CZ20002134A3

CZ20002134A3 - Způsob přípravy kyseliny L-dihydroorotové a jeho použití

Info

Publication number: CZ20002134A3
Application number: CZ20002134A
Authority: CZ
Inventors: Ulrike Milbert; Robert Bartlett; Eric Ruuth; Claude Fudali
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2000-10-11
Also published as: CZ299968B6; PL194068B1; CA2315326A1; EP0933633A1; AU747993B2; KR20010032978A; US6545006B1; HUP0004510A3; JP2001526387A; RU2228932C2; DK1036319T3; AU1877599A; ID24807A; CN1281550A; PL341205A1; WO1999030146A1; ES2248927T3; KR100700906B1; EP1036319A1; HK1033171A1

Description

Způsob přípravy kyseliny L-dihydroorotové a jeho použití

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy kyseliny L-dihydroorotové (dále označované jako „L-DHO) pomocí chromatografie na anexu v bázické vodné směsi za tlaku od přibližně 1,1 MPa do přibližně 40 MPa. Způsob podle předloženého vynálezu se může použit při výzkumu in vitro i in vivo aktivity

N- (4-trifluormethylfenyl) -5-methylisoxazol-4-karboxamidu,

N-(4-trifluormethylfenyl)-2-kyan-3-hydroxykrotonamidu a podobných sloučenin.

Současný stav techniky

L-DHO může být stanovena chromatografií na silikagelu, následnou chemickou derivatizací a kolorimetrickým stanovením (Kesner L., Aronson F.L., Silverman M., Chán P.C., Clin. Chem. 21/3, 353 (1975)). Podle jiné metody se L-DHO převede enzymaticky na kyselinu orotovou působením dehydrogenázy kyseliny L-dihydroorotové (v dalším textu „DHO-DH), připraveného z krysích jater, a po chemické derivatizací se získaný orotát deteguje kolorimetricky (Rogers L.E., Nicolaisen K., Experientia 28/10, 1259 (1972)). Nevýhodou těchto metod je, že při nich interferují jiné látky, přítomné ve složitých fyziologických roztocích. Navíc jsou uvedené metody velmi zdlouhavé, protože příprava vzorků je pracná, a nehodí se proto pro rutinní analýzu při velkých klinických studiích.

Podstata vynálezu

Ve snaze nalézt zlepšené dělící a izolační postupy pro získání kyseliny L-dihydroorotové jsme nyní nalezli, že téhož výsledku je možno dosáhnout chromatografií L-DHO na anexovém materiálu s bázickou vodnou směsí jako eluentem, za tlaků od přibližně • ·· * » «·ι • · • · · · · * · ··*· ·· «· ·· ·· ·· 91

1,1 MPa do přibližně 40 MPa. Tento postup je možno použít pro kvantitativní stanovení L-DHO v buněčných lyzátech, savčím séru i v lidském séru. Postup je vysoce reprodukovatelný, citlivý a ověřený.

Jak je vysvětleno v patentových nárocích, způsob podle předloženého vynálezu spočívá v chromatografické metodě a zahrnuje následující kroky:

a) příprava kolony, která obsahuje tlaku odolný anexový materiál,

b) aplikace vzorku, obsahujícího kyselinu L-dihydroorotovou, na tuto kolonu,

c) provedení chromatografie,

d) eluce kyseliny L-dihydroorotové eluentem, obsahujícím bazickou vodnou směs, přičemž se tento pochod provádí za tlaku od přibližně 1,1 MPa do přibližně 40 MPa.

Pojem tlaku odolný anexový materiál znamená například materiál jako je makropórézní (2 000 Á) divinylbenzen/ethylvinylbenzenový polymer nebo mikropórézní polyvinylbenzylamoniový polymer, síťovaný divinylbenzenem, nebo jejich směsi, které jsou modifikovány alkanolovými kvarterními amoniovými sloučeninami, nebo makroporézní vinylbenzylchlorid/divinylbenzenový polymer, nebo síťovaný polyethyliminopolymer, nebo silika, modifikovaná propyltrimethylamoniem, nebo póly(styren-divinylbenzen)trimethylamonium.

Preferovány jsou zvláště následující produkty:

Ion Pac AS 11, CarboPac PA 1 nebo CarboPac MA 1 anexové kolony, dodávané firmou Dionex Corporation, Idstein, Německo,

GROM-SIL, Strong Anion, nebo GROM-SIL, Weak Anion, dodávané firmou Grom,

P 1000 SAX, Ionospher SA nebo Chrompack PA, dodávané firmou Chrompack,

PRP-X100 nebo RCX-10, dodávané'firmou Hamilton.

Eluční roztok obsahuje směs báze a vody. Vhodné jsou báze alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxyd hořečnatý nebo hydroxid vápenatý. Koncentrace báze se pohybuje od 1 mmol/lítr do přibližně 200 mmol/lítr, vztaženo na vodu jako rozpouštědlo, s výhodou od 2 mmol/lítr do přibližně 120 mmol/lítr, nejvýhodněji 100 mmol/lítr.

Teplota při chromatografickém procesu se pohybuje od přibližně 0 °C do přibližně 50 °C, s výhodou od přibližně 15 °C do přibližně 30 °C, nejvýhodněji od přibližně 19 °C do přibližně 25 °C. Pracovní tlak během chromatografie se prakticky nemění. Chromatografie se může provádět při různých tlacích, například při tlaku od přibližně 1,1 x 10^s Pa (1,1 MPa) do přibližně 40 x 10^s Pa (40 MPa), zvláště od 4,1 MPa do 5,5 MPa. Průtoková rychlost se pohybuje od přibližně 0,2 ml/min do přibližně 3 ml/min, a s výhodou je 1 ml/min. Aplikace na kolonu, chromatografie a eluce L-DHO se provádí běžně známými technikami. Vhodné eluce jsou eluce s časovým gradientem koncentrace báze, nejlépe s lineárním gradientem. Tento koncentrační gradient se například uplatní tím způsobem, že se začne s nízkou koncentrací báze (v limitním případě s nulovou koncentrací) a její koncentrace se potom v průběhu elučního pochodu zvyšuje. Tímto způsobem je možno dosáhnout zvláště účinného oddělení L-DHO ve vzorcích, připravených ze séra nebo z buněčných lyzátů. Preferovaný gradient báze se pohybuje od přibližně 1 % NaOH (100 mmol/lítr) a 99 % vody (na začátku eluce) až do přibližně 60 % NaOH a 40 % vody (na konci eluce), přičemž výhodný gradient je od přibližně 1 % NaOH a 99 % vody (na začátku eluce) až do přibližně 15 % NaOH a 75 % vody (na konci eluce). Koncentrační gradient báze se mění lineárně od

2,5 minut až do přibližně 14 minut a dále od 14 minut do přibližně 25 minut, přičemž strmost gradientově křivky je v těchto dvou časových úsecích rozdílná.

