JP2001526387A - L−ジヒドロオロト酸を得るための方法およびその使用 - Google Patents
L−ジヒドロオロト酸を得るための方法およびその使用Info
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Abstract
Description
“L−DHO”)を得るための方法に関する。この方法は、N−(4−トリフル
オロメチルフェニル)−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキサミド、N
−(4−トリフルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−ヒドロキシクロトン
アミドおよび類似の化合物の試験管内および生体内活性を研究するために使用す
ることができる。
比色測定を行うことによって決定することができる[Kesner、L.、Aronson、F.
L.、Silverman、M.、Chan、P.C.、Clin.Chem 21/3(1975)353]。もう1つの
方法は、L−DHOを、ラットの肝臓から調製したL−ジヒドロオロト酸デヒド
ロゲナーゼ(以下“DHODH”)によって酵素作用でオロト酸に変換し、化学
的誘導体化後に、比色的変化によってオロテート(orotate)を検出する[Roger
s、L.E.、Nicolaisen、K.、Experientia 28/10(1972)1259]。これらの方法 の不利な点は、複雑な生理的溶液中のその他の物質の妨害である。その上、上述
の手順は、面倒な試料調製のため非常に時間がかかり、そのため大規模な臨床研
究における日常分析に対して適応できない。
ための努力の中で、このたび、これを、陰イオン交換物質上、圧力約1.1MP aないし約40MPaでの塩基水混合物中のL−DHOのクロマトグラフィーに
よって達成できることが見出された。この方法は、細胞溶解産物、哺乳類血清お
よびヒト血清中のL−DHOの定量のために使用することができる。上記の方法
は、高度に再現性があり、鋭敏であり、そして有効である。
ニウムで変性させた、マクロポウラス ジビニルベンゼン/エチルビニルベンゼン重合体またはミクロポウラスのジビニ
ルベンゼンで架橋したポリビニルベンジルアンモニウム重合体またはそれらの混
合物類;または塩化ビニルベンジル/ジビニルベンゼンマクロポウラス重合体;
または架橋ポリエチルイミノポリマー;またはプロピル−トリメチル−アンモニ
ウムで変性させたシリカ;またはポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)トリメチ
ルアンモニウムのような物質を意味する。
Idstein)、ドイツ、によって供給されるイオンパック(Ion Pac)AS11、カ
ーボパック(CarboPac)PA1またはカーボパックMA1陰イオン交換カラム、 グロム(Grom)によって供給されるグロム−シル(GROM−SIL)、スト
ロング・アニオン(Strong Anion.)またはグロム−シル(GROM−SIL) 、ウィーク・アニオン(Weak Anion.)、 クロムパック(Chrompack)によって供給されるP 1000 SAX、イオノ スファー(Ionospher)SAまたはクロムパックPA、 ハミルトン(Hamilton)によって供給されるPRP−X100またはRCX−
10。
リウム、水酸化マグネシウムまたは水酸化カルシウムのようなアルカリ金属また
はアルカリ土類金属から誘導される。塩基の濃度は、溶媒としての水に基づいて
、1ミリモル/lないし約200ミリモル/l、好ましくは2ミリモル/lない
し約120ミリモル/l、特に好ましくは100ミリモル/lである。
5℃ないし約30℃、特に好ましくは約19℃ないし約25℃である。クロマト
グラフィー中の操作圧力は、事実上一定である。クロマトグラフィーは、異なる
圧力を使用して実施することができ、例えばクロマトグラフィーは、約1.1 1
06Pa(1.1MPa)ないし約40 106Pa(40MPa)、特に4.1M Paないし5.5MPaの圧力下で実施することができる。溶離剤の流量は、約 0.2ml/分ないし約3ml/分、好ましくは1ml/分である。 カラムの装填、クロマトグラフィー、およびL−DHOの溶離は、公知の一般
的な技法によって行う。
ものである。この濃度勾配は、例えば、この溶離の最初の溶離には低塩基濃度(
極限の場合にはゼロ)が存在することによって、そして溶離プロセス中塩基濃度
を増大させることによって適用することができる。このようにして、血清または
細胞溶解産物由来の試料中のL−DHOの特に有効な分離を達成することが可能
である。好ましい塩基勾配は、ほぼ1%NaOH(100ミリモル/L)および
