CZ280203B6

CZ280203B6 - Deriváty vitaminu D s homology bočního řetězce a způsob jejich výroby

Info

Publication number: CZ280203B6
Application number: CS91281A
Authority: CZ
Inventors: Günter Dr. NEEF; Gerald Dr. Kirsch; Andreas Dr. Steinmeyer; Katica Schwarz; Matthias Dr. Brautigam; Ruth Dr. Thieroff-Ekerdt; Petra Rach
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-02-06
Filing date: 1991-02-06
Publication date: 1995-11-15
Also published as: JPH05501718A; FI100598B; IL97158A; IE70239B1; DK0441467T3; HU913475D0; PT96679B; NO913913L; WO1991012238A1; NO300209B1; CS28191A3; AU652739B2; CN1054588A; IE910389A1; ATE106391T1; PT96679A; EP0441467A1; HUT59665A; FI914677A0; IL97158A0

Abstract

Jsou popsány deriváty vitaminu D s homologickými bočními řetězci, obecného vzorce I, ve kterém R.sup.1.n., R.sup.2.n., R.sup.3.n., R.sup.4.n., R.sup.5 .n.a R.sup.6 .n.mají význam uvedený v popisu, B a D buď každý znamenají atom vodíku nebo dohromady představují dvojnou vazbu (E-konfigurace dvojné vazby) a A znamená přímou vazbu mezi atomy uhlíku 20 a 22 a X představuje alkylenoxyskupinu vzorce -(CH.sub.2.n.).sub.n.n.O-, kde n značí 1 až 3, nebo A znamená methylenový můstek vzorce -CH.sub.2.n.- mezi atomy uhlíku 20 a 22 a X představuje alkylenový zbytek vzorce -(CH.sub.2.n.).sub.n.n.- nebo alkylenoxyskupinu vzorce -(CH.sub.2.n.).sub.n.n.O-, kde n značí vždy 1 až 3, jakož i způsob jejich výroby, farmaceutické prostředky, které tyto sloučeniny obsahují, stejně jako jejich použití pro výrobu léčiv. Nové sloučeniny mají účinek potlačující proliferaci a účinek zabraňující diferenciaci buněk.ŕ

Description

Deriváty vitaminu D s homologickými bočními řetězci, způsob jejich výroby, farmaceutické prostředky tyto látky obsahující a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká nových derivátů vitaminu D s homologickými postranními řetězci, způsobu jejich výroby, farmaceutických prostředků tyto látky obsahujících a jejich použití pro výrobu léčiv.

Dosavadní stav techniky

V přírodě se vyskytující vitaminy D₂ a D₃ (viz obecný vzorec V) jsou jako takové inaktivní a teprve po hydrolýze v poloze 25 v játrech nebo po hydrolýze v poloze 1 v ledvinách se mění na své biologicky aktivní metabolity. Účinek vitaminů D₂ a D₃ spočívá ve stabilizaci hladiny Ca⁺⁺ a hladiny fosfátu v plazmě a působí proti poklesu hladiny Ca⁺⁺ v plazmě.

Je možné vyjádřit pomocí obecného vzorce V

ergokalciferol: R^a = R^b = H, R^c = CH₃, vitamin D₂dvojná vazba C-22/23, cholekalceferol: R^a = R^b = R^c = H, vitamin D₃

25-hydroxycholekalciferol:

R^a = r^c = h, R^b = OH,

Ια-hydroxycholekalciferol:

R^a = OH, R^b = R^c = H,

1α,25-dihydroxycholekalciferol:

R^a = R^b = OH, R^c = H, kalcitriol.

-1CZ 280203 B6

Vedle svého význačného účinku na látkovou výměnu vápníku a fosfátů mají také vitaminy D₂ a D₃ a jejich syntetické deriváty účinky zabraňující proliferaci a diferenciaci buněk (H. F. De Luca, The Metabolism and Function of Vitamin D in Biochemistry of Steroid Hormones, vydavatel H. L. J. Makin, 2. vyd., Blackwell Scientific Publications 1984, str. 71 až 116). Při použití vitaminu D však také může docházet k úkazům předávkováni (hyperkalcinemie).

Ια-Cholekalciferoly hydroxylované v poloze 24 jsou již známé z německého spisu DE-AS 25 26 981. Tyto sloučeniny mají nižší toxicitu než odpovídající nehydroxylovaný Ια-cholekalciferol. Hydroxylované sloučeniny mají selektivní aktivaci účinku způsobujícího intestinální absorbci vápníku a slabší absorbční účinek v kostech než Ια-cholekarciferol.

Analogy 24-hydroxylovaného vitaminu D, které jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce WO 87/00834 mohou sloužit k ošetřování abnormální proliferace buněk a/nebo poruch vyvolaných diferenciací buněk u lidí i zvířat.

De Luca se již krátce zmiňuje o různých 1,25-dihydroxy-homo-vitaminech D a disociaci s ohledem na absorbční účinek v kostech a HL-60 diferenciaci buněk. Absorbční účinek in vitro je přitom přímým měřítkem mobilizace vápníku in vivo.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká derivátů bočními řetězci, obecného vzorce I vitaminu D s homologickými

ve kterém

R¹ znamená atom vodíku, hydroxyskupinu nebo acyloxyskupinu s 1 až 9 atomy uhlíku,

R² znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu s 1 až 9 atomy uhlíku,

-2CZ 280203 B6

R³ nebo R⁴ znamená hydroxyskupinu nebo acyloxyskupinu s 1 až 9 atomy uhlíku a vždy druhý z těchto substituentů znamená atom vodíku nebo

R³ a R⁴ představují dohromady atom kyslíku,

R⁵ a R⁶ znamenají nezávisle na sobě přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu až se 4 atomy uhlíku nebo trifluormethylovou skupinu nebo znamenají dohromady nasycený, nenasycený nebo aromatický karbocyklický kruh, vytvořený s terciárním atomem uhlíku, nebo znamenají s připojeným jedním atomem nebo dvěma atomy dusíku, kyslíku nebo síry heterocyklický 3-, 4-, 5nebo 6-členný kruh,

B a D znamenají vždy buď atom vodíku, nebo tvoří dohromady dvojnou vazbu, která má konfiguraci E a buď

A představuje přímou vazbu mezi atomy uhlíku 20 a 22 a

X znamená alkylenoxyskupinu vzorce -(CH₂)_nO-, kde n představuje číslo 1 až 3, nebo

A znamená methylenový můstek vzorce -CH₂- mezi atomy uhlíku 20 a 22 a představuje alkylenový zbytek vzorce (CH₂)_n- nebo alkylenoxyskupinu vzorce -(CH₂)_nO-, přičemž v těchto vzorcích n představuje číslo 1 až 3, nebo

znamená zbytek vzorce

-(CHq) ₂- - — - nebo -(CH₂)₂- ~ , pokud A znamená přímou vazbu a jakož i B a D tvoří dohromady dvojnou vazbu, stejně jako způsobu jejich výroby, farmaceutických prostředků, které obsahují tyto sloučeniny, jakož i jejich použití pro výrobu léčiv.

Acyloxyskupiny nebo acylové skupiny možné pro substituenty R¹ a R² nebo v substituentech R³ nebo R⁴ jsou zvláště odvozeny od karboxylových kyselin nebo od kyseliny benzoové.

Tvoří-li R⁵ a R⁶ dohromady s terciárním atomem uhlíku nasycený karbocyklický kruh, tak je uvažováno zvláště s cyklopropylovým nebo cyklohexylovým kruhem. Jako alkylové skupiny R a R° přicházejí v úvahu zejména alkylové skupiny, které obsahují 1 až 5 atomů uhlíku.

