CZ20011389A3 - Farmaceutické prostředky obsahující inhibitory poly (ADP-ribosa) glykohydrolázy a způsoby jejich použití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný které obsahují které jsou také těchto inhibitorů pro inhibici nebo se týká farmaceutických prostředků, póly(ADP-ribosa)glykohydrolázy, vynález inhibitory známy jako inhibitory PARG a způsobů použití snížení vyčerpání buněčné energie, poškození buněk nebo odumření buněk indukovaného volnými radikály. Obzvláště se předkládaný vynález týká farmaceutických prostředků obsahujících inhibitory poly(ADP-ribosa)glykohydrolázy jako jsou deriváty glukózy, ligninové glykosidy, hydrolyzovatelné taniny včetně ellagitaninů, adenosinové deriváty, akridinové 6,9-diamnino-2-ethoxyakridinlaktátmonohydrátu, analogy včetně tiloronu R10.556, daunomycin daunorubicinhydrochlorid, ellipticin, proflavin a inhibitory PARG a způsobů jejich použití při léčení prevenci nemocí nebo stavů způsobených vyčerpáním buněčné energie indukované volnými radikály a/nebo poškozením tkáně pocházejícím z poškození buněk nebo odumření buněk způsobeného nekrózou, apoptózou nebo jejich gallotaninů a deriváty včetně tiloronové nebo j iné nebo kombinací.

Dosavadní stav techniky

Současný výzkum v oblasti biomedicíny se hlavně zaměřuje na mechanismus odumírání buněk, jelikož pokračuje vývoj nových specifických léčebných látek, které tyto procesy regulují.

Odumírání buněk je obecně rozděleno do dvou kategorií:

apoptózy a nekrózy. Apoptóza, obvykle nazývaná programovaným odumřením buňky, je zvláště dobře charakterisovaná z hlediska svého vývoje, zatímco nekróza je více známá jako počáteční ·· · · · · · · · · · · • · ··· · · ·

reakce vůči drtivému škodlivému poškození. Programové odumření buňky je geneticky řízený proces, který se v jednotlivých buňkách řídí fyziologickými stimuly a obecně zahrnuje zvlnění buněčné membrány, jadernou a cytoplazmickou kondenzaci, nitronukleosomální rozštěpení DNA a nakonec fagocytózu buňky bez významného zanícení. Nekróza je rychlejší a těžší proces, který se vyskytuje u skupin buněk jako reakce na patologické poranění. Tento způsob odumření buňky je charakterizován otokem mitochondrií a endoplasmického retikula, po kterém následuje ztráta soudržnosti membrány a nahodilá destrukce DNA a ostatních makromolekul, což vrcholí značnou zánětlivou reakcí. Ačkoliv velká většina literatury pojednávající o odumírání buňky předpokládá, že všechny případy odumření buňky mohou být klasifikovány buď jako apoptóza nebo nekróza, existují v řadě paradigmatů odumření buňky aspekty obou mechanismů. Jedním příkladem je excitotoxicita, která následuje po mrtvicí a některých neurodegenerativních poruchách, při kterých je odumírání neuronů při nejmenším částečně důsledkem akumulace vysokých lokálních koncentrací glutamátu jako neuropřenašeče excitace. Zatímco po hypoxii okamžitě následující fáze odumření buňky nejvíce připomíná nekrózu, propagace poškození vyvolává sekundární lézi s mnoha rysy klasické apoptózy. Aby si v budoucnu vytvořili racionální přístupy k odumírání buněk neronů, měli by výzkumní pracovníci pravděpodobně posuzovat jednotlivá paradigmata nemocí jako když leží na jednotlivých pozicích někde na přímce mezi extrémy představovanými apoptózou a nekrózou.

Reparační enzym DNA póly(ADP-ribosa)polymeráza (PARP) (EC 2.4.2.30), také známý jako póly(ADP-ribosa)syntetáza nebo póly(ADP-ribosa)transferáza (PADRŤ), se jeví jako hlavní činitel průběhu postupu odumírání buňky. Rozštěpení PARP pomocí kaspasy-3 je určujícím charakteristickým rysem apoptózy

