KR100700906B1 - Ｌ-디하이드로오로틴산의 분리 방법 및 이에 의해 제조된 용출액 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약 1.1 MPa 내지 약 40 MPa의 압력하에 염기-물 혼합물중의 음이온 교환 물질상에서 크로마토그래피하여 L-디하이드로오로틴산을 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 시험관내 및 생체내에서 5-메틸-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-이속사졸카복스아미드, 2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-2-부텐아미드 및 이와 유사한 화합물의 활성을 조사하는데 사용될 수 있다.
L-디하이드로오로틴산, L-디하이드로오로틴산 데하이드로게나제, L-디하이드로오로틴산 데하이드로게나제 억제제, 레플루노미드, 크로마토그래피

Description

Ｌ-디하이드로오로틴산의 분리 방법 및 이에 의해 제조된 용출액{Process for separating L-dihydroorotic acid and an elutate prepared thereby}
본 발명은 약 1.1MPa 내지 약 40MPa의 압력하에 염기-물 혼합물중의 음이온 교환 물질상에서 크로마토그래피하여 L-디하이드로오로틴산(이후부터, "L-DHO"로서 언급됨)을 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 5-메틸-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-이속사졸카복스아미드, 2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-2-부텐아미드 및 이와 유사한 화합물들의 시험관내 및 생체내 활성을 조사하는데 사용될 수 있다.
L-DHO는 실리카 겔 크로마토그래피 방법 이후 화학적 유도체화 및 비색 측정을 사용하여 결정될 수 있다[문헌참조: Kesner, L., Aronson, F.L., Silverman, M., Chan, P.C., Clin. Chem 21/3(1975)353]. 또 다른 방법은 랫트 간으로부터 제조된 L-디하이드로오로틴산 데하이드로게나제(이후부터 "DHODH"로서 언급됨)를 사용하여 L-DHO를 효소적으로 오로틴산으로 전환시키고 화학적으로 유도체화한후, 비색 변화로 오로테이트를 검출하는 것이다[문헌참조: Rogers, L.E., Nicolaisen, K., Experientia 28/10(1972)1259]. 이들 방법의 단점은 복합 생리학적 용액중에서 또 다른 물질이 간섭한다는 것이다. 추가로, 상기 언급된 방법은 샘플 제조가 고역이기 때문에 많은 시간이 소요됨에 따라서 대규모 임상 연구에서 일상적인 분석에 적용될 수 없다.
L-디하이드로오로틴산을 수득하기 위한 분리 방법 및 단리 방법을 개선시키고자 하는 노력에서 약 1.1MPa 내지 약 40MPa의 압력하에 염기-물 혼합물중의 음이온 교환 물질상에서 L-DHO를 크로마토그래피함으로써 상기 목적한 바를 성취할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 당해 방법은 세포 용해물, 포유동물 혈청 및 사람의 혈청중에서 L-DHO를 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다. 당해 방법은 재현성이 높고 민감하며 효력이 있다.
청구항에서 설명된 바와 같이 본 발명의 목적은;
a) 압력에 안정한 음이온 교환 물질을 포함하는 칼럼을 수득하는 단계;
b) L-디하이드로오로틴산을 포함하는 샘플 용액을 칼럼에 로딩하는 단계;
c) 크로마토그래피를 수행하는 단계;
d) 염기-물 혼합물을 함유하는 용출 용액을 사용하여 L-디하이드로오로틴산을 용출시키는 단계를 포함하는, 약 1.1MPa 내지 약 40MPa의 압력하에 수행하는 크로마토그래피 방법에 의해 성취될 수 있다.
"압력에 안정한 음이온 교환 물질"이란 용어는 예를 들어, 거대 다공성(macroporous, 2000Å) 디비닐벤젠/에틸비닐벤젠 중합체 또는 디비닐벤젠과 가교 결합된 미세다공성 폴리비닐벤질암모늄 중합체 또는 알칸올 4급 암모늄으로 개질된, 이들의 혼합물; 또는 비닐벤질클로라이드/디비닐벤젠 거대다공성 중합체; 또는 가교 결합된 폴리에틸이미노중합체; 또는 프로필-트리메틸-암모늄으로 개질된 실리카; 또는 폴리(스티렌-디비닐벤젠)트리메틸암모늄과 같은 물질을 의미한다.
하기 제품이 특히 바람직하다:
-제조회사(Dionex Corporation, Idstein, Germany)에서 공급되는 Ion Pac AS11, CarboPac PA1 또는 CarboPac MA1 음이온 교환 칼럼;
제조회사(Grom)에서 공급되는 GROM-SIL 강 음이온 또는 GROM-SIL 약 음이온;
제조회사(Chrompack)에서 공급되는 P1000SAX, Ionospher SA 또는 Chrompack PA;
제조회사(Hamilton)에서 공급되는 PRP-X100 또는 RCX-10.
용출액은 염기-물 혼합물을 함유한다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화마그네슘 또는 수산화칼슘과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속으로부터 유래된 염기가 적합하다. 염기의 농도는 용매로서 물을 기준으로 1mmol/l 내지 약 200mmol/l, 바람직하게는 2mmol/l 내지 약 120mmol/l, 특히 바람직하게는 100mmol/l이다. 크로마토그래피 과정 동안에 온도는 약 0℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 30℃, 특히 바람직하게는 약 19℃ 내지 약 25℃이다. 크로마토그래피 동안에 작동 압력은 실질적으로 일정하다. 크로마토그래피는 상이한 압력을 사용하여 수행될 수 있는데 예를 들어, 크로마토그래피는 약 1.1 x 106 Pa(1.1 MPa) 내지 약 40 x 106 Pa(40 MPa), 특히 4.1 MPa 내지 5.5MPa의 압력하에 수행될 수 있다. 용출 유속은 약 0.2ml/분 내지 약 3ml/분, 바람직하게는 1ml/분이다.
칼럼의 로딩, 크로마토그래피 및 L-DHO의 용출은 공지된 통상적인 기술적인 방법에 따라 수행한다.
시간에 따라 염기 농도 구배가 바람직하게 선형으로 나타나는 용출이 적합하다. 예를 들어, 용출개시 시점에 용출액내에 낮은 염기 농도(극단적인 경우 0)로 존재하다가 용출과정동안에 염기 농도를 증가시킴으로써 이와 같은 농도구배가 이루어질 수 있다. 상기 방법으로 혈청 또는 세포 용해물으로부터 유래된 샘플내의 L-DHO를 특히 효과적으로 분리할 수 있다. 바람직한 염기 농도 구배는 NaOH 약 1%(100mmol/l) 및 물 약 99%(용출 개시 시점에서) 내지 NaOH 약 60% 및 물 약 40%(용출 종료 시점에서)의 범위로 다양하고 , 특히 바람직하게는 NaOH 약 1% 및 물 약 99%(용출 개시 시점에서) 내지 NaOH 약 25% 및 물 약 75%(용출 종료 시점에서)의 범위이다. 염기-물 농도구배는 2.5분 내지 약 14분 및 14분 내지 약 25분동안 선형으로 변화하고 이때 농도 구배의 기울기는 이들 2개 유형의 시간동안에 상이하다.
