CN1237345C - 获得l－二氢乳清酸的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过在阴离子交换材料上、于碱水混合物中、约1.1MPa至约40MPa压力下进行层析得到L-二氢乳清酸的方法。该方法可以用来研究N-4(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、N-4(三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羟基丁烯酰胺及类似化合物的体内和体外活性。

Description

获得L-二氢乳清酸的方法及其应用
本发明涉及一种通过在阴离子交换材料上、于碱水混合物中约1.1MPa至约40MPa的压力下进行层析得到L-二氢乳清酸(此后称作“L-DHO”)的方法。该方法可适用于研究N-(4-三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羟基丁烯酰胺及类似化合物的体外和体内活性。
利用硅胶层析法、随后通过化学衍生法和比色分析法可以测量出L-DHO(Kesner，L.，Aronson，F.L.，Silverman，M.，Chan，P.C.，《临床化学》(Clin.Chem)21/3(1975)353)。另一种方法是令L-DHO在由大鼠肝脏制备的L-二氢乳清酸脱氢酶(此后称为“DHODH”)的酶促作用下转化为乳清酸，进而化学衍生化，再通过比色变化来检测乳清酸盐(酯)(Rogers，L.E.，Nicolaisen，K.，《经验》(Experientia)28/10(1972)1259)。这些方法的缺点在于，复杂生理溶液中所含的其他物质对检测造成干扰。此外，上述方法极其耗时，这归因于样本制备繁杂，所以无法在大规模的临床研究中用作常规分析。
在尝试改进获得L-二氢乳清酸的分离和离析方法中，现已发现通过在碱水混合物中、于阴离子交换材料上约1.1MPa-约40MPa的压力下对L-DHO进行层析可获得相同的结果。该方法可用于定量检测细胞溶解产物、哺乳动物血清和人血清中的L-DHO。此方法具有高度的重现性、灵敏度和有效性。
本申请通过采用一种包括下列步骤的层析方法达到了该目的：
a)获得含有耐压阴离子交换材料的层析柱；
b)将含有L-二氢乳清酸的样本溶液进样至该层析柱中；
c)进行层析；
d)用含有碱水混合物的洗脱剂来洗脱L-二氢乳清酸；
该方法是在约1.1MPa-约40MPa的压力下进行。
术语“耐压阴离子交换材料”是指材料，例如，大孔(2000)二乙烯基苯/乙基乙烯基苯的聚合物或与二乙烯基苯交联的微孔聚乙烯基苄基铵聚合物或者它们的混合物，其是被链烷醇季铵改性的；或乙烯基苄基氯/二乙烯基苯的大孔聚合物；或交联聚乙基亚氨基聚合物；或用丙基三甲基铵改性的二氧化硅；或聚(苯乙烯-二乙烯基苯)三甲基铵。
下列产品是特别优选的：
-Ion Pac AS 11、CarboPac PA 1或CarboPac MA 1阴离子交换层析柱，由Dionex公司，Idstein，德国提供；
GROM-SIL，Strong Anion.或GROM-SIL，Weak Anion.；由Grom提供；
P 1000 SAX，Ionospher SA或Chrompack PA；由Chrompack提供；
PRP-X 100或RCX-10，由Hamilton提供。
洗脱剂含有碱水混合物。适用的碱衍生自碱金属或碱土金属，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙。基于作为溶剂的水，碱的浓度是1mmol/l-约200mmol/l，优选2mmol/l-约120mmol/l，更优选100mmol/l。层析过程中的温度约为0℃-约50℃，优选约15℃-约30℃，更优选约19℃-约25℃。层析中的工作压力基本恒定。层析也可以在不同的压力下进行，例如可以在约1.1×106Pa(1.1MPa)-约40×106Pa(40MPa)，优选4.1MPa-5.5MPa的压力下进行。洗脱剂的流速约为0.2ml/分钟-约3ml/分钟，优选1ml/分钟。
层析柱的填装、层析以及L-DHO的洗脱均采用已知的常规技术法。适用的洗脱过程是其中碱浓度表现为时间的梯度，特别是该梯度呈线性过程的洗脱。该浓度梯度可以通过例如在洗脱初始时令洗脱剂中含有低浓度的碱(极限情况中为0)，并且在洗脱过程中提高碱的浓度来实现。此方法能够极其有效地分离出衍生自血清或细胞溶解产物的样本中的L-DHO。优选的碱梯度是在约1％NaOH(100mmol/l)和99％水(洗脱开始时)-约60％NaOH和40％水(在洗脱结束时)内变化，特别优选介于约1％NaOH和99％水(洗脱开始时)-约15％NaOH和75％水(在洗脱结束时)的范围内。碱水梯度在2.5分钟-约14分钟和14分钟-约25分钟间呈线性方式改变，其中，在这两个时间段中梯度的陡度并不相同。
更适当的洗脱可通过在分离过程开始时采用约为1％的低碱浓度且使其保持约2.5分钟来获得。其结果是从层析柱的生物基质中洗脱绝大多数干扰物。通过在总共14分钟的测定时间段中使碱的梯度缓慢升高至约23％碱来分离出被分析物。随后，碱浓度在4分钟内升高至约60％以便洗脱出强结合的物质。使用60％碱应不超过6分钟，马上用1％的碱水混合物再平衡。下一次的分析是在总长45分钟的分析时间之后进行。碱水混合物中的水需经过去离子化和脱气处理。
本发明的分离方法是在柱过程中进行的。适宜在阴离子交换层析法中保持恒定的温度可在很宽的范围内变化。优选的温度范围是约-10℃-约80℃，更优选约15℃-约25℃。
对L-DHO的洗脱发生在梯度开始后的第10分钟-12分钟之间。洗脱过程的进行时间为13分钟-25分钟。利用电导检测器，例如Dionex公司提供的CD20型，来检测L-DHO。为了使基线漂移减至最小并降低背景导电率，可以采用阴离子自再生抑制器，例如Dionex公司的ASRS-1型，4mm。
