PL194068B1

PL194068B1 - Sposób wydzielania rozpuszczonego kwasu L-dihydroorotowego z roztworu i sposób monitorowania aktywności inhibitora dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego

Info

Publication number: PL194068B1
Application number: PL98341205A
Authority: PL
Inventors: Ulrike Milbert; Robert Bartlett; Eric Ruuth; Claude Fudali
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2007-04-30
Also published as: PL341205A1; CA2315326A1; RU2228932C2; CZ299968B6; EP1036319B1; AR016430A1; DE69831752D1; EP0933633A1; DE69831752T2; AU1877599A; CN1281550A; DK1036319T3; HK1033171A1; ID24807A; WO1999030146A1; AU747993B2; ATE305610T1; KR20010032978A; JP4189124B2; KR100700906B1

Abstract

1. Sposób wydzielania rozpuszczonego kwasu L-dihydroorotowego z roztworu zawieraj acego ten kwas i substancje przeszkadzaj ace drog a chromatografii, znamienny tym, ze a) wprowadza si e ten roztwór do kolumny chromatograficznej zawieraj acej anionit odporny na dzia lanie ci snienia i zasadniczo ca ly kwas wiaze si e z zywic a jonowymienn a, przy czym w szczegól- no sci substancje przeszkadzaj ace pochodz a z lizatu komórkowego lub surowicy; b) wi ekszo sc substancji przeszkadzaj acych wymywa si e z kolumny roztworem wodnym zawie- rajacym zasad e w niskim st ezeniu; oraz c) wymywa si e kwas z zywicy jonowymiennej roztworem wodnym zawieraj acym zwi ekszon a ilosc zasady, przy czym wymywanie prowadzi si e pod ci snieniem 1,1 - 40 MPa. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 341205	(11) 194068 (13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 08.12.1998	(51) Int.Cl. G01N 30/02 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:	B01D 15/08 (2006.01)
'F’	08.12.1998, PCT/EP98/07972	C07D 239/22 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
Rzeczypospolitej Polskiej	17.06.1999, WO99/30146 PCT Gazette nr 24/99

₍₅₄₎ Sposób wydzielania rozpuszczonego kwasu L-dihydroorotowego z roztworu ⁽⁵⁴⁾ i sposób monitorowania aktywności inhibitora dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego
(30) Pierwszeństwo: 11.12.1997,EP,97121848.2	(73) Uprawniony z patentu: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GmbH, Frankfurt nad Menem,DE (72) Twórca(y) wynalazku: Ulrike Milbert,Idstein,DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Robert Bartlett,Darmstadt,DE
26.03.2001 BUP 07/01	Eric Ruuth,Boulogne,FR Claude Fudali,Senlis,FR
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2007 WUP 04/07	(74) Pełnomocnik: Zofia Sulima, SULIMAGRABOWSKASIERZPUTOWSKA, Biuro Patentów i Znaków Towarowych sp.j.

⁽⁵⁷⁾ 1. Sposób wydzielania rozpuszczonego kwasu L-dihydroorotowego z roztworu zawierającego ten kwas i substancje przeszkadzające drogą chromatografii, znamienny tym, że

a) wprowadza się ten roztwór do kolumny chromatograficznej zawierającej anionit odporny na działanie ciśnienia i zasadniczo cały kwas wiąże się z żywicą jonowymienną, przy czym w szczególności substancje przeszkadzające pochodzą z lizatu komórkowego lub surowicy;

b) większość substancji przeszkadzających wymywa się z kolumny roztworem wodnym zawierającym zasadę w niskim stężeniu; oraz

c) wymywa się kwas z żywicy jonowymiennej roztworem wodnym zawierającym zwiększoną ilość zasady, przy czym wymywanie prowadzi się pod ciśnieniem 1,1 - 40 MPa.

PL 194 068 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sposób wydzielania rozpuszczonego kwasu L-dihydroorotowego z roztworu i sposób monitorowania aktywno ś ci inhibitora dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego.

Kwas L-dihydroorotowy (zwany dalej „L-DHO) można oznaczać drogą chromatografii na żelu krzemionkowym, a następnie derywatyzacji chemicznej i oznaczania kolorymetrycznego (Kesner, L., Aronson, F. L., Silverman, M., Chan, P. C., Clin. Chem 21/3 (1975) 353). Zgodnie z innym sposobem L-DHO poddaje się przemianie enzymatycznej do kwasu orotowego z użyciem dehydrogenazy kwasu L-dihydroorotowego (zwanej dalej „DHODH) wytwarzanej z wątroby szczura i po derywatyzacji chemicznej kolorymetrycznie wykrywa się orotan (Rogers, L. E., Nicolaisen, K., Experientia 28/10 (1972) 1259). W tych sposobach występują zakłócenia wynikające z obecności innych substancji zawartych w zł o ż onych roztworach fizjologicznych. Poza tym sposoby te są bardzo czasochł onne z powodu pracochłonnego przygotowywania próbek i dlatego nie nadają się do rutynowych analiz w szerokich badaniach klinicznych.

W wyniku prac mających na celu opracowanie ulepszonych sposobów rozdzielania i izolowania dla otrzymania kwasu L-dihydroorotowego obecnie stwierdzono, że można to osiągnąć przez poddanie L-DHO chromatografii w mieszaninie zasady z wodą na anionicie pod ciśnieniem 1,1 - 40 MPa. Sposób ten można stosować do ilościowego oznaczania L-DHO w lizatach komórkowych, surowicy ssaków i surowicy ludzkiej. Sposób ten jest wysoce powtarzalny, czuły i dobrze sprawdzony.

Wynalazek dotyczy sposobu wydzielania rozpuszczonego kwasu L-dihydroorotowego z roztworu zawierającego ten kwas i substancje przeszkadzające drogą chromatografii, polegającego na tym, że

Korzystnie jako zasadę stosuje się wodorotlenek sodu.

Korzystnie stosuje się żywicę jonowymienną wybraną z grupy obejmującej polimer diwinylobenzen/etylowinylobenzen, polimer poliwinylobenzyloamoniowy sieciowany diwinylobenzenem, mieszaniny polimeru diwinylobenzen/etylowinylobenzen i polimeru poliwinylobenzyloamoniowego sieciowanego diwinylobenzenem modyfikowane czwartorzędowym związkiem alkanoloamoniowym, polimer chlorek winylobenzylu/diwinylobenzen; polimer polietyloiminowy, krzemionkę modyfikowaną związkiem propylotrimetyloamoniowym i związek poli(styren-diwinylobenzen)trimetyloamoniowy.

Korzystnie wymywanie prowadzi się pod ciśnieniem 4,1 - 5,5 MPa.

Korzystnie stężenie zasady w roztworze wymywającym zwiększa się w czasie przemywania kolumny.

Korzystnie kwas L-dihydroorotowy wykrywa się z użyciem detektora konduktometrycznego.

Wynalazek dotyczy również sposobu monitorowania aktywności inhibitora dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego, w którym dostarcza się próbkę testową, przygotowuje się roztwór zawierający kwas L-dihydroorotowy i substancje przeszkadzające, który to sposób polega na tym, że następnie

b) większość substancji przeszkadzających wymywa się z kolumny roztworem wodnym zawierającym zasadę w niskim stężeniu;

c) wymywa się kwas z żywicy jonowymiennej roztworem wodnym zawierającym zwiększoną ilość zasady, przy czym proces prowadzi się pod ciśnieniem 1,1 - 40 MPa; oraz

d) mierzy się ilość kwasu L-dihydroorotowego z użyciem detektora przewodnictwa i na tej podstawie określa się aktywność inhibitora dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego.