분리 과정 개시 시점에서 약 2.5분의 시간동안 약 1%의 낮은 염기 농도를 사용하여 용출시키는 것이 특히 적합하다. 그 결과 칼럼의 생물학적 매트릭스로부터 간섭 물질의 대부분을 용출시키게 된다. 총 14분의 분석 시간내에 염기의 농도 구배를 약 23% 까지 서서히 증가시켜 분석물을 분리시킨다. 이어서 염기 농도를 4분 이내에 약 60%까지 증가시켜 강하게 결합한 물질을 용출시키도록한다. 1% 염기-물 혼합물에 의해 재평형화될때까지 6분 내에 60%의 염기가 사용되어야만한다. 다음 분석은 총 분석 시간 45분후에 시작한다.
염기-물 농도 구배의 물은 탈이온화되고 탈기되어야만 한다.
본 발명에 따른 분리 방법은 칼럼 과정에서 발생한다. 음이온 교환 크로마토그래피동안에 바람직하게 일정하게 유지되는 온도는 광범위한 범위내에서 다양할 수 있다. 바람직한 온도 범위는 약 -10℃ 내지 약 50℃, 특히 약 15℃ 내지 약 25℃이다.
L-DHO는 농도 구배를 개시한지 10분 내지 12분후에 용출된다. 용출 과정의 수행 시간은 13분 내지 25분이다. L-DHO는 전도도 검출기(제조회사(Dionex Corporation)로부터 시판되는 모델 CD20)에 의해 검출된다. 기준선 변화를 최소화하고 배경 전도도를 저하시키기 위해 음이온 자가 재생 억제기[예를 들어, 모델 ASRS-I. 4mm(제조회사: Dionex Corporation)]가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 특히 분석 크로마토그래피를 위해 적합하지만 또한 분취용(preparative) 크로마토그래피, 특히 본 발명에 따른 방법이 제조용 고압 액체 크로마토그래피 칼럼(HPLC) 시스템을 사용하여 수행되는 경우 사용될 수 있다. 용어 "분취용 크로마토그래피"는 단지 분석할 목적이 아닌 순수한 산물을 수득할 목적을 갖는 정제 과정을 의미한다. 순수한 산물의 양은 광범위한 한계범위, 예를 들어, 1mg 내지 1000g, 바람직하게는 50mg 내지 500mg에서 다양할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 디하이드로오로틴산 데하이드로게나제(DHO-DH)의 억제로 인한 세포내 또는 세포외 L-DHO 농도의 변화를 검출하는데 사용될 수 있다. 효소 DHO-DH는 새로운(de novo) 피리미딘 합성동안에 L-디하이드로오로틴산을 오로틴산으로 전환시키는데 관여한다. DHO-DH가 억제되는 경우 L-DHO가 축적된다. 본 발명에 따른 방법은 진단 검정을 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 DHO-DH의 억제제의 활성을 결정하는데 사용될 수 있다. DHO-DH의 억제제는 예를 들어, 5-메틸-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-이속사졸카복스아미드; 6-플루오로-2-(2'-플루오로[1,1'-바이페닐]-4-일)-3-메틸-4-퀴놀린카복실산(일반명: 브레퀴나르); 2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-2-헵텐-6-인아미드; 2-시아노-N-(4-시아노페닐)-3-사이클로프로필-3-하이드록시-2-프로펜아미드; 및 2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-2-부텐아미드이다. 본 발명에 따른 방법은 식물, 세포주, 동물 및 사람내 L-DHO 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. L-DHO의 측정은 식물, 포유동물 및 사람내 DHO-DH 억제제의 활성을 조사하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 하기의 실시예에서 상세하게 기술된다. 또 다른 언급이 없는 경우 % 데이터는 중량을 기준으로 한 것이다.
실시예 1
1.1. 화학물질 및 시약
화학물질 및 시약은 하기에 지적된 바와 같이 구입한다.
카보네이트 부재 NaOH 및 KOH Baker, Holland
L-디하이드로오로틴산(L-DHO) Sigma, Munich
HClO4 Riedel de Haen, Seelze
에오신, 클로로포름 Riedel de Haen, Seelze
RPMI 1640 배지 Gibco., Eggenstein
태송아지 혈청(FCS) Bio Whitaker, Verviers,
Belgium
탈이온수는 사용전에 헬륨에 의해 탈기시켜야한다.
1.2. 크로마토그래피 장치
하기 장치로 구성되는 HPLC 시스템
장치 모델 제조업체
용매 컨디셔닝 모듈 SCM 400 써모 세퍼레이션 프로덕츠(Thermo separation products)(TSP)
이원(binary) 농도구배 펌프 P 2000 TSP
20㎕ 루프를 갖는 오토샘플러 AS 3000 TSP
접속장치 SP 4510 TSP
AD 변환기 SN 4000 TSP
전도도 검출기 CD 20 Dionex
음이온 자가 재생 억제기 ASRS-14 mm Dionex
검출 안정화기 DS 3-1 Dionex
PC EI 20, 플렉스 스캔(Flex Scan), F 563-T Escon
프린터 데스크 제트 550C Escon
소프트웨어 PC 1000 TSP
실험 전반에 걸쳐 피크(peak) 물질을 사용한다.
1.3. HPLC 조건
IonPac AG 11 50 x 4mm I.D. 프레칼럼(precolumn)(입자 크기 13㎛; P/N 044078, 디오넥스)을 장착한 250 x 4 mm I.D. IonPac AS 11 음이온 교환 칼럼(입자 크기 13㎛; P/N 044076, 디오넥스)을 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행한다. 추가로 음이온 포집 칼럼 ATC-1(P/N 037151, 디오넥스)은 농도 구배 펌프와 주입 밸브 사이에 장착한다. 기준선 변화를 최소화하고 배경 전도도를 저하시키기 위해 300mA에서 작동하는 ASRS-I 억제기를 설치한다. 검출기의 범위를 10μS로 설정한다. 오토샘플러는 14℃로 냉각되어 있지만 분석 그 자체는 실온에서 수행한다. 이동상은 100mM NaOH(A) 및 탈이온화 된 탈기수(B)로 구성된다. 상기 시스템을 사용하여 하기 농도 구배가 이루어지도록 한다.
시간(분) A(%) B(%)
0 1 99
2.5 1 99
14 23 77
18 60 40
24 60 40
26 1 99
45 1 99

유속은 1ml/분이고 수행 시간은 45분이다.