Podle tohoto vynálezu jsou výhodné deriváty vitaminu D s homologickými bočními řetězci, obecného vzorce I, ve kterém

-3CZ 280203 B6 *1 O A

R, R a R* znamenají hydroxyskupinu nebo

R a R znamenají methylovou skupinu nebo tvoří dohromady s terciárním atomem uhlíku cyklopropylo.vý kruh,

R² představuje atom vodíku a n znamená číslo 1 nebo 2.

Mezi atomy uhlíku 22 a 23, pokud A znamená přímou vazbu, nebo mezi atomy uhlíku 23 a 24, pokud A znamená methylenovou skupinu, se s výhodou nachází dvojná vazba. Obzvláště výhodné jsou sloučeniny

24-[1(R)-hydroxy-4-methylpentyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-[1(S)-hydroxy-4-methylpentyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-(1(R)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-(1(S)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),2(R)-diol,

24-(l(R)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,ιοί 19 )-trien-l(S) ,3(R)-diol,

24-(1(S)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,ιοί 19)-trien-1 (S) ,3(R)-diol,

24-(1(R)-hydroxy-3-isopropoxypropyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraten-l(S),3(R)-diol,

4-(1(S)-hydroxy-3-isopropoxypropyl]-9,10-sekochola-5 Z,7 E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-isopropoxymethyl-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-1(S),3(R),24(R)-triol,

24-isopropoxymethyl-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-1(S),3(R),24(S)-triol,

24-(2-isopropoxyethyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-l(S),3(R),24(R)-triol,

24-(2-isopropoxyethyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-l(S),3(R),24(S)-triol,

26.27- cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholestra-5Z,7E,10,- (19),23E-tetraen-l(S),3(R),24a(R)-triol a

26.27- cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholestra-5Z,7E,10(19) , 23E-tetraen-l(S),3(R),24a(S)-triol.

-4CZ 280203 B6

Nyní bylo zjištěno, že deriváty vitaminu D s homologickými bočními řetězci podle předloženého vynálezu obecného vzorce I, mají ve srovnání s derivátem vitaminu D, kalcitriolem (la,25-dihydroxycholekalciferolem) překvapivě příznivé spektrum účinku. Zatímco účinky na látkovou výměnu vápníku a fosfátů jsou zřetelně zeslabené (pokles vedlejších účinků předávkováním nebo žádoucí vyšší dávku), zůstává účinek zabraňující proliferaci a účinek na diferenciaci buněk přibližně zachován (disociace).

Aktivita vitaminu D se u sloučenin podle tohoto vynálezu stanovuje pomocí receptorových testů s kalcitriolem. Testy se provádějí za použití specifických receptorových proteinů ze střev rachitických kuřat. Receptorové vazebné proteiny se inkubují s 0,5 ng/ml ³H-kalcitriolu v reakčním objemu 0,575 ml v nepřítomnosti nebo přítomnosti zkoušených sloučenin po dobu 1 hodiny v testovací zkumavce. K oddělení volného kalcitriolu a kalcitriolu s vázaným receptorem se provede absorbce na aktivním uhlí a dextranu. K tomu se do každé testovací zkumavky přidá 200 μΐ suspenze aktivního uhlí a dextranu a ínkubuje se za teploty 22 “C po dobu 30 minut. Nakonec se každý zkušební vzorek odstředí během 10 minut za přetížení 1 500 g při teplotě 4 °C. Zachycený podíl se dekantuje a po přibližně jednohodinové ekvilibraci v záření způsobeném atomy (atom light) se změří β počítačem.

Vynesou se kompetiční křivky, které obsahují různé koncentrace zkoušené sloučeniny a referenční látky (neznačeného kalcitriolu) při konstantní koncentraci srovnávací látky (³H kalcitriolu) ve vzájemném vztahu a stanoví se kompetiční faktor (KF).

Kompetiční faktor je definován jako podíl z koncentrací každé zkušební látky a referenční sloučeniny, který je potřebný pro 50% kompetici:

koncentrace zkoušené sloučeniny při 50% kompetici KF = —-----------------------------------koncentrace referenční látky při 50% kompetici

Podle toho vykazuje

24-(l-hydroxy-3-methylbutyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19), 23E-tetraen-l(S),3(R)-diol (sloučenina A) hodnotu KF rovnou 2,0 a 24-(l-hydroxy-3-methylbutyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19), 23E-tetraen-l(S),3(S)-diol (sloučenina B) hodnotu KF rovnou 3,6.

Ke stanovení antiproliferační schopnosti sloučenin podle tohoto vynálezu se se sloučeninami A a B, jako zastupujícími zkušebními látkami, provede test, který je popsán dále. '

Keratinocyty novorozených myší se preparují a kultivují podle metody, kterou popsal S. Yuspa a C. C. Harris, Altered Differentiation of Mouše Epidermal Cells Treated with Retinyl Acetate in Vitro, Exp. Cell Res. 86., 95-105 (1974).

Neonatální myši kmene NMRI obého pohlaví se usmrtí oddělením hlavy, kůže se odpreparuje, promyje v roztoku antibiotika a antimykotika a s dermální strany inkubuje pod roztokem dispasy II (1,2 U/ml v prostředí tkáňové kultury M199 + 25 mmol/1 HEPES +

-5CZ 280203 B6 % fetálního telecího sera (FCS) + 50 U/ml penicilinu/streptomycinu (P/S) (preparační prostředí, PM)) za teploty 4 “C přes noc. Pokožka se odstraní a působením trypsinu se připraví suspenze jednotlivých buněk. Po odstředění se buněčný sediment resuspenduje, po vybarvení trypanovou modří se stanoví počet přežívajících malých kulatých buněk a buňky o hustotě 4xl0⁵ buněk/cm² se vnesou do 24 jamkových desek Primaria v prostředí tkáňové kultury (M199 + 15% FCS + 50 U/ml P/S). Po dvacetičtyřhodinové inkubaci za teploty 37 *C se buňky promyjí solným roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a dále inkubují po dobu 24 hodin s prostředím tkáňové kultury (M199 + 50 U/ml P/S+0,5 % ethanolu) neobsahujícím sérum, a to v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny, za teploty 32,5 C. Potom se přidá ³H methylthymidin o aktivitě 1,48x10^—15 s“í/50 μΐ (13,6xl0”⁹ s^-1/mmol). Po 4 hodinách se prostředí odsaje a reakce se ukončí přídavkem 500 μΐ ledově chladné 10% kyseliny trichloroctové (TCA). Buňky se promyjí TCA a PBS a lyžují inkubací v roztoku proteinázy K (10 mmol/1 Tris-HCl, 10 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 NaCl, 0,2 % Triton-X 100, hodnota pH 8,0, 50 ug/ml proteinkinázy K) a lyzát se vyčeří odstředěním. V takto zpracovaném materiálu se stanoví scintilační fotometrií radioaktivita a po specifickém vybarvení DNA pomocí diamidinofenylindolu (DAPI) se DNA koncentrace stanoví fluorescenční fotometrií.

Podle toho potlačuje kalcitriol, stejně jako sloučenina A a sloučenina B vestavění ³H thymidinu do DNA v závislosti na

dávkách, s	těmito hodnotami IC₅₀:
calcitriol		2X10“⁹	mol/1
sloučenina	A	1X10“⁸	mol/1
sloučenina	B	3,2xl0^-9	mol/1.

Diferenciační stimulační účinek kalcitriolu, jakož i sloučenin podle tohoto vynálezu,

26,27-cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholestra-5Z,7E,10(19), 23E-tetraen-l(S),3(R),24a(R)-triolu (sloučeniny C) a

26,27-cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholestra-5Z,7E,10(19), 23E-tetraen-l(S),3(R),24a(S)-triolu (sloučeniny D) se prakticky neliší.