Korzystnie inhibitor dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego jest wybrany z grupy obejmującej

5-metylo-N-[4-(trifluorometylo)fenylo]-4-izoksazolokarboksyamid, kwas 6-fluoro-2-(2'-fluoro[1,1'-bifenyl]-4-ilo)-3-metylo-4-chinolinokarboksylowy, 2-cyjano-3-hydroksy-N-[4-(trifluorometylo)fenylo]-2-hepten-6-ynoPL 194 068 B1 karboksyamid, 2-cyjano-N-(4-cyjanofenylo)-3-cyklopropylo-3-hydroksy-2-propenoamid i 2-cyjano-3-hydroksy-N-[4-(trifluorometylo)fenylo]-2-butenoamid.

Określenie anionit odporny na działanie ciśnienia oznacza np. takie substancje jak makroporowaty polimer (200 nm) diwinylobenzen/etylowinylobenzen lub mikroporowaty polimer winylobenzyloamoniowy sieciowany diwinylobenzenem lub ich mieszaniny modyfikowane czwartorzędowym związkiem alkanoloamoniowym; lub makroporowaty polimer chlorek winylobenzylu/diwinylobenzen; lub sieciowany polimer polietyloiminowy; lub krzemionka modyfikowana związkiem propylotrimetyloamoniowym; lub związek poli(styren-diwinylobenzen)trimetyloamoniowy. Szczególnie korzystne są następujące produkty:

kolumny anionitowe Ion Pac AS 11, CarboPac PA 1 lub CarboPac MA 1 dostarczane przez Dionex Corporation, Idstein, Niemcy,

GROM - SIL, Strong Anion, lub GROM-SIL, Weak Anion., dostarczane przez Grom,

P 1000 SAK, Ionospher SA lub Chrompack PA, dostarczane przez Chrompack,

PRP-X100 lub RCX-10 dostarczane przez Hamilton.

Roztwór wymywający stanowi mieszanina zasady z wodą. Odpowiednimi zasadami są zasady pochodzące od metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek magnezu lub wodorotlenek wapnia. Stężenie zasady wynosi od 1 mmola/l do około 200 mmoli/l, korzystnie od 2 mmoli/l do około 120 mmoli/l, a zwłaszcza 100 mmoli/l wody jako rozpuszczalnika. Temperatura podczas prowadzenia chromatografii wynosi około 0 - 50°C, korzystnie około 15 - 30°C, a zwłaszcza około 19 - 25°C. Ciśnienie robocze podczas chromatografii jest zasadniczo stałe. Chromatografię można prowadzić pod różnym ciśnieniem, np. pod ciśnieniem około 1,1 - 40 MPa, a zwłaszcza 4,1 - 5,5 MPa. Natężenie przepływu czynnika wymywającego wynosi około 0,2 - 3 ml/min, korzystnie 1 ml/min.

Obciążanie kolumny, chromatografię i wymywanie L-DHO prowadzi się zgodnie ze znanymi sposobami.

Odpowiednim wymywaniem jest wymywanie z gradientem stężenia zasady w czasie, korzystnie o przebiegu liniowym. Gradient stężenia, który można stosować, np. może zaczynać się od niskiego stężenia zasady (zero w granicznym przypadku) na początku wymywania i zwiększać się w trakcie wymywania. W ten sposób możliwe jest osiągnięcie szczególnie skutecznego oddzielenia L-DHO w próbkach pochodzących z surowicy lub lizatów komórkowych. Korzystny gradient stężenia zasady w wodzie wynosi od blisko 1% NaOH (100 mmoli/l) i 99% wody (na początku wymywania) do około 60% NaOH i 40% wody (na końcu wymywania), przy czym szczególnie korzystny zakres wynosi od około 1% NaOH i 99% wody (na początku wymywania) do około 15% NaOH i 75% wody (na końcu wymywania). Gradient stężenia zmienia się liniowo od 2,5 min do około 14 min i od 14 min do około 25 min, przy czym charakterystyka gradientu w czasie jest różna podczas tych dwóch okresów.

Szczególnie właściwe wymywanie prowadzi się stosując na początku procesu oddzielania niskie stężenie zasady wynoszące około 1% w ciągu około 2,5 minuty. W wyniku tego następuje wymycie z kolumny większości substancji przeszkadzających z matrycy biologicznej. Analit powoli oddziela się zwiększając stężenie do około 23% zasady w ciągu okresu 14 minut całkowitego czasu analizy. Następnie stężenie zasady zwiększa się do około 60% w ciągu 4 minut, aby uzyskać wymycie silnie związanych substancji. Stężenie 60% zasady powinno się stosować nie dłużej niż przez 6 minut, po czym stosując 1% roztwór zasady w wodzie doprowadza się do powtórnego ustalenia się stanu równowagi. Następną analizę rozpoczyna się po 45 minutach całkowitego czasu analizy. Woda stosowana do wymywania gradientowego z użyciem roztworów zasady w wodzie musi być zdejonizowana i odgazowana.

Sposób wydzielania według wynalazku zachodzi w kolumnie, którą podczas chromatografii na anionicie korzystnie utrzymuje się w stałej temperaturze, która może być temperaturą w szerokim zakresie. Korzystny zakres temperatury wynosi od około -10°C do około 50°C, a zwłaszcza około 15 - 25°C.

Wymywanie L-DHO zachodzi od 10 do 12 minuty od początku gradientu. Czas prowadzenia wymywania wynosi od 13 do 25 minut. L-DHO wykrywa się za pomocą detektora przewodnictwa, takiego jak model CD20 z Dionex Cooperation. W celu zminimalizowania przemieszczania się linii podstawowej i obniżenia przewodnictwa tła można stosować anionowy samoregenerujący się filtr tłumiący, taki jak model ASRS-I, 4 mm z Dionex Cooperation.

Sposób według wynalazku jest szczególnie odpowiedni do stosowania w chromatografii analitycznej, ale można go również stosować w chromatografii preparatywnej, szczególnie wtedy, gdy sposób według wynalazku prowadzi się z zastosowaniem układu z kolumną do wysokociśnieniowej chro4

PL 194 068 B1 matografii cieczowej (HPLC). Określenie „chromatografia preparatywna oznacza sposób oczyszczania mający na celu otrzymanie, a nie jedynie analizowanie, czystych produktów. Ilości czystych produktów mogą zmieniać się w szerokim zakresie, np. od 1 mg do 1000 g, korzystnie 50 - 500 mg.

Sposób według wynalazku można stosować w celu wykrywania zmian wewnątrzkomórkowego i pozakomórkowego stężenia L-DHO wynikają cych z hamowania dehydrogenazy (DHO-DH) kwasu dihydroorotowego. Enzym DHO-DH jest odpowiedzialny za przemianę kwasu L-dihydroorotowego w kwas orotowy podczas syntezy pirymidyny de novo. Hamowanie DHO-DH prowadzi do gromadzenia się L-DHO. Sposób według wynalazku można stosować do przygotowania testu diagnostycznego. Sposób według wynalazku można stosować do określania aktywności inhibitorów DHO-DH. Inhibitorami DHO-DH są np. N-4-(trifluorometylofenylo)-5-metyloizoksazolo-4-karboksyloamid, sól sodowa kwasu 6-fluoro-2-(2'-fluoro[1,1'-bifenyl]-4-ilo)-3-metylo-4-chinolinokarboksylowego, N-(4-trifluorometylofenylo)-2-cyjano-3-hydroksyhept-2-en-6-ynokarboksyamid, 4-cyjanofenyloamid kwasu 2-cyjano-3-cyklopropylo-3-hydroksyakrylowego lub amid kwasu N-(4-trifluorometylofenylo)-2-cyjano-3-hydroksykrotonowego. Sposób według wynalazku można stosować do oznaczania stężenia L-DHO w roślinach, liniach komórek, organizmach zwierzęcych i ludzkich. Oznaczanie L-DHO można stosować do kontrolowania czynności inhibitorów DHO-DH w roślinach, organizmach ssaków i ludzi.

Sposób według wynalazku szczegółowo opisano w poniższych przykładach. Dane odnośnie udziałów procentowych, o ile nie wskazano inaczej, podano jako procentowe udziały wagowe.