1.4. 표준 샘플 및 품질 관리 샘플
1mg L-DHO를 1ml의 물에 용해시켜 표준 스톡 용액을 제조한다. 400㎕의 분취량을 -20℃에서 동결시킨다. 이들 용액의 안정성은 4주 이상 보장된다. 한정된 양의 스톡 용액을 세포 용해물 및 사람 또는 랫트 혈청에 첨가하고 분석하여 시그날의 증가와 스파이크(spike)된 L-DHO 농도간에 직비례 관계를 평가한다. 방법의 정밀도와 정확도는 저농도, 중간농도 및 고농도 범위의 시그날/농도 선형 곡선에서 L-DHO를 함유하는 품질 관리(QC) 샘플을 사용하여 조사한다.
1.5. 샘플 제조
1.5.1. 세포
유르캣 세포를 ATCC(TIB 182)로부터 수득하고 1.5.1.1.에 기술된 바와 같이 배양한다.
1.5.1.1. 조직 배양 조건
유르캣 세포를 RPMI 1640 배지 및 10% 태송아지 혈청(FCS)에 5 x 105/ml로 씨딩하고 24시간동안 배양한다. 세포 용해를 위해 세포를 신선한 배지내에 풀링하고 세포의 양과 사멸 세포의 %를 에오신을 사용한 바이탈(vital) 현미경으로 계산한다. 24시간후에 세포수는, 7% 미만의 사멸 세포를 나타내며 1.6 내지 1.8 배 증가한다. L-DHO 측정을 위해 취해진 유르캣 세포는 24시간동안 1.6 내지 1.8 배의 증식율을 나타냈고 7% 미만으로 세포가 사멸했다.
1.5.1.2 세포 용해물의 제조
세포를 한정된 용적의 배지에 현탁시키고 샘플의 세포 밀도를 에오신을 사용하는 바이탈 현미경을 통해 측정한다. 약 10 x 106 세포를 제거하고 350 x g에서 5분동안 원심분리하여 펠렛화하고 상등액을 버린다. 세포 펠렛을 500㎕의 1.2 M HClO4에 재현탁시켜 세포를 용해시킨다. 상기 혼합물을 2.0ml의 에펜도르프 세이프-록 캡(Ependorf safe-lock cap)으로 옮기고 단백질을 2분동안의 고속 원심분리로 침전시킨다. 상등액을 완전히 제거하고 유리 바이알에 옮기고 500㎕의 클로로포름을 첨가한후에 2분동안 와동시켜 완전히 혼합한다. 10℃에서 10분동안 원심분리(1502g)한다음 세포성 지질을 클로로포름으로 추출한다. 정제된 상등액을 2ml의 에펜도르프-캡에 수거하고 추가로 사용될때까지 -20℃에서 저장한다. HPLC 분석을 위해 100㎕의 상등액을 30㎕의 6M KOH로 중성화한다. 약 5초동안 진탕시킨후에 30분동안 빙상에서 저장한다. 이후에 이들을 15000rpm에서 5분동안 원심분리한다. 청정한 상등액중 20㎕를 HPLC 분석하는데 사용한다.
1.5.2. 혈청
단백질 함량을 감소시키기 위해 200 ㎕의 혈청을 마이크로콘 필터(10 000 D, 모델 10, 코드 42407, 아미콘)에 첨가하고 분당 13 000회 회전(rpm)으로 30분동안 원심분리한다. 통류액(flowthrough)은 약 150㎕이고 분석물 L-DHO를 함유한다. 상기 액체중 20㎕를 HPLC 분석에 사용한다.
1.6. 정량화
적분기를 사용하여 분석물의 피크-높이를 결정한다. 상이한 생물학적 매트릭스내 분석물 농도에 대해 측정된 피크 높이(y)를 플롯팅함으로써 교정 곡선을 작성한다. 가중된(weighted) 선형 회귀(1/y)를 사용하여 품질 관리 샘플 및 표준 샘플내의 L-DHO 농도를 역으로 계산한다. 일반적인 상관 계수 R은 가중 인자(weighting factor)를 사용한 공분산 모델(covariance model)의 분석을 기준으로하는 PROC GLM에 의해 제공된다.
1.7 안정성
표 1은 한 샘플에 대한 2회 및 3회 동결/해동 사이클후에 -20℃에서 세포 용해물 및 혈청 샘플내에서의 안정성 데이터를 보여준다. L-DHO는 4주 이상의 기간 동안 상기 언급된 조건하에서 유르캣 세포내에서 안정하다. 수회의 해동 사이클후에 몇몇 랫트 혈청 샘플 및 사람 혈청 샘플의 농도에 대한 10% 이상의 검출된 증가는 설명될 수 없고 상기 경우에 정확도는 일반적으로 15% 이하 및 최악의 경우에는 29% 이하로 감소될 수 있음을 보여준다. 이들 근거로부터 랫트 및 사람 혈청 샘플에서 L-DHO가 단지 1주 이상동안 확실히 안정하다는 것을 알 수 있다.
-20℃에서 세포용해물 및 혈청의 안정성 데이타(n=1)
시간(일수) 농도 1 20㎍/ml 잔사(%) 농도 2 100㎍/ml 잔사(%)
유르캣 세포
0 19.34 100 100.05 100
7 19.28 99.7 99.09 99.0
14 n.d. n.d. 115.32 115.3
29 19.98 103.3 99.35 99.3
시간(h) 농도 1 5㎍/ml 잔사(%) 농도 2 20㎍/ml 잔사(%)
랫트 혈청
0 4.30 100 19.94 100
7 4.52 105.1 19.62 98.4
14 4.81 111.9 20.93 105.0
21 5.55 129.1 22.38 112.2
사람 혈청
0 4.67 100 20.22 100
8 4.81 103.0 20.38 100.8
65 4.87 104.3 23.20 114.7
잔사(%)는 초기 분석과 비교한 농도의 퍼센테이지이다. n.d.은 측정되지 않았음을 의미한다.

샘플이 실질적인 분석을 위해 오토샘플러에 대기중인 경우 샘플의 조건을 모방하기 위해 14℃에서 18시간동안 안정성을 측정한다. 이러한 이유때문에 세포 용해물을, 검정을 개시하기 전에 스파이크시키고 30㎕의 6M KOH/100㎕ 용해물로 처리한다. 상응하게, 1.5.2.의 문단에서 기술한 바와 같이 혈청 샘플을 스파이크시키고 단백질을 제거한다. 표 2에 나타낸 바와 같이 L-DHO 함량은 이들 조건하에서 세포내에서 최대 약 7%까지 약간 감소한다. 혈청 샘플에서 분석물은 이들 조건하에서 안정하다. 이들 이유때문에 오토샘플러내에서의 최대 체류 시간이 18시간 이하인 많은 HPLC 샘플을 준비한다.