99%水(溶離の最初)から約60%NaOHおよび40%水(溶離の終わり)
まで変化し、特に好ましい範囲は、約1%NaOHおよび99%水(溶離の最初
)から約15%NaOHおよび75%水(溶離の終わり)までである。塩基水勾
配は、2.5分から約14分までそして14分から約25分まで、直線状に変化 させられ、ここでこの勾配の傾斜は、これらの2期間中で異なっている。
.5分の間使用することによって達成することができる。その結果、このカラム の生物学的マトリックスからの妨害物質のほとんどが溶離される。分析物の分離
は、14分の全分析時間内に勾配を約23%の塩基までゆっくり増大させること
によって達成することができる。次に、塩基濃度を4分内に約60%まで増大さ
せて、強く結合している物質を溶離する。60%の塩基は、再平衡化が1%塩基
水混合物によって行われるまで、6分以内の間適用されなくてはならない。次の
分析は、全分析時間45分の後に開始される。
クロマトグラフィー中一定に保たれる)は、広い範囲内で変えることができる。
好ましい温度範囲は、約−10℃から約50℃まで、特に約15℃から約25℃
までである。
セスの操作時間は、13分から25分までである。L−DHOは、ダイオネクス
・コオペレーション(Dionex Cooperation)からの型CD20のような導電率検
出器によって検出される。基準線シフトを最小にし、バックグラウンド導電率を
低下させるために、ダイオネクス・コオペレーションからの型ASRS−1、4
mmのような陰イオン自己再生抑制器を使用することができる。
、特に本発明に従う方法を分取高速液体クロマトグラフィーカラム(HPLC)
システムを用いて実施するときは、分取クロマトグラフィーについて使用するこ
ともできる。“分取クロマトグラフィー”という用語は、純粋な生成物を、得る
ことを目的とし、単に分析するだけではない精製法を意味する。純粋な生成物の
量は、広い範囲内で、例えば1mgから1000gまで、好ましくは50mgと50
0mgとの間で、変動することができる。
阻害による細胞内または細胞外L−DHO濃度の変化を検出するために使用する
ことができる。酵素DHO−DHは、初めからのピリミジン合成中のL−ジヒド
ロオロト酸のオロト酸への変換の原因となるものである。DHO−DHの阻害に
よりL−DHOの蓄積が起こる。本発明に従う方法は、診断用検定の調製物のた
めに使用することができる。本発明に従う方法は、DHO−DH阻害剤の活性を
決定するために使用することができる。DHO−DH阻害剤は、例えばN−4−
(トリフルオロメチルフェニル)−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキ
シルアミド、ブレキナール(Brequinar)、N−(4−トリ−フルオロメチルフ ェニル)−2−シアノ−3−ヒドロキシヘプタ−2−エン−6−イン−カルボキ
サミド、2−シアノ−3−シクロプロピル−3−ヒドロキシアクリル酸−(4−
シアノフェニル)−アミドまたはN−(4−トリフルオロメチルフェニル)−2
−シアノ−3−ヒドロキシクロトンアミドである。本発明に従う方法は、植物、
細胞系、動物およびヒトにおけるL−DHO濃度を決定するために使用すること
ができる。L−DHO決定は、植物、哺乳類およびヒトにおけるDHO−DH阻
害剤の活性を監視するために使用することができる。 本発明に従う方法を、以下の実施例において詳細に説明する。他に指示しない
かぎり、百分率データは、重量に関連する。
.D.プレカラム[粒径13μm;P/N 044078、ダイオネクス]を装備し
た250×4mm I.D.イオンパックAS11陰イオン交換カラム[粒径13μm
;P/N 044076、ダイオネクス]を用いて実施した。さらに、陰イオン トラップカラムATC−1[P/N 037151、ダイオネクス]を勾配ポン プと注入バルブとの間に取り付けた。基準線シフトを最小にし、バックグラウン
ド導電率を低下させるために、300mAで作動するASRS−1抑制器を取り
付けた。検出器の領域は、10μSにセットした。オートサンプラーを14℃に
冷却したが、分析自体は、室温で実施した。移動相は、100mM NaOH( A)および脱イオンおよび脱気水(B)から成っていた。この系を使用すると下
記の勾配を得た: 時間(分) A(%) B(%) 0 1 99 2.5 1 99 14 23 77 18 60 40 24 60 40 26 1 99 45 1 99 流量は、1ml/分であり;操作時間は、45分であった。
。400μlずつのアリコートを−20℃で凍結させた。これらの溶液の安定性 は、少なくとも4週間保証された。この原液の所定量を、細胞溶解産物およびヒ
トまたはラット血清に加えて、シグナルの増大とスパイクしたL−DHO濃度と