本发明所述的方法特别适用于分析层析法，但也可以用于制备层析法，尤其当本发明所述方法采用的是制备性高压液相层析柱(HPLC)体系时。术语“制备性层析”是指目的在于得到而不仅是分析纯净产物的提纯方法。纯净产物的量可以在很宽的界限内改变，例如1mg-1000g，优选50mg-500mg。
本发明的方法可以用来检测因抑制二氢乳清酸脱氢酶(DHO-DH)所致的细胞内或细胞外L-DHO浓度的变化。DHO-DH酶负责嘧啶从头合成过程中由L-二氢乳清酸转化为乳清酸。对DHO-DH的抑制将导致L-DHO累积。本发明的方法可用于制剂的诊断分析。本发明的方法可以用来测定DHO-DH抑制剂的活性。DHO-DH抑制剂例如是N-4-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、布喹那(Brequinar)、N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羟基庚-2-烯-6-炔-甲酰胺、2-氰基-3-环丙基-3-羟基丙烯酸-(4-氰基苯基)-酰胺或N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羟基丁烯酰胺。本发明的方法可以用来检测植物、细胞系、动物和人体中的L-DHO浓度。对L-DHO的测定可用来监控DHO-DH抑制剂在植物、哺乳动物和人体中的活性。
本发明所述方法将在下列实施例中作详细描述。除非另外说明，百分比数据均是指重量百分率。
实施例1
1.1化学品和试剂
化学品和试剂购得如下：
无NaOH和KOH的碳酸盐                Baker，Holland
L-二氢乳清酸(L-DHO)                Sigma，Munich
HClO4                             Riedel de Haen，Seelze
曙红，氯仿                         Riedel de Haen，Seelze
RPMI 1640培养基                    Gibco，Eggenstein
胎牛血清(FCS)                      Bio Whitaker，Verviers，
                                   Belgium
去离子水在使用前用氦气脱气
1.2层析仪器
HPLC系统是由下列设备构成：
 仪器   型号   制造商
 溶剂调节组件   SCM 400   Thermo separationproducts(TSP)
 二元梯度泵   P 2000   TSP
 具有20μl回路的自动进样器   AS 3000   TSP
 连接器   SP 4510   TSP
 AD变换器   SN 4000   TSP
 电导检测器   CD 20   DIONEX
 阴离子自再生抑制器   ASRS-I4mm   DIONEX
 检测稳定器   DS 3-1   DIONEX
 PC   EI 20，FLEX SCAN，F 583-T   ESCON
 打印机   Desk Jet 550C   ESCON
 软件   PC 1000   TSP
在试验的整个过程中使用聚醚醚酮(peek)材料。
1.3HPLC条件
层析分离采用了250×4mm I.D.IonPac AS 11阴离子交换柱(粒度13μm；P/N 044076，Dionex)，该柱装配有IonPac AG 1150×4mm I.D.前置柱(粒度13μm；P/N 044078，Dionex)。此外，在梯度泵和注射阀之间安装有一个阴离子俘获柱ATC-1(P/N 037151。Dionex)。为了使基线漂移减至最小并降低背景导电率，再安装上在300mA下工作的ASRS-I抑制器。将检测器范围设定在10μS。将自动进样器冷却至14℃，但分析试验本身是在室温下进行。流动相由100mMNaOH(A)和去离子化脱气水(B)组成。同时，利用该系统得到下列梯度：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   1   99
  2.5   1   99
  14   23   77
  18   60   40
  24   60   40
  26   1   99
  45   1   99
流速为1ml/分钟，洗脱时间为45分钟。
1.4标准品和质量控制样品
通过将1mg L-DHO溶解在1ml水中制备标准品储备液。将400μl的等分试样冷藏在-20℃下。这些溶液的稳定性至少可以保持4周。将指定量的储备溶液加入到细胞溶解产物和人或大鼠的血清中并进行测量，以评估信号增量和尖峰L-DHO浓度之间的线性关系。利用具有在信号/浓度线性曲线上低、中和高浓度范围的L-DHO成分的质量控制(QC)样品来测定本发明方法的精确度和准确度。
1.5样品的制备
1.5.1细胞
由ATCC(TIB 182)获得Jurkat细胞并且按照1.5.1.1.所述的方法培养。
1.5.1.1.组织培养条件
将Jurkat细胞以5×105/ml接种，令其在RPMI 1640培养基和10％胎牛血清(FCS)中生长24小时。将细胞合并在新鲜的培养基中用于溶解细胞，利用曙红、通过活体显微镜检计算出细胞数量和死亡细胞的百分比。经24小时后，细胞数量增加1.6-1.8倍，同时死亡细胞低于7％。为测定L-DHO所取的Jurkat细胞在24小时内的增殖率为1.6-1.8倍且死亡细胞少于7％。
1.5.1.2细胞溶解产物的制备