Zvláště vhodné eluce je možno dosáhnout, když se na začátku použije nízké koncentrace báze (přibližně 1 %) po dobu asi

4· · ·· · · ftftft · ftft · * ft····· ftft · · a ft ft · • •ft· ···« ftftft· ftft ftft ·· ·· ftft ftft

2,5 minut. Výsledkem je, že se z kolony eluuje většina interferujícího materiálu z biologické matrice. Analyt se pak rozdělí pomalým zvyšováním koncentrace na přibližně 23 % báze během přibližně 14 minut analýzy. Pak se koncentrace báze zvýší na přibližně 60 % během 4 minut, aby se vymyl silně vázaný materiál. Koncentrace 60 % báze by se neměla použít déle než 6 minut. Pak se kolona reekvilibruje l%ním roztokem báze ve vodě. Další analýza se začne po 45 minutách celkové doby analýzy. Voda, použitá k přípravě směsi s bází, musí být deionizovaná a odplyněná. Separační pochod podle předloženého vynálezu se provádí na koloně. Během celé chromatografie na anexu se teplota s výhodou udržuje konstantní a chromatografie se může provádět v širokém rozmezí teplot. Preferované rozmezí teplot je od přibližně -10 °C do přibližně 50 °C, zvláště od přibližně 15 ^QC do přibližně 25 °C.

Eluce L-DHO nastává od 10 minut do 12 minut po začátku gradientu a doba eluce je od 13 minut do 25 minut. L-DHO se deteguje vodivostním detektorem, jako je například model CD20 firmy Dionex Cooperation. Aby se minimalizoval posun základní linie a snížilo vodivostní pozadí, může se použít „anion šelf . regenerátor suppressor, jako například model ASRS-I, 4 mm, od firmy Dionex Cooperation.

Způsob podle předloženého vynálezu je zvláště vhodný pro analytickou chromatografií, ale může se použít i pro preparativní chromatografií, zvláště pokud se způsob podle vynálezu provádí za použití systému preparativní vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC). Termín „preparativní chromatografie znamená purifikační proces, jehož účelem je získat čisté produkty a nikoliv je jenom analysovat. Množství Čistých produktů se může pohybovat v širokém rozmezí, například od 1 mg do 1000 g, s výhodou mezi 50 mg a 500 mg.

Způsob podle vynálezu se může použít k detekci změn intracelulárních nebo extracelulárních koncentrací L-DHO v důsledku inhibice dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové (DHO-DH). Enzym DHO-DH je odpovědný za přeměnu kyseliny • · ·· • · · · • · » · ·· ·· • · · • · ·· • · ··* • · · • · · « » ·· ··

L-dihydroorotové na kyselinu orotovou během de novo syntézy pyrimidinu. Inhibice DHO-DH vede ke hromaděni L-DHO. Způsob podle vynálezu se může použít pro přípravu diagnostického testu. Může se též použít pro stanovení aktivity inhibitorů DHO-DH. Inhibitory DHO-DH jsou například

N-4-(trifluormethylfenyl)-5-methylisoxazol—4-karboxamid, Brequinar, N-(4-trifluormethylfenyl)-2-kyan-3-hydroxyhept-2-en-6-in-karboxamid, (4-kyanfenyl)amid kyseliny 2-kyan-3-cyklopropyl-3-hydroxyakrylové, nebo

N-(4-trifluormethylfenyl)-2-kyan-3-hydroxykrotonamid. Způsob podle vynálezu může být rovněž použit pro určení koncentrací L-DHO v rostlinách, buněčných liniích, i ve zvířecích nebo lidských materiálech.

Způsob podle vynálezu je podrobně popsán v příkladech, uvedených níže. Pokud není uvedeno jinak, procentické údaje se vztahují na hmotnostní procenta.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1,1. Chemikálie a činidla

Použité chemikálie a Činidla

Uhličitanu prostý NaOH a KOH

Kyselina L-dihydroorotová (L-DHO)

HC1O₄

Eosin, chloroform

RPMI 1640 medium

Petální telecí sérum (FCS) jsou produkty následujících firem Baker, Holandsko

Sigma, Mnichov Riedel de Haen, Seelze Riedel de Haen, Seelze Gibco, Eggenstein Bio Whitaker, Verviers, Belgie

Deionizovaná voda se před použitím odplyní heliem.

1.2. Chromatografické vybavení

HPLC chromatografie se provádí s použitím těchto přístrojů:

- 6 · · · • · ·· · · ··· • · · · · · 0 · ··· · e e * · · · · »· · ··«· ·· ·· ·· »B «· «·

Zařízení	Model	Výrobce
Směšovací modul	SCM 400	Thermo separation Products (TSP)
Binární gradientova pumpa	P 2000	TSP
Autosampler s 20 pl smyčkou	AS 3000	TSP
Interface	SP 4510	TSP
AD měnič	SN 4000	TSP
Vodivostní detektor	CD 20	Dionex
„Anion šelf regenerating suppressor	ASRS-I 4 mm	Dionex
Stabilizátor detekce	DS 3-1	Dionex
PC	El 20, Flex Scan, F 563-T	Escon
Tiskárna	Desk Jet 550 C	Escon
Software	PC 1000	TSP

Pokusy se provádí se špičkovým materiálem.

1.3. Podmínky HPLC

Chromatografické dělení se provádí na koloně o rozměrech 250.x 4 mm vniřního průměru, plněné anexem lonPac AS 11 (velikost částic 13 pm; P/N 044076, Dionex), opatřenou předkolonkou o rozměrech 50 x 4 mm vnitřního průměru, s náplní lonPac AG 11 (velikost částic 13 pm; P/N 044078, Dionex). Navíc se mezi gradientovou pumpu a nástřikový ventil připojí anionty zachycující kolona ATC-1 (P/N 037151, Dionex). Aby se minimalizoval posun nulové linie a snížila se vodivost pozadí, instaluje se ASRS-I suppressor, pracující při 300 mA. Rozsah detektoru se nastaví na 10 pS. Autosampler se chladí na 14 °C, ale samotná analýza se provádí při teplotě místnosti. Mobilní fáze se skládá ze 100 mM NaOH (A) a deionizované a odplyněné _ · · ·· · · ·.· · · · *

-/- ······ ····»··· ' ···»·····».

·· ·· ·· ·· · ·· vody (Β). S těmito dvěma složkami se vytvoří následující gradient:

Čas (min)	A (%)	B (%)
0	1	99
2,5	1	99
14	23	77
18	60	40
24	60	40
26	1	99
45	1	99

Průtoková rychlost je 1 ml/min; trvání 45 minut.

1.4. Standardy a vzorky pro kontrolu kvality

Standardní zásobní roztok se připraví rozpuštěním 1 mg L-DHO v 1 ml vody. Alikvoty o objemu 400 μΐ se zmrazí na -20 °C. Stabilita těchto roztoků je zaručena nejméně po 4 týdny. Definovaná množství zásobního roztoku se přidají k buněčným lyzátům a k lidskému nebo zvířecímu séru a podrobí se analýze, aby se vyhodnotila linearita mezi zvětšením signálu a koncentrací přidané L-DHO. Přesnost a správnost metody se sleduje pomocí QC („quality contrql) vzorků s obsahem L-DHO v nízkém, středním a vysokém koncentračním pásmu křivky lineární závislosti signál/koncentrace.