P r z y k ł a d 1

1.1. Chemikalia i odczynniki

Chemikalia i odczynniki zakupiono w poniższych firmach:

Baker, Holandia

Sigma, Monachium

Riedel de Haen, Seelze

Gibco, Eggenstein

Bio Whitaker, Verviers, Belgia

NaOH i KOH, wolne od węglanów Kwas L-dihydroorotowy (L-DHO)

HClO4

Eozyna, chloroform Pożywka RPML 1640 Płodowa surowica cielęca (FCS)

Wodę dejonizowaną należy przed użyciem odgazować helem.

1.2. Wyposażenie do analizy chromatograficznej

Układ do chromatografii składał się z następujących urządzeń.

Urządzenie	Typ	Producent
Moduł kondycjonowania rozpuszczalników	SCM 400	Thermo Seperation Products (TSP)
Pompa podwójnego gradientu	P 2000	TSP
Automat do pobierania próbek z 20 μΙ pętlą	AS 3000	TSP
Interfejs	SP 4510	TSP
Zmieniacz AD	SN 4000	TSP
Detektor przewodnictwa	CD 20	Dionex
Anionowy samoregenerujący się filtr tłumiący	ASRS-I 4 mm	Dionex
Stabilizator detekcji	DS 3-1	Dionex
PC	El 20, Flex Scan, F563-T	Escon
Drukarka	DeskJet 550C	Escon
Oprogramowanie	PC 1000	TSP

W eksperymentach stosowano materiał znakują cy.

1.3. Warunki HPLC

Rozdzielanie chromatograficzne prowadzono z zastosowaniem kolumny anionitowej lonPac AS 11 o długości 250 mm i średnicy wewnętrznej 4 mm (wielkość cząstek 13 μιτι; P/N 044076, Dionex) wyposażonej w kolumnę wstępną IonPac AG 11 o długości 50 mm i średnicy wewnętrznej 4 mm (wielPL 194 068 B1 kość cząstek 13 μm; P/N 044078, Dionex). Dodatkowo pomiędzy pompą gradientu i zaworem wtryskowym zainstalowano kolumnę ATC-1 (P/N 037151, Dionex) wychwytującą aniony. W celu zmniejszenia przemieszczania się linii podstawowej i obniżenia przewodnictwa tła zainstalowano filtr tłumiący ASRS-I pracujący przy natężeniu prądu 300 mA. Zakres detektora ustawiono na 10 μδ. Automat do pobierania próbek chłodzono do temperatury 14°C, jednak samą analizę wykonywano w temperaturze pokojowej. Faza ruchoma składała się z 100 mM NaOH (A) oraz zdejonizowanej i odgazowanej wody (B). Z zastosowaniem tego układu uzyskano następujący gradient:

Czas (min)	A (%)	B (%)
0	1	99
2,5	1	99
14	23	77
18	60	40
24	60	40
26	1	99
45	1	99

Natężenie przepływu wynosiło 1 ml/min; czas przebiegu 45 minut.

1.4. Wzorce i próbki kontrolne

Podstawowy roztwór wzorcowy sporządzono przez rozpuszczenie 1 mg L-DHO w 1 ml wody. Próbki (400 ul) zamrożono w temperaturze -20°C. Trwałość tych roztworów gwarantowano na okres minimum 4 tygodni. Określone ilości roztworu podstawowego dodawano do lizatów komórkowych i do surowicy ludzkiej lub szczurzej i wykonywano analizę w celu określenia zależności liniowej pomiędzy wzrostem sygnału i stężeniem L-DHO z dodatkiem roztworu podstawowego. Precyzję i dokładność sposobu badano z użyciem próbek kontrolnych (QC) zawierających L-DHO w zakresie niskich, średnich i wysokich stężeń krzywej liniowej zależności sygnału od stężenia.

1.5. Przygotowanie próbek

1.5.1. Komórki

Komórki Jurkata otrzymano z ATCC (TLB 182) i hodowano zgodnie z opisem w punkcie 1.5.1.1.

1.5.1.1. Warunki hodowli komórek ₅

Komórki Jurkata posiano w ilości 5 x 10⁵/ml i hodowano w ciągu 24 godzin w pożywce RPMI 1640 z 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Komórki umieszczono w świeżej pożywce w celu lizy i obliczano ilość komórek i zawartość procentową komórek martwych na podstawie badania mikroskopowego z użyciem eozyny. Po 24 godzinach liczba komórek zwiększyła się 1,6 - 1,8 razy przy liczbie martwych komórek mniejszej niż 7%. Komórki Jurkata pobrane do oznaczania L-DHO wykazywały wskaźnik wzrostu 1,6 - 1,8 razy w ciągu 24 godzin i mniej niż 7% martwych komórek.

1.5.1.2. Wytwarzanie lizatów komórkowych

Komórki przeprowadzono w stan zawiesiny w określonej objętości pożywki i określono gęstość komórek w próbkach na podstawie badania mikroskopowego z użyciem eozyny. Około 10 x 10⁶ komórek usunięto, odwirowano przy 350 x g w ciągu 5 minut i supernatant odrzucono. Przeprowadzono lizę komórek, ponownie przeprowadziwszy uzyskany osad komórek w stan zawiesiny w 500 μΐ 1,2M HClO₄. Mieszaninę tę przeniesiono do 2 ml probówek Eppendorfa ze szczelnym zamknięciem i wytrącono białko przez odwirowanie z dużą szybkością w ciągu 2 minut. Supernatant całkowicie usunięto, przeniesiono do szklanych fiolek i po dodaniu 500 μΐ chloroformu intensywnie mieszano ruchem wirowym w ciągu 2 minut. Lipidy komórkowe wyekstrahowano chloroformem, a następnie wirowano (1502 g) w ciągu 10 minut w temperaturze 10°C. Oczyszczony supernatant zebrano w 2 ml probówkach Eppendorfa i przechowano w temperaturze -20°C do dalszego użycia. Dla celów analizy metodą HPLC 100 μl tego supernatantu zobojętniono 30 μl 6M KOH. Po wytrząsaniu w ciągu około 5 s próbki przechowano na lodzie przez 30 minut. Następnie próbki wirowano w ciągu 5 minut z szybkością 15000 obrotów/min. Do analizy metodą HPLC stosowano 20 μl czystego supernatantu.

PL 194 068 B1

1.5.2. Surowica

W celu obniżenia zawartoś ci biał ka 200 μ l surowicy umieszczono w filtrze Microcon (10000 D, model 10, kod 42407, Amicon) i wirowano w ciągu 30 minut z szybkością 13000 obrotów/min. Otrzymano około 150 μΐ przesączu zawierającego analit, L-DHO. Do analizy metodą HPLC stosowano 20 μΐ tej cieczy.

1.6. Oznaczanie ilościowe

Integrator określał wysokość piku dla analitu. Krzywe kalibracji otrzymano przez wykreślenie zależności zmierzonych wysokości pików (y) od stężenia analitu w różnych matrycach biologicznych. Do retrospektywnego wyliczenia stężenia L-DHO w próbkach wzorcowych, jak również w próbkach kontrolnych stosowano metodę ważonej regresji liniowej (1/y). Wspólny współczynnik regresji R uzyskano za pomocą PROC GLM opartego na analizie modelu kowariancyjnego z użyciem współczynnika ważenia.

1.7. Trwałość

Tabela 1 przedstawia dane dotyczące trwałości analitu w temperaturze -20°C w próbkach lizatów komórkowych i surowic po 2-3 cyklach zamrożenia/rozmrożenia próbki. W wyżej wymienionych warunkach L-DHO w komórkach Jurkata był trwały w okresie co najmniej 4 tygodni. Wykryte zwiększenie stężenia o ponad 10% w kilku próbkach surowicy szczurzej i w jednej próbce surowicy ludzkiej po kilku cyklach rozmrażania nie daje się wytłumaczyć i wykazuje, że w takich przypadkach dokładność metody może być mniejsza, aż do 15% ogólnie i do 29% w najgorszym przypadku. Z tych przyczyn można jedynie stwierdzić, że w próbkach surowicy szczurzej i ludzkiej L-DHO jest zdecydowanie trwały w ciągu co najmniej jednego tygodnia.

