosieren (7 h), fielen jedoch auf Werte zwischen 7 und 12 μg/ml für die Dauer des Versuchs in sowohl erkrankten als auch nicht erkrankten Ratten ab. Erkrankte Tiere nahmen 51 h in Anspruch zum Erreichen dieser Konzentration; wohingegen nicht erkrankte Tiere immer dieselbe nach 27 h erreichten (Tabelle 15). Die A77 1726-Serumkonzentrationen korrelierten mit den L-DHO-Konzentrationen in dem Serum von Adjuvanserkrankten und nicht erkrankten Nagern. Im Gegensatz zu den L-DHO-Serumkonzentrationen, die zu etwa 5 μg/ml für die Dauer des Versuchs äquilibrierten, fiel die Menge an in den Splenozyten gefundener L-DHO unter die Nachweisgrenze (1,5 μg/ml) nach 99 h. Tabelle 13: L-DHO-Konzentrationen in Splenozyten [50 × 10⁶ Zellen] von Ratten, behandelt mit Leflunomid
Tiere wurden mit Leflunomid oder Placebo behandelt, die Milzen entfernt (n = 3) und wie beschrieben vereinigt. Die vereinigten Splenozyten wurden in zweifacher Ausführung bestimmt. DL = Nachweisgrenze (1,5 μg/ml); Tabelle 14: L-DHO-Konzentrationen in Serum von Ratten, behandelt mit Leflunomid
Tiere wurden mit Leflunomid oder Placebo behandelt und Blut genommen, präpariert und wie beschrieben bestimmt. L-DHO-Serumkonzentrationen wurden für jedes Tier einzeln bestimmt. DL = Nachweisgrenze (0,5 μg/ml); Tabelle 15: A77 1726-Konzentrationen in Serum von mit Leflunomid behandelten Ratten
Die Tiere wurden mit Leflunomid oder Placebo behandelt und Blut genommen, präpariert und wie beschrieben bestimmt. A77 1726-Serumkonzentrationen wurden für jedes Tier einzeln bestimmt.
Oral verabreichtes Leflunomid wird sehr schnell in vivo zu A77 1726 umgewandelt. A77 1726 ist der aktive Metabolit von Leflunomid ( US 5 679 709 ). Inkubation von entweder Adjuvans erkrankten oder nicht erkrankten Ratten mit Leflunomid ergab sehr schnelle Akkumulation von L-DHO in deren Serum und Splenozyten. L-DHO-Konzentration korrelierte mit Blutserumkonzentrationen von A77 1726, was somit eine aktive Absenkung von DHO-DH durch dieses Molekül in vivo zeigt. In klinischen Humanstudien kann L-DHO-Verfolgen ein Surrogatmarker für Leflunomid-immunomodulierende Aktivität bei Patienten sein.

Claims

Verfahren zum Gewinnen von L-Dihydroorotsäure durch Chromatographie, umfassend die Schritte von: a) Bereitstellen einer Säule, umfassend druckstabiles anionisches Austauschmaterial; b) Beladen der Säule mit einer Probenlösung, die L-Dihydroorotsäure einschließt; c) Ausführen von Chromatographie; d) Eluieren der L-Dihydroorotsäure mit einer eluierenden Lösung, enthaltend ein Basen-Wasser-Gemisch; wobei das Verfahren unter einem Druck von 1,1 MPa bis 40 MPa ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Base Natriumhydroxid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das druckstabile anionische Austauschmaterial ein Divinylbenzol/Ethylvinylbenzol-Polymer oder ein Polyvinylbenzylammonium-Polymer, vernetzt mit Divinylbenzol oder Gemische davon, die mit quaternärem Alkanolammonium modifiziert sind, darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Druck 4,1 MPa bis 5,5 MPa ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Elution des Basen-Wasser-Gemisches einen Zeitgradienten der Basenkonzentration, vorzugsweise mit einem linearen Verlauf, zeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die L-Dihydroorotsäure durch einen Leitfähigkeitsdetektor nachgewiesen wird.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines diagnostischen Assays.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Bestimmen von Dihydroorotsäure-Dehydrogenaseinhibitoren.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Dihydroorotsäure-Dehydrogenaseinhibitor N-(4-Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid, Brequinar, N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxyhept-2-en-6-in-carboxamid, 2-Cyano-3-cyclopropyl-3-hydroxyacrylsäure-(4-cyanophenyl)amid und/oder N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamid ist.
Verwendung einer L-Dihydroorotsäure-Bestimmung zum Verfolgen der Aktivität von Dihydroorotsäure-Dehydrogenaseinhibitoren.