a PARP také rovněž hraje klíčovou roli při klasickém nekrotickém odumíráni buňky. PARP buněčného jádra je selektivně aktivovaná zlomy řetězce DNA tak, že katalyzuje připojení dlouhých rozvětvených řetězců póly(ADP-ribosy) (PAR) ze svého substrátu, nikotinamidadenindinukleotidu (NAD), k řadě proteinů buněčného jádra, nejpatrněji k samotné PARP. Masivní poškození DNA, takové, které je obecně důsledkem nekrotických stimulů, vyvolá velké zvýšení aktivity PARP, které rychle vyčerpá hladiny NAD v buňkách. Vyčerpání NAD, důležitého ko-enzymu v energetickém metabolismu, má za následek nižší produkci ATP. Navíc buňka při úsilí resyntetizovat NAD spotřebovává ATP a tato energetická krize kulminuje odumřením buňky. Koncepce odumření buňky, zprostředkovaného působením PARP, které následuje po nadměrném poškození DNA, je podporována řadou studií, popisujících prevenci odumření buňky a její ochranu pomocí selektivních inhibitorů PARP u myší s cílenou delecí genu PARP. Výrazná ochrana, kterou poskytují inhibitory PARP může u různých živočišných modelů vést k novým terapeutickým entitám.

Póly(ADP-ribosyl)-ace je zapojena do řady fyziologických jevů, jako je chromatinová dekondensace , replikace DNA, reparace DNA, genová exprese, maligní transformace, buněčná diferenciace a apoptóza. Aktivita PARP v buněčném jádře se hojně vyskytuje v celém těle, obzvláště v mozku, imunitním sytému a v liniích zárodečných buněk. Enzym PARP se může rozdělit na 3 hlavní domény. Koncová část A46-kD N- zahrnuje doménu vážící DNA, která obsahuje dva pohyblivé zinko-peptidy a signál lokalizace jádra. Tato oblast prostřednictvím prvního a druho pohyblivého zinko-peptidu rozeznává nesekvenčním způsobem jak zlomy dvouřetězcové tak jednořetězcové DNA. Středová automodifikační doména A 22 kD obsahuje 15 vysoce chráněných glutamátových residuí, které se považují za cíle vlastni póly(ADP-ribosyl)-ace a koncová oblast 54 kD Cobsahuje jak místa vázání NAD tak katalytickou doménu, která syntetizuje PAR.

Po připojení k zlomům v DNA se činnost PARP zvýší až 500krát, jelikož katalyzuje transfer a polymeraci jednotek ADP-ribosy jak na sebe, tak jiné proteiny buněčného jádra, včetně histonů a DNA tropoisomeráz I a II. Samotná PARP je hlavní in vivo póly(ADP-ribosyl)-ováný protein. Není jasné, jak vázání k zlomům řetězce DNA přes N-koncovou část PARP alostericky aktivuje katalytickou doménu, ale iniciace a následné prodlužování polymeru PARP pravděpodobně probíhá mezimolekulárním mechanismem, tak jako proteinová dimerizace. Po iniciaci, katalyzuje PARP reakce prodlužování a větvení tak, že se syntetizují vysoce rozvětvené a složité struktury více než 200 residuí ADP ribosy do velkého homopolymeru, který je strukturálně podobný nukleovým kyselinám.

Póly(ADP-ribosyl)-ace proteinů obecně vede k jejich inhibici a může z DNA disociovat chromatinové proteiny. Póly(ADP-ribosyl)-ace histonů například dekondenzuje chromatinové struktury, zatímco následná degradace polymeru obnovuje chromatin v jeho jeho kondenzované formě. Uvolnění chromatinu může v poškozených místech zprostředkovávat projevy DNA, stejně jako vznik míst iniciace replikace a transkripce. Jedna hypotéza říká, že PARP pomáhá udržovat chromozomální integritu tím, že chrání narušenou DNA před nevhodnou homologickou rekombinací. Vázání PARP k zakončením DNA by mohlo předejít jejich zapojení do genetického rekombinačního mechanismu, a negativně nabitá PAR by mohla elektrostaticky odpudit jiné molekuly DNA. Auto-poly(ADP-ribosyl)-ace deaktivuje PARP prostřednictvím elektrostatického odpuzování mezi negativně nabitými enzymaticky vázanými polymery ADP • · · ribosy a DNA a uvolněni PARP z DNA umožňuje přístup reparačních enzymů DNA k lézi (obr. 1).

