FI100598B - Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten sivuketjuhomologiste n vitamiini-D-johdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

100598

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten sivuket-juhomologisten vitamiini-D-johdannaisten valmistamiseksi

Keksintö koskee uusien sivuketjuhomologisten vita-5 miini-D-johdannaisten valmistusta, joiden kaava on

D

10 11 | 13 | δ-- (I), 9 0

OH

jossa A on suora sidos tai metyleeniryhmä, 20 B ja D tarkoittavat vetyä tai B ja D muodostavat yhdessä sidoksen (E-konfiguraatio), R3 on vety ja R4 on hydroksi tai R3 on hydroksi ja R4 on vety tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä oksoryhmän, ja X on C^-alkyyli, C1.5-alkoksi-C1.3-alkyyli, syklopropyylimetyyli, 25 syklopropyylimetoksimetyyli, butynyyli tai butenyyli, sil lä edellytyksellä, että kun A on suora sidos ja B ja D muodostavat yhdessä sidoksen, niin X ei ole C^j-alkyyli tai syklopropyylimetyyli. Näillä yhdisteillä on solujen uudis-kasvua estävä ja solujen erilaistumiseen kohdistuva vaiku-30 tus.

Hiiliatomien 22 ja 23 välillä (jos A on suora sidos) tai hiiliatomien 23 ja 24 välillä (jos A on metyleeniryhmä) on edullisesti kaksoissidos. Erityisen edullisia ovat yhdisteet: 35 24-(1(R)-hydroksi-4-metyylipentyyli)-9,10-secokola- 5Z,7E,-10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 2 100598 24-(1(S ) -hydroksi-4-metyylipentyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 24 - (1(R)-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 5 24-( 1 ( S)-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola- 5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 24-(1(R)-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19)-trieeni-1(S),3(R)-dioli, 24 - ( 1(S)-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola-10 5Z,7E,10(19)-trieeni-1(S),3(R)-dioli, 24- (1 ( R)-hydroksi-3-isopropoksipropyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-1(S),3(R)-dioli, 24- (1(S)-hydroksi-3-isopropoksipropyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 15 24-isopropoksimetyyli-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),22E-tet- raeeni-1(S),3(R),24(R)-trioli, 24-isopropoksimetyyli-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),22E-tet-raeeni-1(S),3(R),24(S)-trioli, 24-(2-isopropoksietyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19 ),22E-20 tetraeeni-1(S),3(R),24(R)-trioli, 24-(2-isopropoksietyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),22E-tetraeeni-1(S),3(R),24(S)-trioli, 26,27-syklo-24a,24b-dihomo-9,10-secokolesta-5Z,7E,10(19), 23E-tetraeeni-l(S),3(R),24a(R)-trioli, 25 26,27-syklo-24a,24b-dihomo-9,10-secokolesta-5Z,7E,10(19), 23E-tetraeeni-l(S),3(R),24a(S)-trioli.

Luonnolliset D2-ja D3-vitamiinit (vrt. yleinen kaava V) ovat sinänsä biologisesti inaktiivisia ja muuttuvat vasta maksassa 25-asemassa tapahtuneen hydroksiloinnin tai 30 munuaisissa 1-asemassa tapahtuneen hydroksiloinnin jälkeen niiden biologisesti aktiivisiksi metaboliiteiksi. D2_ ja D3-vitamiinien vaikutus perustuu plasma-Ca**- ja plasma-fosfaattitason stabiloitumiseen. Ne vaikuttavat plasma-Ca~-tason alenemista vastaan.

3 100598

rC

Il 24 j 2JL< V A # r^ftb >\^ 27CH| 5

Ju& I To (V)

HO'"*---W

10

Ergokalsiferoli:

Ra=Rb=H, Rc=CH3 D2-vitamiini

Kaksoissidos C-22/23 Kolekalsiferoli: 15 Ra=Rb=Rc=H D3-vitamiini 25-hydroksikolekalsiferoli:

Ra=Rc=H, Rb=OH

la-hydroksikolekalsiferoli:

Ra=OH, Rb=Rc=H

20 la,25-dihydroksikolekalsiferoli:

Ra=Rb=OH, RC=H Kalsitrioli

Kalsium- ja fosfaattiaineenvaihduntaan kohdistuvan erinomaisen vaikutuksen ohella D2- ja D3-vitamiineilla 25 ja niiden synteettisillä johdannaisilla on myös solujen uudiskasvua estävä vaikutus ja lisäksi ne vaikuttavat solujen erilaistumiseen (H.F. De Luca, The Metabolism and Function of Vitamin D in Biochemistry of Steroid Hormones, Hrsg. H.L.J. Makin. 2nd Edition, Blackwell Scientific Pub-30 lications 1984, S. 71 - 116).

D-vitamiinin käytössä voi kuitenkin esiintyä yliannostelusta johtuvia sivuvaikutuksia (hyperkalsemia eli veren liiallinen kalkkipitoisuus).

24-asemassa hydroksiloidut la-kolekalsiferolit 35 tunnetaan jo patenttijulkaisusta DE-AS 25 26 981; niiden 4 100598 toksisuus on vähäisempää kuin vastaavan ei-hydroksiloidun Ια-kolekalsiferolin toksisuus. Hydroksiloitujen yhdisteiden vaikutuksesta kalsiumin suolistosta imeytymisessä tapahtuu valikoivaa aktivoitumista ja luustoon kohdistuva 5 absorptiovaikutus on heikompi kuin la-kolekalsiferolilla.

Kansainvälisessä WO-patenttihakemuksessa 87/00 834 kuvattuja 24-hydroksi-D-vitamiinianalogeja voidaan käyttää epänormaalista solun uudiskasvusta ja/tai solujen erilaistumisesta johtuvien häiriöiden hoitoon ihmisillä ja 10 eläimillä.

De Luca on äskettäin maininnut eri 1,25-dihydroksi-homo-D-vitamiinijohdannaisten kohdalla eroa luustoon kohdistuvassa absorptiovaikutuksessa ja HL-60-solujen erilaistumisessa. Luustoon kohdistuva absorptiovaikutus 15 in vitro on tällöin suorana mittana kalsiumin mobilisaatiolle in vivo.

Nyt on havaittu, että yleisen kaavan I mukaisilla sivuketjuhomologisilla D-vitamiini-johdannaisilla on D-vitamiinijohdannaiseen kalsitrioliin (la,25-dihydroksiko-20 lekalsiferoli) verrattuna yllättäen edullisempi vaikutus- spektri. Kalsium- ja fosfaattiaineenvaihduntaan kohdistuvien vaikutusten ollessa selvästi heikompia (yliannostelusta tai tarpeellisesta korkeasta annostuksesta johtuvien sivuvaikutusten väheneminen) säilyvät solujen uudiskasvua 25 estävät ja solujen erilaistumiseen kohdistuvat vaikutukset lähes ennallaan, (dissosiaatio).

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa siten, että että yhdiste, jonka kaava on äo ^ Y^r'

35 JC

R1 0 0RZ

(IV)' 5 100598

jossa R1 ja R2 ovat hydroksisuojaryhmiä ja A ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, muutetaan, mahdollisesti sen jälkeen kun sivuketjussa oleva kaksoissidos on selektiivisesti hydrattu niin, että saadaan yhdiste, jonka kaava on 5 H

Λ y\V

y\i/\ h o 10 <IVa>' Λ 15 a1'©’' nX'oR2 jossa R1 , R2 , A ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, ja mahdollisesti karbonyylifunktion pelkistämisen jälkeen ja mahdollisesti pelkistyksessä muodostuneiden kaavojen 20 0

yVV

/N. B OH

: 25

Y (Ula) W>H . «-0H

J' (11 Ib I *~0H « 8 - OH

Γι 30 ι· ,··· x 2'

R1 0‘ XX 0BZ

mukaisten epimeeristen hydroksiyhdisteiden seoksen erottamisen jälkeen, joissa kaavoissa R1 , R2 , A, X ja B tarkoittavat samaa kuin edellä; säteilyttämällä ultraviolet-35 tivalolla yhdisteeksi, jonka kaava on 6 100598

Wyx . 0» • >T .....