1.5. Příprava vzorků

1.5.1. Buňky

Buňky Jurkat se získají od ATCC (TIB 182) a kultivují se způsobem, popsaným v části 1.5.1.1.

1.5.1.1. Podmínky kultivace tkáňové kultury

Buňky Jurkat se vysejí při 5 x 10⁵/ml a nechají se růst 24 hodin v prostředí RPMI 1640 s 10%ním fetálním telecím sérem (FCS). Buňky se spojí v čerstvém mediu pro buněčnou lýzi,,a • · *·»

- 8 · · · · · 9 · * ·*· ·· ·» ·· ·· ·· · množství buněk a procento mrtvých buněk se stanoví vitální mikroskopií pomocí eosinu. Po 24 hodinách vzroste počet buněk

1,6-1,8 krát, přičemž počet mrtvých buněk je menší než 7 %. Buňky Jurkat pro stanovení L-DHO mají dělící poměr 1,6-1,8 během 24 hodin a mrtvých buněk je méně než 7 %.

1.5.1.2. Příprava buněčných lyzátů

Buňky se suspendují v definovaném objemu media a jejich hustota se stanoví vitální mikroskopií s použitím eosinu. Přibližně 10 x 10⁶ buněk se odebere a peletuje se 5-minutovou centrifugaci při 350 x g a supernatant se vylije. Lýze buněk se provede resuspenzí buněčné pelety v 500 μΐ 1,2 M HCIO4. Tato směs se přenese do 2,0 ml Eppendorfových zkumaveček s bezpečnostním víčkem a protein se srazí vysokorychlostní centrifugaci po dobu 2 minut. Supernatant se úplně odstraní, přenese se do skleněných vialek a po přidání 500 μΐ chloroformu se důkladně promíchá vířivým pohybem. Celulární lipidy se extrahují chloroformem a následnou centrifugaci (1502 x g) při 10 °C po dobu 10 minut. Přečištěný supernatant: se shromáždí ve 2 ml Eppendorfových zkumavečkách a do použití se uchovává při teplotě -20 °C. Pro HPLC analýzu se 100 μΐ supernatantu neutralizuje 30 μΐ 6 Μ KOH. Vzorky se třepou přibližně 5 vteřin a nechají se stát v ledu po dobu 30 minut. Pak se centrifugují po dobu 5 minut při 15 000 ot/min. Pro HPLC analýzu se pak použije 20 μΐ čirého supernatantu.

1.5.2. Sérum

Aby se zredukoval obsah proteinů, přidá se 200 μΐ séra k filtru Microcon (10 OOO D, model 10, kód 42407, Amicon) a centrifuguje se po dobu 30 minut při 13 000 otáček za minutu (rpm). Filtrát má objem přibližně 150 μΐ a obsahuje analýzovanou L-DHO. 2 této kapaliny se použije 20 μΐ pro analýzu HPLC.

- 9 i · ~ i · ·«· · i · « • · · · · · · t | · • · ft · · · · « · · · · ·· ·· ·» ·· ·· «·

1.6. Kvantitativní stanovení

Velikost píku analytu se stanoví integrátorem. Kalibrační křivky se získají vynesením naměřených velikostí píku (y) proti koncentraci analytu v různých biologických matricích. Vážená lineární regrese (1/y) se použije ke zpětnému výpočtu koncentrace L-DHO ve standardních vzorcích i ve vzorcích „quality control. Společný korelační koeficient R se získá pomocí PROČ GLM na základe analýz kovariančního modelu s použitím vážícího faktoru.

1.7. Stabilita

V tabulce 1 jsou uvedeny údaje o stabilitě analytu při teplotě -20 °C v buněčných lyzátech a vzorcích séra po 2-3 cyklech zmrazení/tání jednoho vzorku. Za uvedených podmínek byla L-DKO v buňkách Jurkat stabilní přinejmenším 4 týdny. Pozorovaný více než 10%ní vzrůst koncentrace v některých vzorcích krysího séra a v jednom vzorku lidského séra po několika cyklech zmrazení/tání není možno vysvětlit a ukazuje to, že v takových případech se přesnost obecně snižuje až na 15 % a v nejhorším případě až na 29 %. Z těchto důvodů je možno konstatovat, že v krysím a lidském séru je L-DHO s určitostí stálá pouze přinejmenším 1 týden.

Tabulka 1

Stabilita v buněčných lyzátech a v sérech při -20 °C (n = 1)

Doba (dny)	Koncentrace 1 20 μ9/πι1	Zbytek (%)	Koncentrace 2 100 μg/π^l	Zbytek (%)
Buňky Jurkat
0	19,34	100	100,05	100
1	19,28	99,7	99,09	99,0
14	n.d.	n.d.	115,32	115,3
29	19, 98	103,3	99,35	99,3

• · 999 • 9 99 • 9 9 9

-10 Tabulka 1 (pokračování) • ·· 9 9 · 9 9 · · · φ* 9

9 9 · 999· · · · ·

99 ·9 ·· 99 9·

Doba (hodiny)	Koncentrace 1 5 pg/ml	Zbytek (%)	Koncentrace 2 20 pg/ml	Zbytek {%)
Krysí sérum
0	4,30	100	19,94	100
7	4,52	105,1	19,62	98,4
14	4,81	111,9	20,93	105,0
21	5,55	129,1	22,38	112,2
Lidské sérum
0	4, 67	100	20,22	100
8	4,81	103,0	' 20,38	100,8
65	4,87	104,3	23,20	114,7

Zbytek (%) je procento koncentrace v porovnání s počáteční analýzou, n.d. = neurčeno.

Aby se simulovaly podmínky, ve kterých se nacházejí vzorky, když čekají v autosampleru na analýzu, určí se jejich stabilita během 18 hodin při 14 °C. K buněčným lyzátúm se proto přidá roztok L-DHO a pak se k nim přidá 30 μΐ 6 M KOH/100 μΐ lyzátu před začátkem analýzy. V.zorky sér se rovněž dopují a pak se deproteinují, jak je popsáno v odstavci 1.5.2.

Jak je vidět z tabulky 2, obsah L-DHO v buněčných vzorcích se za těchto podmínek mírně sníží, maximálně až o přibližně 7 %.

V sérových vzorcích je za těchto podmínek analyt stálý. Proto se připravuje pouze tolik vzorků pro HPLC, aby maximální doba Čekání v autosampleru byla kratší než 18 hodin.