PAR, která je syntetizována při reakci na masivní poškození DNA má krátký poločas rozpadu, blízký jedné minutě, jelikož se rychle hydrolyzuje ve vazbách ribosa-ribosa a mění se působením enzymu póly(ADP-ribosa)glykohydroláza (PARG) na volnou ADP-ribosu. Rychlá reakce PARG na syntézu PAR naznačuje, že degradace PAR je také důležitou reakcí buněčného jádra na poškození DNA. Podle toho zde prezentované výsledky naznačují, že konverze PAR na volnou ADP-ribosu pomocí PARG mohou dále podporovat činnost PARP tím, že pro PARP poskytují pomocný substrát (ADP-ribosy) a další cíle póly(ADP-ribosyl) ace (místa kde PARG odštěpila jednotky ADP-ribosy). Aktivace PARG takto podporuje vyčerpání buněčné energie indukované PARP, zvýšení poškození buňky a odumření buňky spojené s nemocemi a poruchami spojenými s činností PARP, jak je popsáno výše. Ačkoliv se věří, že je to způsobem jejího působení, může být za její účinek zodpovědný nebo může přispívat k užitečnosti inhibitorů PARG, zde popsaných včetně způsobů léčby nebo prevence poruch nebo nemocí zde popsaných, jiný mechanismus. Nedávno byla klonována hovězí cDNA kódující PARG. Zatímco PARG se přibližně 13-50-krát méně často vyskytuje než PARP, její specifická aktivita je asi 50 až 70-krát vyšší. Buňka spotřebovává při rychlé syntéze a degradaci polymeru PAR značnou energii, což naznačuje, že jako PARP, může být PARG užitečným cílem farmakologické intervence.

Aktivace PARP je extrémně citlivým indikátorem poškození DNA, projevujícím se mnohem dříve a přesahujícím co do velikosti přírůstek zlomů DNA kontrolovaný koncovou deoxynkleotidyl-transferázou. Jelikož velké sítě proteinů buněčného jádra jsou okamžitě po zlomu DNA kovalentně modifikovány PAR, za hlavního činitele v reakci buňky na poškození DNA je považována póly(ADP-ribosylace)-ace. Linie mutantnich buněk se sníženou expresí PARP vykazují kompromisní reparaci DNA a inhibitory PARP činí buňky hypersensitivními vůči činidlům poškozujícím DNA. Mimo to vyčerpání PARP prostřednictvím exprese antimediátoru PARP, kterým je mRNA, inhibuje zacelení zlomu řetězce v poškozené DNA.

Vývoj dvou nezávislých skupin myší s cíleným vyčerpáním PARP poskytl příležitost určitěji ohodnotit úlohu tohoto enzymu při reparaci DNA. Wang a kol. vytvořil paralyzovanou myš přerušením exonu 2, zatímco Menissier de Murcia a kol. přerušil exon 4. Obě větve mutantnich myší byly zdravé a plodné a fibroblasty z Wangovy PARP -/- myši vykazovaly normální reparaci DNA následující po poškození DNA ozářením UV paprsky nebo alkylačními činidly, což representuje účinnost reparace excize nukleotidů a základní reparační systémy excize. Zatímco proliferace PARP -/- primárních fibroblastů nebo in vivo thymocytů následující po ozáření γ-paprsky je poněkud narušená, jediným významným defektem pozorovaným Wangem a kol. u jejich paralyzované myši byla zvýšená náchylnost k epidermální hyperplazii. Wang a kol. navrhli, že nedostatečná aktivita PARP v keratinocytech může zabránit vyloučení buněk, které obsahují velké množství poškozené DNA a tak učinění těchto buněk více náchylnými k hyperproliferaci. U jiné linie PARP -/- myší nebyla pozorována žádná epidermální onemocnění, avšak to naznačuje, že epidermální hyperplazie by mohla být z hlediska genetického pozadí sekundární.

Na druhé straně PARP -/- myši ze skupiny Menissier de Murcii opravdu vykazují abnormální reakce na poškození DNA. Tyto PARP -/- buňky jsou extrémně sensitivni na apoptózu, která následuje po ošetření alkylačnim činidlem N-methyl-N• · • ·