JR1' 10 jossa 5,6-kaksoissidoksen stereisomeria on muuttunut ja jossa R1 , R2 , A, X, B ja D tarkoittavat samaa kuin edellä, minkä jälkeen hydroksisuojaryhmät poistetaan.

Sivuketjukarbonyylifunktion pelkistys yleisen kaa-15 van IV mukaisessa yhdisteessä tapahtuu esimerkiksi

Cer( III )kloridi/natriumboorihydridillä polaarisessa liuot-timessa. Pelkistyksessä muodostuu sekä yleisen kaavan lila tai Illb mukainen (R)- että myös (S)-hydroksi-isomeeri. Molemmat isomeerit voidaan erottaa kromatografisesti.

20 Ennen karbonyylifunktion pelkistystä voidaan kak- soissidos mahdollisesti hydrata selektiivisesti sivuketjussa. Hydrausaineeksi soveltuu m.m. litium-tri-tert.-bu-toksi-alumininiumhydridi polaarisessa liuottimessa.

Yleisen kaavan Illa/IIIb mukaisen yhdisteen muutta-25 minen tämän jälkeen yleisen kaavan II mukaiseksi yhdisteeksi tapahtuu esim. säteilyttämällä ultraviolettivalolla niin sanotun "Triplettisensibilisaattorin" läsnäollessa. Esillä olevassa keksinnössä käytetään tällöin antraseenia. Lohkaisemalla 5,6-kaksoissidoksen π-sidos, kiertämällä 30 A-rengasta 180 °C:lla 5,6-yksinkertaisen sidoksen ympäri ja muodostamalla uudelleen 5,6-kaksoissidos muuttuu 5,6-kaksoissidoksen stereoisomeria päinvastaiseksi.

Lopuksi esiintyvät hydroksisuojaryhmät lohkaistaan, edullisesti käyttäen tetra-n-butyyli-ammoniumfluoridia se-35 kä mahdollisesti vapaat hydroksiryhmät esteröidään osittain tai täydellisesti tavanomaisten menetelmien mukaan 7 100598 vastaavalla karboksyylihappohalogenidilla (halogenidi = kloridi, bromidi) tai karboksyylihappoanhydridillä.

Lähtöaineiden valmistus 1) 1(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyyliok-5 si)-20(S)-formyyli-9,10-secopregna-5E,7E,10(19)-trieenil:

Yhdisteen 1 valmistus tapahtuu julkaisun "H. J. Cal-verley. Tetrahedron 43, 4609 (1987)" mukaan; katso myös kansainvälinen WO-patenttihakemus 87/00 834. Siinä on kuvattu myös lähtöyhdisteen, jossa R1 on vety, valmistusta.

10 2) l(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyyliok- si)-20(R)-metyyli-9,10-secopregna-5E, 7E,10(19)-trieeni-21-karbaldehydi 2

Aldehydia 2 valmistetaan uuden menetelmän mukaisesti.

15 a) Suspensioon, jossa on 1,8 g natriumhydridiä (80-prosenttista öljyssä) 70 ml:ssa abs. THF:ää, tiputetaan 25 °C:ssa liuos, jossa on 15,57 g dietyylifosfono-etoksietikkahappoetyyliesteriä (valmistettu julkaisun "W. Grell und H. Machleidt, Liebigs Ann. Chem. 699, 53 20 (1966)" mukaan) 200 ml:ssa THF:ää. Lisäyksen jälkeen se koitetaan edelleen 30 min ajan 60 °C:ssa, jäähdytetään uudelleen 25 °C:een ja lisätään tipoittain liuos, jossa on 6.2 g yhdistettä 1 70 ml:ssa THF:ää. Sekoitetaan 2 tuntia paluujäähdyttäen, sitten jäähdytetty reaktioliuos kaade-

25 taan veteen ja uutetaan etyyliasetaatilla. Sen jälkeen, I

kun on kuivattu (Na2S04:llä) ja haihdutettu, saatu raaka-tuote kromatografioidaan silikageelillä käyttäen heksaa-ni/etyyliasetaattia. Pääfraktiosta saadaan tulokseksi 5.2 g 1(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi)- 30 23-(etoksi-9,10-secokola-5E,7E,10(19)-tetraeeni-24-happo- etyyliesteriä C-22-kaksoissidosisomeerien öljymäisenä seoksena.

b) 5,2 g kohdassa a) saatua tuotetta liuotetaan 120 ml:aan tolueenia ja 0 °C:ssa lisätään hitaasti 20 ml 35 20-prosenttista di-isobutyylialuminiumhydridi-liuosta to- lueenissa. Sen jälkeen, kun on pidetty 30 minuutin ajan 8 100598 0 °C:ssa, reaktioliuos kaadetaan varovasti NH4Cl-liuokseen ja uutetaan etyyliasetaatilla. Tavanomaisen edelleenkäsit-telyn jälkeen saadaan 4,88 g 1(S),3(R)-bis-(tert.-butyyli-dimetyylisilyylioksi)-23-etoksi-9,10-secokola-5E,7E, 10- 5 (19),22-tetraen-24-olia värittömänä öljymäisenä isomeeri- seoksena, jota käytetään seuraavaan vaiheeseen ilman eri puhdistusta.

c) Kohdassa b) valmistettua yhdistettä (4,88 g) sekoitetaan 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa seoksessa, jo- 10 ka koostuu 55 ml:sta dikloorimetaania ja 55 ml:sta 70-pro-senttista vesipitoista etikkahappoa. Lopuksi neutraloidaan lisäämällä NH3-liuosta ja uutetaan dikloorimetaanilla. Raa-katuote kromatografioidaan silikageelillä käyttäen heksaa-ni/etyyliasetaattia. Tällä tavalla saadaan 2,02 g 15 1(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi)-24-hyd- roksi-9,10-secokola-5E,7E,10(19)-trieeni-23-onia 5 värittömänä öljynä.

1H-NMR (CDC13): 6 = 0,01 ppm (s,12H,Si-CH3), 0,52 (s,3H, H-18), 0,81 ja 0,84 (s, kulloinkin 9H, Si-t-butyyli), 0,90 20 (d,J=7Hz,3H,H-21), 3,09 (t,J=5Hz,1H-0H), 4,10 (dd,lH, H-24), 4,16 (m,1H,H-3), 4,21 (dd,1H,H-24), 4,39 (m,lH, H-l), 4,88, 4,93 (s, kulloinkin 1H,H-19), 5,77, 6,39 (d, J=llHz, kulloinkin lH,H-6,H-7).

d) Kohdassa c) saatu tuote (2,02 g) liuotetaan 25 25 ml:aan metanolia ja 25 ml:aan THF:ää ja 0 °C:ssa lisätään 300 mg natriumboorihydridiä. Sekoitetaan 1,5 tunnin ajan 0 °C:ssa, sitten reaktioseos kaadetaan NH4C1-liuokseen ja uutetaan etyyliasetaatilla. Saadaan 1,75 g 1 ( S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi)-9,10-30 secokola-5E,7E,10(19)-trieeni-23,24-diolia 6 värittömänä öljymäisenä 23epimeerien seoksena, jota käytetään sellaisenaan seuraavaan vaiheeseen.

e) 1,75 g kohdassa d) saatua tuotetta liuotetaan 40 ml:aan tolueenia ja jäävedellä jäähdyttäen lisätään 35 annoksittain 1,23 g lyijytetra-asetaattia. Sekoitetaan 9 100598 30 minuuttia, lisätään uudelleen 1,0 g Pb(0Ac)4:ää ja sekoitetaan edelleen 15 minuuttia +5 - +10 °C:ssa.