将细胞悬浮在指定的培养基体积中并且利用曙红通过活体显微镜检测定出样品的细胞密度。取约10×106个细胞，在350×g下离心5分钟使之成团并且弃去上清液。将细胞团再次悬浮在500μl的1.2M HClO4中以使细胞溶解。将该混合物转移到2.0ml Eppendorf带盖管中，通过高速离心2分钟沉淀出蛋白质。取出全部上清液，转移至玻璃瓶中，在加入500μl氯仿后通过2分钟涡旋令其充分混合。在10℃下离心10分钟(1502g)后用氯仿提取细胞脂质。将纯化的上清液收集在2mlEppendorf管中并储存在-20℃下直至使用。为了进行HPLC分析，用30μl 6M KOH中和100μl该上清液。振摇约5秒钟后，将样品在冰上储存30分钟。此后，在15000rpm下离心5分钟。取20μl澄清的上清液用于HPLC分析。
1.5.2血清
为了降低蛋白质的含量，将200μl血清加入到Microcon滤器(10000D，10型，编号42407，Amicon)上并以13000转/分钟(rpm)离心30分钟。过滤的流过物约为150μl且含有被分析物L-DHO。由此液体中取20μl用于HPLC分析。
1.6定量分析
用积分仪测量被分析物的峰高。由测出的峰高(y)对不同生物基质中的被分析物浓度绘图得到校正曲线。利用加权线性回归(1/y)反向计算出标准样品和质量控制品中的L-DHO浓度。由基于利用加权因子进行的协方差模型分析的PROC GLM得到共同相关系数(commoncorrelation coefficient)R。
1.7稳定性
表1列出了-20℃下细胞溶解产物和血清样本中的被分析物在各个样品经过2-3个冷冻/融化循环后的稳定性数据。Jurkat细胞中的L-DHO在上述条件下于至少4周内保持稳定。但还无法解释在一些大鼠血清样本和一个人血清样本中检测到的被分析物经过数个融化循环后浓度增高10％以上的现象，这表明这些情况中的准确度一般降低达15％，在最坏的情况下降低达29％。因此，只能认为大鼠和人血清样本中L-DHO仅在至少一周内明确保持稳定。
表1：-20℃下细胞溶解产物和血清中的稳定性数据(n＝1)
  时间(天)   浓度120μg/ml   残余率(％)   浓度2100μg/ml   残余率(％)
  Jurkat细胞
  0   19.34   100   100.05   100
  7   19.28   99.7   99.09   99.0
  14   n.d.   n.d.   115.32   115.3
  29   19.98   103.3   99.35   99.3
  时间   浓度1   残余率(％)   浓度2   残余率
  (小时)   5μg/ml   20μg/ml   (％)
  大鼠血清
  0   4.30   100   19.94   100
  7   4.52   105.1   19.62   98.4
  14   4.81   111.9   20.93   105.0
  21   5.55   129.1   22.38   112.2
  人血清
  0   4.67   100   20.22   100
  8   4.81   103.0   20.38   100.8
  65   4.87   104.3   23.20   114.7
残余率(％)是指和测定起始时比较，浓度的百分率。
n.d.＝未测量
为了模拟样品在自动进样器中等待期间的条件以使分析更精确，我们测定了14℃下18小时内的稳定性。出于上述原因，将细胞溶解产物增敏(spiked)再在分析开始之前用30μl 6M KOH/100μl细胞溶解产物处理。相应地，增敏血清样本再按照1.5.2所述方法除去蛋白质。
由表2可以看出，细胞中L-DHO的含量在这些条件下略微降低，最多约为7％。在血清样本中，被分析物在上述条件下保持稳定。鉴于这些原因，只有制备如此多的HPLC样品，以使它们在自动进样器中的最大滞留期少于18小时。
表2：14℃下18小时的稳定性(n＝1)
  时间(小时)   浓度120μg/ml   残余率(％)   浓度2100μg/ml   残余率(％)
  Jurkat细胞
  0   19.96   100   100.02   100
  18   18.60   93.2   97.43   97.4
  时间   浓度1   残余率(％)   浓度2   残余率
  (小时)   5μg/ml   20μg/ml   (％)
  大鼠血清
  0   4.61   00   19.99   100
  18   4.96   107.6   20.53   102.7
  人血清
  0   3.34   100   18.78   100
  18   3.37   100.9   22.09   117.6
1.8选择性
将未增敏Jurkat细胞溶解产物和相应的用50μg L-DHO/ml增敏的细胞溶解产物的层析进行比较，对比显示在11.983分钟处有一个小尖峰，该峰和L-DHO的保留时间相同。此尖峰极有可能是由上述细胞中含有的天然被分析物引起的。所以，可以认为由于用KOH处理细胞溶解产物，L-DHO峰裂分为2个峰。然而，KOH的处理是必需的，为的是在HPLC分析之前中和酸性细胞溶解产物。在上述条件下评估第二个峰(保留时间(RT)＝11.954分钟)的高度可以在线性和再现性方面得到改进的结果。
在大鼠和人血清的情况中还发现和L-DHO有相同保留时间的空白值。推测由此反映出生物中天然L-DHO的含量。对这两个物种的至少10个不同样本进行测定，结果显示出天然L-DHO的含量在检测限1μg/ml以下。
1.9线性
对由细胞系和不同血清样本获得的5条校正曲线的检测线性进行评估。在不同的5天内制备样品并层析，L-DHO的浓度为1.5-150μg/ml(细胞溶解产物)和1-30μg/ml(血清样品)。结果如表3-5所示。利用峰高来测出回归线。基于此，反向计算出不同标准品的相应浓度，示于不同表中。
表3：Jurkat细胞溶解产物中L-DHO测定的线性
增敏后，用30μl 6M KOH处理样品，且随后按照1.3分析1次。
    天                         浓度      (μg/ml)1.5         6         10         50          100            150   斜率     y轴截距   r