の間の直線性を評価するために検定した。この方法の精密度および正確度は、シ
グナル/濃度直線性曲線の低、中および高濃度領域のL−DHO含量をもつ品質
管理(QC)試料を使用することによって調査した。
で説明するように培養した。
10%ウシ胎仔血清(FCS)中で24時間成長させた。細胞を細胞溶解産物用
の新しい培地中にプールして、細胞の量および死亡細胞の百分率をエオシンを用
いる生体顕微鏡検査法によって計算した。24時間後に細胞数は、1.6〜1.8
倍に増加し、死亡細胞は7%よりも少なかった。L−DHO決定用に採取したジ
ャーカット細胞は、24時間で増殖率1.6〜1.8倍および7%よりも少ない死
亡細胞を有していた。
する生体顕微鏡検査法によって決定した。約10×106の細胞を取り出して、 350×gで5分の遠心分離によってペレット化し、上澄みを捨てた。この細胞
ペレットを500μlの1.2M HCLO4中に再懸濁させることによって細胞の
溶解を行った。この混合物を2.0mlエッペンドルフ(Eppendorf)セーフ−ロッ
クキャップ(safe-lock caps)中に移し、タンパク質を2分の高速遠心分離によ
って沈殿させた。上澄みを完全に取り出して、ガラスバイアル中に移し、500
μlのクロロホルムを添加した後、2分間渦動させる(vortexing)ことによって
完全に混合した。10℃で10分間遠心分離(1502g)した後、細胞脂質を
クロロホルムによって抽出した。精製した上澄みを2mlエッペンドルフ−キャッ
プ中に集めて、次に使用するまで−20℃で貯蔵した。HPLC分析用には、1
00μlのこの上澄みを30μlの6M KOHで中和した。約5秒間震盪させた 後、この試料を氷上で30分間貯蔵した。その後これらを15000rpmで5
分間遠心分離した。透明な上澄みから20μlをHPLC分析のために使用した 。
)フィルター[10000D、型10、コード42407、アミコン(Amicon)
]に加えて、13000回転毎分(rpm)で30分間遠心分離した。貫流物(
flow through)は、約150μlより成り、分析物L−DHOを含有する。この 液体から20μlをHPLC分析のために使用した。
トリックスにおける測定されたピーク高さ(y)対分析物濃度をプロットするこ
とによって得た。重みつき線形回帰(1/y)は、標準試料ならびに品質対照に
おけるL−DHO濃度を逆算するために使用した。共通相関係数(common corre
lation coefficient)Rは、重みづけ因子を使用する共分散モデルの分析に基づ
くPROC GLMによってもたらされた。
び血清試料中での−20℃での分析物の安定性データを示す。L−DHOは、ジ
ャーカット細胞中での上記の条件下で、少なくとも4週間にわたって安定であっ
た。数回の融解サイクル後に検出された、いくつかのラット血清試料および1つ
のヒト血清試料の濃度の10%より多い増大は、説明できず、そしてそのような
場合における正確度は、一般には15%まで、そして最悪では29%まで低下さ
せ得ることを示す。これらの理由で、ラットおよびヒトの血清試料ではL−DH
Oは、少なくとも1週間だけは明確に安定であることだけは述べることができる
。
するために、14℃で18時間の間の安定性を測定した。そのため、細胞溶解産
物は、スパイクした後、分析の開始前に30μlの6M KOH/100μl溶解 産物で処理した。相応して、血清試料は、スパイクした後、1.5.2.に記載し たように除タンパクした。
細胞においては最大約7%までわずかに減少する。血清試料においては、分析物
は、これらの条件下で安定である。これらの理由だけのために、非常に多くのH
PLC試料が調製されて、オートサンプラー中の滞在の最大長さは、18時間未
満であった。
スパイクした細胞溶解産物を使用した相当するクロマトグラムと比較すると、L
−DHOと同一の保持時間である11.983分に小さなピークがあることを示 した。このピークがこれらの細胞中の分析物の自然含量の結果であることは、非
常に可能性がある。さらに、細胞溶解産物をKOHで処理したためにL−DHO
ピークが2つのピークに分裂することは、考えることができる。しかしながらK
OH処理は、HPLC分析前に酸性細胞溶解産物を中和するために必須である。
上記した条件下では、2番目のピーク高さ[保持時間(RT)=11.954分]
の評価は、直線性および再現性に関して改良された結果を得るために使用できる
ことが示された。
試験値が見出された。これは、その有機体の自然L−DHO含量を反映している
ことが考えられる。両方の種の少なくとも10の異なる試料の測定は、自然L−
DHO含量が検出限度1μg/mlよりも低かったことを示している。
正曲線に関して評価した。試料は、調製して、別々の5日に1.5〜150μg/