Edelleenkäsittelyä varten lisätään NaHC03-liuosta, muodostunut suspensio suodatetaan celiten läpi ja suodos 5 uutetaan etyyliasetaatilla. Raakatuote kromatografioidaan silikageelillä käyttäen heksaani/etyyliasetaattia. Sen jälkeen, kun pääfraktio on kiteytetty etanolista, saadaan 560 mg 1(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi)-20(R)-metyyli-9,10-secopregna-5E,7E,10(19)-trieeni-21-10 karbaldehydia, jonka sulamispiste on 101 - 104 eC.

Aldehydin 1 tai 2 reaktio fosforaanin kanssa, jolla on kaava 0 R5

15 JL

\ X ^ ^ R6 johtaa yleisen kaavan IV mukaisiin yhdisteisiin (Wittig-reaktio).

20 Käytettyjen fosfori-ylidien valmistus 1)Isobutyylikarbonyylimetyleenitrifenyylifosforaa-ni a) Bromimetyyli-isobutyyliketoni 50 ml:aan isobutyylimetyyliketonia 240 ml:ssa meta-25 nolia lisätään 0 °C:ssa 20 ml bromia ja lisäyksen jälkeen sekoitetaan vielä 1,5 tuntia +10 °C:ssa. Tämän jälkeen lisätään 360 ml vettä ja sekoitetaan edelleen 16 tuntia huoneenlämpötilassa .

Edelleenkäsittelyä varten reaktioseokseen lisätään 30 kyllästettyä keittosuolaliuosta, erottuva orgaaninen faasi erotetaan ja vesipitoinen faasi uutetaan eetterillä. Yhdistetyt orgaaniset faasit pestään 10-prosenttisella Na2C03-liuoksella ja kuivataan Na2S04:llä. Suodattamisen jälkeen liuotin poistetaan tislaamalla vesisuihkuvakuumis-35 sa ja jäännös tislataan. Pääfraktio sisältää 53,7 g bromi-metyyli-isobutyyliketonia, jonka Kp15'20 on 67 - 69 °C.

10 100598 b) Isobutyylikarbonyylimetyylitrifenyylifosfonium- bromidi

Bromimetyyli-isobutyyllketoni (53,6 g) ja trifenyy-lifosfiini (78,5 g) sekoitetaan perusteellisesti keskenään 5 500 ml:n pyörökolvissa ja alkavan voimakkaan lämpösävytty- misen päätyttyä annetaan seistä 12 tuntia typpiatmosfää-rissä huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen kiinteä reaktio-massa liuotetaan 330 ml:aan metyleenikloridia ja kuumennetaan 30 minuuttia paluujäähdyttäen. Sen jälkeen, kun on 10 lisätty 500 ml eetteriä, jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja tuote eristetään suodattamalla. Kuivaamisen jälkeen saadaan 111,7 g fosfoniumsuolaa, jonka sulamispiste on 244 - 245 °C.

c) Isobutyylikarbonyylimetyleenitrifenyylifosfo- 15 raani 111,6 g:aan kohdassa b saatua fosfoniumbromidia lisätään menestyksellisesti 1 500 ml metyleenikloridia ja 1 500 ml 2N-NaOH:ta ja sekoitetaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Orgaaninen faasi erotetaan, pestään vedellä 20 ja kuivataan Na2S04:llä. Haihduttamisen jälkeen saatu kiinteä jäännös kiteytetään uudelleen tert.-butyylimetyylieet- teristä, ja tulokseksi saadaan 72,2 g ylidiä, jonka sulamispiste on 120 - 121 °C.

2) Isoamyylikarbonyylimetyleenitrifenyylifosforaa- 25 ni

Otsikonyhdisteen muodostus tapahtuu vastaavasti, kuten kohdassa 1 kuvatussa menetelmässä bromaamalla iso-amyylimetyyliketoni, antamalla bromidin reagoida trife-nyylifosfiinin kanssa fosfoniumsuolaksi ja muodostamalla 30 ylidi 2N NaOH:n kanssa.

50,0 ml:sta isoamyylimetyyliketonia ja 18,2 ml:sta bromia saadaan tislaamalla suoritetun puhdistuksen jälkeen 54,68 g l-bromi-5-metyyli-heksan-2-onia, jonka Kp15'20 on 80 - 86 °C.

11 100598 54,58 g:sta bromidia ja 74,14 g:sta trifenyylifos-fiinia saadaan 91,6 g fosfoniumsuolaa, jonka sulamispiste on 230 - 233 °C.

91,6 g:sta fosfoniumsuolaa saadaan sen jälkeen, kun 5 on käsitelty NaOH:lla ja raakatuote on kiteytetty uudelleen metyleenikloridi/esteristä, 69,8 g otsikonyhdistettä, jonka sulamispiste on 64 - 67 “C.

3) Isopropoksimetyylikarbonyylimetyleenitrifenyyli-fosforaani 10 2,43 g natriumia liuotetaan 150 ml:aan isopropano lia. Sen jälkeen, kun on lisätty 20,0 g kloorimetyylikar-bonyylimetyleenitrifenyylifosforaania (R.F. Hudson et ai., J. Org. Chem. 28, 2446, 1963), liuotettuna 200 ml:aan isopropanolia, kuumennetaan 8 tuntia paluujäähdyttäen.

15 Jäähdytetty reaktioseos kaadetaan keittosuolaliuok seen ja uutetaan etyyliasetaatilla. Haihduttamisen jälkeen saatu öljyinen jäännös kromatografioidaan silikageelillä käyttäen etyyliasetaattia. Saadaan 9,53 g otsikonyhdistettä, jonka sulamispiste on 134 eC.

20 4) (2-isopropoksietyyli)-karbonyylimetyleenitrife- nyylifosforaani a) l-bromi-4-isopropoksi-butan-2-oni

Liuokseen, jossa on 68,2 g 4-isopropoksi-2-butano- nia (F.B. Hasan et ai., J. Biol. Chem. 256, 7781, 1981) 25 315 ml:ssa metanolia lisätään tipoittain 0 °C:ssa 26,9 ml bromia ja tämän jälkeen sekoitetaan 1,5 tuntia +10 °C:ssa. Lopuksi reaktioliuokseen tiputetaan 470 ml vettä ja sekoitetaan 16 tuntia huoneenlämpötilassa. Edelleenkäsittelyä varten kaadetaan kyllästettyyn keittosuolaliuokseen ja 30 uutetaan eetterillä. Tislaamalla raakatuote saadaan tulokseksi 78,07 g bromi johdannaista, jonka Kp15'20 on 95 °C.

b) 4-isopropoksi-2-okso-butyyli-trifenyylifosfo-niumbromidi 78,0 g:sta kohdassa a) saatua bromidia ja 35 97,85 g:sta trifenyylifosfiinia saadaan kohdassa 1 kuvatun 12 100598 menetelmän mukaisesti 133,35 g fosfoniumsuolaa, jonka sulamispiste on 183 °C.

c) (2-isopropoksietyyli)-karbonyylimetyleenitrife-nyylifosforaani 5 Kohdassa b) saatua fosfoniumbromidia (133,2 g) kä sitellään, kuten kohdassa 1 kuvattiin 2N-NaOH:lla metylee-nikloridissä. Sen jälkeen, kun raakatuote on kiteytetty uudelleen etyyliasetaatista saadaan 64,38 g otsikon yhdistettä, jonka sulamispiste on 97 °C.

10 5) (1-etyylipropoksimetyyli)-karbonyylimetyleeni- trifenyylifosforaani

Liuoksen, jossa on 3,04 g natriumia 100 ml:ssa 3-pentanolia annetaan reagoida 25,0 g:n kanssa kloorime-tyylikarbonyylimetyleenitrifenyylifosforaaniavastaavasti, 15 kuten isopropoksimetyylikarbonyylimetyleenitrifenyylifos- foraanin valmistuksessa. Otsikonyhdiste saadaan kiteytyneenä öljynä, jonka sulamispiste on 66 - 70 eC.