• · 000 • 0 0 0 • 0 00

- 11 Tabulka 2. Stabilita během 18 hodin při 14 ^eC (n = 1) • 0 0 ··· 0 0 ··· 0 0 0 Φ 0 0 0 *000 0000 • 0 00 00 00 00 00

Doba (hodiny)	Koncentrace 1 20 pg/ml	Zbytek (%)	Koncentrace 2 100 μ^/αΐ	Zbytek (%>
		Buňky Jurkat	ť
0	19,96	100	100,02	100
18	18, 60	93,2	97,43	97,4'

Doba (hodiny)	Koncentrace 1 5 pg/ml	Zbytek (%)	Koncentrace 2 20 μg/lIll	Zbytek (%)
Krysí sérum
0	4,61	100	19,99	100
18	4,96	107,6	20,53	102,7
Lidské sérum
0	3,34	100	18,78	100 .
18	3,37	100,9	22,09	117,6

e

I. 8. Selektivita

Srovnání chromátogramů samotných lyzátů buněk Jurkat s odpovídajícími chromatogramy buněčných lyzátů, ke kterým bylo přidáno 50 pg L-DHO/ml, ukazuje existenci malého píku při

II, 983 min, což je tentýž retenční čas, jaký má L-DHO. Je vysoce pravděpodobné, že tento pík je důsledkem přirozeného obsahu analytu v těchto buňkách. Rovněž je možno pozorovat, že po působení KOH na buněčné lyzáty se pík L-DHO rozštěpí na dva píky. Působení KOH je však nutné, aby se neutralizoval kyselý buněčný lyzát před HPLC analýzou. Za popsaných podmínek dává vyhodnocení velikosti tohoto druhého píku (retenční čas 11,954 min) zlepšené výsledky co se týče linearity a reprodukovatelnosti.

- 12 « · ·· · · *·· · • · · · · · · · · * I · · » ···· · · · · ···· 99 99 ·· ·· ·· ··

Rovněž v případě krysího a lidského séra byl nalezen pík stejného retenčního času, jako má L-DHO. Předpokládá se, že co ukazuje přirozený obsah L-DHO v organizmu. Analýza přinejmenším 10 různých vzorků obou specií ukazuje, že přirozený obsah L-DHO je pod detekčním limitem 1 pg/ml.

1.9. Linearita

Linearita stanovení se vyhodnotí pomocí pěti kalibračních křivek pro buněčné vzorky a různé sérové vzorky. Připravené vzorky se analyzují pět dní za sebou. Koncentrace L-DHO je v rozmezí 1,5-150 pg/ml (buněčné lyzáty) a 1-30 pg/ml (sérové vzorky). Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 3-5. Pro určení regresní přímky byly použity výšky píků. Na této bázi se zpětně vypočetly odpovídající koncentrace různých standardů, jak je uvedeno v tabulkách.

Tabulka 3

Linearita určení L-DHO v lyzátech buněk Jurkat

Po přidání L-DHO byly vzorky vystaveny působení 30 pl 6 M KOH a pak jednou analyzovány jak je popsáno v odd. 1.3.

í Den í-'		Koncentrace (pg/ml)	l . . • 100	- - - ->>>' - 150	Směrnice	KritěrcěpL	r - }
	zlo.;	asoe
1	1.78	5.54	9.09	49.80	102.46	149.09	1317.54	-258.17	0.9995
2	1.90	5.14	9.54	50.77	100.22	150.20	1324.84	204.79	0.9995
3	1.86	5.24	9.46	51.18	99.91	150.07	1295.48	302.48	0.9996
4	1.85	5.34	9.39	51.45	100.97	148.71 .	1306.08	833.68	0.SS96
. 5	’ΤθδΊ	5.26	9.53	50.98	100.07	n.d.	1318.67	530.19	0.9993
Průměr) 1.85	5.30	9.40	50.80	100.73	149.52	1312.52	322.59
S.D.	0.04	0.15	0.19	0.63	1.05	0.73	11.69	404.93
C.V. (%)	2.3	2.8	2.0	1.2	1.0	0.5	0.9	125.5

R=0,9995

ΦΦΦΦ

- 13 • ··· • · ♦ · Φ · Φ Φ · 9 Φ · · * • · φ Φ Φ φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ • Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

Tabulka 4

Linearita určení L-DHO v krysím séru

Po přidání L-DHO bylo sérum zbaveno proteinů způsobem popsaným v odd. 1.5.2.

í ?^en '		Koncentrace (ug/ml) ’. .:	Směrnice ;	y-íntercept	- Γ-.7
	.. ,20	, .130
1	1.05	4.48	10.10	22.10	28.61	15334	-4719.83	0.9966
2	1.16	4.59	8.60	21.07	30.97	17559	-4630.63	0.9960
3	1.07	4.64	9.81	20.07	30.45	17674	-3175.63	0.9395
4	1.11	4.62	9.54	19.27	31.65	18322	-4296.53	0.9981
5	1.06	4.81	9.99	18.89	31.40	17738	-829.00	0.9985
Průměr	1.09	4.63	9.61	20.28	30.62	17325.4 0	-3530.33
S.D.	0.05	0.12	0.60	1.32	1.21	1151.65	1630.62 ,	-
C.V.	4.2	2.6	6.3	6.5	4.0	6.7	46.19

R=0.9959

Tabulka 5

Linearita určení L-DHO v lidském séru

Den -	BBS	- ' Koncentrace (pg/mi)	30	Směrnice	y-lntercěpt	h/_:./r iý
1	0.90	5.17	11.30	19.41	29,42	13498	2930.30	0.9980
2	0.99	4.87	10.12	21.51	28.68	15663	477.61	0.9982
3	0.94	4.94	11.29	19.41	29.59	14328	1367.80	0.9982
4	1.01	4.77	10.32	20.82	29.15	15777	1771.98	0.9992
5	1.01	4.81	10.10	20.86	29.28	15216	1612.77	0.9993
Průměr) 0.97	4.91	10.62	20.40	29.23	14896.4	1632.09
S.D.	0.05	0.16	0.61	0.95	0.35	967.46	831.47
C.V. (%)	5.2	3.2	5.8 ·'	4.6	1.2	6.5	54.01

R = 0,9986, ♦ standardní koncentrace (ug/ml), - nestanoveno, SD = směrodatná odchylka • · · · · * • · · · · ·· »· ·· ·0

- 14 ·« ··

Ml

Jak je vidět z těchto tabulek, ve všech případech je prokázána linearita. Odráží se to v individuálních korelačních koeficientech „r, které jsou ve všech případech vyšší než 0,99. V každé tabulce je udána střední regresní přímka pro koncentrační křivky, získané během pěti dnů, a je zřejmé, že její směrnice je velmi dobře reprodukovatelná a má maximální odchylku 6,7 %.

Zpětně vypočítané standardní koncentrace vykazují v průměru hodnoty C.V. menší než 6,5 % a svědčí tak o vysoké přesnosti nalezených hodnot. Korelační koeficient R, který je vyšší než 0,99, vyjadřuje vysokou správnost a reprodukovatelnost této metody.

1.10. Limit stanovení

Z uvedených výsledků plyne, že limit stanovení u buněk Jurkat je 1,5 μg/ml. Ve vzorcích krysího a lidského séra je možno detegovat 1 gg/ml L-DHO. Vzorky, ke kterým byla přidána L-DHO, vykazují při těchto koncentracích poměr signál/šum přinejmenším 1:3.