14℃에서 18시간동안의 안정성(n=1)
시간(h) 농도 1 20㎍/ml 잔사(%) 농도 2 100㎍/ml 잔사(%)
유르캣 세포
0 19.96 100 100.02 100
18 18.60 93.2 97.43 97.4
시간(h) 농도 1 5㎍/ml 잔사(%) 농도 2 20㎍/ml 잔사(%)
랫트 혈청
0 4.61 100 19.99 100
18 4.96 107.6 20.53 102.7
사람 혈청
0 3.34 100 18.78 100
18 3.37 100.9 22.09 117.6

1.8. 선택성
50㎍의 L-DHO/ml로 스파이크된 세포 용해물을 사용한 상응하는 크로마토그램과 스파이크되지 않은 유르캣 세포 용해물을 비교하면, L-DHO와 동일한 체류 시간인 11.983분에서 작은 피크가 있음이 나타난다. 상기 피크는 이들 세포내에 천연적으로 함유된 분석물로부터 비롯되었다는 것을 능히 짐작할 수 있다. 추가로 세포 용해물을 KOH로 처리함으로 인해 L-DHO의 피크가 2개의 피크로 나누어진다는 것을 알 수 있다. 그러나, KOH 처리는 HPLC 분석전에 산성 세포 용해물을 중성화시키기 위해 필수적이다. 기술된 조건하에서 2번째 피크 높이(체류 시간(RT)=11.954분)에 대해 평가함으로써 선형성(linearity) 및 재현성의 관점에서 개선된 결과를 수득할 수 있다는 것을 알 수 있다.
또한 사람 및 랫트 혈청의 경우에 L-DHO와 동일한 체류시간을 갖는 블랭크 값이 밝혀졌다. 이러한 사실은 유기체의 천연 L-DHO 함량을 반영하는 것으로 제안된다. 2개의 종에서 10개 이상의 상이한 샘플에 대한 측정시 천연 L-DHO 함량의 검출 한계는 1㎍/ml이하이다.
1.9. 선형성
세포주 및 상이한 혈청 샘플에 대한 5개의 교정 곡선상에서 측정에 대한 선형성을 평가한다. 샘플을 준비하고 1.5 내지 150㎍/ml(세포 용해물) 및 1 내지 30㎍/ml(혈청 샘플)의 범위에 있는 L-DHO 농도를 사용하여 각각 상이한 5일 동안 시험한다. 결과는 표 3 내지 5에 나타낸다. 회귀선을 측정하기 위해 피크 높이를 사용한다. 이를 기준으로 상이한 표준물에 대한 상응하는 농도를 다른 표에서 지적한 바와 같이 역으로 계산한다.
유르캣 세포 용해물에서 L-DHO 측정치에 대한 선형성 (스파이크한 후에 샘플을 30㎕ 6M KOH로 처리하고 이어서 1.3.문단에 기술된 바와 같이 1회 분석한다)
일 농도(㎍/㎖) 기울기 y-절편 r
1.5 6 10 50 100 150
1 1.78 5.54 9.09 49.80 102.46 149.09 1317.54 -258.17 0.9995
2 1.90 5.14 9.54 50.77 100.22 150.20 1324.84 204.79 0.9995
3 1.86 5.24 9.46 51.18 99.91 150.07 1295.48 302.48 0.9996
4 1.85 5.34 9.39 51.45 100.97 148.71 1306.08 833.68 0.9996
5 1.86 5.26 9.53 50.98 100.07 측정되지 않음 1318.67 530.19 0.9993
평균 1.85 5.30 9.40 50.80 100.73 149.52 1312.52 322.59
S.D. 0.04 0.15 0.19 0.63 1.05 0.73 11.69 404.93
C.V. (%) 2.3 2.8 2.0 1.2 1.0 0.5 0.9 125.5
R=0.9995
랫트 혈청내 L-DHO 측정치에 대한 선형성(스파이크한후 1.5.2. 문단에 기술된 바와 같이 혈청으로부터 단백질을 제거한다)
일 농도(㎍/㎖) 기울기 y-절편 r
1 5 10 20 30
1 1.05 4.48 10.10 22.10 28.61 15334 -4719.83 0.9966
2 1.16 4.59 8.60 21.07 30.97 17559 -4630.68 0.9960
3 1.07 4.64 9.81 20.07 30.45 17674 -3175.63 0.9995
4 1.11 4.62 9.54 19.27 31.65 18322 -4296.53 0.9981
5 1.06 4.81 9.99 18.89 31.40 17738 -829.00 0.9985
평균 1.09 4.63 9.61 20.28 30.62 17325.4 0 -3530.33
S.D. 0.05 0.12 0.60 1.32 1.21 1151.65 1630.62
C.V. (%) 4.2 2.6 6.3 6.5 4.0 6.7 46.19
R=0.9959
사람 혈청내 L-DHO 측정치에 대한 선형성(스파이크한후 1.5.2. 문단에 기술된 바와 같이 혈청으로부터 단백질을 제거한다)
일 농도(㎍/㎖) 기울기 y-절편 r
1 5 10 20 30
1 0.90 5.17 11.30 19.41 29.42 13498 2930.30 0.9980
2 0.99 4.87 10.12 21.51 28.68 15663 477.61 0.9982
3 0.94 4.94 11.29 19.41 29.59 14328 1367.80 0.9982
4 1.01 4.77 10.32 20.82 29.15 15777 1771.98 0.9992
5 1.01 4.81 10.10 20.86 29.28 15216 1612.77 0.9993
평균 0.97 4.91 10.62 20.40 29.23 14896.4 1632.09
S.D. 0.05 0.16 0.61 0.95 0.35 967.46 881.47
C.V. (%) 5.2 3.2 5.8 4.6 1.2 6.5 54.01
R=0.9986*표준 농도(㎍/㎖) -측정되지 않음

이들 표에서 알 수 있는 바와 같이 각각의 경우에 선형성이 입증된다. 이것은 각각의 보정 계수 "r"이 모든 경우에 0.99를 초과한다는 것에서 입증된다. 각각 상이한 5일동안 수득된 농도 곡선에 대한 평균 선형 회귀선은 각각의 표에 기술되어 있고 기울기는 최대 6.7%의 변이를 나타내며 재현성이 매우 양호함을 보여준다.
역으로 계산된 표준 농도는 수치의 높은 정확도를 보여주는 6.5% 미만의 평균 C.V.를 나타낸다. 0.99보다 높은 일반적인 상관 값 R은 당해 방법의 매우 높은 정밀도 및 재현성을 나타낸다.