    1   1.78   5.54   9.09   49.80   102.46   149.09   1317.54     -258.17   0.9995
    2   1.90   5.14   9.54   50.77   100.22   150.20   1324.84     204.79   0.9995
    3   1.86   5.24   9.46   51.18   99.91   150.07   1295.48     302.48   0.9996
    4   1.85   5.34   9.39   51.45   100.97   148.71   1306.08     833.68   0.9996
    5   1.86   5.26   9.53   50.98   100.07   n.d.   1318.67     530.19   0.9993
   平均值   1.85   5.30   9.40   50.80   100.73   149.52   1312.52     322.59
   S.D.   0.04   0.15   0.19   0.63   1.05   0.73   11.69     404.93
   C.V.(％)   2.3   2.8   2.0   1.2   1.0   0.5   0.9     125.5
R＝0.9995
表4：大鼠血清中L-DHO测定的线性
增敏后，按照1.5.2所述除去样品中的蛋白质。
天   浓度                      (μg/ml)1             5            10              20            30   斜率   y轴截距    r
    1   1.05   4.48    10.10     22.10   28.61   15334   -4719.83    0.9966
    2   1.16   4.59    8.60     21.07   30.97   17559   -4630.68    0.9960
    3   1.07   4.64    9.81     20.07   30.45   17674   -3175.63    0.9995
    4   1.11   4.62    9.54     19.27   31.65   18322   -4296.53    0.9981
    5   1.06   4.81    9.99     18.89   31.40   17738   -829.00    0.9985
    平均值   1.09   4.63    9.61     20.28   30.62   17325.40   -3530.33
    S.D.   0.05   0.12    0.60     1.32   1.21   1151.65   1630.62
    C.V.(％)   4.2   2.6    6.3     6.5   4.0   6.7   46.19
R＝0.9959
表5：表3：人血清中L-DHO测定的线性
增敏后，按照1.5.2所述除去样品中的蛋白质。
天   浓度                            (μg/ml)1           5            10              20              30   斜率   y轴撼距     r
  1   0.90   5.17   11.30   19.41   29.42   13498   2930.30     0.9980
  2   0.99   4.87   10.12   21.51   28.68   15663   477.61     0.9982
  3   0.94   4.94   11.29   19.41   29.59   14328   1367.80     0.9982
  4   1.01   4.77   10.32   20.82   29.15   15777   1771.98     0.9992
  5   1.01   4.81   10.10   20.86   29.28   15216   1612.77     0.9993
  平均值   0.97   4.91   10.62   20.40   29.23   14896.4   1632.09
  S.D.   0.05   0.16   0.61   0.95   0.35   967.46   881.47
  C.V.(％)   5.2   3.2   5.8   4.6   1.2   6.5   54.01
R＝0.9986    *标准品浓度(μg/ml)        -未测量
如上表所示，各种情况中的线性已得到证实。这反映在各个相关系数“r”在所有情况中均＞0.99。在各表中描述了在不同的5天内所得浓度曲线的平均值线性回归线，显示出斜率的重现性很好，最大变异为6.7％。
反向计算出的标准品浓度表现为平均C.V.小于6.5％，这表明这些数值的准确度很高。共同相关值R高于0.99，这表明该方法的精确度和重现性皆很高。
1.10定量的极限
基于这些结果，Jurkat细胞中的定量极限为1.5μg/ml。在大鼠和人血清样本中可以检测到1μg/ml L-DHO。增敏样品在这些浓度下的信噪比至少为1∶3。
1.12准确度和精确度
表6-8概括出在不同的5天内对三个不同浓度的L-DHO重复测定时的准确度和精确度。准确度表示为L-DHO测量值相对于添加值的百分差(回收率)。利用同一样品在一天内测量两次所得的两个数值来算出当日精确度，将其表示为C.V.(％)。不同天间的精确度也表示为C.V.(％)，是利用在不同的5天内对各对照样品的平均测量值来计算的。