ml(細胞溶解産物)および1〜30μg/ml(血清試料)の範囲のL−DHO濃 度を使用して操作した。結果を表3〜5に示す。回帰線の決定のためにはピーク
高さを使用した。それを基にして相当する異なる標準の濃度を、別の表に示すよ
うに逆算した。
れは、個々の相関係数“r”に反映されており、この値は、すべての場合に>0
.99である。別々の5日に得た濃度曲線に対する平均線形回帰線は、各表に記 載され、勾配が最大変動6.7%で十分に再現性があったことを示している。
を検出することができる。これらの濃度でスパイクした試料は、シグナル対ノイ
ズ比、少なくとも1:3を示した。
度を、表6〜8に要約する。 正確度は、加えたL−DHO量に対する測定されたL−DHO量の%差異(回
収率)として表す。C.V.(%)として表された日内精密度は、1つの試料を1
日に2回測定したときに得られた2つの値を使用して計算した。日間精密度もま
た、C.V.(%)として表し、別々の5日の各対照試料の平均測定値を使用して
計算した。
変動で測定されたこと、およびそのためこの方法は非常に正確であることを示し
ている。1つの場合にだけジャーカット細胞測定における回収率がこの値とは少
し異なっていた(−11.7%)。この効果は、12%という高い日内変動によ って説明することができる。ジャーカット細胞、ラットまたはヒト血清における
日内精密度は、各々5%、7%および10%よりも低かった。研究したすべての
マトリックスにおける日間精密度は、非常に低く、6.0%よりも小さいC.V. を有していた。これは、得られた結果が非常に再現性があり、精密であることを
示す。
KCl、10ml 35%NaOH溶液、および0.5ml 1Mメルカプトエタノー
ル溶液[リーデル・ド・ハーン]で補充した10リットルの2度蒸留した水に溶
解させ、無菌濾過した。1リットルの調製したイスコブ(Iscove)培地に、使用
前に、32mgヒトホロ−トランスフェリン、1gウシアルブミンおよび1.5ml 脂質[シグマ]を加えた。
はこの後A771726)での細胞の処理。A771726を2回蒸留水(aqua
bidest)(10mM)に溶解させ、血清を含まない培地中でさらに希釈した。次
に細胞に適当な量のA771726を与えて、37℃、5%CO2でインキュベ ートした。
れたDHO含量に依って、100〜5000万個の間の細胞を取り出して、ペレ
ット化し(5分、350×g)、そして上澄みを捨てた。500μlの1.2M
HClO4を加えることによって細胞を溶解させた。溶解産物を2mlのエッペン ドルフセーフ−ロック−キャップ内に移して、タンパク質を2分間の高速遠心分
離によって沈殿させた。酸性化した溶解産物を完全に取り出して、ガラスバイア
ル内に移し、500μlのクロロホルムを添加した後に、2分間渦動させること によって完全に混合した。10分間の冷遠心分離(1502×g;10℃)に続
いて細胞脂質を抽出した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)測定まで−
20℃で貯蔵するために、精製した上澄みを2mlのエッペンドルフキャップ内に
集めた。
器の領域は、10μSにセットした。分析は、室温で実施した。移動相は、10
0mM NaOH(A)および水(B)から成っていた。この系を使用して下記 の勾配を得た: 時間(分) A(%) B(%) 0 1 99 2.5 1 99 14 8 92 22 8 92 28 60 40 32 60 40 34 1 99 49 1 99 流量は、1ml/分であり;操作時間は、49分であった。
胞内DHO量を有した(表9〜11)。表9に示される結果は、DHO−水準は
、抽出された細胞の数と直接相関したことを証明する。
℃、5%CO2)してから、DHO抽出のために調製した(n=3)。
ために、変化する密度のA20.2.J細胞をA771726(5μM)とともに インキュベートした。試料を異なる時点で回収して、DHO−濃度を測定した(
表10)。DHO−濃度が抽出された細胞の量と直接相関した(表9参照)とい
う事実のため、後の実験のためにDHO−濃度をμg/mlで10×106細胞まで
補外した。DHO−水準の最良の直線状の増加は、密度1×106細胞/mlで見 出された。この細胞密度を使用して、A771726とともにインキュベートし
た細胞における細胞内DHO−水準の時間依存増加を研究した。検出できるDH
O量は、薬剤濃度に関係無く、インキュベーションの1時間後に測定することが
できた(表11)。直線状増加は、6時間後に測定されたDHOの最大量で記録
された(表11)。この期間の後、それ以上のDHOの増加はなく、飽和が観察
された。
とともにインキュベートして、その細胞内DHO−濃度を各試料点で測定した。
(*すべての値を10×106細胞まで補外した)(n=2)。