Z literatury (D. J. Mangelsdorf a kol., J. Cell, Biol. 98, 391 až 398 /1984/) je známo, že zpracování leukemických buněk člověka (promyelocytová buněčná linie HL 60) in vitro s kalcitriolem indukuje diferenciaci buněk na makrofágy.

Ke kvantitativnímu stanovení diferenciačního stimulačního účinku analogu kalcitriolu se provede test, který je popsán dále.

Buňky HL 60 se kultivují v prostředí tkáňové kultury (RPMI - 10% fetální telecí sérum) za teploty 37 ’C v atmosféře, kterou tvoří 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu.

K testování sloučenin se buňky odstředí a 2,8xl0⁵ buněk na mililitr se vyjme do prostředí tkáňové kultury, které neobsahuje fenolovou červeň. Testované sloučeniny se rozpustí v ethanolu a prostředí tkáňové kultury neobsahující fenolovou červeň se získaným roztokem zředí na požadovanou koncentraci. Směs z ředi-6CZ 280203 B6 cích stupňů se smíchá se suspenzí buněk v poměru 1:10 a vždy 100 μΐ této suspenze buněk obsahující přidanou testovanou sloučeninu se odpipetuje do jamky, umístěné na desce s 96 jamkami. Ke kontrolnímu stanovení se suspenze buněk analogicky přidá k rozpuštědlu.

Po inkubaci trvající 96 hodin za teploty 37 °C ve vzduchu obsahujícím 5 % oxidu uhličitého se do každé jamky, umístěné na desce obsahující 96 jamek, k suspenzi buněk odpipetuje 100 μΐ roztoku NBT-TPA (NBT = nitro-tetrazoliová modř, konečná koncentrace v násadě 1 mg/ml a tetradekanoylphorbolmyristát-13-acetát (TPA), konečná koncentrace v násadě 2xl0~⁷ mol/1).

Inkubací trvající 2 hodiny za teploty 37 C ve vzduchu obsahujícím 5 % oxidu uhličitého se v důsledku intracelulárního uvolnění radikálů kyslíku, stimulovaného TPA, sníží v buňkách vlivem NBT diferenciace na makrofágy k nerozpustnému formazanu.

Ke zkončení reakce se obsah jamek umístěných na desce s 96 prohlubněmi odsaje a ulpělé buňky se fixují přídavkem methanolu a po fixaci vysuší.

K přípravě vzniklých intracelulámich formazanových krystalů se do každé jamky odpipetuje 100 μΐ (2 val/1) hydroxidu draselného a 100 μΐ dimethylsulfoxidu a podrobí se působení ultrazvuku po dobu 1 minuty. Koncentrace formazanu se stanoví spektrální fotometr i í při vlnové délce 650 nm.

Jako měřítko indukce diferenciace buněk HL 60 na makrofágy slouží koncentrace vzniklého formazanu. Relativní účinnost testovaných sloučenin se vyjadřuje jako podíl ED₅₀ testované sloučeniny a ED₅q kalcitriolu.

. Podle toho má kalcitriol, sloučenina C a sloučenina D hodnotu EDg₀ odpovídající l,8xio“⁹ mol/1, 2,2xl0~⁹ mol/1 a 2,5xl0^-9mol/1.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se tím, že snižují riziko hyperkalcinemie hodí obzvláště pro výrobu léčiv k ošetřování chorob, které se vyznačuji hyperproliferací, jako například hyperproliferačních onemocnění kůže (lupénky) a maligních nádorů (leukémie, karcinomu tračníku nebo karcinomu prsu). Předpokladem úspěšného ošetření je důkaz, že se receptory kalcitriolu dostávají do cílového orgánu.

Tento vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obecného vzorce I společně Sloučeniny se mohou připrasnášenlivých rozpouštědlech ve farmaceuticky vhodobsahují alespoň jednu sloučeninu s farmaceuticky snášenlivým nosičem, vovat jako roztoky ve farmaceuticky nebo jako emulze, suspenze nebo disperze ných rozpouštědlech, nebo jako tablety, pilulky nebo kapsle, které obsahují pevné nosné látky, jež jsou o sobě známé. Pro lokální zpracovávej í na krémy a masti tvoří lékovou formu vhodnou prostředek může také obsahovat netoxické pomocné látky, jako použití se s výhodou sloučeniny nebo podobné přípravky, které k lokálnímu použití. Každý takový jiné farmaceuticky snášenlivé a

-7CZ 280203 B6 jsou například stabilizátory, antioxidanty, pojivá, barviva, emulgátory nebo ochucovadla. Sloučeniny se s výhodou používají ve sterilních roztocích vhodných pro injekce nébo jako intravenózní infuze, jako perorální dávky podávané zažívacím traktem nebo lokální aplikační formy, které tvoří krémy, masti, lotiony nebo vhdoné transdermální ňáplasti, jak je popsáno v evropském patentu č. 0 387 077A.

Denní dávky pro pacienta činí 0,1 až 1 000 μ9, s výhodou 1,0 až 500 μg.

Tento vynález se kromě toho týká použití sloučenin obecného vzorce I pro výrobu léčiv.

Výroba derivátů vitaminu D s homologickými bočními řetězci obecného vzorce I se podle tohoto vynálezu provádí tím, že se sloučenina obecného vzorce IV

(IV), ve kterém

R^x znamena atom vodíku nebo chráněnou hydroxyskupinu,

R znamena chráněnou hydroxyskupinu a

A, X, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený pod obecným vzorcem I, popřípadě po selektivní hydrogenaci dvojné vazby v bočním řetězci, převede na sloučeninu obecného vzorce IVa

-8CZ 280203 B6

(IVa) ve kterém

Ί t Ol

R¹ , E² , A,

IV,

X, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený pod obecným vzorcem která, podle potřeby po redukci karbonylové funkce a popřípadě po rozdělení směsi, se redukuje na epimerní hydroxysloučeniny obecného vzorce lila a Illb

(lila) ****** OH = a -OH (Illb) ***** OH = β -OH ve kterém

R¹', R²', A,

IV a

X, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený pod obecným vzorcem

B a D mají význam uvedený pod obecným vzorcem I, a ozařováním ultrafialovým zářením, při vratné stereochemii dvojné vazby v poloze 5, 6, se převede na sloučeninu obecného vzorce

II

-9CZ 280203 B6 ve kterém

R¹', R²', A, B, D, vzorců lila a Illb, e z:

X, R a R mají význam uvedený u obecných a nakonec se odštěpí přítomné a hydroxyskupiny se částečně sloučeniny obecného vzorce I.

chránící skupiny na hydroxyskupině nebo zcela esterifikují za vzniku

Redukce karbonylové funkce v bočním řetězci sloučeniny obecného vzorce IV se provádí například působením chloridu čeřitého nebo natriumborhydridu v polárním rozpouštědle. Při redukci vzniká jako R-hydroxyisomer obecného vzorce lila, tak také S-hydroxyisomer obecného vzorce Illb. Oba isomery se dají oddělit chromatograf icky .

Podle potřeby se před redukcí karbonylové funkce může selektivně hydrogenovat dvojná vazba bočního řetězce. Jako hydrogenační činidlo se mimo jiné hodí lithium-tri-terc.butoxyaluminiumhydrid v polárním rozpouštědle.

Následující převedení sloučeniny obecného vzorce lila nebo obecného vzorce Illb na sloučeninu obecného vzorce II se provádí například ozařováním ultrafialovým zářením v přítomnosti tak zvaného triplet sensibilizátoru. V rámci tohoto vynálezu se k tomu používá antracenu. Štěpení pí-vazby dvojné vazby v poloze

5,6, otočení kruhu A o 180° s jednoduchými vazbami v poloze 5 a 6 a opětovný vznik dvojné vazby v poloze 5,6 představuje vratný stereoisomerni pochod dvojné vazby 5,6.