1.10. 정량화의 한계
이들 결과를 기준으로 유르캣 세포내에서의 정량화 한계는 1.5㎍/ml이다. 랫트 및 사람 혈청 샘플에서 1㎍/ml의 L-DHO가 검출될 수 있다. 이들 농도에서 스 파이크된 샘플은 시그날 대 노이즈 비율이 1:3이상을 나타낸다.
1.12. 정확도 및 정밀도
각각 상이한 5일동안의 3개의 상이한 농도에서 L-DHO에 대한 반복적인 측정값의 정확도 및 정밀도는 표 6 내지 표 8에 요약되어 있다. 정확도는 첨가된 L-DHO 양에 대한 실측치의 % 차이로서 표현된다(회수율). C.V.(%)로서 나타내는 하루 이내의 정밀도는 하나의 샘플을 하루에 2회 측정하는 경우 수득된 2개의 값을 사용하여 계산한다. 하루간의 정밀도는 또한 C.V.(%)로서 나타내는데 상이한 5일동안 각각의 대조구 샘플에 대해 평균 실측치를 사용하여 계산한다.
스파이크후에 이어서 30㎕의 6M KOH로 중화시킨후에 유르캣 세포 용해물내의 정확도 및 정밀도(n이 2란 의미는 하나의 세포 용해물 샘플이 상응하는 농도로 스파이크되고 2회 측정된다는 것을 의미한다)
대조구 샘플 (㎍/㎖) 일 n 정확도 정밀도
평균 실측치 회수율 C.V.(%) C.V.(%)
(㎍/㎖) (%) 하루 이내 하루간
20 1 2 20.10 +0.5 1.4 2.9
2 2 19.20 -4.0 1.3
3 2 19.40 -2.8 3.9
4 2 19.51 -2.5 2.2
5 2 18.55 -7.2 1.3
70 1 2 69.12 -1.3 0.1 2.8
2 2 69.13 -1.2 0.8
3 2 73.69 +5.3 0.2
4 2 71.52 +2.2 1.1
5 2 69.64 -0.5 0.9
130 1 2 123.21 -5.2 2.8 6.0
2 2 114.78 -11.7 12.0
3 2 135.21 +4.0 0.2
4 2 126.89 -2.4 1.4
5 2 122.43 -5.8 4.1
스파이크후에 탈단백질화 시킨후에 랫트 혈청내의 정확도 및 정밀도(n이 2란 의미는 하나의 혈청 샘플이 상응하는 농도로 스파이크되고 2회 측정된다는 것을 의미한다)
대조구 샘플 (㎍/㎖) 일 n 정확도 정밀도
평균 실측치 회수율 C.V.(%) C.V.(%)
(㎍/㎖) (%) 하루 이내 하루간
8 1 2 7.68 -4.0 0.4 3.0
2 2 7.73 -3.4 1.0
3 2 7.83 -2.2 2.1
4 2 7.43 -7.1 1.0
5 2 8.06 +0.7 0.6
15 1 2 14.53 -3.1 6.8 1.8
2 2 14.73 -1.8 1.3
3 2 14.26 -5.0 0.1
4 2 14.85 -1.0 0.4
5 2 14.88 -0.8 0.9
25 1 2 24.98 -0.1 2.5 3.7
2 2 25.83 +3.3 1.3
3 2 25.43 +1.7 0.6
4 2 24.31 -2.8 2.0
5 2 26.81 +7.2 0.2
스파이크후에 이어서 탈단백질화 시킨후에 사람 혈청내의 정확도 및 정밀도(n이 2란 의미는 하나의 혈청 샘플이 상응하는 농도로 스파이크되고 2회 측정된다는 것을 의미한다)
대조구 샘플 (㎍/㎖) 일 n 정확도 정밀도
평균 실측치 회수율 C.V.(%) C.V.(%)
(㎍/㎖) (%) 하루 이내 하루간
8 1 2 7.77 -2.9 0.7 3.8
2 2 7.84 -2.0 15.5
3 2 7.43 -7.1 10.9
4 2 7.17 -10.4 2.1
5 2 7.80 -2.5 1.2
15 1 2 13.88 -7.5 0.9 6.0
2 2 14.00 -6.7 8.5
3 2 15.10 +0.6 1.5
4 2 15.13 +0.8 7.2
5 2 16.03 +6.8 12.8
25 1 2 26.56 +6.2 3.4 4.2
2 2 23.77 -4.9 0.7
3 2 24.80 -0.8 4.7
4 2 25.46 +1.8 7.8
5 2 24.54 -1.9 0.2

여기에 제공된 결과는 대부분의 경우에 대조구 값이 최대 +/- 10% 변이가 있어 당해 방법이 매우 정확하다는 것을 보여준다. 단지 한 경우에만 유르캣 세포 측정치에서의 회수율은 상기 값(-11.7%)과는 약간 상이하다. 이것은 하루 이내의 변이가 12%로 높기 때문에 설명될 수 있다. 유르캣 세포, 랫트 또는 사람 혈청에서 하루 이내의 정밀도는 각각 5%, 7% 및 10%보다 낮다. 조사된 모든 매트릭스에서 하루간의 정밀도는 C.V.가 6.0% 미만인 만큼 매우 낮다. 이것은 수득된 결과가 매우 재현성이 있고 정밀하다는 것을 보여준다.
실시예 2
2.1. 조직 배양 조건:
- 무혈청 배지의 제조: 이스코브 분말 배지(Biochrom)를, NaCl 18.95g, NaHCO3 11.43g, KCl 700mg, 35% NaOH 용액 10ml 및 1M 머캅토에탄올 용액(Riedel de Haen)0.5ml이 보충된 10ℓ의 2회 증류된 물에 용해시키고 멸균 여과한다. 제조된 이스코브 배지 1ℓ에 사람 홀로-트랜스페린 32mg, 소 알부민 1g 및 지질 1.5ml(시그마)을 사용전에 첨가한다.
- 세포 배양: A20.2.J 세포를 세포 대수 증식의 확장 배양물내 무혈청 배지(37℃, 5% CO2)에서 배양한다. 분석을 위해 취해진 세포는 24시간에 2.2 배의 증식율을 갖는다. 사멸 세포의 퍼센테이지는 8% 미만(3)이다.
- EP-0 529 500에 기술된 바와 같이 제조된 2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-2-부텐아미드(이후부터: A 77 1726으로 언급됨)를 사용한 세포의 처리: A77 1726을 아쿠아 비데스트(10mM)에 용해시키고 추가로 무혈청 배지에 희석시킨다. 적당한 양의 A77 1726을 세포에 공급하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양한다.