1.12. Přesnost a správnost

Přesnost a správnost opakovaných stanovení L-DHO při třech různých koncentracích během pěti dnů jsou shrnuty v tabulkách 6-8. Přesnost je vyjádřena jako % rozdílu mezi nalezeným a přidaným množstvím L-DHO. Denní správnost je vyjádřena jako C.V. {%) a je vypočtena s použitím dvou hodnot, získaných dvěma měřeními jednoho vzorku v jeden den. Mezidenní správnost je rovněž vyjádřena jako C.V. (%) a je vypočtena s použitím průměrných nalezených hodnot pro každý kontrolní vzorek po pět dnů.

v «V • · · ft · · • « · ·* ftft • »· • · · • · ft ♦r

- 15 « ·

Tabulka 6

Přesnost a správnost v lyzátech buněk Jurkat po přidání L-DHO a následné neutralizaci 30 μΐ 6 Μ KOH; n = 2 znamená, že k jednomu vzorku buněčného lyzátu byla přidána odpovídající koncentrace L-DHO a vzorek byl měřen dvakrát.

ft· • ··» • · • · • ft ··

Kontr. vzorek (gg/ml)	Den	n	Přesnost Průměr ‘ Odchylka (pg/ml) (%)	Správnost C.V.(%) C.V. (%) denní mezidenní
20	1	2	20.10 +0.5	1.4	2.9
2	' 2	19.20	-4.0	1.3
3	2	19.40	-2.8	3.9
4	2	19.51	-2.5	2.2
5	2	18.55	-7.2	1.3
70	1	2	69.12	-1.3	0.1	2.8
2	2	69.13	-1.2	0.8
3	2	73.69	+5.3	0.2
4	2	71.52	+2.2	1.1
5	2	69.64	-0.5	0.9
130	Ί	2	123.21	-5.2	2.8	CLU
2	2	114.78	-11.7	12.0
3	2	135.21	+4.0	Λ Λ u.z
4	2	126.89	-2.4	1.4
5	2	122.43	-5.8	4.1

Tabulka 7

Přesnost a správnost v krysím séru po přidání L-DHO a následné deproteinaci; n = 2 znamená, že k jednomu vzorku séra byla přidána odpovídající koncentrace L-DHO a byl měřen dvakrát.

Kontr. vzorek (Mg/ml)	Den	n	Přesnost Průměr Odchylka (pg/ml) (%)	Správnost C.V.(%) C.V. (%) denní mezidenní
8	1	2	7.68 \| -4.0	0.4	3.0
2	2	7.73 \| -3.4	1.0
3	2	7.83 l -2.2	2.1
4	2	7.43 l -7.1	1.0
Γ 5	2	8.06 \| +0.7	0.6
15	1	2	14.53 \| -3.1	6.8	1.8
2	2	14.73	-1.8	1.3
3	2	14.26	-5.0	0.1 '
4	2	14.85	-1.0	0.4
	5	2	14.88	-0.8	0.9
25	1	2	24.98 ( -0.1	2.5	3.7
2	2	25.83	+3.3	1.3
3	2	25.43	+1.7	0.6
4	2	24.31	-2.8	2.0
5	2	26.81	+7.2	0,2

- 16 Tabulka 8

Přesnost a správnost v lidském séru po přidáni L-DHO a následné deproteinaci; n = 2 znamená, že k jednomu vzorku séra byla přidána odpovídající koncentrace L-DHO a byl měřen dvakrát.

Kontr. vzorek (gg/mt)	Den	n	Přesnost Průměr Odchylka (pg/ml·) (%)	Správnost C.V.(%) C.V. {%) denní mezidenní
8	1	2	7.77	-2.9	0.7	3.8
2	2	7.84	-2.0	15.5
3	2	7.43	-7.1	10.9
4	2	7.17	-10.4	2.1
5	2	7.80	-2.5	1.2
15	1 I 2	13.88	-7.5	0.9	6.0
2	2	14.00	-6.7	8.5 1
3	2	15.10	+0.5	1.5
4	2	15.13	+0.8	7.2
5 I 2	16.03	+6.8	12.8
25	1	2	26.56	+6.2	3.4	4.2
2	2	23.77	-4.9	0.7
3	2	24.80	-0.8	4.7
4	2	25.46	+1.8	7.8
c	2	24.54	-1.9	0.2

Uvedené výsledky ukazují, že ve většině případů mají kontrolní hodnoty odchylku maximálně ± 10 %, a že tato metoda je tudíž velmi přesná. Pouze v jednom případě u buněk Jurkat nalezená hodnota mírně převyšuje tuto odchylku (-11,7 %). Může to být vysvětleno vysokou denní hodnotou 12 %. Denní správnost u buněk Jurkat je nižší než 5 %, u krysího séra je nižší než 7 % a u lidského séra nižší než 10 %. Mezídenní správnost ve všech sledovaných případech je nižší než 6,0 %. Ukazuje to, že získané výsledky jsou vysoce reprodukovatelné a jejich sporávnost je velká.

• » ·· · · ♦·· * · · · · · «φ

- 17 • · · • · ··

Přiklad 2

2.1. Tkáňové kultury

Příprava séraprostého prostředí: Práškové medium Iscove (Biochrom) se rozpustí v 10 litrech redestilované vody, obsahující 18,95 g NaCl, 11,43 g NaHCOa, 700 mg KC1, 10 ml 35%ního roztoku NaOH a 0,5 ml 1 M roztoku merkaptoethanolu (Riedel de Haen), a sterilně se zfiltruje. K jednomu litru takto připraveného media Iscove se před použitím přidá 32 mg lidského holo-transferrinu, 1 g hovězího albuminu a 1,5 ml lipidů (Sigma).

Buněčná kultura: Buňky A20.2.J se kultivuji v séraprostém mediu (37 °C, 5 % CO₂) v expanzní kultuře za podmínek logaritmického růstu buněk. Použité buňky mají dělící rychlost 2,2 za 24 hodin. Procento mrtvých buněk je menši nez 8 % (3).

Působení N-(4-trifluormethyl) -2-kyan-3-hydroxykrotonamidu (v dalším A77 1726) na buňky: Látka A77 1726 se připraví podle patentového spisu EP-0 529 500, rozpustí se v redestilované vodě (10 mM) a dále se zředí séraprostým mediem. Vhodné množství A77 1726 se pak přidá k buňkám a ty se inkubují při 37 °C a 5 % CO₂.

2.2. Příprava buněčných lyzátů pro stanovení L-DHO

Připravené buňky se resuspendují v určeném objemu media na určenou hustotu buněk. Podle očekávaného obsahu DHO se odebere

1-50 milionů buněk, které se peletují (5 min, 350 x g) a supernatant se zlikviduje. Buňky se podrobí lýze působením 500 μΐ 1,2 M HCIO4. Lyzáty se přemístí do Eppendorfových zkumaveček s bezpečnostními víčky a protein se odstraní vysokorychlostní centrífurací (2 min). Okyselené lyzáty se kvantitativně přenesou do skleněných vialek, přidá se k nim 500 μΐ chloroformu a směs se důkladně promíchá na Vortexu (2 minuty). Tím se extrahují celulární lipidy. Směs se podrobí centrifugací za chladu (10 minut, 1502 x g, 10 °C). Takto přečištěné supernatanty se uchovávají v 2 ml Eppendorfových zkumavečkách při -20 °C až do HPLC analýzy.