6) Syklopropyylimetoksimetyylikarbonyylimetylee-nitrifenyylifosforaani 20 Liuoksen, jossa on 5,58 g natriumia 25,0 g:ssa syk- lopropyylimetanolia ja 200 ml tolueenia annetaan reagoida 30.0 g:n kanssa kloorimetyylikarbonyylimetyleenitrifenyy-lifosforaania vastaavasti, kuten isopropoksimetyylikarbo-nyylimetyleenitrifenyylifosforaanin valmistuksessa. Otsi- 25 konyhdiste saadaan kiinteänä aineena, jonka sulamispiste on 121 °C.

7) (3-butinyyli)-karbonyylimetyleenitrifenyyli-fosforaani 20,0 g metyylikarbonyylimetyleenitrifenyylifosfo- 30 raania liuotetaan 528 ml:aan tetrahydrofuraania ja -78 °C:ssa lisätään tipoittain 41,3 ml butyylilitiumia (1,6 molaarinen liuos heksaanissa). Lopuksi tiputetaan 5.0 ml propargyylibromidia. Reaktioseos lisätään huoneenlämpötilaan lämmittämisen jälkeen jää/keittosuola-liuok- 35 seen ja seos uutetaan etikkaesterillä. Sen jälkeen, kun 13 100598 orgaaninen faasi on kuivattu natriumsulfaatilla saadaan 23,4 g kiinteätä ainetta. Suorittamalla pylväskromatogra-finen puhdistus (silikageeli/etikkaesteri) saadaan tulokseksi 15,4 g otsikonyhdistettä, jonka sulamispiste on 5 135 - 136 eC.

8) (3-butenyyli)-karbonyylimetyleenitrifenyylifos- foraani

Antamalla 15,0 g:n metyylikarbonyylimetyleenitrife-nyylifosforaania 471 ml:ssa tetrahydrofuraania reagoida 10 31,0 ml:n kanssa butyylilitiumia ja 4,28 ml:n kanssa al- lyylibromidia vastaavasti kuten kohdassa 7, saadaan otsi-konyhdiste kiteytyneenä öljynä, jonka sulamispiste on 92 -93 °C.

Vaihtelemalla Wittig-reagenssin valmistuksessa käy-15 tettyjä keto-komponentteja voidaan vastaavalla tavalla saada muita fosforaaneja, joiden voidaan antaa reagoida aldehydin 1^ tai 2 kanssa vastaavasti, kuten seuraavassa on kuvattu, muiksi yleisen kaavan IV mukaisiksi yhdisteiksi.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden D-vitamiiniaktivi-20 teetti määritetään kalsitrioli-reseptoritestin avulla. Se suoritetaan käyttäen riisitautia sairastavien kanojen suolesta saatua spesifistä reseptoriproteiinia. Reseptoria sisältävää sitojaproteiinia inkuboidaan 3H-kalsitriolin (0,5 ng/ml) kanssa reaktiotilavuuden ollessa 0,575 ml tes-25 tiaineiden läsnäollessa ja ilman testiaineita 1 tunnin ajan koeputkessa. Vapaasta ja reseptoriin sitoutuneesta kalsitriolista erottamiseksi suoritetaan puuhiilidekst-raaniabsorptio. Tätä tarkoitusta varten jokaiseen koeputkeen lisätään 200 μΐ puuhiilidekstraanisuspensiota ja in-30 kuboidaan 22 °C:ssa 30 minuutin ajan. Lopuksi näytteitä sentrifugoidaan 1 500 x g nopeudella 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. Päälläoleva kerros dekantoidaan ja sen jälkeen kun on annettu tasapainottua noin 1 tunnin ajan, mitataan atomi-valossa β-laskijalla.

35 Käyttäen testiaineen sekä vertailuaineen (leimaama- ton kalsitrioli) eri konsentraatioita 3H-kalsitriolin kon- 14 100598 sentraation ollessa vakio, saadaan kompetiitiokäyrät, joita verrataan toisiinsa ja näin saadaan kompetiitiote-kijä (KF).

Se on määritelty kunkin testiaineen ja vertailuai-5 neen 50 prosenttiseen kompetiitioon tarvittavien konsent-raatioiden osamääräksi:

Testiaineen konsentraatio kompetiition ollessa 50 % KF* _ 10 Vertailuaineen konsentraatio kompetiition ollessa 50 % Tämän mukaisesti 24-(l-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola-5Z, 7E, ΙΟΙ 5 (19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-diolin (yhdisteen A) kompe- tiitiotekijäarvo on 2,0 ja 24-(l-hydroksi-3-metyylibutyy-li)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S), 3(S) -diolin (yhdisteen B) kompetiitiotekijäarvo on 3,6.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden solujen uudiskasvua 20 estävän vaikutuksen määrittämiseksi suoritetaan seuraavas- sa kuvattu testi käyttäen testiaineina yhdisteitä A ja B.

Vastasyntyneiden hiirten ihon pintakerroksen solut preparoidaan muunnellen julkaisussa "Yuspa, S. und Harris, C.C., "Altered differentiation of mouse epidermall cells 25 treated with retinyl acetate in vitro", Exp. Cell Res. 86:95 - 105, 1974" kuvattua menetelmää ja suoritetaan viljely.

Kumpaakin sukupuolta olevat vastasyntyneet NMRI-hiiret tapetaan poistamalla pää, iho preparoidaan, pestään 30 antibioottiantimykoottiliuoksessa ja inkuboidaan ihopuolen ollessa alaspäin Dispase-II-liuoksessa (1,2 U/ml kudosvil-jelyväliaineessa M199 + 25 mmol/1 HEPES + 15 % naudan sikiön seerumia (FCS) + 50 U/ml penisilliini/streptomysii-niä (P/S) (preparointiväliaine PM) 4 °C:ssa yön ajan. Ihon 35 pintakerros poistetaan ja käsittelemällä trypsiinillä valmistetaan kertasolususpensio. Sentrifugoinnin jälkeen so-

O

15 100598 lusedimentti suspensoidaan uudelleen, ja sen jälkeen kun trypaanisinen on annettu vaikuttaa, määritetään elävien pienien pyöreiden solujen lukumäärä, ja solut pipetoidaan solutiheyden ollessa 4 x 105 solua/cm2 Primaria-24-kuoppa-5 levyille kudosviljelyväliaineeseen (M199 + 15 % FCS + 50 U/ml P/S). Sen jälkeen, kun on inkuboitu 24 tunnin ajan 37 eC:ssa, solut pestään fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja inkuboidaan edelleen 24 tunnin ajan seerumivapaassa kudosviljelyväliaineessa (Ml99 + 50 U/ml 10 P/S + 0,5 % etanolia) testiaineiden kanssa ja ilman testi-aineita 32,5 °C:ssa. Sitten lisätään 0,4 pCi/50pl 3H-metyy-li-tymidiiniä (40Ci/mmol). 4 tunnin kuluttua väliaine imu-suodatetaan ja reaktio päätetään lisäämällä 500 μΐ jääkylmää, 10-prosenttista trikloorietikkahappoa (TCA). Solut 15 pestään TCA:11a ja PBS:llä, liuotetaan inkuboimalla pro-teinaasi-K-liuoksessa (10 mmol/1 Tris-HCl, 10 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 NaCl, 0,2 % Triton-X 100, pH 8,0, 50 pg/ml pro-teiinikinaasi K) ja liuennut aines selvitetään sentrifu-goimalla. Radioaktiivisuus määritetään päälläolevasta ker-20 roksesta skintillaatiofotometrisesti ja DNA:n diamidinofe-nyyli-indolilla (DAPI) tapahtuneen spesifisen värjäyksen jälkeen määritetään DNA-konsentraatio fluoresenssifotomet-risesti.