2.2. DHO 측정용 세포-용해물의 제조
준비된 세포를 한정된 용적의 배지 및 세포 밀도로 재현탁시킨다. 예상되는 DHO 함량에 따라 1 x 106 내지 5 x 107개의 세포를 제거하고 펠렛화(5분, 350 x g)하고 상등액을 버린다. 세포에 500㎕의 1.2M HClO4를 첨가하여 세포를 용해시킨다. 용해물을 2ml의 에펜도르프 세이프-락-캡스로 이동시키고 2분동안 고속 원심분리하여 단백질을 침전시킨다. 산성화된 용해물을 완전히 제거하고 유리 바이알에 이동시키고 500㎕의 클로로포름을 첨가한 후에 2분동안의 와동으로 완전히 혼합한다. 10분동안 냉각 원심분리(1502 x g; 10℃)한 후에 세포성 지질을 추출한다. 정제된 상등액을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정할때까지 -20℃에서의 저장을 위해 2ml의 에펜도르프캡에 수거한다.
2.3. DHO의 HPLC 측정
실시예 1에 기술된 바와 같이 크로마토그래피 분리를 수행한다. 전도도 검출기의 범위를 10μS로 설정한다. 실온에서 분석한다. 이동상은 100mM NaOH(A) 및 물(B)로 구성된다. 상기 시스템으로 하기의 농도구배를 생성시킨다.
시간(분) A(%) B(%)
0 1 99
2.5 1 99
14 8 92
22 8 92
28 60 40
32 60 40
34 1 99
49 1 99

유속은 ㎖/분이고 수행 시간은 49분이다.
2.4. 결과
A77 1726과 함께 항온처리된 A20.2.J 세포는 세포내 DHO의 양이 증가한다(표 9 내지 11). 표 9에 나타낸 결과는 DHO-농도가 추출된 세포의 수와 직접적으로 상관됨을 증명한다.
세포내 DHO-농도와 A77 1726과 함께 항온처리된 세포수와의 상관 관계
DHO-농도(㎍/㎖±SD)
세포 (×106) 실험 1(E10B) 실험 2(E14)
1 14.08±2.40 11.75±0.23
2 19.51±6.47 28.27±0.79
4 53.58±3.50 57.20±2.76
6 73.01±1.49 85.38±2.33
8 99.89±5.96 107.02±3.47
10 113.37±4.24 128.73±1.95

A20.2.J 세포를 5μM A77 1726으로 처리하여 24시간동안 배양하고(37℃, 5% CO2) 이어서 DHO 추출물(n=3)을 제조한다.
세포 배양 방법을 최적화하고 세포/A77 1726의 최상 몰비를 측정하기 위해 다양한 밀도의 A20.2.J 세포를 A77 1726(5μM)과 함께 항온처리한다. 상이한 시간에 샘플을 채취하고 DHO-농도를 측정한다(표 10). DHO 농도가 추출된 세포의 양과 직접적으로 관련이 있다는 사실(표 9 참조)로 인해 하기 실험을 위해 DHO-농도를 10 x 106 세포(㎍/ml)에 외삽한다. DHO-농도의 최상의 선형 증가는 1 x 106 세포/ml의 밀도에서 관찰된다. 상기 세포 밀도를 사용하여 A77 1726으로 항온처리된 세포에서 세포내 DHO-농도의 시간 의존적인 증가를 연구한다. DHO의 검출양은 약제 농도와는 무관하게 1시간 항온처리후 측정될 수 있다(표 11). 선형 증가는 6시간후에 측정되는 최대량의 DHO로서 기록한다(표 11). 상기 시간후에 추가로 DHO가 증가하지 않는 포화 상태가 관찰된다.
세포 밀도, 및 세포내 DHO-농도의 시간 의존적 증가
항온 처리 시간(h) 농도 1×106세포/ml DHO(㎍/㎖)평균±SD 2×106세포/ml 3×106세포/ml
1 6.25±0.42 5.47±0.10 5.63±0.19
4 33.06±2.26 26.36±0.42 19.39±1.87
7 60.07±0.01 42.31±1.07 28.79±0.34

다양한 양의 A2O.2.J-세포를 상기 주어진 기간 동안 A77 1726(5μM)과 함께 항온처리하고 각 샘플 시점에서 세포내 DHO-농도를 측정한다(*모든 값은 10×106세포로 외삽한다(n=2))
세포내 L-DHO-농도의 시간 의존적 증가
항온 처리 시간(h) 농도 DHO(㎍/㎖) 평균±SD
A77 1726(5μM) A77 1726(10μM) A77 1726(25μM)
0 2.73±0.10 2.73±0.10 2.73±0.08
1 9.20±0.09 8.5±0.39 15.05±0.26
2 24.03±1.15 20.74±1.43 26.06±0.20
4 59.48±0.72 58.65±2.06 50.21±1.54
7 87.54±1.58 82.65±4.50 114.89±3.61
1 x 106개의 A20.2.J-세포/ml를 다양한 농도의 A77 1726과 함께 항온처리하고 이의 세포내 DHO-농도를 상이한 시간에 측정한다. 데이터는 1 x 107개의 세포로 외삽된 ㎍/ml DHO ± SD로 주어진다(0 내지 4h=n=2, 7h=n=4).
A77 1726과 함께 A20.2.J 종양 세포의 항온처리는 DHO-DH의 억제로 인해 L-DHO가 신속하게 축적된다. 세포내 L-DHO 농도는 세포수와 상관되고 시간 의존성이다. L-DHO 모니터링은 환자내 A77 1726 면역조절 활성에 대한 대용 마커이다.
실시예 3
동물: 체중 160 내지 200g의 수컷 위스타르-루이스 랫트(Mollegaard Breading Center Ltd. Ejby, DK)
애쥬반트 관절염: 0.1ml의 프로인트 보조제(1ml의 중질 백색 파라핀 오일(Merck, Darmstadt) 내에 현탁된 6mg의 미코박테리움 스메그마티스 )를 위스타르-루이스 래트의 꼬리근에 주사하여 질환을 유도한다. 일반적으로 병리학적 증상은 질환 유도후 10 내지 14일 사이에 나타난다.
약제 치료: 약제를 1%의 카복시메틸셀룰로스(COMC)에 현탁시킨다. 건강한 동물(n=18) 및 보조제 질환 유도된 랫트(n=18)(질환 발병 9일)에 경구적으로 5-메틸-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-이속사졸-카복스아미드(이후부터 레플루노미드로서 언급함)를 5일동안 하루에 2회(7:30h 및 13:30h), 예를 들어, 시간 0h, 6h, 24h, 30h, 48h, 54h, 72h, 78h, 96h(표 12 참조)으로 투여한다. 시간 0h에서, 질환 유도된 그룹과 질환 유도되지 않은 그룹으로부터 3마리의 동물을 희생시켜 기준선 농도를 결정한다. 추가로 3마리의 건강하고 3마리의 질환 유도된 동물을 5일동안 위약(COMC 단독)으로 처리한다.