表6：
Jurkat细胞溶解产物在增敏和随后用30μl 6M KOH中和后的准确度和精确度。n＝2是指一个细胞溶解产物样品用相应浓度增敏并测量两次。
  对照样品(μg/ml)   天   n   准确度   精确度
  平均测量值(μg/ml)   回收率(％)   C.V.(％)当天   C.V.(％)不同天
20   1   2   20.10   +0.5   1.4 2.9
  2   2   19.20   -4.0   1.3
  3   2   19.40   -2.8   3.9
  4   2   19.51   -2.5   2.2
  5   2   18.55   -7.2   1.3
70   1   2   69.12   -1.3   0.1 2.8
  2   2   69.13   -1.2   0.8
  3   2   73.69   +5.3   0.2
  4   2   71.52   +2.2   1.1
  5   2   69.64   -0.5   0.9
130   1   2   123.21   -5.2   2.8 6.0
  2   2   114.78   -11.7   12.0
  3   2   135.21   +4.0   0.2
  4   2   126.89   -2.4   1.4
  5   2   122.43   -5.8   4.1
表7：
大鼠血清溶解产物在增敏及随后去蛋白后的准确度和精确度。n＝2是指一个血清样本用相应浓度增敏并测量两次。
  对照样品(μg/ml)   天   n   准确度   精确度
  平均测量值(μg/ml)   回收率(％)   C.V.(％)当天   C.V.(％)不同天
8   1   2   7.68   -4.0   0.4 3.0
  2   2   7.73   -3.4   1.0
  3   2   7.83   -2.2   2.1
  4   2   7.43   -7.1   1.0
  5   2   8.06   +0.7   0.6
15   1   2   14.53   -3.1   6.8 1.8
  2   2   14.73   -1.8   1.3
  3   2   14.26   -5.0   0.1
  4   2   14.85   -1.0   0.4
  5   2   14.88   -0.8   0.9
25   1   2   24.98   -0.1   2.5 3.7
  2   2   25.83   +3.3   1.3
  3   2   25.43   +1.7   0.6
  4   2   24.31   -2.8   2.0
  5   2   26.81   +7.2   0.2
表8：
人血清在增敏且随即被去蛋白后的准确度和精确度。n＝2是指一个血清样品用相应浓度增敏并测量两次。
  对照样品(μg/ml)   天   n   准确度   精确度
  平均测量值(μg/ml)   回收率(％)   C.V.(％)当天   C.V.(％)不同天
8   1   2   7.77   -2.9   0.7 3.8
  2   2   7.84   -2.0   15.5
  3   2   7.43   -7.1   10.9
  4   2   7.17   -10.4   2.1
  5   2   7.80   -2.5   1.2
15   1   2   13.88   -7.5   0.9 6.0
  2   2   14.00   -6.7   8.5
  3   2   15.10   +0.6   1.5
  4   2   15.13   +0.8   7.2
  5   2   16.03   +6.8   12.8
25   1   2   26.56   +6.2   3.4 4.2
  2   2   23.77   -4.9   0.7
  3   2   24.80   -0.8   4.7
  4   2   25.46   +1.8   7.8
  5   2   24.54   -1.9   0.2
所列结果表明，在绝大多数情况中，对照值的最大变异为±10％，所以该方法极其准确。只有在一个情况中，Jurkat细胞测定的回收率与对照值略微不同(-11.7％)。该现象可由当天内的变异高达12％得到解释。在Jurkat细胞、大鼠或人血清中的当天精确度分别小于5％、7％和10％。不同天间的精确度在所有被评估模型中均极低，它们的C.V.小于6.0％。这表明所得结果具有高度的重现性和精确度。
实施例2
2.1组织培养的条件：
-制备无血清培养基：将Iscove粉状培养基(Biochrom)溶解在10升的双蒸水中，该水中补加有18.95g NaCl，11.43g NaHCO3，700mg KCl，10ml 35％NaOH溶液和0.5ml 1M巯基乙醇溶液(Riedel de Haen)并且经过滤除菌。在使用前，向1L制备的Iscove培养基中加入32mg人全转铁蛋白(holo-transferrin)、1g牛白蛋白和1.5ml脂质(Sigma)。-细胞培养：在无血清培养基中(37℃，5％CO2)扩大培养对数生长期的A20.2.J细胞。分析所采用的细胞在24小时内具有2.2倍的增殖率。死亡细胞的百分率＜8％(3)。
-用按照EP-0529500所述方法制备的N-(4-三氟甲基)-2-氰基-3-羟基-丁烯酰胺(此后称A 771726)处理细胞。将A771726溶解在bidest水溶液(10mM)中，并进一步稀释于无血清培养基中。随后，向细胞加入适量的A771726，在37℃和5％CO2的条件下温育。
2.2.用于测定DHO的细胞溶解产物的制备