Tämän mukaisesti kalsitrioli sekä yhdisteet A ja B 25 estävät annoksesta riippuen 3H-tymidiinin kulkeutumisen DNA:hän seuraavilla IC50-arvoilla:

Kalsitrioli 2 x 10*9 moolia/1

Yhdiste A 1 x 10'8 moolia/1 30 Yhdiste B 3,2 x 10‘9 moolia/1

Kalsitriolin sekä kaavan I mukaisten yhdisteiden 26,27-syklo-24a,24b-dihomo-9,10-secokolesta-5Z,7E,10(19), 23E-tetraeeni-l(S),3(R),24a(R)-triolin (yhdisteen C) ja 35 26,27-syklo-24a,24b-dihomo-9,10-secokolesta-5Z,7E,10(19), 23E-tetraeeni-l(S),3(R),24a(S)-triolin (yhdisteen D) so- 16 100598 lujen erilaistumista stimuloivat vaikutukset eivät käytännössä eroa ollenkaan.

On kirjallisuudesta (Mangelsdorf, D. J. et ai, J. Cell. Biol. 98: 391 - 398 (1984)) tunnettua, että 5 ihmisen leukemiasolujen (promyelosyyttisolulinja HL 60) käsittely kalsitriolilla in vitro saa aikaan solujen erilaistumisen makrofageiksi.

Kalsitriolianalogien solujen erilaistumista stimuloivan vaikutuksen kvantifioimiseksi suoritetaan seuraa-10 vassa esitetty testi: HL 60-soluja viljellään kudosviljelyväliaineessa (RPMI - 10 % naudan sikiön seerumia) 37 °C:ssa 5-prosent-tisessa C02/ilma-atmosfäärissä.

Aineen testaamiseksi solut sentrifugoidaan ja 2,8 x 15 105 solua/ml liuotetaan fenolipunaisesta vapaaseen kudos vil jelyväliaineeseen. Testiaineet liuotetaan etanoliin ja kudosviljelyväliaine laimennetaan ilman fenolipunaista halutuksi konsentraatioksi. Laimennusvaiheet sekoitetaan so-lususpension kanssa suhteessa: 1:10 ja kulloinkin 100 μΐ 20 tätä solususpensiota, johon on lisätty ainetta, pipetoi-daan 96-kuoppalevylle. Kontrollia varten solususpensioon lisätään vastaavasti liuotinta.

Sen jälkeen, kun on inkuboitu 96 tunnin ajan 37 °C:ssa 5-prosenttisessaisessa C02/ilma-atmosfäärissä, 25 solususpensioon pipetoidaan 96-kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan 100 μΐ NBT-TPA-liuosta (nitrosinitetratsoli (NBT), seoksen loppukonsentraatio 1 mg/ml, tetradekanoyyliforbo-limyristaatti-13-asetaatti (TPA), seoksen loppukonsentraatio 2 x 10‘7 mol/-l).

30 Inkuboimalla 2 tuntia 37 °C:ssa ja 5-prosenttisessa C02/ilma-atmosfäärissä NBT pelkistyy TPA:n stimuloiman so-lunsisäisten happiradikaalien vapautumisen johdosta makrofageiksi erilaistuvissa soluissa liukenemattomaksi format-saaniksi.

17 100598

Reaktion päättämiseksi 96-kuoppalevyn kuopat imetään tyhjäksi ja tarttuvat solut kiinnitetään lisäämällä metanolia ja kiinnityksen jälkeen kuivataan.

Muodostuneiden solunsisäisten formatsaanikiteiden 5 liuottamiseksi jokaiseen kuoppaan pipetoidaan 100 μΐ ka-liumhydroksidia (2 val/1) ja 100 μΐ dimetyylisulfoksidia ja suoritetaan 1 minuutin kestävä ultraäänikäsittely. For-matsaanin konsentraatio mitataan spektraalifotometrisesti aallonpituudella 650 nm.

10 Mittana HL 60-solujen makrofageiksi erilaistumisin- duktiolle pidetään muodostuneen formatsaanin konsentraa-tiota. Testiaineen suhteellinen vaikutus käy ilmi osamäärästä : ED50-testiaine/ED50-kalsitrioli.

Tämän mukaisesti kalsitriolilla, yhdisteellä C ja 15 yhdisteellä D on ED50-arvot: 1,8 x 10~9 mol/1, 2,2 x 10'9 mol/1 tai 2,5 x 10"9 mol/1.

Pienentyneen hyperkalsemiariskin johdosta kaavan I mukaiset yhdisteet soveltuvat erityisesti sellaisten lääkeaineiden valmistamiseksi, joita käytetään hoidettaessa 20 sairauksia, joille on tunnusomaista epänormaali solunjakautuminen, esimerkkinä ihon hyperproliferatiiviset sairaudet (psoriasis) ja pahanlaatuiset kasvaimet (leukemia, paksusuolen syöpä, rintasyöpä).

Farmaseuttiset valmisteet sisältävät vähintään yhtä 25 yleisen kaavan I mukaista yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa. Yhdisteitä voidaan käyttää liuoksina farmaseuttisesti hyväksyttävissä liuottimissa tai emulsioina, suspensioina tai dispersioina tarkoitukseen soveltuvissa farmaseuttisissa liuottimissa 30 tai kataja-aineissa tai pillereinä, tabletteina tai kapseleina, jotka sisältävät sinänsä tunnetulla tavalla kiinteitä kantaja-aineita. Paikallisessa annostelussa yhdisteitä käytetään edullisesti emulsiovoiteina tai salvoina tai vastaavina paikalliseen käyttöön soveltuvina lääkeai-35 neina. Jokainen tällainen valmiste voi sisältää myös muita 18 100598 farmaseuttisesti hyväksyttäviä ja ei-toksisia apuaineita, kuten esim. stabilisaattoreita, antioksidantteja eli hapetuksen estoaineita, sideaineita, väriaineita, emulgaatto-reita tai makua parantavia aineita. Yhdisteet annostellaan 5 edullisesti ruiskeena tai sopivien steriilien liuosten laskimonsisäisenä infuusiona tai suun kautta tapahtuvana annostuksena ruoansulatuskanavan kautta tai paikallisesti emulsiovoiteina, salvoina, lotioneina tai sopivana depot-laastarina, kuten EP-A-patenttijulkaisussa 0 387 077 on 10 kuvattu. Päivittäinen annos on 0,1 pg/potilas/päivä - 1 000 pg (1 mg)/potilas/päivä, edullisesti 1,0 pg/poti-las/päivä - 500 pg /potilas/päivä.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä annostellaan yleensä vastaavasti, kuten psoriaasiksen hoidossa käytettävää tun-15 nettua valmistetta "Calsipotriolia"

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1

Liuosta, jossa on 1,6 g l(S),3(R)-bis-(tert.-butyy-lidimetyylisilyylioksi)-20(R)-metyyli-9,10-secopregna-20 5E,7E,10(19)-trieeni-21-karbaldehydia 50 ml:ssa tolueenia sekoitetaan sen jälkeen, kun on lisätty 3,02 g isoamyyli-karbonyylimetyleenitrifenyylifosforaania, 16 tunnin ajan 80 °C:ssa argon-atmosfäärissä. Lopuksi liuotetaan poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa ja jäännös kro-25 ma-tografioidaan silikageelillä käyttäen heksaani/etyy- li-asetaattia. Pääfraktiosta saadaan tulokseksi 1,15 g [1( S), 3(R)-bis-( tert. -butyylidimetyylisilyylioksi )-9,10-secokola-5E,7E,10(19),23(E)-tetraen-24-yyli]-4-metyyli-pentan-l-onia värittömänä öljynä.