샘플링: 그룹당 3마리의 동물을 각 샘플링시에 희생시킨다. 3h, 7h, 27h, 51h, 75h 및 99h에 혈청 및 비세포를 취한다(표 12 참조). 7h째의 값을 제외하고 최종 약제를 적용시킨지 3시간후에 샘플을 채취한다. 7h 값은 2번째 투여한지 1시간후에 채취한다. 위약 처리된 동물로부터 샘플을 0h(n=3) 및 99h(n=3)에서 채취한다.
Figure 112000011744988-pct00001
샘플의 제조
-심장 천공으로 수거된 혈액을 4℃에서 30분동안 저장함에 이어서 3000rpm에서 10분동안 원심분리한다. 혈청을 분리하고 -20℃에서 에펜도르프 캡내에 저장한다(3). HPLC 분석전에 동결된 혈청을 해동하고 단백질을 제거하기 위해 200㎕의 혈청을 마이크로콘 필터(모델 10, 코드 42407, 아미콘)에 첨가하고 13000 rpm에서 30분동안 원심분리한다.
-비장을 분리하고(n=3) L-DHO 분석을 위해 풀(pool)한다. 티징(teasing)(스테인레스 강 신장기(strainer)에 통과시킴)에 의해 분리된 세포를 0.17M NH4Cl로 처리하여 적혈구를 용해시킨다. 5 x 107개의 비장 세포 프로 그룹의 분취량을 준비하고 원심분리를 위해 캡내에 위치시키고 상등액을 버린다. 세포 펠렛을 계속적으로 혼합하면서 500㎕의 1.2M HClO4 용액을 주입하여 세포를 용해시키고 2분동안 원심분리한다. 산성 세포 용해물을 완전히 유리 바이알로 이동시키고 500㎕의 클로로포름을 첨가하고 2분동안 볼텍스 믹서로 혼합한다. 세포성 지질을 원심분리(1502 x g 및 10℃에서 10분)하여 침전시킨다. 상등액을 2ml의 캡에 위치시키고 -20℃에서 저장한다.
A77 1726 혈청 농도의 측정을 하기와 같이 수행한다:
혈청 샘플을 실온으로 하고 볼텍스 믹서를 사용하여 완전히 혼합한다. 혈청을 에펜도르프 캡에 피펫팅(200㎕)하고 내부 표준물(400㎕의 아세토니트릴중 A 77 1726 2㎍)을 첨가한다. 이어서 튜브를 볼텍스 믹서로 혼합하고 10분동안 2500 rpm(실온)에서 원심분리한다. HPLC 분석을 위해 상등액(400㎕)을 바이알로 이동시키고 물(400㎕)을 첨가하고 혼합한다. HPLC 조건은 하기와 같다: 하드웨어는 TSP P2000 펌프, TSP AS 1000 오토샘플러, TSP SP4270 적분기 및 TSP UV100 UV-검출기로 구성된다. 292 nm 파장에서 검출한다. 이동상은 메탄올 650ml(CHROMASOLV), 테트라부틸암모늄브로마이드 2.42g 및 0.05M 암모늄아세테이트 350ml로 구성된다. 유속은 분당 0.5ml이고 1cm 역상(R2) 가드 칼럼과 함께 CHROMPACK Spherisorb ODS-2 10㎝ 칼럼을 사용한다. 100㎕를 칼럼에 주입하고 수행시간은 7분이다.
L-DHO 농도의 HPLC 측정: 실시예 1에 기술된 바와 같이 크로마토그래피로 분리한다. 전도도 검출기의 범위는 10μS로 설정한다. 분석은 실온에서 수행한다. 이동상은 100mM NaOH(A) 및 물(B)로 구성된다. 상기 시스템으로 하기 구배를 나타낸다:
혈청
시간 (분) A (%) B (%)
0 1 99
2.5 1 99
14 23 77
18 60 40
24 60 40
26 1 99
45 1 99

비세포
시간 (분) A (%) B (%)
0 1 99
2.5 1 99
14 8 92
22 8 92
28 60 40
32 60 40
34 1 99
49 1 99
유속은 1㎖/분이다

건강한 랫트 및 질환 유도된 랫트 모두는 레플루노미드를 경구 투여받은후 세포(표 13) 및 혈청내(표 14)의 L-DHO 농도가 증가한다. 이러한 증가는 이들 동물에서 측정된 A77 1726 혈청 농도(표 15)와 관련되어 있다. 처음에, 경구 약제 투여한지 3시간후에 A77 1726의 농도는 보조제로 질환 유도된 랫트에서는 약 26㎍/ml이고 질환 유도되지 않은 랫트에서는 약 31㎍/ml에 달한다. 이들 값은 2번째 투여(7h)한지 1시간후에 피크로 나타나지만 계속되는 실험동안에 질환 유도된 랫트 및 질환 유도되지 않은 랫트 모두에서 7 내지 12㎍/ml 사이로 저하된다. 질환 유도된 동물에서는 이들 농도에 도달하는데 51시간이 걸리는 반면에 질환 유도되지 않은 랫트에서는 이미 27시간후에 여기에 도달하게 된다(표 15). A77 1726 혈청 농도는 보조제로 질환 유도된 설치류 및 질환 유도되지 않은 설치류 혈청에서 L-DHO 농도와 관련되어 있다. 실험 지속기간 동안 약 5㎍/ml으로 평형화되는 L-DHO-혈청 농도와는 반대로 비세포에서 발견되는 L-DHO의 양은 99시간후에 검출 한계(1.5㎍/ml)이하로 떨어진다.
레플루노미드로 처리된 랫트의 비세포[50 x 106 세포]내 L-DHO 농도
보조제로 질환 유도된 랫트 질환 유도되지 않은 랫트
시간 [h] 단일값 평균 [㎍/㎖] SD [㎍/㎖] SD [%] 단일값 평균 [㎍/㎖] SD [㎍/㎖] SD [%]
0 위약 <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L.
3 5.81 4.60 5.21 0.60 11.52 5.09 6.31 5.70 0.61 10.70
7 13.00 11.22 12.11 0.89 7.35 16.77 14.87 15.82 0.95 6.01
27 16.28 16.84 16.56 0.28 1.69 8.69 10.25 9.47 0.78 8.24
51 3.63 1.84
3.97 3.80 0.17 4.47 2.34 2.09 0.25 11.96
75 2.58 1.92
2.71 2.65 0.06 2.26 2.24 2.08 0.16 7.69
99 <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L.
위약 (99) <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L.
동물을 레플루노미드 또는 위약으로 처리하고 비장을 제거하며(n=3) 기술된 바와 같이 풀링한다. 풀링한 비세포를 2회 검정한다. DL=검출 한계(1.5㎍/ml)
레플루노미드로 처리된 랫트의 혈청내 L-DHO-농도
보조제로 질환 유도된 랫트 질환 유도되지않은 랫트
시간 [h] 랫트 단일값 평균 [㎍/㎖] SD [㎍/㎖] SD [%] 단일값 평균 [㎍/㎖] SD [㎍/㎖] SD [%]
0 (위약) 1 2 3 <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L. <D.L.