-nitrosomočovinou (MNU). Pravděpodobně z důvodu nedostatečné nebo zpožděné reparace DNA také vykazuji zvýšenou akumulaci p53. To naznačuje, že u těchto myší, nedostatek PARP akceleruje reakci p53 na poškození DNA. To je v protikladu k tomu, co bylo pozorováno u Wangových PARP -/- myší, jejichž fibroblasty projevují stejné snížení p53 jako standardní typ poškození DNA. Jiní prokázali, že póly(ADP-ribosyl)-ace má v buňkách standardního typu při p53 signalizaci modulační úlohu. Zjistilo se, že zatímco úrovně p53 mohou být částečně určovány aktivitou PARP, aktivace p53 je převážně na PARP nezávislá. Rychlost výměny sesterských chromatidů u de Murciových PARP -/- myší je 4 až 5-krát vyšší než rychlost u Wangových myší jak v bazálních úrovních, tak při následujícím poškození DNA. To potvrzuje dřívější ve stejné poloze zjištěné výsledky s dominantně-negativním mutantem lidské PARP, které naznačily úlohu PARP při omezování výměny sesterských chromatoidů, které následuje po poškození DNA. Oba typy paralyzované myši zemřely po ošetřování methylačním činidlem MNU nebo ozařováním celého těla γ-paprsky rychleji než standardní typ myši. Tato rychlá aktivace PARG při reakci na syntézu PAR a aktivaci PARP naznačuje, že degradace PAR vedoucí přes PARP by mohla podporovat poruchy a nemoci spojené s činností PARP. Podle toho by inhibitory PARG mohly být užitečné při snižování aktivity PARP pomocí snižování substrátu a cílů pro činnost PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu poruch a nemocí spojených s činností PARP, zvláště poruch a nemocí navržených zde. Inhibitory PARG by měly být užitečné pro jakékoliv způsoby a terapie, kde je použití inhibitorů PARG užitečné.

Bylo popsáno, že aktivace PARP hraje klíčovou roli při neurotoxicitě indukované jak NMDA tak NO, jak prokázalo použití inhibitorů PARP k prevenci takové toxicity v • · · · · · kortikálních kulturách v poměru k jejich schopnostem jako inhibitorů tohoto enzymu (Zhang a kol., Nitric Oxide Activation of Póly(ADP-Ribose) Synthetase in Neurotoxicity, Science, 263, 687 až 689 (1994); a v plátcích hypokampu (Wallis a kol., Neuroprotection Against Nitric Oxide Injury with Inhibitors of ADP-Ribosylation, NeuroReport, (3), 245 až 248 (1993). Potenciální úloha inhibitorů PARP při léčbě neurodegenerativních poruch a úrazů hlavy se tak stala známou. Výzkumní pracovnici však pokračovali, aby přesně určili přesný mechanismus jejich prospěšného účinku při cerebrální ischemii, (Endres a kol.,Ischemic Brain Injury is Mediated by the Activation of Póly(ADP-Ribose)Polymerase, J. Cereb. Blood Flow Metabol., 17, 1143 až 1151 (1997) a při traumatických poraněních mozku (Wallis a kol., Traumatic Neuroprotection with Inhibitors of Nitric Oxide and ADP-Ribosylation, Brain Res., 710, 169 až 177 (1996) . Inhibitory PARG by měly pomocí snižování aktivity PARP ovlivňovat neurotoxicitu indukovanou NMDA a NO spojenou s PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu neurodegenerativních chorob, úrazů hlavy a cerebrální ischemie.

Prokázalo se, že jedna inijekce inhibitorů PARP snížila u králíků velikost infarktu srdečního nebo kosterního svalu způsobeného ischemii a reperfúzí. V těchto studiích se uvádí, že jedna inijekce inhibitoru PARP, 3-aminobenzamidu (10 mg/kg) , podaná buď před okluzí nebo jednu minutu před reperfúzí, způsobila v srdci podobná snížení velikostí infarktu (32 až 42 %). Další inhibitor PARP, 1,5-dihydroxyisochinolin (1 mg/kg), snížil velikost infarktu v srovnatelném stupni (38 až 48 %). Thiemermann a kol.,

Inhibition of the Activity of Poly(ADP Ribose) Synthetase Reduces Ischemia-Reperfusion Injury in the Heart and Skeletal Muscle, Proč. Nati. Acad. Sci. , USA, 94, 679 až 683 (1997).

·· ····

Toto zjištění naznačuje, že inhibitory PARP by mohly být schopné zachránit srdce, které bylo dříve ischemické nebo tkáň kosterního svalu. Podobně by měly inhibitory PARG snižováním aktivity PARP ovlivnit ischemické srdce nebo poškozenou tkáň kosterního svalu, nemocné ve spojení s aktivitou PARP, a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro záchranu srdce, které bylo dříve ischemické nebo tkáně kosterního svalu.