- 18 9 • 99

9 9 »

9 « » 9 • 9

9 999 • 9 9 9 • 9 9 ·

9· ··

9 9 • 9 9 • »9 · ·

2.3. HPLC stanovení L-DHO

Chromatografická separace se provede stejně jako je popsáno v příkladu 1. Rozsah vodivostního detektoru se nastaví na 10 μδ. Analýza se provádí při teplotě místnosti. Mobilní fáze se skládá z 100 mM NaOH (A) a vody (B). Tyto dvě složky se použijí v následujícím gradientu:

Čas (min)	A (%)	B (%)
0	1	99
2,5	1	99
14	8	92
22	8	92
28	60	40
32	60	40
34	1	99
49	1	⁹⁹

Průtok 1 ml/min, doba analýzy 49 min.

2.4. Výsledky

Buňky A20.2.J při inkubaci se sloučeninou A77 1726 mají zvýšený obsah intracelulární L-DHO (tabulky 9-11). Výsledky, uvedené v tabulce 9 ukazují, že obsah L-DHO přímo koreluje s počtem extrahovaných buněk.

- 19 • · ·· * · ··· ί »:

·· · · · ♦ · ··· · · • ·· · ·«·· ·»· ·· ·« «» ·« «(

Tabulka 9

Korelace koncentrace intracelulární L-DHO a počtu buněk kultivovaných s A77 1726

Buňky	Koncentrace L-DHO ^g/ml ± SD)
(χ 10⁶)
	Pokus 1 (ElOB)	Pokus 2 (E14)
1	14,08 ± 2,40	11,75 ± 0,23
2	19,51 ± 6,47	28,27 ± 0,79
4	53,58 ± 3,50	57,20 ± 2,76
6	73,01 ± 1,49	85,38 ± 2,33
8	99, 89 ± 5,96	107,02 ± 3,47
10	113,37 + 4,24	128,73 ± 1,95

Buňky A20.2.J se smíchají s 5 μΜ sloučeniny A77 1726, kultivují se 24 hodin (37 °C, 5 % CO2) a pak se připraví pro extrakci L-DHO (n = 3).

Aby se optimalizovaly kultivační metody a stanovil se nej lepší molární poměr buňka/A77 1726, inkubují se různé hustoty buněk A20.2.J spolu s A77 1726 (5 μΜ). V různých okamžicích se odeberou vzorky a stanoví se koncentrace L-DHO (tabulka 10). Protože koncentrace L-DHO jsou přímo úměrné množství extrahovaných buněk (viz tabulku 9), v dalších pokusech se extrapolují koncentrace L-DHO v μΙ/ml na 10 x 10^s buněk/ml. Nejlepší lineární vzrůst úrovně 1-DHO je při hustotě 1 x IQ⁶buněk/ml. Tato hustota se použije pro studium časové závislosti intracelulárních hladin v buňkách inkubovaných se sloučeninou A77 1726. Detegovatelná množství L-DHO je možno nalézt po jednohodinové inkubaci, nezávisle na koncentraci sloučeniny (tabulka 11). Vzrůst koncentrace je lineární, s největším množstvím L-DHO po 6 hodinách (tabulka 11). Pak nastane perioda nasycení, bez dalšího vzrůstu obsahu L-DHO.

-20 • · ·· · · ··· · · · · *·· · · · · · ·· · · · ···· · ·· · · ·* · ·· ·· ·· ·· ·· ··

Tabulka 10

Hustota buněk a časová závislost vzrůstu koncentraci intracelulární L-DHO

Doba inkubace (h)	Koncentrace L-DHO (pg/ml) průměr ± SD
1x10® buněk/ml	2x10® buněk/ml	3x10® buněk/ml
1	6,25 ± 0,42	5,47 ± 0,10	5,63 ± 0,19
4	33,06 ± 2,26	26,36 ± 0,42	19,39 ± 1,87
7	60,07 ± 0,01	42,31 ± 1,07	28,79 ± 0,34

Různá množství buněk A20.2.J se inkubují spolu se sloučeninou A77 1726 (5 pM) po udanou dobu·, a pro každý vzorek se stanoví koncentrace intracelulární L-DHO (všechny hodnoty jsou extrapolovány na 10 x IQ⁶ buněk) (n = 2).

Tabulka 11

Časová závislost vzrůstu koncentrací intracelulární L-DHO

Doba inkubace (h)	Koncentrace L-DHO (pg/ml)	průměr ± SD
A77 1726 (5 pM)	A77 1726 (10 pM)	A77 1726 (25 pM)
0	2,73 ± 0,10	2,73 ± 0,10	2,73 ± 0,08
1	9,20 ± 0,09	8,5 ± 0,39	15,05 ± 0,26
2	24,03 ± 1,15	20,74 ± 1,43	26,06 ± 0,20
4	59,48 ± 0,72	58,65 ± 2,06	50,21 ± 1,54
7	87,54 ± 1,58	82, 65 ± 4,50	114,89 ± 3,61

Buňky A20.2.J (1 milion/ml) se inkubují spolu s různými koncentracemi sloučeniny A77 1726 a stanoví se koncentrace intracelulární L-DHO v různých okamžicích. Hodnoty jsou udávány jako pg/ml L-DHO ± SD a jsou extrapolovány na deset milionů buněk (0-4 hodiny: n = 2, 7 hodin: n = 4).

Inkubace tumorových buněk A20.2.J se sloučeninou A77 1726 vede k rychlé akumulaci L-DHO v důsledku inhibice DHO-DH. Intracelulární koncentrace L-DHO korelují s počtem buněk a jsou • · ·· • · ···

-21 • · · ··· · · · · * · « » ·«·· · · · · ··»» ·· ·· · ·· «· «· závislé na čase. Monitorování L-DHO je náhradní markér pro imunomodulační aktivitu sloučeniny A77 1726 u pacientů.

Příklad 3

Zvířata: Krysí samci Wistar-Lewis (Mollegaard Breading Center Ltd., Ejby, Dánsko) o tělesné hmotnosti 160-200 g.

Adjuvantní artritida: Vyvolá se injekcí 0,1 ml Freundova adjuvans {suspenze 6 mg Mycobacterium smegmatis v 1 ml těžkého bílého parafinového oleje; Merck, Darmstadt) do kořene ocasu krys Wistar-Lewis. Patologické změny se obvykle projeví mezi 10. a 14. dnem po injekci.

Podávání: Sloučeniny se suspendují v l%ní karboxymethylceluloze (COMC). Zdravým zvířatům (n = 18) a zvířatům, kterým bylo podáno adjuvans (9. den po projevení pbruchy; n = 18), se orálně podává 10 mg/kg N-4-(trifIuormethyifenyi)-5-methyiisoxazol-4-karboxamidu (dále leflunomid) dvakrát denně (7:30 h a 13:30 h) po dobu pěti dnů, tedy v čase 0 h, 6 h, h, 30 h, 48 h, 54 h, 72 h, 78 h a 96 h (viz tabulku 12).