にインキュベートして、異なる時点でそれらの細胞内DHO−濃度を測定した。
データは、1000万細胞まで補外したμg/ml DHO±SDとして示した( 0〜4時間=n=2、7時間=n=4)。
DHO−DH阻害によるL−DHOの迅速な蓄積が起こった。細胞内L−DHO
−濃度は、細胞数と相関し、そして時間依存性であった。L−DHOの監視は、
患者におけるA771726免疫調節活性に対する代理マーカーである。
ット[モールガード・ブリーディング・センター社(Mollegaard Breading Cent
er Ltd.)、エイビー(Ejby)、DK]。
0.1mlのフロイントアジュバント(1mlの重、白色パラフィン油中に懸濁させ た6mgのスメグマ菌)[メルク(Merck)、ダームシュタット]を注射すること によって誘発された。病理学的症状は、一般に、疾患誘発後10ないし14日で
現れる。
た。健康な動物(n=18)およびアジュバント罹患(n=18)ラット(病気
の9日目)に、5日間1日に2回(7:30時および13:30時)、すなわち
時点:0時間、6時間、24時間、30時間、48時間、54時間、72時間、
78時間、96時間で、10mg/kgのN−4−(トリフルオロメチルフェニル)
−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキサミド、本明細書中で以後レフル
ノミド(leflunomide)を経口的に与えた。(表12参照)。0時間の時点で、 罹患グループと罹患していないグループとの両方からの3匹の動物を犠牲にして
、基準線水準を測定した。追加の3匹の健康な動物および3匹の罹患動物を5日
間偽薬(COMC単独)で処理した。
た。血清および脾細胞を3時間、7時間、27時間、51時間、75時間、およ
び99時間で採取した(表12参照)。7時間の値を除いて、試料は、最終の薬
剤適用の3時間後に採取した。7時間の値は、2番目の投与の1時間後に採取し
た。偽薬で処理した動物からの試料は、0時間(n=3)および99時間(n=
3)の時点で採取した。
20℃で貯蔵した(3)。HPLC分析の前に、凍結した血清を融解させ、タン
パク質を除去するために、200μlの血清をマイクロコンフィルター[型10 、コード42407、アミコン]に加え、13000rpmで30分間遠心分離
した。
(ステンレス鋼ストレーナを通過させること)によって分離した細胞を0.17 MのNH4Clで処理して赤血球を溶解させた。5000万の脾臓細胞プログル ープ(pro group)のアリコートを製造して、遠心分離用のキャップ内に入れ、 上澄みを捨てた。細胞ペレットに、不変混合下で、500μlの1.2M HCl O4溶液を加えて細胞を溶解させ、2分間遠心分離した。酸性細胞溶解産物を完 全にガラスバイアルに移し、500μlのクロロホルムを加えて、渦動(Vortex)
ミキサーで2分間混合した。細胞脂質を遠心分離(10分、1502×gおよび
10℃)によって沈殿させた。上澄みを2mlのキャップに入れて、−20℃で貯
蔵した。
ピペット(200μl)でエッペンドルフキャップ内に移し、内標準(A771 726、400μlのアセトニトリル中2μg)を加えた。次にこれらのチュー ブを渦動ミキサー中で混合し、10分間2500rpm(室温)で遠心分離した
。HPLC分析用に、上澄み(400μl)をバイアルに移し、水(400μl)
を加えて、混合した。HPLC条件は以下のとおりであった:ハードウェアは、
TSP P2000ポンプ、TSP AS1000オートサンプラー、TSP S P4270積分器、およびTSP UV100 UV−検出器より成っていた。検
出は、292nm波長で行った。移動相は、650mlメタノール[クロマソルブ
(CHROMASOLV)]、2,42g臭化テトラブチルアンモニウム、および350ml
0.05M酢酸アンモニウムより成っていた。流量は、0.5ml/分であった。1
cmの逆相(R2)ガードカラムを伴うクロンパック・スフェリソルブ(CHROMPAC
K Spherisorb)ODS−2 10cmカラムを使用した。100μlをカラム内に注
入し、操作時間は、7分間であった。
載したように実施した。導電率検出器の領域は、10μSにセットし;分析は、
室温で実施した。移動相は、100mM NaOH(A)および水(B)より成 っていた。この系を使用して下記の勾配を得た: 血 清 時間(分) A(%) B(%) 0 1 99 2.5 1 99 14 23 77 18 60 40 24 60 40 26 1 99 45 1 99
、増加した細胞(表13)および血清(表14)L−DHO濃度を有していた。
この増加は、これらの動物において測定したA771727血清濃度と相関して
いた(表15)。最初に、経口薬剤投与の3時間後に、A771726は、アジ