30 1H-NMR (CDC13): δ = 0,01 ppm (s, 12H,Si-CH3), 0,56 (s,3H,H-18), 0,87 (s,18H, Si-t.-butyyli), 0,88 (d,J=7Hz, 6H,C-(CH3)2), 0,95 (d, J=7Hz,3H,H-21); 4,25 (m,lH,H-3); 4,55 (m, 1H, H-l); 4,94 ja 5,00 (s, kulloinkin 1H,H-19); 5,82 ja 6,46 (d,J=HHz, kulloinkin lH,H-6,H-7); 6,10 35 (d,J=16Hz,lH,H-24); 6,80 (m,lH,H-23).

19 100598

Esimerkki 2 572 mg Cer(III)-kloridi-heptahydraattia liuotetaan 10 ml:aan metanolia ja lisätään esimerkin 1 mukaan valmistettu yhdiste (1,10 g) 5 ml:aan metanolia liuotettuna. Sen 5 jälkeen, kun on lisätty 61 mg natriumboorihydridiä sekoitetaan 30 min ajan 0 °C:ssa. Edelleenkäsittelyä varten kaadetaan veteen, uutetaan dikloorimetaanilla, kuivataan (Na2S04:llä) ja haihdutetaan. Näin saatu diastereomeeristen alkoholien seos erotetaan kromatografioimalla silikagee-10 Iillä käyttäen heksaani/etyyliasetaattia. Saadaan eluoin- tijärjestyksessä 290 mg l(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidi-metyylisilyylioksi)-24-(l-hydroksi-4-metyylipentyyli)-9,lO-seco-5E,7E,10(19),23(E)-kolatetraeeniä (epimeriä A) ja 120 mg epimeeriä B. Epimeereillä on identtiset NMR-15 spektrit.

:H-NMR (CDClj): δ = 0,01 ppm (s, 12H, Si-CH3 ), 0,49 (s,3H, H-18 ), 0,86 (s,18H, Si-t.-butyyli); 0,86 (d,J=7 Hz,6H, C-(CH3)2); 0,88 (d,J=7Hz,3H,H-21); 4,16 (m,lH,H-3); 4,48 (m,lH,H-l); 4,88 ja 4,93 (s, kulloinkin 1H,H-19); 5,40 20 (dd, J=15, 5 ja 7Hz, lH,H-24); 5,55 (m,lH,H-23); 5,77 ja 6,40 (d,J=llHz, kulloinkin lH,H-6,H-7).

Esimerkki 3

Liuosta, jossa on 290 mg esimerkissä 2 saatua tuotetta (epimeeriä A) 80 mlrssa tolueenia säteilytetään sen 25 jälkeen, kun on lisätty 44 mg antraseenia ja 0,01 ml tri-etyyliamiinia Pyrex-upporeaktorissa elohopeakorkeapaine-lampun (Philips HPK 125) avulla. Säteilytysaika on 3,5 minuuttia, liuoksen sekoittuminen taataan johtamalla siihen typpivirta. Sen jälkeen, kun on haihdutettu ja kromatogra-30 fioitu silikageelillä käyttäen heksaani/etyyliasetaattia saadaan 241 mg l(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyy-lioksi )-24-( l-hydroksi-4-metyylipentyyli )-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23(E)-tetraeeniä värittömänä öljynä.

[αί° = + 49,6° (CHC13, c = 0,425).

20 100598 Käsittelemällä 120 mg esimerkin 2 mukaan saatua polaarista isomeeriä (epimeeriä B) vastaavasti saadaan 113 mg värittömänä öljynä.

[a] |°« + 41,4° (CHC13, c = 0,285).

5 Esimerkki 4

Liuosta, jossa on 225 mg esimerkin 3 mukaisesti epimeeristä A saatua tuotetta 5 ml:ssa THF:ää, sekoitetaan 60 minuutin ajan 60 °C:ssa sen jälkeen, kun on lisätty 1,31 ml lM-tetrabutyyliammoniumfluoridi-liuosta THF:ssä.

10 Jäähdyttämisen jälkeen kaadetaan kyllästettyyn keittosuolaliuokseen ja uutetaan etyyliasetaatilla. Raakatuote kro-matografioidaan silikageelillä käyttäen heksaani/etyyli-asetaattia ja saadaan 85 mg 24-(l-hydroksi-4-metyylipen-tyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23(E)-tetraeeni-15 1(S),3(R)-diolia valkoisena vaahtona.

^-NMR (CDCI3): 6 = 0,57 ppm (s,3H,H-18), 0,84 (d, J=7Hz,3H,H-21); 0,92 (d,J=7Hz,6H,C-(CH3)2; 4,03 (m,lH, H-25); 4,23 (m,lH,H-3); 4,43 (m,lH,H-l); 5,00 ja 5,33 (s, kulloinkin 1H,H-19); 5,45 (dd,J=15,5 ja 7Hz, lH,H-24); 20 5,60 (m; 1H, H-23); 6,02 ja 6,38 (d,J=HHz, kulloinkin 11H,H-6,H-7).

Käsittelemällä esimerkin 3 mukaisesti epimeeristä B saatua tuotetta (85 mg) saadaan tulokseksi 35 mg epimeeristä triolia värittömänä öljynä. Epimeerien NMR-spektrit 25 ovat identtiset.

Esimerkki 5

Vastaavasti, kuten esimerkissä 1 kuvatussa menetelmässä annetaan 2,05 g:n l(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidime-tyylisilyylioksi)-20-(R)-metyyli-9,10-secopregna-30 5E,7E,10(19)-trieeni-21-karbaldehydia 53 ml:ssa tolueenia reagoida 3,4 g:n kanssa isobutyylikarbonyylimetyleenitri-fenyylifosforaania. Sen jälkeen kun on puhdistettu kromatografisesta saadaan [l(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyy-lisilyylioksi )-9,10-secokola-5E, 7E, 10( 19 ), 23( E )-tetraen- 21 100598 24-yyli]-3-metyyli-butan-l-oni, jonka sulamispiste on 79-81 °C (etanolista).

[α] o° * + 52,6° (CHC13, c = 0,500).

Esimerkki 6 5 Pelkistämällä 1,75 g esimerkissä 5 saatua tuotetta esimerkin 2 olosuhteissa saadaan 1(S),3(R)-bis-(tert.-bu-tyylidimetyylisilyylioksi)-24-(1(R,S)-hydroksi-3-metyyli-butyyli)-9,10-secokola-5E,7E,10(19),23E-tetraeeni epimee-rien öljymäisenä seoksena. Kromatografioimalla silikagee-10 Iillä käyttäen heksaani/etyyliasetaattia saadaan eluointi-järjestyksessä 780 mg epimeeriä A ja 600 mg epimeeriä B värittöminä öljyinä, jotka eivät ole erotettavissa NMR-spektroskooppisesti.

Esimerkki 7 15 Suorittamalla triplettisensibilisoitu fotoisomeri- sointi vastaavasti, kuten esimerkissä 3 ja lohkaisemalla lopuksi silyylieetteri esimerkin 4 mukaisesti saadaan 700 mg:sta esimerkin 6 mukaan valmistettua epimeeriä A 240 mg 24-(l-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola-20 5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-diolia (yhdiste A) hajoamisalueen ollessa 119-125 °C, [a]£° = + 38,8° (meta- noli, c = 0,505).

Käsittelemällä vastaavasti 330 mg epimeeriä B saadaan tulokseksi 129 mg 24-(l-hydroksi-3-metyylibutyyli)-25 9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(S)-diolia (yhdiste B) hajoamisalueen ollessa 139-145 °C, [a]*0 = + 54,8° (metanoli, c = 0,505).

Esimerkki 8

Liuosta, jossa on 170 mg esimerkin 5 mukaan saatua 30 tuotetta 5 ml:ssa THF:ää, sekoitetaan sen jälkeen, kun on lisätty 200 mg litium-tri-tert.-butoksi-aluminiumhydridiä, 90 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Edelleenkäsittelyä varten lisätään 0,8 ml kyllästettyä NH4Cl-liuosta, suodatetaan ja suodos haihdutetaan. Kromatografioimalla raakatuo-35 te Al203:lla (Merck, neutraali, vaihe III) saadaan tulok- 22 100598 seksi 108 mg l-[l(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisi-lyylioksi )-9,10-secokola-5E,7E,10(19)-trien-24-yyli]-3-metyyli-butan-l-onia värittömänä öljynä.