Konečné odštěpení chránící skupiny na hydroxyskupině se s výhodou provádí za použití tetra-n-butylamoniumfluoridu. Podle potřeby se volné hydroxyskupiny na závěr provedeného způsobu částečně nebo úplně esterifikují působením odpovídajícího halogenidu karboxylové kyseliny, přičemž halogenidem se rozumí chlorid nebo bromid, nebo působením anhydridu karboxylové kyseliny.

-10CZ 280203 B6

Výroba výchozích sloučenin

1. Způsob výroby 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-

-20 (S) -f ormyl-9,10-sekopregna-5E, 7E, 10 (19) -trienu 1

Výroba sloučeniny 1 se provede jak popsal M. J. Calverley v Tetrahydron 43., 4609 /1987/ a jak je také zřejmé z mezinárodní patentové přihlášky WO 87/00834. Tam je také popsána výroba výchozí sloučeniny, kde R¹ znamená atom vodíku.

2. Způsob výroby 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-20(R)-methyl-9,10-sekoprogna-5E,7E,10(19)-trien-21-karbaldehydu 2

Aldehyd 2 se vyrábí novým způsobem.

a) K suspenzi 1,8 g natriumhydridu (80 % v oleji) v 70 ml absolutního tetrahydrofuranu se přikape za teploty 25 ’C roztok

15,57 g ethylesteru kyseliny diethylfosfonoethoxyoctové (vyroben podle W. Grella a H. Machleidta, Liebigs Ann. Chem. 699, 53 /1966/) ve 200 ml tetrahydrofuranu. Po ukončení přidáváni se míchá dalších 90 minut za teploty 60 °C, reakční směs se znovu ochladí na teplotu 25 ’C a přikape se k ní roztok 6,2 g sloučeniny 1 v 70 ml tetrahydrofuranu. Po dvouhodinovém míchání pod zpětným chladičem se reakční směs ochladí a potom vylije do vody a extrahuje ethylacetátem. Po vysušení (síranem sodným) se provede odpaření a získaný surový produkt se chromatograf u je na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu. Hlavní frakce poskytne 5,2 g ethylesteru 1(S),3(R)-bis-(terč.butyldimethylsilyloxy)-23-(ethoxy-9,10-sekochola-5E,7E, 10(19)-tetraen-24-kyseliny, který tvoří olejovitá směs isomerů s dvojnou vazbou C 22.

b) 5,2 g sloučeniny získané ad a) se rozpustí ve 120mml toluenu a za teploty 0 ’C pomalu vnese 20 ml 20% roztoku diisobutylaluminiumhydridu v toluenu. Po 30 minutách za teploty 0 °C se reakční roztok opatrně vylije do roztoku chloridu amonného a extrahuje se ethylacetátem. Obvyklým zpracováním se dostane

4,88 g l(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-23-ethoxy-9,10—sekochola-5E,7E,10(19),22-tetraen-24-olu, který tvoří bezbarvá olejovitá isomerní směs. Získaná směs se použije bez dalšího čistění v následujícím stupni.

c) 4,88 g sloučeniny vyrobené ve stupni b) se míchá se směsí 55 ml dichlormethanu a 55 ml 70% vodné kyseliny octové po dobu 4 hodin za teploty místnosti. Potom se reakční směs neutralizuje roztokem amoniaku a extrahuje se dichlormethanem. Surová látka se chromatografuje na silikagelu za použití smési hexanu a ethylacetátu. Tímto způsobem se získá 2,02 g l(S),3(R)-bis-(terč.-butyldimethylsilyloxy)-24-hydroxy-9,10-sekochola-5E,7E, 10(19)trien-23-onu 5, ve formě bezbarvého oleje.

¹H NMR spektrum (deuterovaný chloroform): S = 0,01 (s, 12H, Si-CH₃, 0,52 (s, 3H, H-18), 0,81 a 0,84 (s, někdy 9H, Si-terc.-butyl), 0,90 (d, J = 7 Hz, 3H, H-21), 3,09 (t, J = 5 Hz, 1H, OH), 4,10 (dd, 1H, H-24), 4,16 (m, 1H, H-3), 4,21 (dd, 1H,

-11CZ 280203 B6

H-24), 4,39 (m, IH, H-l), 4,88, 4,93 (s, někdy IH, H-19), 5,77, 6,39 (d, J » 11 Hz, někdy IH, H-6, H-7) ppm.

d) 2,02 g sloučeniny vyrobené ve stupni c) se rozpustí v 25 ml methanolu a 25 ml tetrahydrofuranu a za teploty 0 °C se přidá 300 mg natriumborhydridu. Reakční směs se míchá po dobu 1,5 hodiny za teploty 0 ’C, potom se vylije do roztoku chloridu amonného a extrahuje se ethylacetátem. Získá se 1,75 g l(s),3 (R)-bis(terč.-butyldimethylsilyloxy)-9,10-sekochola-5E,7E,10 (19)trien-23,24-diolu 6, který tvoří bezbarvou olejovitou směs epimerů 23. Tato směs se použije v následující reakci.

e) 1,75 g sloučeniny získané pod d) se rozpustí ve 40 ml toluenu a k roztoku se po částech přidá 1,23 g octanu olovičitého za chlazení ledem. Směs se míchá po dobu 30 minut a znovu se k ní přidá 1,0 g octanu olovičitého. Vzniklá směs se míchá během dalších 15 minut za teploty +5 až +10 “C.

Reakční směs se uvede do styku s roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vzniklá suspenze se filtruje přes Celit a filtrát extrahuje ethylacetátem. Získaný surový produkt se chromatografuje na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu. Po krystalizaci hlavní frakce z ethanolu se dostane 560 mg 1(S),3(R)-bis-(terč.-butyldimethylsilyloxy)-20(R)-methyl-9,10-sekopregna-5E, 7E,10(19)-trien-21-karbaldehydu o teplotě tání 101 až 104 °c.

Reakce aldehydu 1 nebo 2 s fosforanem obecného vzorce

ve kterém

X, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený shora, vede ke sloučeninám obecného vzorce IV (Wittigova reakce).

Způsob výroby použitých fosfor-ylidů

1. Způsob výroby isobutylkarbonylmethylentrifenylfosforánu *

a) Způsob výroby brommethylisobutylketonu

K 50 ml isobutylketonu v 240 ml methanolu se přidá za teploty 0 °C 20 ml bromu a po přidání se ještě míchá za teploty 10 · po dobu 90 minut. Potom se přidá 360 ml vody a reakční směs se míchá za teploty místnosti po dobu 16 hodin.

Ke zpracování se reakční směs uvede do styku s nasyceným roztokem chloridu sodného, odloučená organická fáze se oddělí a vodná fáze se extrahuje etherem. Spojené organické fáze se pro-12CZ 280203 B6 myjí 10% roztokem uhličitanu sodného a vysuší síranem sodným. Po filtraci se rozpouštědlo oddestiluje ve vakuu vodní vývěvy a získaný zbytek se destiluje. Hlavni frakce obsahuje 53,7 g brommethylisobutylketonu o teplotě varu 67 až 69 °C/15 až 20.

b) Způsob výroby isobutylkarbonylmethyltrifenylfosfoniumbromidu

53.6 g brommethylisobutylketonu a 78,5 g trifenylfosfinu se důkladně promíchá v 500 ml baňce s kulatým dnem a po odeznění počátečního silného vývoje tepla se 12 hodin vše nechá pod dusíkovou atmosférou za teploty místnosti. Potom se pevná reakční směs vyjme 330 ml methylenchloridu a zahřívá při zpětném toku po dobu 30 minut. Potom se přidá 500 ml etheru, směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a produkt se izoluje filtrací. Po vysušení se dostane 111,7 g fosfoniové soli, která má teplotu tání 244 až 245 ’C.

c) Způsob výroby isobutylkarbonylmethylentrifenylfosforánu

111.6 g fosfoniumbromidové soli se opatrně vnese do 1 500 ml methylenchloridu a 1 500 ml 2-normálního hydroxidu sodného a míchá po dobu 30 minut za teploty místnosti. Organická fáze se oddělí, promyje vodou a vysuší síranem sodným. Odpařením se získá pevná látka, která se rekrystaluje z terc.butylmethyletheru. Dostane se 72,2 g ylidu, který má teplotu tání 120 až 121 °C.