T a b e l a 1. Trwałość w lizatach komórkowych i surowicy w -20°C (n = 1)

Czas (dni)	Stężenie 1 20 μg/ml	Pozostałość (%)	Stężenie 2 100 μg/ml	Pozostałość (%)
Komórki Jurkata
0	19,34	100	100,05	100
7	19,28	99,7	99,09	99,0
14	n.o.	n.o.	115,32	115,3
29	19,98	103,3	99,35	99,3

Czas (h)	Stężenie 1 5 μg/ml	Pozostałość (%)	Stężenie 2 20 μg/ml	Pozostałość (%)
Surowica szczurza
0	4,30	100	19,94	100
7	4,52	105,1	19,62	98,4
14	4,81	111,9	20,93	105,0
21	5,55	129,1	22,38	112,2
Surowica ludzka
0	4,67	100	20,22	100
8	4,81	103,0	20,38	100,8
65	4,87	104,3	23,20	114,7

Pozostałość (%) oznacza procent stężenia w stosunku do stężenia początkowego.

n.o. = nie oznaczano

W celu symulacji warunków dla próbek w automacie do pobierania próbek oczekujących na poddanie analizie określono trwałość w ciągu 18 godzin w temperaturze 14°C. W tym celu do lizatów

PL 194 068 B1 komórkowych dodawano roztwór podstawowy i następnie dodawano 30 μΐ 6M KOH/100 μΐ lizatu przed rozpoczęciem analizy. Odpowiednio do próbek surowicy również dodawano roztwór podstawowy, a następnie usunięto z nich białko, tak jak to opisano w punkcie 1.5.2.

Jak można zauważyć w tabeli 2, zawartość L-DHO ulega w tych warunkach nieznacznemu zmniejszeniu, maksymalnie o wartość około 7%. W próbkach surowicy analit jest w tych warunkach trwały. Z tego powodu przygotowywano tylko taką ilość próbek do analizy metodą HPLC, aby maksymalny czas oczekiwania w automacie do pobierania próbek był krótszy niż 18 godzin.

T a b e l a 2. Trwałość w ciągu 18 godzin w 14°C (n = 1)

Czas (dni)	Stężenie 1 20 μg/ml	Pozostałość (%)	Stężenie 2 100 μg/ml	Pozostałość (%)
Komórki Jurkata
0	19,96	100	100,02	100
18	18,60	93,2	97,43	97,4

Czas (h)	Stężenie 1 5 μg/ml	Pozostałość (%)	Stężenie 2 20 μg/ml	Pozostałość (%)
Surowica szczurza
0	4,61	00	19,99	100
18	4,96	107,6	20,53	102,7
Surowica ludzka
0	3,34	100	18,78	100
18	3,37	100,9	22,09	117,6

1.8. Selektywność

Porównanie chromatogramów lizatów komórek Jurkata z dodatkiem 50 μg L-DHO/ml z odpowiadającymi im chromatogramami lizatów bez takiego dodatku wykazało, że na tych ostatnich występuje niewielki pik przy czasie retencji 11,983 minuty, co odpowiada czasowi retencji L-DHO. Jest wysoce prawdopodobne, że ten pik wynika z naturalnej obecności w tych komórkach analitu. Ponadto stwierdzono, że po podziałaniu na lizaty komórkowe KOH pik odpowiadający L-DHO dzieli się na dwa piki. Jednakże działanie KOH jest niezbędne w celu zobojętnienia kwasowych lizatów komórkowych przed analizą metodą HPLC. Można wykazać, że w opisanych warunkach ocenę wysokości drugiego piku (czas retencji (RT)= 11,954 min) można wykorzystać dla uzyskania wyników lepszych pod względem liniowości i powtarzalności.

Także w przypadku surowicy ludzkiej i szczurzej znaleziono nie przypisane wartości o takim samym czasie retencji jak L-DHO. Przypuszcza się, że odpowiadają one naturalnej zawartości L-DHO w organizmach. Analiza co najmniej dziesięciu różnych próbek obu rodzajów wykazuje, że naturalna zawartość L-DHO była poniżej granicy wykrywalności 1 μg/ml.

1.9. Liniowość

Liniowość oznaczania oceniano na podstawie pięciu krzywych kalibracji dla próbek linii komórek i różnych surowic. Próbki przygotowano i wykonywano analizę w pięciu różnych dniach przy stężeniu L-DHO w zakresie 1,5 - 150 μg/ml (lizaty komórkowe) i 1 - 30 μg/ml (próbki surowicy). Wyniki przedstawiono w tabelach 3-5. Dla określenia linii regresji użyto wysokości pików. Na podstawie tego wyliczono retrospektywnie odpowiednie stężenia różnych wzorców jak to przedstawiono w różnych tabelach.

PL 194 068 B1

T a b e l a 3. Liniowość oznaczeń L-DHO w lizatach komórek Jurkata

Na domieszkowane próbki podziałano 30 μΐ 6M KOH i następnie analizowano je jednokrotnie zgodnie z opisem w punkcie 1.3.

Dzień	Stężenie ^g/ml)	Nachylenie	Przecięcie z osią Y	r
1,5	6	10	50	100	150
1	1,78	5,54	9,09	49,80	102,46	149,09	1317,54	-258,17	0,9995
2	1,90	5,14	9,54	50,77	100,22	150,20	1324,84	204,79	0,9995
3	1,86	5,24	9,46	51,18	99,91	150,07	1295,48	302,48	0,9996
4	1,85	5,34	9,39	51,45	100,97	148,71	1306,08	833,68	0,9996
5	1,86	5,26	9,53	50,98	100,07	n.o.	1318,67	530,19	0,9993
Średnia	1,85	5,30	9,40	50,80	100,73	149,52	1312,52	322,59
SD	0,04	0,15	0,19	0,63	1,05	0,73	11,69	404,93
C.V. (%)	2,3	2,8	2,0	1,2	1,0	0,5	0,9	125,5

R=0,9995

T a b e l a 4. Liniowość oznaczeń L-DHO w surowicy szczurzej Po domieszkowaniu surowicę oczyszczono z białek zgodnie z opisem w punkcie 1.5.2.

Dzień	Stężenie ^g/ml)	Nachylenie	Przecięcie z osią Y	r
1	5	10	20	30
1	1,05	4,48	10,10	22,10	28,61	15334	-4719,83	0,9966
2	1,16	4,59	8,60	21,07	30,97	17559	-4630,68	0,9960
3	1,07	4,64	9,81	20,07	30,45	17674	-3175,63	0,9995
4	1,11	4,62	9,54	19,27	31,65	18322	-4296,53	0,9981
5	1,06	4,81	9,99	18,89	31,40	17738	-829,00	0,9985
Średnia	1,09	4,63	9,61	20,28	30,62	17325,40	-3530,33
SD	0,05	0,12	0,60	1,32	1,21	1151,65	1630,62
C.V. (%)	4,2	2,6	6,3	6,5	4,0	6,7	46,19

R=0,9959

T a b e l a 5. Liniowość oznaczeń L-DHO w surowicy ludzkiej Po domieszkowaniu surowicę oczyszczono z białek zgodnie z opisem w punkcie 1.5.2.