Ukázalo se také, že aktivace PARP poskytuje index poškození, které následuje po neurotoxických poškozeních způsobených glutamátem (prostřednictvím stimulace receptorů NMDA), reaktivními kyslíkovými meziprodukty, amyloid β-proteinem, N-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinem (MPTP) a jeho aktivním metabolitem N-methyl-4-fenylpyridinem MPP'), které se podílí na pathologických stavech jako jsou mrtvice, Alzheimerova choroba nebo Parkinsonova nemoc. Zhang a kol., Póly(ADP-Ribose) Synthetase Activation: An Early Indicator of Neurotoxic DNA Damage, J. Neurochem., 65 (3J , 1411 až 1414 (1995). Jiné studie pokračovaly ve zkoumání úlohy aktivace PARP v cerebrálních granuloidních buňkách in vitro a ve zkoumání neurotoxicity MPTP. Cosi a kol., Póly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP) Revisited. A New Role for an Old Enzyme: PARP Involvment in Neurodegeneration and PARP Inhibitors as Possible Neuroprotective Agents, Ann. N. Y. Acad. Sci., 825, 366 až 379 (1997); a Cosi a kol., Póly(ADP-Ribose) Polymerase

Inhibitors Protéct Against MPTP-induced Depletions of Striatal

Dopamine and Cortical Noradrenaline in C57B1/6 Míce, Brain

Res., 729, 264 až 269 (1996) . Inhibitory PARG by měly (přes stimulaci receptorů NMDA) ovlivňovat neurotoxická poškození, spojená s činností PARP způsobená glutamátem, reaktivními kyslíkovými meziprodukty, amyloid β-proteinem, N-methyl-4 fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinem (MPTP) a jeho aktivním metabolitem N-fenylpyridinem (MPP'), která se podílejí na pathologických stavech jako jsou mrtvice, Alzheimerova choroba a Parkinsonova nemoc snížením aktivity PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu nebo prevenci takových patologických stavů.

Poškození nervů, které následuje po mrtvici nebo jiném neurodegenerativním procesu se považuje za následek masivního uvolnění glutamátu jako excitačního transmitéru, který působí na receptory N-methyl-D-aspartatu (NMDA) a další podtypy receptorů. Glutamát slouží v centrálním nervovém systému (CNS) jako převládající excitační neurotransmiter. Když jsou zbaveny kyslíku, uvolňují neurony glutamát ve velkých množstvích, což se může stát během ischemického postižení mozku jako je mrtvice nebo infarkt. Toto nadměrné uvolňování glutamátu následně způsobuje nadměrnou stimulaci (excitotoxicitu) N-methyl-D-aspartátu (NMDA), AMPA, kainátových a MGR receptorů. Když se glutamát váže k těmto receptorům, otvírají se v receptorech iontové kanály, které umožňují toky iontů přes jejich buněčné membrány, např. Ca²⁺ a Na⁺ do buněk a K⁺ z buněk. Tyto iontové toky, zvláště přívod Ca²⁺, způsobují nadměrnou stimulaci neuronů. Nadměrně stimulované neurony vylučují více glutamátu, což vytváří smyčku zpětné vazby nebo dominoefekt, který nakonec vyústí poškozením nebo odumřením buňky prostřednictvím tvorby proteáz, lipáz a volných radikálů. Nadměrná aktivace glutamátových receptorů je zapojena do různých neurologických onemocnění a stavů včetně epilepsie, mrtvice, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy nemoci, amyotropické laterální sklerózy (ALS), Huntingtonovy nemoci, schizofrenie, chronické bolesti, ischemie a úbytku neuronů po hypoxii, hypoglykemii, ischemii, úrazu a poškození nervů. Nedávno zveřejněné studie také podpořily myšlenku odpovědnosti glutaminergických bází za kompulsivní poruchy, zvláště závislosti na drogách. Důkazy zahrnují zjištění u mnoha ·· ···· živočišných druhů, stejně jako v cerebrálně-kortikálních kulturách ošetřovaných glutamátem nebo NMDA, že antagonisté glutamátového receptoru blokuji poškození neuronů, které následuje po mozkové mrtvici. Dawson a kol., Protection of the Brain from Ischemia, Cerebrovascular Disease, vyd. H. Hunt Batjer, 319 až 325 (1997). Pokusy zabránit excitotoxicitě blokací NMDA, AMPA, kainátových a MGR receptoru se ukázalo jako obtížné, protože každý z receptorů má četná místa, ke kterým se může vázat glutamát. Mnohé z prostředků, které jsou účinné při blokádě receptorů jsou také pro živočichy toxické.