2. Způsob výroby isoamylkarbonylmethylentrifenylfosforánu

Výroba sloučeniny pojmenované v nadpise se provádí analogickým způsobem, jako je popsán ad 1, bromací isoamylmethylketonu, reakcí bromidu s trifenylfosfinem na fosfoniovou sůl a tvorbou ylidu působením 2-normálního roztoku hydroxidu sodného.

Z 50,0 ml isoamylmethylketonu a 18,2 ml bromu se po destilačním přečištění dostane 54,68 g l-brom-5-methylhexan-2-onu, který má teplotu varu 80 až 86 ’C/15 až 20. Z 54,58 g bromidu a 74,14 g trifenylfosfinu se dostane 91,6 g fosfinové soli, která má teplotu táni 230 až 233 ’C.

Z 91,6 g fosfinové soli se po zpracování s hydroxidem sodným a po rekrystalizaci surového produktu ze směsi methylenchloridu a esteru získá 69,8 g sloučeniny pojmenované v nadpise, která má teplotu tání 64 až 67 ’C.

3. Způsob výroby isopropoxymethylkarbonylmethylentrifenylfosforánu

2,43 g sodíku se rozpustí v 150 ml isopropanolu. Potom se přidá 20,0 g chlormethylkarbonylmethylentrifenylfosforánu (R. F. Hudson a kol., J. Org. Chem. 28, 2446 /1963/) rozpuštěného ve 200 ml isopropanolu a reakční směs se vaří po dobu 8 hodin pod zpětným chladičem.

Ochlazená reakční směs se nalije do roztoku chloridu sodného a extrahuje se ethylacetátem. Olejovitý odparek získaný po odpaření se chromátografuje na silikagelu pomocí ethylacetátu. Získá

-13CZ 280203 B6 se 9,53 g sloučeniny pojmenované v nadpise, která má teplotu tání 134 ’C.

4. Způsob výroby (2-isopropoxyethyl)karbonylmethylentrifenylfosforanu

a) Způsob výroby l-brom-4-isopropoxybutan-2-onu

Roztok 68,2 g 4-isopropoxy-2-butanonu (F. B. Hasan a kol., J. Biolog. Chem. 256, 7781 /1981/) v 315 ml methanolu se po kapkách uvede do styku s 26,9 ml bromu a potom se míchá za teploty +10 *C po dobu 90 minut. Potom se přidá 470 ml vody k reakčnímu roztoku a vše se míchá za teploty místnosti po dobu 16 hodin. Ke zpracování se reakční roztok nalije do nasyceného roztoku chloridu sodného a extrahuje se etherem. Destilaci surového produktu se dostane 78,07 g bromového derivátu, který má teplotu varu 95 C/15 až 20.

b) Způsob výroby 4-isopropoxy-2-oxobutyltrifenylfosfoniumbromidu

Z 78,0 g bromidu získaného ad a) a 97,85 g trifenylfosfinu se způsobem popsaným pod 1) získá 133,35 g fosfoniové soli, která má teplotu tání 183 °C.

c) Způsob výroby (2-isopropoxyethyl)karbonylmethylentrifenylfosforánu

Na 133,2 g fosfoniumbromidu se působí 2-normálním roztokem hydroxidu sodného v methylenchloridu způsobem, který je popsán pod 1). Po rekrystalizaci surového produktu z ethylacetátu se dostane 64,38 g sloučeniny pojmenované v nadpise, která má teplotu tání 97 ’C.

5. Způsob výroby (l-ethylpropoxymethyl)karbonylmethylentrifenyl- * fosforánu

Roztok 3,04 sodíku ve 100 ml 3-pentanolu se nechá reagovat s 25,0 g chlormethylkarbonylmethylentrifenylfosforánu obdobně, jako je znázorněno pro isopropoxymethylkarbonylmethylentrifenylfosf orán. Sloučenina pojmenovaná v nadpise se dostane jako krystalizovatelný olej, který má teplotu tání 66 až 70 ’C.

6. Způsob výroby cyklopropylmethoxymethylkarbonylmethylentrifenylfosforánu

Roztok 5,58 g sodíku v 25,0 g cyklopropylmethanolu a 200 ml * toluenu se nechá reagovat s 30,0 g chlormethylkarbonylmethylentrif enylfosf oránu obdobné, jako je převedeno na výrobě isopropoxymethylkarbonylmethylentrifenylfosforánu. Sloučenina pojmenovaná v nadpise se dostane jako pevná látka, která má teplotu tání 121 “C.

7. Způsob výroby (3-butinyl)karbonylmethylentrifenylfosforánu

20,0 g methylenkarbonylmethylentrifenylfosforánu se rozpustí v 628 ml tetrahydrofuranu a za teploty -78 ’C se nechá reagovat s 41,3 ml butyllithia (1,6-molární roztok v hexanu), který se přidává po kapkách. Nakonec se přidá 5,0 ml propargylbromi-14CZ 280203 B6 du. Reakční směs se nechá ohřát na teplotu místnosti, přidá se ledový roztok chloridu sodného a směs se extrahuje ethylacetátem. Po vysušení organické fáze síranem sodným se dojde k 23,4 g pevné látky, která se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití ethylacetátu. Dostane se 15,4 g sloučeniny pojmenované v nadpise, která má teplotu tání 135 až 136 °C.

8. Způsob výroby (3-butenyl)karbonylmethylentrifenylfosforánu

Reakcí 15,0 g methylkarbonylmethylentrifenylfosforánu v 471 ml tetrahydrofuranu s 31,0 ml butyllithia a 4,28 ml allylbromidu se obdobné, jako je popsáno pod 7), získá sloučenina pojmenovaná v nadpise, kterou tvoří krystalizovatelný olej o teplotě tání 92 až 93 ’C.

Změnou ketoderivátů použitých při Wittigově reakci se mohou vyrobit další fosforany obecného vzorce IV.

Příklad 1

Roztok 1,6 g 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-20(R)-methyl-9,10-sekopregna-5E,7E,10(19)-trien-21-karbaldehydu v 50 ml toluenu se po přidání 3,02 g isoamylkarbonylmethylentrifenylfosforánu míchá za teploty 80 ’C pod dusíkovou atmosférou po dobu 16 hodin. Nakonec se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a odparek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu. Hlavní frakce poskytne 1,15 g (1(S),3(R)-bis-(terč.-butyldimethylsilyloxy)-9,10-sekochola-5E,7E,10(19),23E-tetraen-24-yl]-4-methylpentan-l-onu, který tvoři bezbarvý olej .

^H NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ = 0,01 (s, 12H, Si-CHg), 0,56 (s, 3H, H-18), 0,87 (s, 18H, Si-terc.-butyl), 0,88 (d, J = 7 Hz, 6H, C-(CH₃)₂), 0,95 (d, J = 7 Hz, 3H, H-21), 4,25 (m, 1H, H-3), 4,55 (m, 1H, H-l), 4,94 a 5,00 (s, někdy 1H, H-19), 5,82 a 6,46 (d, J = 11 Hz, někdy 1H, H-6, H-7), 6,10 (d, J = 16 Hz, 1H, H-24), 6,80 (m, 1H, H-23) ppm.