Dzień	Stężenie ^g/ml)	Nachylenie	Przecięcie z osią Y	r
1	5	10	20	30
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1	0,90	5,17	11,30	19,41	29,42	13498	2930,30	0,9980
2	0,99	4,87	10,12	21,51	28,68	15663	477,61	0,9982
3	0,94	4,94	11,29	19,41	29,59	14328	1367,80	0,9982
4	1,01	4,77	10,32	20,82	29,15	15777	1771,98	0,9992
5	1,01	4,81	10,10	20,86	29,28	15216	1612,77	0,9993

PL 194 068 B1 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5	6	7	8	9
Średnia	0,97	4,91	10,62	20,40	29,23	14896,4	1632,09
SD	0,05	0,16	0,61	0,95	0,35	967,46	881,47
C.V. (%)	5,2	3,2	5,8	4,6	1,2	6,5	54,01

R=0,9986 * stężenie wzorca (pg/ml) - nie oznaczano

Jak to wynika z powyższych tabeli, liniowość w każdym przypadku została potwierdzona. Znajduje to odbicie w poszczególnych współczynnikach korelacji „r”, których wartość we wszystkich przypadkach jest większa niż 0,99. W każdej tabeli opisano średnią linię regresji liniowej dla krzywych stężenia otrzymanych na podstawie wyników z pięciu różnych dni i wykazuje ona, że nachylenie było dobrze odtwarzalne z maksymalnym odchyleniem 6,7%.

Wyliczone retrospektywne stężenia wzorców wykazywały średnio wartość C.V. mniejszą niż 6,5%, co pokazuje dużą dokładność tych wartości. Wspólna wartość korelacji R większa niż 0,99 wyraża bardzo wysoką precyzję i odtwarzalność sposobu.

1.10. Granica oznaczania ilościowego

Na podstawie powyższych wyników granica oznaczania ilościowego w komórkach Jurkata wynosi 1,5 pg/ml. W próbkach surowicy ludzkiej i szczurzej możliwe jest wykrycie stężenia L-DHO 1 pg/ml. Domieszkowane próbki wykazywały przy tych stężeniach stosunek sygnału do zakłóceń co najmniej 1:3.

1.12. Dokładność i precyzja

Dokładność i precyzję powtarzanych oznaczeń L-DHO w trzech różnych stężeniach wykonanych w pięciu różnych dniach przedstawiono w tabelach 6-8. Dokładność wyrażono jako procentową różnicę wykrytej ilości L-DHO względem ilości dodanej (odzysk). Precyzję oznaczania w ciągu dnia, wyrażoną jako C.V. (%), określono na podstawie dwu wartości otrzymanych w wyniku pomiaru jednej próbki dwukrotnie w ciągu jednego dnia. Precyzję w okresie kilku dni, wyrażoną także jako C.V. (%), określono na podstawie średnich wartości wykrytych w każdej próbce kontrolnej w pięciu różnych dniach.

T a b e l a 6

Dokładność i precyzja w przypadku lizatów komórek Jurkata po domieszkowaniu, a następnie zobojętnieniu 30 pl 6M KOH. n = 2 oznacza, że każdą próbkę lizatu komórkowego domieszkowano przy odpowiednim stężeniu i analizowano dwukrotnie.

Próbka kontrolna (pg/ml)	Dzień	n	Dokładność	Precyzja
Średnia stwierdzona (pg/ml)	Odzysk (%)	C.V.(%) dzienna	C.V.(%) w różnych dniach
1	2	3	4	5	6	7
20	1	2	20,10	+0,5	1,4	2,9
2	2	19,20	-4,0	1,3
3	2	19,40	-2,8	3,9
4	2	19,51	-2,5	2,2
5	2	18,55	-7,2	1,3
70	1	2	69,12	-1,3	0,1	2,8
2	2	69,13	-1,2	0,8
3	2	73,69	+5,3	0,2
4	2	71,52	+2,2	1,1
5	2	69,64	-0,5	0,9

PL 194 068 B1 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5	6	7
130	1	2	123,21	-5,2	2,8	6,0
2	2	114,78	-11,7	12,0
3	2	135,21	+4,0	0,2
4	2	126,89	-2,4	1,4
5	2	122,43	-5,8	4,1

T a b e l a 7

Dokładność i precyzja w przypadku surowicy szczurzej po domieszkowaniu a następnie usunięciu białka; n = 2 oznacza, że każdą próbkę lizatu komórkowego domieszkowano przy odpowiednim stężeniu i analizowano dwukrotnie.

Próbka kontrolna ^g/ml)	Dzień	n	Dokładność	Precyzja
Średnia stwierdzona ^g/ml)	Odzysk (%)	C.V.(%) w ciągu dnia	C.V.(%) w różnych dniach
8,0	1	2	7,68	-4,0	0,4	3,0
2	2	7,73	-3,4	1,0
3	2	7,83	-2,2	2,1
4	2	7,43	-7,1	1,0
5	2	8,06	+0,7	0,6
15	1	2	14,53	-3,1	6,8	1,8
2	2	14,73	-1,8	1,3
3	2	14,26	-5,0	0,1
4	2	14,85	-1,0	0,4
5	2	14,88	-0,8	0,9
25	1	2	24,98	-0,1	2,5	3,7
2	2	25,83	+3,3	1,3
3	2	25,43	+ 1,7	0,6
4	2	24,31	-2,8	2,0
5	2	26,81	+7,2	0,2

PL 194 068 B1

T a b e l a 8

Dokładność i precyzja w przypadku surowicy ludzkiej po domieszkowaniu, a następnie usunięciu białka; n = 2 oznacza, że każdą próbkę lizatu komórkowego domieszkowano przy odpowiednim stężeniu odpowiednim stężeniu i analizowano dwukrotnie.

Próbka kontrolna (pg/ml)	Dzień	n	Dokładność	Precyzja
Średnia stwierdzona (pg/ml)	Odzysk (%)	C.V.(%) w ciągu dnia	C.V.(%) w różnych dniach
8	1	2	7,77	-2,9	0,7	3,8
2	2	7,84	-2,0	15,5
3	2	7,43	-7,1	10,9
4	2	7,17	-10,4	2,1
5	2	7,80	-2,5	1,2
15	1	2	13,88	-7,5	0,9	6,0
2	2	14,00	-6,7	8,5
3	2	15,10	+0,6	1,5
4	2	15,13	+0,8	7,2
5	2	16,03	+6,8	12,8
25	1	2	26,56	+6,2	3,4	4,2
2	2	23,77	-4,9	0,7
3	2	24,80	-0,8	4,7
4	2	25,46	+ 1,8	7,8
5	2	24,54	-1,9	0,2

Przedstawione wyniki wykazują, że w większości przypadków wartości uzyskane dla próbek kontrolnych były określane maksymalnie z ±10% odchyleniem, a zatem sposób jest bardzo dokładny. Tylko w jednym przypadku odzysk w oznaczeniach w komórkach Jurkata różnił się nieznacznie od tej wartości (-11,7%). Efekt ten można wyjaśnić wystąpieniem wysokiego odchylenia dziennego 12%. Precyzja oznaczeń w ciągu dnia, wyrażona jako C.V., w komórkach Jurkata, surowicy szczurzej i ludzkiej była odpowiednio niższa niż 5%, 7% i 10%. Precyzja w różnych dniach we wszystkich badanych matrycach była bardzo wysoka i wynosiła, jako C.V., mniej niż 6,0%. Pokazuje to, że otrzymane wyniki są wysoce odtwarzalne i precyzyjne.

P r z y k ł a d 2

2.1. Warunki hodowli tkanek

- Przygotowanie pożywki wolnej od surowicy: sproszkowaną pożywkę Iscove (Biochrom) rozpuszczono w 10 litrach podwójnie destylowanej wody z dodatkiem 18,95 g NaCl, 11,43 g NaHCO3, 700 mg KCl, 10 ml 35% roztworu NaOH i 0,5 ml 1M roztworu merkaptoetanolu (Riedel de Haen) i przesączono w jałowych warunkach. Do 1 litra tak przygotowanej pożywki Iscove dodano przed użyciem 32 mg ludzkiej holotransferyny, 1 g albuminy bydlęcej i 1,5 ml lipidów (Sigma).

- Hodowla komórek: komórki A20.2.J hodowano w pożywce wolnej od surowicy (37°C, 5% CO2) w warunkach hodowli ekspansyjnej z logarytmicznym wzrostem komórek. Komórki pobrane do oznaczenia wykazywały 2,2 krotną szybkość proliferacji w ciągu 24 godzin. Procent komórek martwych wynosił mniej niż 8% (3).