3 1 2 3 7.85 9.66 8.05 8.52 0.99 11.70 11.92 10.88 10.60 11.13 0.67 6.30
7 1 2 3 19.55 17.00 16.06 17.54 1.81 10.30 20.29 18.14 17.54 18.66 1.45 7.80
27 1 2 3 19.73 15.95 13.67 16.45 3.06 18.60 8.22 8.42 8.64 8.43 0.21 2.50
51 1 2 3 3.06 3.68 3.06 3.27 0.36 11.00 4.87 4.77 4.02 4.55 0.46 10.20
75 1 2 3 5.38 4.45 5.60 5.14 0.61 11.90 4.60 4.17 4.23 4.33 0.23 5.40
99 1 2 3 5.48 4.89 4.68 5.02 0.41 8.30 5.67 6.64 4.95 5.75 0.85 14.80
위약 (99) 1 2 3 <D.L <D.L <D.L <D.L. <D.L <D.L <D.L D.L
동물을 레플루노미드 또는 위약으로 처리하고 기술된 바와 같이 채혈하고 제조하고 검정한다. L-DHO 혈청 농도를 각각의 동물에 대해 측정한다. DL= 검출 한계(0.5㎍/ml).
레플루노미드로 처리된 랫트의 혈청내 A77 1726 농도
보조제로 질환 유도된 랫트 질환 유도되지 않은 랫트
시간 [h] 랫트 단일값 평균 [㎍/㎖] SD [㎍/㎖] SD [%] 단일값 평균 [㎍/㎖] SD [㎍/㎖] SD [%]
0 (위약) 1 2 3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
3 1 2 3 26.8 27.2 25.0 26.33 1.17 4.45 32.0 30.6 29.6 30.7 1.21 3.92
7 1 2 3 44.1 45.2 37.6 42.3 4.11 9.71 47.7 49.4 46.5 47.9 1.46 3.04
27 1 2 3 21.3 22.0 15.9 19.7 3.34 16.92 10.2 9.9 8.8 9.6 0.74 7.65
51 1 2 3 9.1 10.2 8.2 9.2 1.00 10.93 7.8 8.7 5.8 7.4 1.48 19.97
75 1 2 3 9.0 7.3 13.3 9.9 3.09 31.34 6.7 9.4 8.2 8.1 1.35 16.70
99 1 2 3 12.0 11.9 12.6 12.2 0.38 3.11 14.6 11.4 12.2 12.7 1.67 13.08
위약 (99) 1 2 3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
동물을 레플루노미드 또는 위약으로 처리하고 기술된 바와 같이 채혈하고 제조하고 검정한다. A77 1726 혈청 농도를 각각의 동물에 대해 측정한다.
경구적으로 투여된 레플루노미드는 생체내에서 매우 신속하게 A77 1726으로 전환된다. A77 1726은 레플루노미드의 활성 대사물(US 5,679,709)이다. 보조제로 질환 유도되거나 질환 유도되지 않은 랫트중 하나를 레플루노미드와 함께 항온처리하면 이의 혈청과 비세포내 L-DHO가 신속하게 축적된다. L-DHO 농도는 A77 1726의 혈청 농도와 관련이 있고, 따라서 생체내에서 상기 분자를 통한 DHO-DH의 활성 억제를 입증한다. 사람의 임상적인 연구에서 L-DHO의 모니터링은 환자내 레플루노미드의 면역 조절 활성에 대한 대용 마커일 수 있다.

Claims (10)

  1. a) 세포 용해물 또는 혈청으로부터 수득된 L-디하이드로오로틴산과 간섭 물질을 포함하는 용액을, 압력에 안정한 음이온 교환 물질을 포함하는 크로마토그래피 칼럼에 로딩하여 음이온 교환 물질에 L-디하이드로오로틴산이 실질적으로 모두 결합하도록 하는 단계;
    b) 수용액을 사용하여 대부분의 간섭 물질을 칼럼으로부터 용출시키는 단계; 및
    c) 1.1 MPa 내지 40 MPa의 압력하에, 염기를 포함하는 용출 용액을 사용하여 음이온 교환 물질로부터 L-디하이드로오로틴산을 용출시켜 L-디하이드로오로틴산을 포함하는 용출액을 제공하는 단계를 포함하고, 여기서, 간섭 물질이 세포 용해물 또는 혈청으로부터 유도되는,
    L-디하이드로오로틴산과 간섭 물질을 포함하는 용액으로부터 용해된 L-디하이드로오로틴산을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 염기가 수산화나트륨인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 음이온 교환 물질이 디비닐벤젠/에틸비닐벤젠 중합체; 디비닐벤젠과 가교 결합된 폴리비닐벤질암모늄 중합체; 알칸올 4급 암모늄으로 추가로 개질된, 디비닐벤젠과 가교 결합된 폴리비닐벤질암모늄 중합체와 디비닐벤젠/에틸비닐벤젠 중합체의 혼합물; 비닐벤질클로라이드/디비닐벤젠 중합체; 폴리에틸이미노 중합체; 프로필트리메틸암모늄으로 개질된 실리카; 및 폴리(스티렌디비닐벤젠)트리메틸암모늄으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 압력이 약 4.1 MPa 내지 약 5.5 MPa인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 용출 용액중 염기의 농도를 칼럼의 용출동안 증가시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 용출 용액중의 L-디하이드로오로틴산의 존재를 전도도 검출기를 사용해 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 제조되고, 디하이드로오로틴산 데하이드로게나제 억제제의 활성을 측정하는데 유용한 용출액.
  8. (a) 검정하고자 하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) L-디하이드로오로틴산과 간섭 물질을 포함하는 용액을 샘플로부터 제조하는 단계;
    (c) 제1항 내지 제6항중 어느 한 항의 방법에 따라 용액으로부터 용해된 L-디하이드로오로틴산을 분리하는 단계; 및
    (d) 샘플중 L-디하이드로오로틴산의 양을 근거로 하여 디하이드로오로틴산 데하이드로게나제 억제제의 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 간섭 물질이 세포 용해물 또는 혈청으로부터 유도되는,
    디하이드로오로틴산 데하이드로게나제 억제제의 활성을 모니터하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 억제제가 5-메틸-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-이속사졸카복스아미드; 6-플루오로-2-(2'-플루오로[1,1'-바이페닐]-4-일)-3-메틸-4-퀴놀린카복실산; 2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-2-헵텐-6-인아미드; 2-시아노-N-(4-시아노페닐)-3-사이클로프로필-3-하이드록시-2-프로펜아미드; 및 2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-2-부텐아미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  10. 삭제
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