1H-NMR (CDC13): δ = 0,53 ppm (s,3H,H-18), 4,22 (m,lH,H-3); 5 4,54 (m,lH,H-l); 4,93 ja 4,98 (m, kulloinkin 1H,H-19); 5,82 ja 6,46 (d,J=llHz, kulloinkin lH,H-6,H-7).

Esimerkki 9

Suorittamalla fotokemiallinen kaksoissidosisomeri-sointi vastaavasti, kuten esimerkissä 3 ja lohkaisemalla 10 silyylieetteri esimerkin 4 mukaisesti saadaan tulokseksi 100 mg:sta esimerkin 8 tuotetta 50 mg l-[l(S),3(R)-dihyd-roksi-9,10-secokola-5Z, 7E, 10( 19 )-trien-24-yyli] -3-metyy-li-butan-l-onia.

UV (metanoli): = 212 nm ( =14 300), 265 (15 860).

15 Esimerkki 10

Antamalla 1,6 g:n 1(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidime-tyylisilyylioksi)-20(R)-metyyli-9,10-secopregna-5E,7E,10-(19 )-trieeni-21-karbaldehydia reagoida (2-isopropoksietyy-li)-karbonyylimetyleenitrifenyylifosforaanin kanssa vas-20 taavasti, kuten esimerkissä 1, saadaan tulokseksi 1,15 g 1-[1(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi)-9,10-secokola-5E, 7E, 10( 19 )-23( E )-tetraen-24-yyli] -3-iso-propoksi-propan-l-onia värittömänä öljynä.

1H-NMR (CDCI3): δ = 0,01 ppm (s,12H,Si-CH3); 0,55 (s,3H, 25 H-18); 0,86 ja 0,90 (s, kulloinkin 9H, Si-t.-butyyli); 0,96 (d,J=7Hz,3H,H-21), 1,15 (t,J=7Hz,6H,C-(CH3 )2); 3,60 (m,1H,CH-0 ), 3,73 (t,J=7Hz,2H,CH2-0); 4,23 (m,lH,H-3); 4,55 (m,lH,H-l); 4,95 ja 5,00 (m, kulloinkin 1H,H-19); 5,83 ja 6,46 (d,J=llHz, kulloinkin lH,H-6,H-7); 6,11 (d,J=15,5Hz, 30 1H,H-24); 6,87 (m,lH,H-23).

Esimerkki 11

Pelkistämällä vastaavasti, kuten esimerkissä 2, suorittamalla fotoisomerisointi vastaavasti, kuten esimerkissä 3 ja lohkaisemalla silyylieetteri esimerkin 4 35 mukaisesti saadaan 1,05 g:sta esimerkin 10 mukaan valmis- 23 100598 tettua tuotetta 143 mg 24-(1(R,S)-hydroksi-3-isopropoksi-propyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23-tetraeeni-1(S),3(R)-dio-lia diastereomeerien 1:1-seoksena, joka voidaan erottaa korkeapainenestekromatografiaa käyttäen. Iso-5 meerien NMR-spektrit ovat identtiset.

1H-NMR (CDC13): 6 = 0,57 ppm (s,3H,H-18), 0,94 (d,J=7Hz, 3H,H-21); 1,15 (d, J=7Hz, 6H,C(CH3 )2); 4,17 (m,lH,H-3); 4,21 (m,1H,H-25); 4,38 (m,lH,H-l); 4,98 ja 5,29 (m, kulloinkin 1H,H-19); 5,45 (dd,J=15,5 ja 7Hz,1H,H-24); 5,63 (m,lH, 10 H-23); 6,02 ja 6,38 (d,J=HH, kulloinkin lH,H-6,H-7).

Esimerkki 12 Lähtien aldehydista 1 ja isopropoksimetyylikarbo-nyylimetyleenitrifenyylifosforaanista saadaan vastaavasti, kuten esimerkkien 1-4 jaksossa isomeeri B (5Z,7E,22E-15 l(S),3(R),24(S)-9,10-seco-24a,24b-dihomo-24b-oksakolesta- 5,7,10(19)22-tetraeeni-l,3,24-trioli), jonka sulamispiste on 131 - 132 eC.

Esimerkki 13 Lähtien aldehydista 1 ja (2-isopropoksietyyli)-kar-20 bonyylimetyleenitrifenyylifosforaanista saadaan vastaavas ti, kuten esimerkkien 1-4 jaksossa isomeeri B (5Z,7E,22E-l(S),3(R),24(S)-9,10-seco-24a, 24b-trihomo-24c-oksakolesta-5,7,10(19)22-tetraeeni-l,3,24-trioli), jonka sulamispiste on 125 - 126 °C.

25 Esimerkki 14

Vastaavasti, kuten esimerkissä 1 0,85 g:n 1(S), 3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi)-20(R)-metyyli- 9 , 10-secopregna-5E, 7E, 10(19 ) -trieeni-21-karbaldehydia annetaan reagoida 4,5 g:n kanssa syklopropyylimetyylikar-30 bonyylitrifenyylifosforaania. Sen jälkeen, kun on puhdistettu kromatografioimalla silikageelillä käyttäen heksaa-ni/etikkaesteriä saadaan tulokseksi 500 mg l(S),3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi )-26,27-syklo-24a, 24b-dihomo-9,10-secokolesta-5E,7E,10(19)-23E-tetraen-24a-onia 35 värittömänä vaahtona.

24 100598 XH-NMR (CDC13): δ = 0,01 ppm ( s,12H,Si-CH3); 0,09 ja 0,50 (m, kulloinkin 2H,H-26 ja H-27); 0,50 (s,3H,H-18); 0,83 ja 0,85 (s, kulloinkin 9H, Si-t.-butyyli); 0,91 (d,J=7,3Hz, 3H,H-21), 0,96 (m,lH,H-25); 2,47 (d,J«6Hz,2H,H-24b); 4,16 5 (m,1H,H-3); 4,47 (m,1H,H-1); 4,89 ja 4,93 (s, kulloinkin 1H,H-19); 5,77 ja 6,40 (d,J=llHz, kulloinkin lH,H-6 ja H-7); 6,08 (d,J=15,5Hz,H-24); 6,75 (ddd,J=15,5, 9, 6,5 Hz, 1H,H-23).

Esimerkki 15 10 Pelkistämällä esimerkissä 14 saatu tuote vastaavas ti , kuten esimerkissä 2 saadaan tulokseksi 200 mg 1(S), 3(R)-bis-(tert.-butyylidimetyylisilyylioksi)-26,27-syklo-24a,24b-dihomo-9,10-secokolesta-5E,7E,10(19),23E-tetraen-24a(R,S)-olia epimeerien öljymäisenä seoksena, joka ei ole 15 erotettavissa NMR-spektroskooppisesti.

XH-NMR (CDCI3): 6 = 0,01 ppm (s, 12H, Si-CH3); 0,09 ja 0,40 (m, kulloinkin 2H,H-26 ja H-27); 0,50 (s,3H,H-18); 0,68 (m,lH,H-25); 0,81 ja 0,86 (s, kulloinkin 9H, Si-t.-butyyli); 0,88 (d,J=7Hz,3H,H-21); 1,40 (t,J=7Hz,H-24b); 4,13 20 (m, lH,H-24a); 4,17 (m,lH,H-3); 4,49 (m,lH,H-l); 4,88 ja 4,93 (s, kulloinkin 1H,H-19); 5,45 (dd,J=15,5, 6,5 Hz, 1H, H-24); 5,59 (ddd,J=15,5, 7, 6,5 Hz, lH,H-23); 5,77 ja 6,40 (d,J=llHz, kulloinkin lH,H-6 ja H-7).