- Działanie na komórki N-(4-trifluorometylo)-2-cyjano-3-hydroksykrotonoamidem wytworzonym jak opisano w EP-0529500, zwanym dalej A771726. A771726 rozpuszczono w podwójnie destylowanej wodzie (10 mM) i następnie rozcieńczono w pożywce wolnej od surowicy. Do komórek dodano odpowiednią ilość A771726 i inkubowano je w temperaturze 37°C przy 5% CO2.

PL 194 068 B1

2.2. Preparowanie lizatów komórkowych do oznaczania DHO

Przygotowane komórki przeprowadzono w stan zawiesiny w określonej objętości pożywki przy określonej gęstości komórek. Zależnie od przewidywanej zawartości DHO pobrano 1-50 milionów komórek, oddzielono osad (5 min, 350 x g) i supernatant odrzucono. Komórki poddano lizie przez dodanie 500 μΐ 1,2M HClO₄. Lizaty przeniesiono do 2 ml probówek Eppendorfa ze szczelnym zamknięciem i wytrącono białko drogą szybkiego wirowania w ciągu 2 minut. Zakwaszone lizaty usunięto całkowicie, przeniesiono do szklanych fiolek i po dodaniu 500 μl chloroformu intensywnie mieszano ruchem wirowym w ciągu 2 minut. Lipidy komórkowe wyekstrahowano, a następnie odwirowano w obniżonej temperaturze w ciągu 10 minut (1502 x g; 10°C). Oczyszczone supernatanty zebrano w 2 ml probówki Eppendorfa w celu przechowania w temperaturze -20°C do czasu oznaczania metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC).

2.3. Oznaczanie DHO metodą HPLC

Rozdzielanie chromatograficzne wykonywano zgodnie z opisem w przykładzie 1. Zakres detektora przewodnictwa ustawiono na 10 μβ. Analizę wykonywano w temperaturze pokojowej. Faza ruchoma składała się z 100 mM NaOH (A) i wody (B). Z zastosowaniem tego układu uzyskano następujący gradient:

Czas (min)	A (%)	B (%)
0	1	99
2,5	1	99
14	8	92
22	8	92
28	60	40
32	60	40
34	1	99
49	1	99

Natężenie przepływu wynosiło 1 ml/min., a czas przebiegu 49 minut.

2.4. Wyniki

Komórki A20.2.J inkubowane z dodatkiem A771726 wykazały zwiększoną ilość wewnątrzkomórkowego DHO (tabele 9-11). Wyniki przedstawione w tabeli 9 wykazują, że poziomy stężenia DHO korelują bezpośrednio z liczbą wyekstrahowanych komórek.

T a b e l a 9

Korelacja wewnątrzkomórkowego stężenia DHO i liczby komórek hodowanych z dodatkiem A771726

Komórki (x 10⁶)	Stężenie DHO ^g/ml ± SD)
	Doświadczenie 1 (E10B)	Doświadczenie 2 (E 14)
1	14,08 ± 2,40	11,75 ±0,23
2	19,51 ±6,47	28,27 ± 0,79
4	53,58 ±3,50	57,20 ± 2,76
6	73,01 ± 1,49	85,38 ±2,33
8	99,89 ±5,96	107,02 ±3,47
10	113,37 ±4,24	128,73 ± 1,95

Na komórki A20.2.J podziałano 5 μΜ A771726, hodowano je przez 24 godziny (37°C, 5% CO₂) i następnie przygotowano do ekstrakcji DHO (n=3).

PL 194 068 B1

W celu optymalizacji sposobu hodowli komórek i okreś lenia najlepszego stosunku komórek do molowości A771726, komórki A20.2.J przy różnej gęstości komórkowej inkubowano razem z A771726 (5 pM). Oznaczono stężenie DHO w próbkach pobranych w różnych punktach czasowych (tabela 10). Ze względu na bezpośrednią korelację stężenia DHO z ilością wyekstrahowanych komórek (patrz tabela 9) wartości stężenia DHO dla tych eksperymentów ekstrapolowano do wartości 10 x 10⁶ komórek w μg/ml. Najlepszy liniowy wzrost poziomu DHO stwierdzono przy gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml. Stosując tę wartość gęstości komórek badano zależność wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów DHO w komórkach inkubowanych z dodatkiem A771726 od czasu. Wykrywalne ilości DHO można było określić po 1 godzinie prowadzenia hodowli, niezależnie od stężenia leku (tabela 11). Zarejestrowano wzrost liniowy z większą ilością DHO, stwierdzony po 6 godzinach (tabela 11). Po tym czasie obserwowano nasycenie bez dalszego wzrostu stężenia DHO.

T a b e l a 10. Zależność wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia DHO od gęstości komórek i czasu

Czas inkubacji h	Średnie stężenie DHO (pg/ml) ± SD
1x10⁶ komórek/ml	2x10⁶ komórek/ml	3x10⁶ komórek/ml
1	6,25 ± 0,42	5,47 ±0,10	5,63 ± 0,19
4	33,06 ± 2,26	26,36 ± 0,42	19,39 ± 1,87
7	60,07 ± 0,01	42,31 ± 1,07	28,79 ± 0,34

Różne ilości komórek A20.2.J inkubowano z dodatkiem A771726 (5 μM) w ciągu podanego wyżej okresu czasu i wewnątrzkomórkowe stężenia DHO określono dla punktu każdej próbki. (* wszystkie wartości ekstrapolowane do 10 x 10⁶ komórek) (n=2).

T a b e l a 11. Zależność wzrostu wewnątrzkomórkowych stężeń L-DHO od czasu

Czas hodowli (godziny)	Średnie stężenie DHO (pg/ml) ± SD
A771726 (5 pM)	A771726 (10 pM)	A771726 (25 pM)
0	2,73 ± 0,10	2,73 ± 0,10	2,73 ± 0,08
1	9,20 ± 0,09	8,5 ± 0,39	15,05 ±0,26
2	24,03 ±1,15	20,74 ±1,43	26,06 ± 0,20
4	59,48 ± 0,72	58,65 ± 2,06	50,21 ± 1,54
7	87,54 ±1,58	82,65 ± 4,50	114,89 ±3,61

10⁶ komórek A20.2.J/ml inkubowano przy różnych stężeniach A771726 i oznaczano wewnątrzkomórkowe stężenie DHO w różnych punktach czasowych. Wartości podane jako μg/ml DHO ± SD ekstrapolowano do wartości 10⁷ komórek. (0-4 h = n = 2, 7 h = n = 4).

Rezultatem inkubacji komórek nowotworowych A20.2.J z dodatkiem A771726 było szybkie nagromadzenie się L-DHO w wyniku hamowania DHO-DH. Wewnątrzkomórkowe stężenie L-DHO korelowało z liczbą komórek i było zależne od czasu. Kontrolowanie L-DHO jest zastępczym znacznikiem immunomodulującego działania A771726 u pacjentów.

P r z y k ł a d 3

Zwierzęta: Samce szczurów Wistar-Lewis (Mollegaard Breading Center Ltd. Ejby, Dania) o masie ciała 160-200 g.

Adiuwant wywołujący zapalenie stawów: Chorobę spowodowano przez wstrzyknięcie 0,1 ml adiuwantu Freunda (6 mg Mycobacterium smegmatis przeprowadzonych w stan zawiesiny w 1 ml ciężkiego, białego oleju parafinowego (Merck, Darmstadt) w nasady ogonów szczurów Wistar-Lewis. Objawy choroby zasadniczo pojawiają się pomiędzy 10 i 14 dniem po wywołaniu choroby.