ュバント罹患ラットでは濃度約26μg/ml、そして罹患していないラットでは 31μg/mlに達した。これらの値は、2回目の投薬の1時間後(7時間)にピ ークに達したが、罹患ラットおよび罹患していないラットの両方においてこの実
験の間7ないし12μg/mlの間の値まで下がった。罹患動物は、これらの濃度 に達するのに51時間かかり、一方罹患していないラットは、27時間後にすで
にそれに達していた(表15)。A771726血清濃度は、アジュバント罹患
齧歯動物および罹患していない齧歯動物の血清中のL−DHO−濃度と相関して
いた。実験の間約5μg/mlに平衡していたL−DHO−血清濃度に反して、脾 細胞中に見出されたL−DHOの量は、99時間後に検出限度(1.5μg/ml)
未満に下がった。
n=3)、プールした。プールした脾細胞を二重反復して検定した。DL=検出
限度(1.5μg/ml);
調製し、そして検定した。L−DHO血清濃度は各動物について各々測定した。
DL=検出限度(1.5μg/ml);
調製し、そして検定した。A771726血清濃度は各動物について各々測定し
た;
れる。A771726は、レフルノミドの活性な代謝産物である[米国特許第5
,679,709号]。アジュバント罹患または罹患していないラットのいずれか
をレフルノミドとともにインキュベートすると、それらの血清および脾細胞内に
L−DHOの迅速な蓄積が起こった。L−DHO濃度は、A771726の血液
血清濃度と相関していて、この結果生体内でのこの分子によるDHO−DHの活
発な抑制を証明した。ヒトの臨床研究においては、L−DHO監視は、患者にお
けるレフルノミドの免疫調節活性に対する代理マーカーであることができる。
Claims (10)
- 【請求項1】 次の工程: a) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し; b) 上記カラムにL−ジヒドロオロト酸を含む試料溶液を装填し; c) クロマトグラフィーを実施し; d) L−ジヒドロオロト酸を、塩基水混合物を含有する溶離液で溶離すること; より成り、この方法を約1.1MPaないし約40MPaの圧力下で実施するク ロマトグラフィーによるL−ジヒドロオロト酸を得るための方法。
- 【請求項2】 塩基が水酸化ナトリウムである、請求項1に記載の方法。
- 【請求項3】 圧力安定性陰イオン交換物質がアルカノール第四級アンモニ
ウムで変性させた、ジビニルベンゼン/エチルビニルベンゼン重合体、またはジ
ビニルベンゼンで架橋したポリビニルベンジルアンモニウム重合体、またはその
混合物である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 圧力が約4.1MPaないし約5.5MPaである、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項5】 塩基水混合物の溶離が、好ましくは直線状の、塩基濃度の時
間勾配を示す、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 L−ジヒドロオロト酸を導電率検出器によって検出する、請
求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項7】 診断用検定の調製物のための、請求項1ないし6のいずれか
1項に記載の方法の使用。 - 【請求項8】 ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤の測定のための請
求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法の使用。 - 【請求項9】 ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤がN−4(トリフ
ルオロメチルフェニル)−5−メチルイソオキサゾール−4−カルボキサミド、
ブレキナール、N−(4−トリ−フルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−
ヒドロキシヘプタ−2−エン−6−イン−カルボキサミド、2−シアノ−3−シ
クロプロピル−3−ヒドロキシアクリル酸−(4−シアノフェニル)−アミドお
よび/またはN−(4−トリフルオロメチルフェニル)−2−シアノ−3−ヒド
ロキシクロトンアミドである、請求項8に記載の使用。 - 【請求項10】 ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤の活性の監視の
ためのL−ジヒドロオロト酸測定の使用。
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