V čase 0 h se zabijí tři zdravá a tři nemocná zvířata, aby se stanovily hodnoty pozadí. Dalším třem zdravým a třem nemocným zvířatům se podává po pět dnů pouze placebo (COMC).

Odebírání vzorků: V každém časovém bode se zabijí tři zvířata z každé skupiny. Odebere se sérum a splenbcyty při 3 h, 7 h, 27 h, 51 h, 75 h a 99 h (viz tabulku 12). Vzorky se berou tři hodiny po posledním podání sloučeniny, s výjimkou hodnoty pro 7 h, kdy se vezmou jednu hodinu po druhém podání. Vzorky od krys, jimž bylo podáno placebo, se vezmou v 0 h (n = 3) av 99 h (n = 3) .

Tabulka 12

Podání leflunomidu a časy odebrání vzorků

Hodina: 0 3	67	24 27 30	48 51	54	72 75 78	96 99
Podáni (p.o.) γ	7	T 7	7	7	7 7	7
Odběr vzorků t t	7	' 7	7		7	7

-22 Příprava vzorků: Krev, získaná punkcí srdce, se uchovává 30 minut při 4 °C a pak se centrifuguje 10 minut při 3000 ot/min. Sérum se oddělí a uchovává se v Eppendorfových zkumavečkách při -20 °C (3). Před HPLC analýzou se sérum rozmrazí a 200 μΐ séra se přidá k filtru Microcon (model 10, kód 42407, Amicon) a centrifuguje se 30 minut při 13 000 ot/min.

Sleziny se vyjmou (n = 3) a spojí pro HPLC analýzu L-DHO. Buňky se- oddělí průchodem nerezovým filtrem a přidá se k nim 0,17 M NH4CI, aby se lyžovaly erytrocyty. Připraví se alikvóty 50 milionů slezinných buněk na skupinu, vloží se do zkumaveček a podrobí se centrifugaci. Supernatant se zlikviduje. K získané buněčné peletě se přidá za stálého . míchání 500 μΐ 1,2 M roztoku HCÍO^, aby se lýzovaly buňky, a pak se odstřeďuje po dobu 2 minut. Kyselý buněčný lyzát se kvantitativně přenese do skleněných viaiek, přidá se 500 μΐ chloroformu a mixuje se po dobu 2 minut v mixéru Vortex, Celulární lipidy se odstraní centrifugaci (10 min, 1502 x g, 10 °C). Supernatant se přenese do 2 ml zkumaveček a uchovává se při -20 °C.

Stanovení koncentrací sloučeniny A77 1726 v séru: Vzorky séra se ohřejí na teplotu místnosti a pečlivě se promíchají v mixéru Vortex. Sérum se napipetuje (200 μΐ) do Eppendorfových zkumaveček a přidá se vnitřní standard (sloučenina A77 1726; 2 μς ve 400 μΐ acetonitrilu). Po mixování v mixeru Vortex se směs odstřeďuje při 2500 ot/min po dobu deseti minut při teplotě místnosti. Pro HPLC analýzu se 400 μΐ supernatantu přenese do vialky, přidá se 400 μΐ vody a směs se zamíchá. Podmínky analýzy HPLC jsou následující: hardware sestává z pumpy TSP P2000, autosampleru TSP AS1000, integrátoru TSP SP4270 a UV detektoru TSP UV100. Detekce se provádí při vlnové délce 292 nm. Mobilní fáze sestává z 650 ml methanolu (CHROMASOLV), 2,42 g tetrabutylamonium-bromidu a 350 ml 0,05 M octanu amonného.

-23 ·· ·· ·· ·· ·· *·

Průtoková rychlost je 0,5 ml/min. Chromatografie se provádí na 10 cm koloně CHROMAPACK Spherisorb ODS-2 s předkolonkou {1 cm) s reverzní fází (R2) . Na kolonu se aplikuje 100 μΐ a analýza trvá 7 min.

HPLC stanovení koncentrace L-DHO: Chromatografická separace se provede stejně, jako v příkladu 1. Rozsah vodivostního detektoru se nastaví na 10 με. Analýza se provádí při teplotě místnosti. Mobilní fáze se skládá z 100 mM NaOH (A) a vody (B). Tyto dvě složky se použijí v následujícím gradientu:

Sérum:

Splenocyty:

Čas (min)	A <%)	B (%)
0	1	99
2,5	1	99
14	8	92
22	8	92
28	60	40
32	60	40
34	1	99
49	1	99

Průtok je 1 ml/min.

Po orálním podání leflunomidu mají zdravá i nemocná zvířata zvýšenou koncentraci celulární {tabulka 13) i sérové (tabulka 14) L-DHO. Tento vzrůst koreluje s koncentrací • 9 99

-24 • 9 99 • *9 9 • · 9 9 9 · 9 9 9 · 9 9 9 9 «999 9 9 9 9 9 9 9 · • 9 99 99 99 99 99 sloučeniny A77 1726 v séru těchto zvířat {tabulka 15). Zpočátku, po 3 hodinách po orálním podání leflunomidu, dosáhne koncentrace sloučeniny A77 1726 asi 26 μς/ιηΐ u krys, kterým bylo podáno adjuvans, a 31 gg/ml u zdravých krys. Tyto hodnoty kulminují 1 hodinu po druhém podání (7 h), ale pak se sníží na hodnoty mezi 7 az 12 μg/ml po dobu celého pokusu, a to u zdravých i nemocných krys. U nemocných zvířat se této hodnoty dosáhne za 51 hodin, zatímco u zdravých krys již po 27 hodinách (tabulka 15). Koncentrace sloučeniny A77 1726 v séru korelují s koncentracemi L-DHO v séru zdravých krys i těch, kterým bylo podáno adjuvans. V protikladu ke koncentracím L-DHO v séru, které se během pokusu ustálí na přibližně 5 pg/ml, obsah L-DHO, nalezený ve splenocytech, klesne po 99 hodinách pod detekční limit (1,5 μg/ml).

Tabulka 13

Koncentrace L-DHO ve splenocytech (50 x 10^s buněk) u krys, kterým byl podán leflunomid

	Nemocné'krysy	Zdravé krysy
Čas l (hod)	Hodnota	Průměr [pg/rnl)	SD (pg/ml)	SD [%]	Λ » 1 Hodnota'	. Průměr fma/mil	SD fpg/mll	SD [%]
0 (Placebo)	< D.L. < D.L.	< D.L.			< D.L < D.L.	< D.L
3	5.81 4.60	5.21	0.60	11.52	5.09 6.31	5.70	0.61	10.70
7	13.00 11.22	12.11	0.89	7.35	16.77 14.87	15.82	0.95	6.01
27	16.28 16.84	16.56	0.28	1.69	8.69 10.25	9.47	0.73	3.24
51	3.63				1.84
	3.97	3.80	0.17	4.47	2.34	2.09	0.25	11.96
75	2.58				1.92
	2.71	2.65	0.06	2.26	2.24	2.08	0.16	7.69
99	< D.L. < D.L.	< D.L.			< D.L. < D.L.	< D.L.
Placebo (99)	< D.L. < D.L.	<D.L.			< D.L. < D.L	< D.L.