Leczenie lekiem: Leki przeprowadzono w stan zawiesiny w 1% karboksymetylocelulozie (COMC). Zwierzętom zdrowym (n = 18) i szczurom z chorobą wywołaną adiuwantem (n = 18) (w 9 dniu choroby) podano doustnie (p.o.) 10 mg/kg N-4-(trifluorometylofenylo)-5-metyloizoksazolo-4-karboksyamidu,

PL 194 068 B1 zwanego dalej leflunomidem, dwa razy dziennie (o godzinie 7:30 i 13:30) przez 5 dni, to jest w punktach czasowych: 0, 6, 24, 30, 48, 54, 72, 78, 96 godzin, (patrz tabela 12). W punkcie 0 godzin po 3 zwierzęta z grupy chorych i zdrowych uśmiercono w celu określenia poziomów podstawowych. Dodatkowo 3 zdrowym i 3 chorym zwierzętom podawano placebo (wyłącznie COMC) przez 5 dni.

Pobieranie próbek: Po trzy zwierzęta z grupy uśmiercano w każdym punkcie czasowym pobierania próbek. Surowicę i limfocyty śledziony pobierano w 3, 7, 27, 51, 75 i 99 godzinie (patrz tabela 12). Za wyjątkiem wartości dla punktu 7 godzin, próbki pobrano 3 godziny od ostatniego podania leku. Próbkę w punkcie 7 godzin pobrano w jedną godzinę po podaniu drugiej dawki. Próbki od zwierząt, którym podawano placebo, pobrano w punktach czasowych 0 godzin (n = 3) i 99 godzin (n = 3).

T a b e l a 12. Czas podawania leflunomidu i pobierania tkanek

Godzina:	0	3	6	7	24	27	30	48	51	54	72	75	78	96	99
Lek (p.o.)	t		t		t		t	t		t	t		t	t
Pobór próbek	t	t		t		t			t			t			t

Przygotowanie próbek

- Krew pobraną przez nakłucie serca przechowywano przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie odwirowano w ciągu 10 minut z szybkością 3000 obrotów/min. Surowicę oddzielono i przechowywano w probówkach Eppendorfa w temperaturze -20°C (3). Przed analizą metodą HPLC zamrożoną surowicę rozmrożono i w celu usunięcia białek dodano 200 μl surowicy do filtra Microcon (model 10, kod 42407, Amicon) i odwirowano w ciągu 30 minut z szybkością 13000 obrotów/min.

- Śledziony pobrano (n = 3) i zebrano do analizy L-DHO.

Na komórki oddzielone przez rozdrobnienie (przepuszczenie przez sito ze stali nierdzewnej) podziałano 0,17M NH4Cl w celu lizy erytrocytów. Przygotowano próbki po 50 milionów komórek śledziony na grupę, umieszczono je w probówkach do wirowania i supernatant odrzucono. Osad komórek w trakcie ciągłego mieszania poddano działaniu 500 μl 1,2M roztworu HClO₄ w celu lizy komórek i odwirowano w ciągu 2 minut. Kwaśne lizaty komórkowe przeniesiono całkowicie do szklanych fiolek, dodano 500 μl chloroformu i mieszano w ciągu 2 minut z użyciem mieszalnika wirowego. Lipidy komórkowe wytrącono przez odwirowanie (10 min, 1502 x g i 10°C). Supernatant umieszczono w 2 ml probówkach i przechowywano w temperaturze -20°C.

Oznaczanie stężenia A771726 w surowicy wykonano w następujący sposób:

Próbki surowicy doprowadzono do temperatury pokojowej i intensywnie mieszano przy użyciu mieszalnika wirowego. Surowicę (200 μ!) przeniesiono za pomocą pipety do probówek Eppendorfa i dodano wzorzec wewnętrzny (A771726, 2 μg w 400 μl acetonitrylu). Probówki mieszano następnie w mieszalniku wirowym i wirowano z szybkością 2500 obrotów/min (w temperaturze pokojowej) w ciągu 10 minut. Dla celów analizy metodą HPLC supernatant (400 μ) przeniesiono do fiolek i dodano wody (400 μθ i wymieszano.

Warunki HPLC były następujące: aparatura składała się z pompy TSP P2000, automatu do pobierania próbek TSP AS1000, integratora TSP SP4270 i detektora UV TSP UV100. Detekcję prowadzono przy długości fali 292 nm. Faza ruchoma składała się z 650 ml metanolu (CHROMASOLV), 2,42 g bromku tetrabutyloamoniowego i 350 ml 0,05M octanu amonu. Natężenie przepływu wynosiło 0,5 ml/min. Zastosowano kolumnę CHROMPACK Spherisorb ODS-2, 10 cm, z 1 cm kolumną ochronną z odwróconymi fazami (R2). Porcja wstrzyknięta do kolumny wynosiła 100 a czas przebiegu 7 minut.

Oznaczanie stężenia L-DHO z zastosowaniem HPLC: Rozdzielanie chromatograficzne wykonywano zgodnie z opisem w przykładzie 1. Zakres detektora ustawiono na 10 μS; analizę wykonywano w temperaturze pokojowej. Faza ruchoma składała się z 100 mM NaOH (A) i wody (B). Z zastosowaniem tego układu uzyskano następujące gradienty:

PL 194 068 B1

Surowica

Limfocyty śledziony

Natężenie przepływu wynosiło 1 ml/min.

Zarówno zdrowe, jak i chore szczury miały zwiększone stężenie L-DHO w komórkach (tabela 13) i w surowicy (tabela 14) po doustnym podaniu leflunomidu. Wzrost ten korelował z określonymi u tych zwierząt stężeniami A771727 w surowicy (tabela 15). Początkowo, w 3 godziny po doustnym podaniu leku, A771726 osiągnął stężenie około 26 μg/ml u szczurów z chorobą wywołaną adiuwantem i 31 μg/ml u szczurów zdrowych. Wartości te osiągnęły maksimum po jednej godzinie od podania drugiej dawki (7 godzina), ale uległy obniżeniu do wartości pomiędzy 7 a 12 μg/ml w trakcie trwania doświadczenia zarówno u chorych, jak i u zdrowych szczurów. Osiągnięcie tego stężenia u chorych zwierząt zajęło 51 godzin, natomiast u zdrowych zwierząt nastąpiło to po 27 godzinach (tabela 15). Stężenia A771726 w surowicy korelowały ze stężeniami L-DHO w surowicy chorych po podaniu adiuwantu i zdrowych gryzoni. Przeciwnie niż stężenia L-DHO w surowicy, które oscylowały wokół wartości 5 μg/ml w trakcie trwania doświadczenia, ilość L-DHO wykryta w limfocytach śledziony spadła po 99 godzinach poniżej granicy wykrywalności (D.L.) (1,5 μg/ml).

T a b e l a 13. Stężenia L-DHO w limfocytach śledziony [50 x 10⁶ komórek] szczurów leczonych leflunomidem

	Szczury z chorobą wywołaną adiuwantem	Szczury zdrowe
Czas	Wartość	Średnia	SD	SD	Wartość	Średnia	SD	SD
[h]	pomiaru	^g/ml]	^g/ml]	[%]	pomiaru	[mg/ml]	^g/ml]	[%]
1	2	3	4	5	6	7	8	9
0 Placebo	<D.L. <D.L.	<D.L.			<D.L. <D.L	<D.L.

PL 194 068 B1 cd. tabeli 13

1	2	3	4	5	6	7	8	9
3	5,81 4,60	5,21	0,60	11,52	5,09 6,31	5,70	0,61	10,70
7	13,00 11,22	12,11	0,89	7,35	16,77 14,87	15,82	0,95	6,01
27	16,28 16,84	16,56	0,28	1,69	8,69 10,25	9,47	0,78	8,24
51	3,63				1,84
	3,97	3,80	0,17	4,47	2,34	2,09	0,25	11,96
75	2,58				1,92
	2,71	2,65	0,06	2,26	2,24	2,08	0,16	7,69
99	<D.L. <D.L.	<D.L.			<D.L. <D.L.	<D.L.
Placebo (99)	< D.L. < D.L	<D.L.			<D.L. <D.L.	<D.L.

Zwierzętom podawano leflunomid lub placebo, śledziony usunięto (n = 3) i pobrano do analizy jak opisano. Pobrane limfocyty śledziony poddawano analizie dwukrotnie. DL = granica wykrywalności (1,5 pg/ml).