将制备的细胞再悬浮在指定的培养基体积中且达到一定的细胞密度。根据预期的DHO含量，取1-50百万个细胞，使之成团(5min，350×g)并且弃去上清液。通过加入500μl 1.2M HClO4使细胞溶解。将细胞溶解产物转移至2ml Eppendorf带盖管中，通过高速离心2分钟沉淀出蛋白质。取出全部酸化细胞裂解产物，转移至玻璃瓶中，在加入500μl氯仿后通过2分钟涡旋令其充分混合。冷却条件下离心10分钟(1502×g；10℃)以提取细胞脂质。将纯化的上清液收集在2mlEppendorf管中并储存在-20℃下至进行高压液相层析(HPLC)测定。
2.3HPLC对DHO的测定
按照实施例1所述方法进行层析分离。将电导检测器的范围设定在10μS。分析是在室温下进行。流动相由100mM NaOH(A)和水(B)组成。用该体系得到下列梯度：
  时间(分钟)   A(％)   8(％)
  0   1   99
  2.5   1   99
  14   8   92
  22   8   92
  28   60   40
  32   60   40
  34   1   99
  49   1   99
流速为1ml/分钟；洗脱时间为49分钟。
2.4.结果
与A771726一起温育的A20.2.J细胞的胞内DHO量增高(表9-11)。表9中的结果证实，DHO的水平与被提取细胞的数目直接相关。
表9：胞内DHO浓度和与A77 1726共培养的细胞数的相关性
  细胞(×106)   DHO浓度(μg/ml±SD)
  Experiment 1(E10B)   Experiment 2(E14)
  1   14.08±2.40   11.75±0.23
  2   19.51±6.47   28.27±0.79
  4   53.58±3.50   57.20±2.76
  6   73.01±1.49   85.38±2.33
  8   99.89±5.96   107.02±3.47
  10   113.37±4.24   128.73±1.95
A20.2.J细胞用5μM A771726处理并培养24小时(37℃，5％CO2)，随后准备用于DHO提取(n-3)。
为了优化细胞培养法且测出最佳的细胞/A771726摩尔浓度比，将不同密度的A20.2.J细胞与A77 1726(5μM)一起温育。在不同的时间点取样并且测定DHO浓度(表10)。由于DHO的浓度与被提取细胞的数量直接相关(参见表9)，对于随后的试验，将DHO的浓度以μg/ml外推至10×106个细胞。发现在1×106个细胞/ml的密度下DHO浓度线性增加最好。利用此细胞密度，研究与A77 1726一起温育的细胞中胞内DHO水平随时间的升高。在温育1小时后，可以测量出可检测量的DHO，这不依赖于药物的浓度(表11)。记录到有线性增加，在6小时后测定到DHO的最大量(表11)。经过此时间段后观察到出现饱和状态，DHO不再升高。
表10：细胞密度和胞内DHO浓度随时间的增加
  温育时间(小时)   DHO的浓度(μg/ml)平均值±SD
  1×106细胞/ml   2×106细胞/m l   3×106细胞/ml
  1   6.25±0.42   5.47±0.10   5.63±0.19
  4   33.06±2.26   26.36±0.42   19.39±1.87
  7   60.07±0.01   42.31±1.07   28.79±0.34
将不同量的A20.2.J细胞与A77 1726(5μM)一起温育如上长的时间，并且测定各样品点的胞内DHO浓度(*所有值外推至10×106细胞)(n＝2)。
表11：胞内L-DHO浓度随时间的增加
  温育时间(小时)   DHO的浓度(μg/ml)平均值±SD
  A771726(5μM)   A771726(10μM)   A771726(25μM)
  0   2.73±0.10   2.73±0.10   2.73±0.08
  1   9.20±0.09   8.5±0.39   15.05±0.26
2   24.03±1.15   20.74±1.43   26.06±0.20
  4   59.48±0.72   58.65±2.06   50.21±1.54
7   87.54±1.58   82.65±4.50   114.89±3.61
将1百万A20.2.J细胞与不同浓度的A77 1726一起温育并且在不同的时间点测定其胞内DHO浓度。数据表示为外推至10百万个细胞时的μg/ml DHO±SD(0-4小时＝n＝2，7小时＝n＝4)。
A20.2.J肿瘤细胞与A77 1726一起温育时，由于DHO-DH被抑制而导致L-DHO迅速累积。胞内L-DHO的浓度与细胞数目相关，并随时间而变化。因此L-DHO的监测是A77 1726在患者体内免疫调节活性的替代标志。
实施例3
动物：体重为160-200g的雄性Wistar-Lewis大鼠(MollegaardBreading Center Ltd.Ejby，DK)。
佐剂关节炎：将0.1ml弗氏佐剂(6mg耻垢分枝杆菌悬浮在1ml白色重石蜡油中)(Merck，Darmstadt)注射到Wistar-lewis大鼠尾根部，以诱发该疾病。病理症状一般在疾病诱发后10-14天出现。药物处理：将药物悬浮在1％的羧甲基纤维素(COMC)中。给健康大鼠(n＝18)和佐剂致病(n＝18)大鼠(患病第9天)口服给药10mg/kg的N-4-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺(此后称作来氟米物(Leflunomide))，每天2次(7:30和13:30)，共5天；即时间点：0小时、6小时、24小时、30小时、48小时、54小时、72小时、78小时、96小时(参见表12)。在时间点0小时时，处死患病和未患病组各3只动物，用于测定基线水平。另外取3只健康和3只患病的动物用安慰剂(单独的COMC)处理5天。