Jelikož je způsobených	tomu tak, glutamátem.	není známa účinná	léčba	poruch
Stimulace receptorů NMDA za další aktivuje	enzym	tvorby
kysličníku	dusičného v	neuronech syntázu (	NNOS),	která
způsobuj e	tvorbu oxidu	dusičného (NO),	který	přímo

zprostředkovává neurotoxicitu. Ochrana proti neurotoxicitě způsobované NMDA se projevila po ošetření inhibitory NOS. Viz Dawson a kol., Nitric Oxide Mediates Glutamate Neurotoxicity in Primary Cortical Cultures, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 6368 až 63671 (1991); a Dawson a kol., Mechanism of Nitric Oxid-mediated Neurotoxicity in Primary Brain Cultures,

J. Neurosci., 13 (6), 2651 až 2661 (1993). Ochrana proti neurotoxicitě se také může vyskytnout v kulturách buněk mozkové kůry myší s cíleným přerušením aktivace NNOS. Viz Dawson a kol., Resistance to Neurotoxicity in Cortical Cultures from Neuronal Nitric Oxide Synthase-Deficient Mice, J. Neurosci., 16 (8J, 2479 až 2487 (1996).

Je známo, že poškození nervů, které následuje po mozkové mrtvici je výrazně sníženo u živočichů, ošetřovaných inhibitory NOS nebo u myší s přerušením tvorby genu NNOS. Iadecola, Bright and Dark Sides of Nitric Oxide in Ischemic ·· ····

Brain Injury, Trends Neurosci., 20 (3), 132 až 139 (1997); a Huang a kol., Effects of Cerebral Ischemia in Mice Deficient in Neuronal Nitric Oxide Synthase, Science, 265, 1883 až 1885 (1994). Viz také Beckman a kol., Pathological Implications of Nitric Oxide, Superoxide and Peroxynitrite Formation, Biochem. Soc. Trans., 21, 330 až 334 (1993) . Buď NO nebo peroxydusitan může způsobit poškozeni DNA, které aktivuje PARP. Další podpora tomuto tvrzení je poskytována v práci Szabó a kol., DNA Strand Breakage, Activation of Poly(ADPRibose) Synthetase, and Cellular Energy Depletion are Involved in the Cytotoxicity in Macrophages and Smooth Muscle Cells Exposed to Peroxynitrite, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 93, 1753 až 1758 (1996).

Zhang a kol. v US patentu č. 5 587 384, uděleném 24. prosince 1996 pojednává o použití jistých inhibitorů PARP, jako jsou benzamid a 1,5-dihydroxy-isochinolin, k prevenci neurotoxicity zprostředkované NMDA a tak k léčbě mrtvice, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy nemoci a Huntingtonovy nemoci. Avšak, nyní se zjistilo, že Zhang a kol., se mohli při klasifikaci neurotoxicity jako neurotoxicity zprostředkované NMDA mýlit. Spíše by bylo správnější klasifikovat in vivo neurotoxicitu jako glutamátovou neurotoxicitu. Viz Zhang a kol., Nitric Oxide Activation of Póly(ADP-Ribose) Synthetase in Neurotoxicity, Science, 263, 687 až 689 (1994). Viz také Cosi a kol., Póly(ADP-Ribose)Polymerase Inhibitors Protéct Against MPTP-induced Depletions of Striatal Dopamine and Cortical Noradrenaline in C57B1/6 Mice, Brain Res., 729, 264 až 269 (1996). Inhibitory PARG by měly ovlivňovat glutamátovou neurotoxicitu spojenou s PARP pomocí snížení aktivity PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu nebo prevenci poruch nebo nemocí spojených s glutamátovou neurotoxicitou, o kterých se zde pojednává.