Zvířatům se podá leflunomid nebo placebo, sleziny se odstraní (n = 3) a spojí, jak je posáno výše. Spojené splenocyty se analyzují dvojmo. D.L.= detekční limit (1,5 μg/ml}.

ŠD - směrodatná odchylka.

• · • · • ·

-25 ft ft

Tabulka 14

Koncentrace L-DHO v séru krys, kterým byl podán leflunomid • ft • ftft • · · • ft · ·· • ftftft • · · · • · · · ·· ·· • · • ft

	Nemocné krysy	Zdravé krysy
Čas (hod)	Krysa	Hodnota	’ Průměr fug/mi]	SD [pg/mf[	SD L%1-	Hodnota	Průměr fpg/mil	SD [pg/mll	SD
	1	< D.L				< D.L
0	2	< D.L.	< D.L,			< D.L.	< D.L
(Placebo)	3	<D.L.				< D.L.
	1	7.85				11.92	I
3	2	9.66	8.52	0.99	11.70	10.88	11.13	0.67	6.30 .
	3	8.05				10.60
	1	19.55				20.29
7	2	17.00	17,54	1.81	10.30	18.14	18.66	1.45	7.80
	3	16.06				17.54
	1	19.73				8.22
27	2	15.95	16.45	3.06	18.60	8.42	8.43	0.21	2.50
	3	13.67				8.64
	1	3.06				4.87
51	2	3.68	3.27	0.36	11.00	4.77	4.55	0.46	10.20
	3	3.06				4.02
	1	5.38				4.60
75	2	4;45	5.14	0.61	11.90	4.17	4.33	0.23	5.40
	3	5.60				4.23
	1	5.43				5.67
99	2	4.89	5.02	0.41	8.30	6.54	5.75	0.85	14.80
	3,	4.68				4.95
Placebo	1	< D.L				< D.L
(99)	2	< D.L	< D.L.			< D.L	D.L
*	3	< D.L				< D.L

Zvířatům se podá leflunomid nebo placebo. Krev se odebere, zpracuje a analyzuje, jak je popsáno výše. Koncentrace L-DHO v séru se stanovují pro každé zvíře individuálně.

D.L. = detekční limit (0,5 gg/ral). SD = směrodatná odchylka.

-26 Tabulka 15

Koncentrace sloučeniny A77 1726 v séru krys, kterým byl podán lefluriomid • · · · · · · * · · · · · · ••tt ···* ···· ·· ·· ·· ·· ·· ··

	Nemocné krysy	Zdravé krysy
Čas	Krysa	Hodnota	Průměr	SD	SD	Hodnota	Průměr	SD	so
(hod)	[pg/mll	[pg/ml]	[%1	[pg/mi]	[pg/ml]	[%]
	1	0.0				0.0
0	2	0.0	0.0	0.0		0.0	0.0	0.0
(Placebo)	3	0.0				0.0
	1	26.8				32.0
3	2	27.2	26.33	1.17	4.45	30.6	30.7	1.21	3.92
	3	25.0				29.6
	1	44.1				47.7
7	2	45.2	42.3	4.11	9.71	49.4	47.9	1.4S	3.04
	3	37.6				46.5
	1	21.3				10.2
27	2	22.0	19.7	3.34	15.92	9.9	9.6	0.74	7.65
	3	15.9				8.8
	1	9.1				7.8
5)	2	10.2	9.2	1.00	10.93	8.7	7.4	1.48	19.97
	3	8.2				5.8
	1	9.0				6.7
75	2	7.3	9.9	3.09	31.34	9.4	8.1	1.35	16.70
	3	13.3				8.2
	1	12.0				14.6
99	2	11.9	12.2	0.33	3.11	11.4	12.7	1.67	13.08
	3	12.6				12.2
Placebo	1	0.0				0.0
(99)	2	0.0	0.0	Q.O		0.0	o.o	0.0
	3	0.0				0.0

Zvířatům se podá leflunomid nebo placebo. Krev se odebere, zpracuje a analýzuje, jak je popsáno výše. Koncentrace sloučeniny A77 1726 v séru se stanovují pro každé zvíře individuálně. SD = směrodatná odchylka.

- z/

Perorálně podaný leflunomid se in vivo velmi rychle přeměňuje na sloučeninu A77 1726, která je aktivním metabolitem leflunomidu (viz patentový spis US 5,679,709). Po podání leflunomidu dojde jak u zdravých krys, tak u krys, kterým bylo podáno adjuvans, k rychlé akumulaci L-DHO v séru i ve splenocytech. Koncentrace L-DHO koreluje s koncentracemi sloučeniny A77 1726 v krevním séru a ukazuje tak na aktivní potlačení DHO-DH molekulou této látky in vivo. V klinických studiích na lidech může být monitorování L-DHO náhradním markérem pro imunomodulační aktivitu leflunomidu u pacientů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob získání kyseliny L-dihydroorotové, který se vyznačuj e chromatografií, zahrnující následující kroky:

a) přípravu kolony, obsahující tlaku odolný anexový materiál,

b) aplikaci vzorku, obsahujícího kyselinu L-dihydroorotovou, na kolonu,

c) provedení chromatografie,

d) eluci kyseliny L-dihydroorotové eluentem, obsahujícím směs báze a vody;

přičemž tento pochod se provádí za tlaku od přibližně 1,1 MPa do přibližně 40 MPa.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že báze je hydroxid sodný.
3. Způsob podle nároku'1, vyznačující se tím, že tlaku odolný anexový materiál je divinylbenzen/ethylvinylbenzenový polymer nebo polyvinylbenzylamoniový polymer síťovaný divinylbenzenem, nebo jejich směsi, které jsou modifikovány alkanolkvarternim amoniem.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že tlak se pohybuje v rozmezí od přibližně 4,1 MPa do přibližně
5,5 MPa.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že eluce směsí báze a vody vykazuje časový gradient koncentrace báze, s výhodou o lineárním průběhu.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, v y z n a č ující se tím, že kyselina L-dihydroorotová se deteguje vodivostním detektorem.
7. Použití způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro provedení diagnostického testu.

- zy
8. Použití způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro určování inhibitorů dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové.
9. Použití způsobu podle nároku 8, kde inhibitor dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové je N-4-{trifluormethylfenyl)-5-methylisoxazol-4-karboxamid, Brequinar,

N-(4-trifluormethylfenyl)-2-kyan-3-hydroxyhept—2-en-6-inkarboxamid, (4-kyanfenyl)amid kyseliny 2-kyan-3-cyklopropyl-3-hydroxyakrylové, anebo N-(4-trifluormethylfenyl)-2-kyan-3-hydroxykrotonamid.
10. Použití stanovení kyseliny dihydroorotové při monitorování aktivity inhibitorů dehydrogenázy kyseliny dihydroorotové.