取样：在各个取样时间点从每组中取3只动物处死。在3小时、7小时、27小时、51小时、75小时和99小时取血清和脾细胞(参见表12)。除了7小时时的数值以外，其它样本均是在末次给药后3小时时采集。7小时的数值是在第二次给药后1小时采集样本得到的。在0小时(n＝3)和99小时(n＝3)的时间点自安慰剂处理动物取样。
表12：来氟米物的给药和组织取样时间
  小时：   0  3  6  7   24  27  30   48  51  54   72  75  78   96  99
  药物(p.o.)取样  ↑     ↑   ↑      ↑   ↑      ↑   ↑      ↑   ↑
 ↑ ↑    ↑       ↑       ↑       ↑       ↑
样本的制备：
-将通过心脏穿刺收集的血液在4℃下储存30分钟，随后在3000rpm下离心10分钟。分离血清并储存在-20℃的Eppendorf管中(3)。在HPLC分析前，将冷冻血清融化，为了除去蛋白质，将200μl血清加入到Microcon滤器(10型，编号42407，Amicon)中并在13000rpm下离心30分钟。
-取出脾脏(n＝3)并且合并用于L-DHO分析。将通过拨挑分离的细胞(穿过不锈钢滤过器)用0.17M NH4Cl处理，以溶解红细胞。每组制备50百万个脾细胞的等分样本，置于离心管中，弃去上清液。在持续混合下，向细胞团中加入500μl的1.2M HClO4溶液以溶解细胞，离心2分钟。将全部酸性细胞溶解产物转移到玻璃瓶中，加入500μl氯仿并用涡旋混合器混合2分钟。通过离心沉淀出细胞脂质(10分钟，1502×g和10℃)。将上清液置于2ml的管中并储存在-20℃下。
按照下列方法测定A77 1726的血清浓度：
将血清样本升至室温并用涡旋混合器充分混合。将血清吸移(200μl)至Eppendorf管中并加入内标(A77 1726，2μg于400μl乙腈中)。随后将该管在涡旋混合器中混合并在2500rpm下离心10分钟(室温下)。为进行HPLC分析，将上清液(400μl)转移到瓶内，加入水(400μl)且混合。将HPLC条件设定如下：硬件由TSP P2000泵、TSP AS1000自动进样器、TSP SP4270积分仪和TSP UV100 UV检测器组成。检测是在292nm的波长下进行。流动相由650ml甲醇(CHROMASOLV)、2.42g溴化四丁基铵和350ml 0.05ml醋酸铵组成。流速为0.5ml/分钟，试验采用CHROMPACKSpherisorb ODS-210cm柱，并且带有1cm的反相(R2)保护柱。将100μl液体注射至柱内，洗脱时间为7分钟。
HPLC对L-DHO浓度的测定：按照实施例1所述方法进行层析分离。将电导检测器的范围设定在10μS；分析是在室温下进行。流动相由100mMNaOH(A)和水(B)组成。用该体系得到以下梯度：
血清：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   1   99
  2.5   1   99
  14   23   77
  18   60   40
  24   60   40
  26   1   99
  45   1   99
脾细胞
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   1   99
  2.5   1   99
  14   8   92
  22   8   92
  28   60   40
  32   60   40
  34   1   99
  49   1   99
流速为1ml/分钟
在来氟米物口服给药后，健康和患病大鼠的细胞(表13)和血清(表14)L-DHO浓度均升高。这种升高与在这些动物中测出的A77 1726血清浓度相关(表15)。首先，在口服给药后3小时，A77 1726的浓度在佐剂致病大鼠中达到约26μg/ml，在未致病大鼠中达到31μg/ml。这些数值在第二次给药后1小时(7小时)达到高峰，但在试验期间对于患病和未患病大鼠来说该值都降低至7-12μg/ml。患病动物经51小时达到这些浓度，而未患病大鼠在27小时后已经达到(表15)。A77 1726的血清浓度与佐剂致病和未致病大鼠血清中的L-DHO浓度相关。与在试验期间稳定在约5g/ml的L-DHO血清浓度相反，L-OHO在脾细胞中的含量在99小时之后降低至检测限(1.5μg/ml)以下。
表13：从用来氟米物处理的大鼠中取出的脾细胞[50×106细胞]中的L-DHO浓度
  佐剂致病大鼠   未致病大鼠
  时间[小时]   单值   平均值[μg/ml]   SD[μg/ml]   SD[％]   单值   平均值[mg/ml]   SD[μg/ml]   SD[％]
  0(安慰剂)   ＜D.L.＜D.L. ＜D.L.   ＜D.L.＜D.L. ＜D.L.
  3   5.814.60 5.21 0.60 11.52   5.096.31 5.70 0.61 10.70
  7   13.0011.22 12.11 0.89 7.35   16.7714.87 15.82 0.95 6.01
  27   16.2816.84 16.56 0.28 1.69   8.6910.25 9.47 0.78 8.24
  51   3.63   1.84
  3.97   3.80   0.17   4.47   2.34   2.09   0.25   11.96
  75   2.58   1.92
  2.71   2.65   0.06   2.26   2.24   2.08   D.16   7.69
  99   ＜D.L.＜D.L. ＜D.L.   ＜D.L.＜D.L. ＜D.L.
  安慰剂(99)   ＜D.L.＜D.L. ＜D.L.   ＜D.L.＜D.L. ＜D.L.