T a b e l a 14. Stężenia L-DHO w surowicy szczurów leczonych leflunomidem

	Szczury z chorobą wywołaną adiuwantem	Szczury zdrowe
Czas [h]	Szczur	Wartość	Średnia	SD	SD	Wartość	Średnia	SD	SD
		pomiaru	[pg/ml]	[pg/ml]	[%]	pomiaru	[pg/ml]	[pg/ml]	[%]
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	1	<D.L				<D.L.
0	2	<D.L.	<D.L.			<D.L.	<D.L.
(Placebo)	3	<D.L.				<D.L.
	1	7,85				11,92
3	2	9,66	8,52	0,99	11,70	10,88	11,13	0,67	6,30
	3	8,05				10,60
	1	19,55				20,29
7	2	17,00	17,54	1,81	10,30	18,14	18,66	1,45	7,80
	3	16,06				17,54
	1	19,73				8,22
27	2	15,95	16,45	3,06	18,60	8,42	8,43	0,21	2,50
	3	13,67				8,64
	1	3,06				4,87
51	2	3,68	3,27	0,36	11,00	4,77	4,55	0,46	10,20
	3	3,06				4,02
	1	5,38				4,60
75	2	4,45	5,14	0,61	11,90	4,17	4,33	0,23	5,40
	3	5,60				4,23

PL 194 068 B1 cd. tabeli 14

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	1	5,48				5,67
99	2	4,89	5,02	0,41	8,30	6,64	5,75	0,85	14,80
	3	4,68				4,95
Placebo	1	<D.L	<D.L.			<D.L
(99)	2	<D.L				<D,L	D.L
	3	<D.L				<D.L

Zwierzętom podano leflunomid lub placebo i krew pobierano, przygotowywano i analizowano jak opisano. Stężenia L-DHO w surowicy oznaczano dla każdego zwierzęcia indywidualnie. DL = granica wykrywalności (0,5 pg/ml).

T a b e l a 15. Stężenia A771726 w surowicy szczurów leczonych leflunomidem

	Szczury z chorobą wywołaną adiuwantem	Szczury zdrowe
Czas [h]	Szczur	Wartość	Średnia	SD	SD [%]	Wartość	Średnia	SD	SD
		pomiaru	[pg/ml]	[pg/ml]		pomiaru	[pg/ml]	[pg/ml]	[%]
	1	0,0				0,0
0	2	0,0	0,0	0,0		0,0	0,0	0,0
(Placebo)	3	0,0				0,0
	1	26,8				32,0
3	2	27,2	26,33	1,17	4,45	30,6	30,7	1,21	3,92
	3	25,0				29,6
	1	44,1				47,7
7	2	45,2	42,3	4,11	9,71	49,4	47,9	1,46	3,04
	3	37,6				46,5
	1	21,3				10,2
27	2	22,0	19,7	3,34	16,92	9,9	9,6	0,74	7,65
	3	15,9				8,8
	1	9,1				7,8
51	2	10,2	9,2	1,00	10,93	8,7	7,4	1,48	19,97
	3	8,2				5,8
	1	9,0				6,7
75	2	7,3	9,9	3,09	31,34	9,4	8,1	1,35	16,70
	3	13,3				8,2
	1	12,0				14,6
99	2	11,9	12,2	0,38	3,11	11,4	12,7	1,67	13,0
	3	12,6				12,2			8
Placebo	1	0,0				0,0
(99)	2	0,0	0,0	0,0		0,0	0,0	0,0
	3	0,0				0,0

Zwierzętom podano leflunomid lub placebo i pobrano od nich krew, którą przygotowano i analizowano jak opisano. Stężenia A771726 w surowicy oznaczono dla każdego zwierzęcia indywidualnie.

Podany doustnie leflunomid ulega szybkiej przemianie w A771726 in vivo. A771726 jest czynnym metabolitem leflunomidu (US 5679709). Podawanie leflunomidu hodowanym szczurom z chorobą

PL 194 068 B1 wywołaną adiuwantem i szczurom zdrowym powodowało szybkie nagromadzenie L-DHO w ich surowicy i limfocytach śledzony. Stężenie L-DHO korelowało ze stężeniami A771726 w surowicy krwi, co wykazuje czynne tłumienie in vivo DHO-DH przez tą cząsteczkę. W badaniach klinicznych u ludzi kontrolowanie L-DHO może być zastępczym znacznikiem immunomodulującego działania leflunomidu u pacjentów.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wydzielania rozpuszczonego kwasu L-dihydroorotowego z roztworu zawierającego ten kwas i substancje przeszkadzające drogą chromatografii, znamienny tym, że

a) wprowadza się ten roztwór do kolumny chromatograficznej zawierającej anionit odporny na działanie ciśnienia i zasadniczo cały kwas wiąże się z żywicą jonowymienną, przy czym w szczególności substancje przeszkadzające pochodzą z lizatu komórkowego lub surowicy;

b) większość substancji przeszkadzających wymywa się z kolumny roztworem wodnym zawierającym zasadę w niskim stężeniu; oraz

c) wymywa się kwas z żywicy jonowymiennej roztworem wodnym zawierającym zwiększoną ilość zasady, przy czym wymywanie prowadzi się pod ciśnieniem 1,1 - 40 MPa.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się wodorotlenek sodu.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się żywicę jonowymienną wybraną z grupy obejmującej polimer diwinylobenzen/etylowinylobenzen, polimer poliwinylobenzyloamoniowy sieciowany diwinylobenzenem, mieszaniny polimeru diwinylobenzen/etylowinylobenzen i polimeru poliwinylobenzyloamoniowego sieciowanego diwinylobenzenem modyfikowane czwartorzędowym związkiem alkanoloamoniowym, polimer chlorek winylobenzylu/diwinylobenzen; polimer polietyloiminowy, krzemionkę modyfikowaną związkiem propylotrimetyloamoniowym i związek poli(styren-diwinylobenzen)trimetyloamoniowy.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymywanie prowadzi się pod ciśnieniem 4,1 - 5,5 MPa.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie zasady w roztworze wymywającym zwiększa się w czasie przemywania kolumny.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kwas L-dihydroorotowy wykrywa się z użyciem detektora konduktometrycznego.
7. Sposób monitorowania aktywności inhibitora dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego, w którym dostarcza się próbkę testową, przygotowuje się roztwór zawierający kwas L-dihydroorotowy i substancje przeszkadzające, znamienny tym, że następnie

a) wprowadza się ten roztwór do kolumny chromatograficznej zawierającej anionit odporny na działanie ciśnienia i zasadniczo cały kwas wiąże się z żywicą jonowymienną, przy czym w szczególności substancje przeszkadzające pochodzą z lizatu komórkowego lub surowicy;

b) większość substancji przeszkadzających wymywa się z kolumny roztworem wodnym zawierającym zasadę w niskim stężeniu;

c) wymywa się kwas z żywicy jonowymiennej roztworem wodym zawierającym zwiększoną ilość zasady, przy czym wymywanie prowadzi się pod ciśnieniem 1,1 - 40 MPa; oraz

d) mierzy się ilość kwasu L-dihydroorotowego z użyciem detektora przewodnictwa i na tej podstawie określa się aktywność inhibitora dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że inhibitor dehydrogenazy kwasu dihydroorotowego jest wybrany z grupy obejmującej 5-metylo-N-[4-(trifluorometylo)fenylo]-4-izoksazolokarboksyamid, sól sodową kwasu 6-fluoro-2-(2'-fluoro[1,1'-bifenyl]-4-ilo)-3-metylo-4-chinolinokarboksylowego, 2-cyjano-3-hydroksy-N-[4-(trifluorometylo)fenylo]-2-hepten-6-ynokarboksyamid, 2-cyjano-N-(4-cyjanofenylo)-3-cyklopropylo-3-hydroksy-2-propenoamid i 2-cyjano-3-hydroksy-N-[4-(trifluorometylo)fenylo]-2-butenoamid.