Esimerkki 16 25 Vastaavasti, kuten esimerkissä 3 saadaan suoritta malla triplettisensibilisoitu fotoisomerisointi ja lohkaisemalla suojaryhmät esimerkin 4 mukaisesti 190 mgrsta esimerkissä 15 kuvattua yhdistettä 86 mg 26,27-syklo-24a,24b-dihomo-9,10-secokolesta-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-30 1(S),3(R),24a(R,S)-triolia diastereomeerien 1:1-seoksena, joka erotetaan korkeapainenestekromatografiaa käyttäen. Kummankin isomeerin NMR-spektrit ovat identtiset.

XH-NMR (CDCI3): δ = 0,09 ja 0,49 (m, kulloinkin 2H,H-26 ja H-27); 0,53 (s,3H,H-18); 0,70 (m,lH,H-25); 0,93 (d,J= 7Hz, 35 3H,H-21); 4,18 (m,1H,H-24a); 4,22 (m,lH,H-3); 4,43 (m,lH, 100598 25 H-l); 5,00 ja 5,32 (s, kulloinkin 1H,H-19); 5,50 (dd,J« 15,5, 6,5Hz,H-24); 5,64 (ddd,J=15,5, 7, 6,5 Hz, lH,H-23); 6,02 ja 6,38 (d,J=llHz, kulloinkin lH,H-6 ja H-7).

Esimerkki 17 5 Lähtien aldehydista 1 ja (1-etyylipropoksimetyyli)- karbonyylimetyleenitrifenyylifosforaanista saadaan vastaavasti, kuten esimerkkien 1-4 jaksossa isomeeri B (5Z,7E,-22E-1(S ),3(R),24(S)-26,27-dimetyyli-24a,24b-dihomo-24b-oksa-9,10-secokolesta-5,7,10(19)22-tetraeeni-l,3,24-trio-10 li), jonka sulamispiste on 103 - 105 °C.

Esimerkki 18 Lähtien aldehydista 1 ja syklopropyylimetoksime-tyylikarbonyylimetyleenitrifenyylifosforaanista saadaan vastaavasti, kuten esimerkkien 1-4 jaksossa isomeeri B 15 ( 5Z,7E,22E-l(S),3(R),24(S)-26,27-syklo-24a,24b,24c-tri- homo-24b-oksa-9,10-secokolesta-5,7,10(19)22-tetraeeni-1,3,24-trioli).

1H-NMR (DMS0-d6): δ = 0,16 ppm (m,2H); 0,43 (m,2H); 0,53 (S,3H); 1,00 (d,J=6Hz,3H); 3,21 (m,4H); 4,00 (m,2H); 4,19 20 (m,1H); 4,51 (d,J=5Hz,1H); 4,70 (d,J=5Hz,1H); 4,75 (m,lH); 4,82 (d,J=5Hz,1H); 5,21 (m,lH); 5,39 (m,2H); 5,98 (d,J« 11Hz,1H ); 6,10 (d,J=llHz,1H).

Esimerkki 19 Lähtien aldehydista 1 ja (3-butynyyli)-karbonyyli-25 metyleenitrifenyylifosforaanista saadaan vastaavasti, kuten esimerkkien 1-4 jaksossa isomeeri B (5Z,7E,22E-1(S),3(R),24(S )-24-(3-butynyyli)-9,10-secokola-5,7,10-(19)22-tetraeeni-l,3,24-trioli), jonka sulamispiste on 115 - 118 °C.

30 Esimerkki 20 Lähtien aldehydista 1 ja (3-butenyyli)-karbonyyli-metyleenitrifenyylifosforaanista saadaan vastaavasti, kuten esimerkkien 1-4 jaksossa isomeeri B (5Z,7E,22E-1(S),-3( R),24( S )-24-(3-butenyyli)-9,10-secokola-5,7,10(19)22-35 tetraeeni-1,3,24-trioli), jonka sulamispiste on 146 -147 eC.

Claims (2)

26 100598 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten sivuketjuhomologisten vitamiini-D-johdannaisten val-5 mistamiseksi, joiden kaava on /\ A I R ΙΓ / \/ I7\ 10 "f » ] H -' (I), 9 0 OH jossa A on suora sidos tai metyleeniryhmä, 20. ja D tarkoittavat vetyä tai B ja D muodostavat yhdessä sidoksen (E-konfiguraatio), R3 on vety ja R4 on hydroksi tai R3 on hydroksi ja R4 on vety tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä oksoryhmän, ja X on C^-alkyyli, C^-alkoksi-C^-alkyyli, syklopropyylimetyyli, 25 syklopropyylimetoksimetyyli, butynyyli tai butenyyli, sillä edellytyksellä, että kun A on suora sidos ja B ja D muodostavat yhdessä sidoksen, niin X ei ole C^-alkyyli tai syklopropyylimetyyli; tunnettu siitä, että yhdiste, jonka kaava on 27 100598 (IV),

10 R1'0 ‘ OR2 jossa R1 ja R2 ovat hydroksisuojaryhmiä ja A ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, muutetaan, mahdollisesti sen jälkeen kun sivuketjussa oleva kaksoissidos on selektiivi-15 sesti hydrattu niin, että saadaan yhdiste, jonka kaava on Λ x*vv AiA H o

20 I (iva), Λ 25 Rr0' N^/^OR2' jossa R1 , R2 , A ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, ja mahdollisesti karbonyylifunktion pelkistämisen jälkeen ja 30 mahdollisesti pelkistyksessä muodostuneiden kaavojen 28 100598 Λ yNV /\i B oh

5 I _( (Ilia) W)H · Ä - OH y < 111b) a*moh * e-oH . Λ mukaisten epimeeristen hydroksiyhdisteiden seoksen erottamisen jälkeen, joissa kaavoissa R1 , R2 , A, X ja B tar-15 koittavat samaa kuin edellä; säteilyttämällä ultraviolettivalolla yhdisteeksi, jonka kaava on /\ /k I OH

20. I (II), 25 l//^ r2V‘’ JR1’ jossa 5,6-kaksoissidoksen stereisomeria on muuttunut ja 30 jossa R1 , R2 , A, X, B ja D tarkoittavat samaa kuin edellä, minkä jälkeen hydroksisuojaryhmät poistetaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 24-(l(R)-hydroksi-4-metyylipentyyli )-9,10-secokola-5Z, 7E, -35 10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 29 100598 24-(1(S )-hydroksi-4-metyylipentyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 24-(1(R)-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 5 24-(1(S)-hydroksi-3-metyylibutyyli)-9,10-secokola- 5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 24-(1(R)-hydroksi-3-isopropoksipropyyli)-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 24-(1(S)-hydroksi-3-isopropoksipropyyli)-9,10-secokola-10 5Z,7E,10(19),23E-tetraeeni-l(S),3(R)-dioli, 24-isopropoksimetyyli-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),22E-tet-raeeni-1(S),3(R),24(R)-trioli, 24-isopropoksimetyyli-9,10-secokola-5Z,7E,10(19),22E-tet-raeeni-1(S),3(R),24(S)-trioli, 15 24-( 2-isopropoksietyyli )-9,10-secokola-5Z, 7E, 10(19), 22E- tetraeeni-l(S),3(R),24(R)-trioli, 24-( 2-isopropoksietyyli ) - 9,10-secokola-5Z, 7E, 10(19 ), 22E-tetraeeni-1(S),3(R),24(S)-trioli, 26.27- syklo-24a, 24b-dihomo-9,10-secokolesta-5Z, 7E, 10( 19 ), -20 23E-tetraeeni-l(S),3(R),24a(R)-trioli, tai 26.27- syklo-24a, 24b-dihomo-9,10-secokolesta-5Z, 7E, 10( 19 ), -23E-tetraeeni-l(S),3(R),24a(S)-trioli. 30 100598