Příklad 2 sodným a odpařením. Takto se dělí chromatografíčky na a ethylacetátu. V uvedeném

V 10 ml methanolu se rozpustí 572 mg heptahydrátu chloridu čeřitého a přidá se 1,10 g sloučeniny vyrobené v příkladu 1, která je rozpuštěna v 5 ml methanolu. K reakční směsi se přidá 61 mg natriumborhydridu a vše se míchá po dobu 30 minut za teploty 0 ’C. Reakční směs se zpracuje jejím vylitím do vody, extrakcí dichlormethanem, vysušením síranem získaná směs diateromerních alkoholů silikagelu za použiti směsi hexanu po řadí se dostane eluovánim 290 mg 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy )-24-(l-hydroxy-4-methylpentyl)-9,10-seko-5E,7E-10-(19),23E-cholatetraenu (epimer A) a 120 mg epimeru B. Epimery vykazují identické NMR spektrální údaje.

-15CZ 280203 B6 ¹H NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ = 0,01 (s, 12H, Si-CH₃), 0,49 (S, 3H, H-18), 0,86 (s, 18H, Sí-terc.-butyl), 0,86 (d, J = 7 HZ, 6H, C-(CH₃)₂), 0,88 (d, J » 7 Hz, 3H, H-21), 4,16 (m, 1H, H-3), 4,48 (m, 1H, H-l), 4?88 a 4,93 (s, někdy 1H, H—19), 5,40 (dd, J - 15,5 a 7 Hz, 1H, H-24), 5,55 (m, 1H, H-23), 5,77 a 6,40 (d, J = 11 Hz, někdy 1H, H-6, H-7) ppm.

Příklad 3

Roztok 290 mg epimeru A, získaného jako produkt v příkladě

2, v 80 ml toluenu se po přidání 44 mg antracenu a 0,01 ml triethylaminu ozařuje v ponorném reaktoru zhotoveném ze skla Pyrex pomocí vysokotlaké rtuťové žárovky (Philips HPK 125). Ozařování trvá 3,5 minuty. Promíchávání roztoku se dosahuje zaváděním proudu dusíku. Po odpaření a chromatografii na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu se získá 241 mg 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-24-(l-hydroxy-4-methylpěntyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraenu, který tvoří bezbarvý olej.

[a]²⁰ _D = +49,6’ (CHC1₃, c = 0,425).

Analogickým zpracováním polárního isomeru (epimer Β), získaného podle příkladu 2, se dostane 113 mg sloučeniny, kterou tvoří bezbarvý olej.

[a]²⁰ _D = +41,4' (CHC1₃, c = 0,285).

Příklad 4

Roztok 225 mg produktu získaného z epimeru A podle příkladu

3, v 5 ml tetrahydrofuranu se po přidání 1,31 ml 1-molárního roztoku tetrabutylamoniumfluoridu v tetrahydrofuranu míchá za teploty 60 ’C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se po ochlazení vylije na nasycený roztok chloridu sodného a extrahuje se ethylacetátem. Surový produkt se chromatografuje na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu. Jako bílá pěna se dostane 85 mg 24-(l-hydroxy-4-methylpentyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19,23E-tetraen-1(S),3(R)-diolu.

^H NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ =0,57 (s, 3H, H-18), 0,84 (d, J = 7 Hz, 3H, H-21), 0,92 (d, J = 7 Hz, 6H, C-(CH₃)₂), 4,03 (m, 1H, H-25), 4,23 (m, 1H, H-3), 4,43 (m, 1H, H-l), 5,00 a 5,33 (s, někdy 1H, H-19), 5,45 (dd, J = 15,5 a 7 Hz, 1H, H-24), 5,60 (m, 1H, H-23), 6,02 a 6,38 (d, J = 1 Hz, někdy 11H, H-6, H-7) ppm.

Obdobným zpracováním produktu získaného z epimeru B podle příkladu 3 (95 mg) se dostane 35 mg epimerního triolu, který tvoři bezbarvý olej. NMR spektrální údaje obou epimerů jsou shodné.

Příklad 5

Analogickým způsobem, jako je popsán v příkladě 1, se nechá

-16CZ 280203 B6 reagovat 2,05 g 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-20(R)-methyl-9,10-sekopregna-5E,7E,10(19)-trien-21-karbaldehydu v 53 ml toluenu s 3,4 g isobutylkarbonylmethylentrifenylfosforánu. Po chromatografickém přečištění se dostane [l(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-9,10-sekochola-5E,7E,10(19,23E-tetraen-24-yl]-3-methylbutan-l-on, který má teplotu 79 až 81 ’C (z ethanolu).

[a]²⁰ _D - +52,6’ (CHC1₃, c = 0,500).

Příklad 6

Redukcí 1,75 g produktu získaného podle příkladu 5 se za podmínek popsaných v příkladě 2 získá 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-24-[1(R,S)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5E,7E,10(19),23E-tetraen, tvořený olejovitou směsí epimeru. Chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu se v uvedeném pořadí eluování dostane 780 mg epimeru A a 600 mg epimeru B, které jsou tvořeny bezbarvými oleji. Tyto epimery se nedají NMR spektroskopii rozlišit.

Příklad 7

Triplett-sensibilizační fotoisomerizaci analogickou jako v příkladě 3 a připojeným odštěpením silyletheru analogicky jako v příkladě 4 se dostane z 700 mg epimeru A, vyrobeného podle příkladu 6, 240 mg 24-(l-hydroxy-3-methylbutyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)diolu (sloučenina A), rozkládajícího se v teplotním intervalu od 119 do 125 ’C.

[a]²⁰Q = +38,8’ (methanol, c = 0,505).

Obdobným zpracováním 330 mg epimeru B se dostane 129 mg 24-(l-hydroxy-3-methylbutyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(S)diolu (sloučenina B), rozkládajícího se v teplotním intervalu od 139 do 145 C.

[a]²⁰ _D = +54,8’ (methanol, c = 0,505).

Příklad 8

Roztok 170 mg produktu získaného podle příkladu 5 v 5 ml tetrahydrofuranu se po přidání 200 mg lithium-tri-terc.-butoxy -aluminiumhydridu míchá za teploty místnosti po dobu 90 minut. Reakční směs se zpracuje s 0,8 ml nasyceného roztoku chloridu amonného, filtruje a filtrát se odpaří. Chromatografií surového produktu na oxidu hlinitém (Měrek, stupeň neutralizace III) poskytne 108 mg 1-[1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-9,10-sekochola-5E,7E,10(19)-trien-24-yl]-3-methylbutan-l-onu ve formě bezbarvého oleje.

NMR spektrum (chloroform, deuterovaný): S = 0,53 (s, 3H, H-18), 4,22 (m, 1H, H-3), 4,54 (m, 1H, H-l), 4,93 a 4,98 (m, někdy 1H, H-19), 5,82 a 6,46 (d, J = 11 Hz, někdy 1H, H-6, H-7) ppm.

-17CZ 280203 B6

Příklad 9

Fotochemickou isomerací dvojné vazby, obdobnou jako v příkladě 3, a odštěpením silyletheru, analogicky jako v příkladě 4, se dostane z 100 mg produktu vyrobeného v příkladě 8, 50 mg 1-[1(S),3(R)-dihydroxy-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19)-trien-24-yl]-3-methylbutan-l-on.

UV spektrum (methanol): 212 (e = 14 300), 265 (e = 15 860) nm.

Příklad 10

Analogickou reakcí jako v příkladě 1 se z 1,6 g 1(S),3(R)-bis-(terč.-butyldimethylsilyloxy)-20(R)-methyl-9,10-sekopregna-5E,7E,10(19)-trien-21-karbaldehydu a (2-isopropoxyethyl)karbony lmethylentrif enylf osf anu získá 1,15 g 1-[1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-9,10-sekochola-5E,7E,10(19),23E-tetraen-24-yl]-3-isopropoxypropan-l-ol, který tvoří bezbarvý olej.

NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ = 0,01 (s, 12H, Si-CH₃), 0,55 (s, 3H, H—18), 0,86 a 0,90 (s, někdy 9H, Si-terc.-butyl),0,96 (d, J = 7 Hz, 3H, H-21), 1,15 (d, J =7 Hz, 6H, C(CH₃)₂), 3,60 (m, 1H, CH-O), 3,73 (t, J = 7 Hz, 2H, CH₂-O),

4,23 (m, 1H, H-3), 4,55 (m, 1H, H-l), 4,95 a 5,00 (m, někdy 1H,

H-19), 5,83 a 6,46 (d, J = 11 Hz, někdy 1H, H-6, H-7), 6,11 (d, J = 15,5 Hz, 1H, H—24), 6,87 (m, 1H, H-23) ppm.

Příklad 11

Redukcí provedenou analogicky jako v příkladě 2, fotoisomerací, provedenou analogicky jako v příkladě 3 a odštěpením silyletheru, provedeným obdobně jako v příkladě 4, se získá z 1,05 g produktu vyrobeného podle příkladu 10, 143 mg 24-[l(R,S)-hydroxy-3-isopropoxypropyl)-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23-tetraen]-1(S),3(R)-diolu, který tvoří směs diastereomerů v poměru 1:1. Tato směs se · rozdělí vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Isomery mají shodné NMR spektrum.

³H NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ = 0,57 (s,3H,

H-18) 0,94 (d, J = 7 HZ, 3H, H-21), 1,15 (d, J = 7 Hz,6H,

C(CH₃)₂), 4,17 (m, 1H, H-3), 4,21 (m, 1H, H-25), 4,38 (m,1H,

H-l), 4,98 a 5,29 (m, někdy 1H, H-19), 5,45 (dd, J = 15,5 a 7 Hz,

1H, H-24), 5,63 (m, 1H, H-23), 6,02 a 6,38 (d, J = 11 Hz, někdy

1H, H-6, H-7) ppm.

Přiklad 12

Vychází-li se z aldehydu 1 a isopropoxymethylkarbonylmethylentrifenylfosforánu a provedou se analogické kroky jako v příkladech 1 až 4, získá se isomer B, to jest 5Z,7E, 22E-1(S),3(R),24(S)-9,10-seko-24a,24b-dihomo-24b-oxacholesta-5,7,10(19),22-tetraen-l,3,24-triol, který má teplotu tání 131 až 132 °C.

-18CZ 280203 B6

Příklad 13

Vychází-li se z aldehydu 1 a (2-isopropoxyethyl)karbonylmethylentrifenylfosforánu a provedou se analogické kroky jako v příkladech 1 až 4, získá se isomer B, to jest 5Z,7E,22E-1(S),~ 3(R),24(S)-9,10-seko-24a,24b,24c-trihomo-24c-oxaenolesta-5,7,10(19),22-tetraen-3,24-triol, který má teplotu tání 125 až 126 °C.

Příklad 14

Analogicky jako v příkladě 1 se nechá reagovat 0,85 g 1(S),3(R)-bis-(terč.-butyldimethylsilyloxy)-20(R)-methyl-9,10-sekopregna-5E,7E,10(19)-trien-21-karbaldehyd s 4,5 g cyklopropylmethylkarbonyltrifenylfosforánu. Po chromatografickém přečištění na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu se dostane 500 mg 1(S),3(R)-bis-(terc.-butyldimethylsilyloxy)-26,27-cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholesta-5E,7E,10(19),23E-tetraen-24a-onu, který tvoří bezbarvá pěna.

^H NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ = 0,01 (s, 12H, Si-CH₃), 0,09 a 0,50 (m, někdy 2H, H-26 a H-27), 0,50 (s, 3H,

H-18), 0,83 a 0,85 (s, někdy 9H, Si-terc.-butyl), 0,91 (d, J =

7,3 HZ, 3H, H-21), 0,96 (m, 1H, H-25), 2,47 (d, J =6 Hz, 2H, H-24b), 4,16 (m, 1H, H-3), 4,47 (m, 1H, H-l), 4,89 a 4,93 (s, někdy 1H, H-19), 5,77 a 6,40 (d, J = 11 Hz, někdy 1H, H-6 a H-7), 6,08 (d, J = 15,5 Hz, H-24), 6,75 (ddd, J = 15,5, 9, 6,5 HZ, 1H, H-23) ppm.

Příklad 15

Redukcí produktu z příkladu 14, provedenou analogicky jako v příkladě 2, se dostane 200 mg 1(S),3(R)-bis-(terč.-butyldimethylsilyloxy )-26,27-cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholesta-5E,7E,10(19),23E-tetraen-24a(R,S)-olu, který je tvořen olejovitou směsí epimerú. Epimery není možné rozlišit pomocí NMR spektroskopie.

^H NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ = 0,01 (s, 12H, Si-CH₃), 0,09 a 0,40 (rn, někdy 2H, H-26 a H-27), 0,50 (s, 3H, H-18), 0,68 (m, 1H, H-25), 0,81 a 8,86 (s, někdy 9H, Si-terc.-butyl), 0,88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-21), 1,40 (t, J = 7 Hz, H-24b), 4,13 (m, 1H, H-24a), 4,17 (m, 1H, H-3), 4,49 (m, 1H, H-l), 4,88 a 4,93 (s, někdy 1H, H-19), 5,45 (dd, J = 15,5, 6,5 HZ, 1H, H-24), 5,59 (ddd, J = 15,5, 6,5 Hz, 1H, H-23), 5,77 a 6,40 (d, J = 11 Hz, někdy 1H, H-6 a H-7) ppm.

Příklad 16

Triplett-sensibilizační fotoisomerizací a odštěpením chránících skupin, provedených obdobné jako v příkladě 3 a 4, se získá ze sloučeniny popsané v příkladě 15, o hmotnosti 190 mg, 86 mg

26,27-cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholesta-5Z,7E,10(19),23-tetraen-l(S),3(R),24a(R,S)triolu, který je tvořen směsí diastereomerů v poměru 1:1. Tato směs se rozdělí vysokotlakou kapalino-19CZ 280203 B6 vou chromatografií. NMR spektrální údaje obou diastereomerů jsou identické.

NMR spektrum (deuterovaný chloroform): δ = 0,09 a 0,49 (m, někdy 2H, H-26 a H-27), 0,53 (s, 3H, H-18), 0,70 (m, 1H, H—25), 0,93 (d, J - 7 HZ, 3H, H-21), 4,18 (m, 1H, H-24a), 4,22 (m, 1H, H-3), 4,43 (m, 1H, H-l), 5,00 a 5,32 (s, někdy 1H, H—19), 5,50 (dd, J - 15,5, 6,5 Hz, H-24), 5,64 (ddd, J = 15,5, 7, 6,5 HZ, 1H, H-23), 6,02 a 6,38 (d, J = 11 Hz, někdy 1H, H-6 a H-7) ppm.

Příklad 17

Vychází-li se z aldehydu 1 a (1-ethylpropoxymethyl)karbony1methylentrifenylfosforánu a provedou se analogické kroky, jako v příkladech 1 až 4, získá se isomer B, to jest 5Z,7E,22E-1(S),3(R),24(S)-26,27-dimethyl-24a,24b-dihomo-24b-oxa-9,10-sekocholesta-5,7,10(19),22-tetraen-l,3,24-triol, který má teplotu tání 103 až 105 ’C.

Příklad 18

Vychází-li se z aldehydu 1 a cyklopropylmethoxymethylkarbonyImethylentrifenylfosforánu a provedou se obdobné kroky, jako v příkladech 1 až 4 získá se isomer B, to jest 5Z,7E,22E-1(S),3(R),24(S)-26,27-cyklo-24a,24b,24c-trihomo-24b-oxa-9,10-sekocholesta-5,7,10(19),22-tetraen-l,3,24-triol.