用来氟米物或安慰剂处理动物，取出脾(n＝3)并按照上述方法合并。将合并的脾细胞一式二份进行分析。DL＝检测限(1.5μg/ml)
表14：来氟米物处理大鼠的血清中的L-DHO浓度
  佐剂致病大鼠   未致病大鼠
  时间[小时]   大鼠   单值   平均值[μg/ml]   SD[μg/ml]   SD[％]   单值   平均值[μg/ml]   SD[μg/ml]   SD[％]
0(安慰剂)   123   ＜D.L.＜D.L.＜D.L. ＜D.L.   ＜D.L.＜D.L.＜D.L. ＜D.L.
3   123   7.859.668.05 8.52 0.99 11.70   11.9210.8810.60 11.13 0.67 6.30
7   123   19.5517.0016.06 17.54 1.81 10.30   20.2918.1417.54 18.66 1.45 7.80
27   123   19.7315.9513.67 16.45 3.06 18.60   8.228.428.64 8.43 0.21 2.50
51   123   3.063.683.06 3.27 0.36 11.00   4.874.774.02 4.55 0.46 10.20
75   123   5.384.455.60 5.14 0.61 11.90   4.604.174.23 4.33 0.23 5.40
99   123   5.484.894.68 5.02 0.41 8.30   5.676.644.95 5.75 0.85 14.80
  安慰剂(99)   123   ＜D.L＜D.L＜D.L ＜D.L.   ＜D.L＜D.L＜D.L D.L
用来氟米物或安慰剂处理动物并且按照上述方法取血，制备和分析。分别测定各动物的L-DHO血清浓度。DL＝检测限(1.5μg/ml)
表15：来氟米物处理大鼠的血清中的A77 1726浓度
  佐剂致病大鼠   未致病大鼠
  时间[小时]   大鼠   单值   平均值[μg/ml]   SD[μg/ml]   SD[％]   单值   平均值[μg/ml]   SD[μg/ml]   SD[％]
0(安慰剂)   123   0.00.00.0 0.0 0.0   0.00.00.0 0.0 0.0
3   123   26.827.225.0 26.33 1.17 4.45   32.030.629.6 30.7 1.21 3.92
7   123   44.145.237.6 42.3 4.11 9.71   47.749.446.5 47.9 1.46 3.04
27   123   21.322.015.9 19.7 3.34 16.92   10.29.98.8 9.6 0.74 7.65
51   123   9.110.28.2 9.2 1.00 10.93   7.88.75.8 7.4 1.48 19.97
75   123   9.07.313.3 9.9 3.09 31.34   6.79.48.2 8.1 1.35 16.70
99   123   12.011.912.6 12.2 0.38 3.11   14.611.412.2 12.7 1.67 13.08
  安慰剂(99)   123   0.00.00.0 0.0 0.0   0.00.00.0 0.0 0.0
用来氟米物或安慰剂处理动物并且按照上述方法取血，制备和分析。分别测定各动物的A77 1726血清浓度。
口服给药的来氟米物在体内很快转化为A77 1726。A77 1726是来氟米物的活性代谢产物(US 5679709)。在来氟米物给药的佐剂致病大鼠或未致病大鼠中，L-DHO在其血清和脾细胞中迅速累积。L-DHO的浓度与A77 1726的血清浓度相关，由此证实该分子在体内能有效抑制DHO-DH。在人体临床研究中，L-DHO的监测是患者中来氟米物免疫调节作用的替代标志。

Claims (8)

1.一种从含有L-二氢乳清酸和干扰材料的溶液中分离溶解的L-二氢乳清酸的方法，包括：
(a)将所述溶液加样到含有可耐压阴离子交换材料的层析柱上，以结合基本上所有的该酸；
(b)用水溶液将大部分所述干扰材料从柱上洗脱下来；和
(c)在从1.1MPa到40MPa的压力下用含有碱的水溶液从所述交换材料上将该酸洗脱下来。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述碱是氢氧化钠。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述耐压阴离子交换材料是大孔二乙烯基苯/乙基乙烯基苯聚合物；与二乙烯基苯交联的微孔聚乙烯基苄基铵聚合物；被链烷醇季铵改性的大孔二乙烯基苯/乙基乙烯基苯聚合物和与二乙烯基苯交联的微孔聚乙烯基苄基铵聚合物的混合物；乙烯基苄基氯/二乙烯基苯大孔聚合物；交联聚乙基亚氨基聚合物；用丙基三甲基铵改性的二氧化硅；或聚(苯乙烯-二乙烯基苯)三甲基铵。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述压力约为4.1MPa-约5.5MPa。
5.如权利要求1所述的方法，其中洗脱溶液中碱的浓度在柱洗脱过程中提高。
6.如上述权利要求1-5任一项所述的方法，其中洗出液中L-二氢乳清酸的存在是通过电导检测器来检测。
7.如权利要求1所述的方法，其中还包括测定二氢乳清酸脱氢酶抑制剂的活性。
8.如权利要求7所述的方法，其中二氢乳清酸脱氢酶抑制剂选自下组：5-甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-4-异唑甲酰胺；6-氟-2-(2′-氟[1，1′-联苯]-4-基)-3-甲基-4-喹啉羧酸；2-氰基-3-羟基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-2-庚-6-烯酰胺；2-氰基-N-(4-氰基苯基)-3-环丙基-3-羟基-2-丙烯酰胺和2-氰基-3-羟基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-2-丁烯酰胺。
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