¹H NMR spektrum (DMSO-d₆): δ = 0,16 (m, 2H), 0,43 (m, 2H),

0,53 (s, 3H), 1,00 (d, J = 6 Hz, 3H), 3,21 (m, 4H), 4,00 (m, 2H), 4,19 (m, 1H), 4,51 (d, J = 5 Hz, 1H), 4,70 (d, J =5 Hz, 1H), 4,75 (m, 1H), 4,82 (d, J = 5 Hz, 1H), 5,21 (m, 1H), 5,39 (m, 2H), 5,98 (d, J = 11 HZ, 1H), 6,18, (d, J = 11 Hz, 1H) ppm.

Příklad 19

Vychází-li se z aldehydu 1 a (3-butinyl)karbonyImethylentrifenylfosf oránu a provedou se analogické kroky, jako v příkladech 1 až 4, získá se isomer B, to jest 5Z,7E,22E-1(S),3(R),24(s)-24-(3-butinyl)-9,10-sekochola-3,7,10(19),22-tetraen-3,24-triol, který má teplotu tání 115 až 118 °C.

Příklad 20

Vychází-li se z aldehydu 1 a (3-butenyl)-1-karbonyImethylentrifenylfosf oránu a provedou se analogické kroky, jako v příkladech 1 až 4, získá se isomer B, to jest 5Z,7E,22E-1(S),3(R)-24(S)-24-(3-butenyl)-9,10-sekochola-5,7,10(19),22-tetraen-l,3-24-triol. Tato sloučenina má teplotu tání 146 až 147 °C.

Claims

* PATENTOVÉ NÁROKY

1. Deriváty vitaminu D s vzorce I .

homologickými bočními řetězci, obecného ve kterém

R¹ znamená atom vodíku, hydroxyskupinu nebo acyloxyskupinu s 1 až 9 atomy uhlíku,

R² znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu s 1 až 9 atomy uhlíku,

R³ nebo R⁴ znamená hydroxyskupinu nebo acyloxyskupinu s 1 až 9 atomy uhlíku a vždy druhý z těchto substituentů znamená atom vodíku nebo

R³ a R⁴ představují dohromady atom kyslíku,

R⁵ a R⁶ znamenají nezávisle na sobě vždy přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu až se 4 atomy uhlíku, trifluormethylovou skupinu nebo znamenají dohromady nasycený, nenasycený nebo aromatický karbocyklický kruh nebo s připojeným jedním atomem nebo dvěma atomy dusíku, kyslíku nebo síry tvoří heterocyklický 3-, 4-, 5- nebo 6-členný kruh,

B a D znamenají vždy bud atom vodíku, nebo tvoří dohromady dvojnou vazbu, která má konfiguraci· E a bud

A představuje přímou vazbu mezi atomy uhlíku 20 a 22 a

X znamená alkylenoxyskupinu vzorce -(CH₂)_n ⁰“, kde n představuje číslo 1 až 3, nebo

-21CZ 280203 B6

A znamená methylenový můstek vzorce -CH₂- mezi atomy uhlíku 20 a 22 a

X představuje alkylenový zbytek vzorce (CH₂)_n- nebo alkylenoxyskupinu vzorce -(CH₂)_no-, přičemž v těchto vzorcích n představuje číslo 1 až 3, nebo znamená zbytek vzorce

-(CH,)₂- ³⁵⁵³ nebo -(CH₂)₂- ^—pokud A znamená přímou vazbu dvojnou vazbu.

a D tvoří dohromady
2. Derivát vitaminu D podle nároku 1, kde R¹ znamená hydroxyskupinu.
3. Derivát vitaminu D podle nároku 1, kde R² znamená atom vodíku.
4. Derivát vitaminu D podle nároku 1, kde A znamená přímou vazbu mezi atomem uhlíku 20 a atomem uhlíku 22.
5. Derivát vitaminu D podle nároku 1, kde A znamená methylenový můstek.

Derivát vitaminu D podle mady dvojnou vazbu.

nároku

I, kde B a D znamenají dohro7.

Derivát vitaminu D podle droxyskupinu.

nároku

1, kde R³ nebo R⁴ znamená hy8.

Derivát vitaminu D podle 1 nebo 2.

nároku

1, kde

X představuje číslo

9.

Derivát vitaminu D podle nároku methylenovou skupinu.

1, kde

R⁵ a R⁶ znamenají
10.Derivát vitaminu uhlíku dohromady kde

D podle nároku 1, představují cyklopropylový kruh.

R^e a terciární atom

D podle nároku 1, vybraný ze skupiny zahrnu- li. Derivát vitaminu j ící:

24-[1(R)-hydroxy-4-methylpentyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-[1(S)-hydroxy-4-methylpentyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-(1(R)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-[1(S)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

-22CZ 280203 B6

24-[1(R)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19)-trien-1(S),3(R)-diol,

24-(1(S)-hydroxy-3-methylbutyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19)-trien-1(S),3(R)-diol,

24-[1(R)-hydroxy-3-isopropoxypropyl]-9,10-sekochola-5Z,7E, 10(19),23E-tetraen-l(S),3(R)-diol,

24-isopropoxymethyl-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-1(S),3(R),24(R)-triol,

24-isopropoxymethyl-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-1(S),3(R),24(S)-triol,

24-[2-isopropoxyethyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-1(S),3(R),24(R)-triol,

24-(2-isopropoxyethyl]-9,10-sekochola-5Z,7E,10(19),22E-tetraen-1(S),3(R),24(S)-triol,

26.27- cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholesta-5Z,7E,10(19) , 23E-tetraen-l(S),3(R),24a(R)-triol,

26.27- cyklo-24a,24b-dihomo-9,10-sekocholesta-5Z,7E,10(19),23E-tetraen-l(S),3(R),24a(S)-triol.
12.Způsob výroby derivátů vitaminu tézci, obecného vzorce I

D s homologickými bočními ře- dí ve kterém

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶, stejně jako

A, B, D a X mají význam uvedený v nároku 1, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce IV

-23CZ 280203 B6 (IV) ve kterém

1 t

R znamená atom vodíku nebo chráněnou hydroxyskupinu,

R znamena chráněnou hydroxyskupinu a

A, X, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený pod obecným vzorcem I, se převede, popřípadě po selektivní hydrogenaci dvojné vazby v bočním řetězci, na sloučeninu obecného vzorce IVa (IVa) ve kterém

R¹', R² ’ , A, X, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený pod obecným vzorcem IV, která, podle potřeby po redukci karbonylové funkce a popřípadě po

-24CZ 280203 B6 rozdělení směsi, se redukuje obecného vzorce lila a Illb na epimerní hydroxysloučeniny

D (lila) λ***** OH ⁼ ct —OH (Illb) ***** OH = β -OH ve kterém

R¹', R²', A, X, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený pod obecným vzorcem IV a

B a D mají význam uvedený pod obecným vzorcem I, které se ozařují ultrafialovým zářením, při vratné stereochemii dvojné vazby v poloze 5,6, za vzniku sloučeniny obecného vzorce II (II) ve kterém

R¹’, R²', A, B, D, X, stejně jako

R⁵ a R⁶ mají význam uvedený u obecných vzorců lila a Illb,

-25CZ 280203 B6 a nakonec se odštěpí přítomné chránící skupiny na hydroxyskupině a hydroxyskupiny se popřípadě částečně nebo zcela esterifikují na sloučeninu obecného vzorce I.
13. Farmaceutický prostředek s účinkem potlačujícím proliferaci a zabraňujícím diferenciaci buněk, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden derivát vitaminu D podle nároků 1 až 11 popřípadě s farmaceuticky přijatelným nosičem.
14. Použití derivátů vitaminu D podle nároků 1 až 11 pro výrobu léčiv.