• 9	• •99	9«	• 9	··	•
•		9	•	•	•	9 ·	9 9
• 9	999	•	9	999	9	9	9
•	•	9 9	9	•	9 9	9 9	9	*
•	•	•	*	•	• 9	9	9	9
99	9*9	• 9	99	99	999

Je také známo, že inhibitory PARP obecně ovlivňuj i reparaci DNA. Cristovao

Ribose)Polymerase Inhibitor on a kol., Effect

DNA Breakage of a

Póly(ADPInduced

Carcino., and Cytotoxicity and γ-Radiation, Terato.,

227 (1996), pojednává o účinku by Hydrogen Peroxide and Muta., 16, 219 až ozařování γ-paprsky na zlomy řetězců DNA za vodíku a peroxidu přítomnosti nebo -aminobenzamidu.

při absenci silného inhibitoru PARP 3Cristovao a řetězců DNA závislé na PARP v vodíku. Inhibitory PARG kol. pozoroval zotavení zlomů leukocitech ošetřených peroxidem snížením aktivity ovlivňovat s PARP spojenou

PARG užitečné pro léčbu by reparaci DNA a tak jsou nebo prevenci

PARP měly poruch inhibitory a nemocí spojených s poškozením DNA poj ednává.

a reparací DNA, o kterých se zde

O inhibitorech PARP se uvádí, že účinné při jsou účinné potenciálně pravděpodobně DNA. Viz j sou radiosenzitizaci hypoxických nádorových buněk při ochraně nádorových buněk proti zotavení letálního poškození DNA po radiační terapii, prostřednictvím jejich schopnosti zabránit reparaci US patenty čís. 5 032 617, 5 215 738 a 5 041 653. Inhibitory

PARG by měly ovlivňovat radiosenzitizaci spojenou s PARP tím, že snižují aktivitu PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné jako radiosenzitizéry nebo činidla spojená s radiosenzitizaci.

Existují také důkazy, že inhibitory PARP jsou užitečné pro léčbu zánětlivých onemocnění střev. Salzman a kol., Role of Peroxynitrite and Póly(ADP-Ribose)Synthase Activation

Experimental Colitis, Japanese J. Pharm. , 7 5, dod. I, str. 15 (1997), pojednává o schopnosti inhibitorů PARP zabránit nebo

Kolitida byl vyvolána u krys pomocí intraluminálního podávání heptantrinitribenzensulfonové kyseliny v 50% ethanolu. Ošetřené krysy dostávaly 314

-aminobenzamid, specifický inhibitor aktivity PARP. Inhibice aktivity PARP snížila zánětlivou reakci a obnovila morfologii a energetické poměry vzdáleného kolonu. Viz také Southan a kol., Sponataneous Rearrangement of Aminoalkylithioureas into Merkaptoalkylguanidines, a Novel Class of Nitric Oxide Synthase Inhibitors with Selectivity Towards the Inducible Isoform, Br. J. Pharm. , 117, 619 až 632 (1996) a Szabó a kol., Mercaptoethylguanidine and Guanidine Inhibitors of Nitric Oxide Synthase React with Peroxynitrite and Protéct Against Peroxinitrite-induced Oxidative Damage, J. Biol. Chem., 272, 9030 až 9036 (1997). Inhibitory PARG by měly pomocí snížení aktivity PARP ovlivňovat kolitidu spojenou s účinky PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu nebo prevenci příznaků, poruch nebo nemocí spojených s kolitidou, jak je o tom pojednáváno zde.

Existují také důkazy, že inhibitory PARP jsou užitečné pro léčbu artritidy. Szabó a kol., Protective Effects of an Inhibitor of Póly(ADP-Ribose)Synthetase in Collagen-Induced Arthritis, Japanese J. Pharm., 75, dod. I, str. 102 (1997), pojednává o schopnosti inhibitorů PARP zabránit nebo léčit kolagenem vyvolanou artritidu. Viz také Szabó a kol., DNA Strand Breakage, Activation of Póly(ADP-Ribose)Synthetase, and Cellular Energy Depletion are Involved in the Cytotoxicity in Macrophages and Smooth Muscle Cells Exposed to Peroxynitrite, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 93, 1753 až 1758 (březen 1996), Bauer a kol., Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of rastransformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-l, 2-benzopyrone (INH2BP), Intl. J. Oncol., 239 až 252 (1996) a Hughes a kol., Induction of T Helper Cell Hyporesponsiveness in an Experimental Model of Autoimmunity by Using Nonmitogenic Anti-CD3 Monoclonal Antibody, J. Immuno.,

153, 3319 až 3325 (1994) . Inhibitory PARG by měly pomocí snížení aktivity PARP ovlivnit artritidu spojenou s působením PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu nebo prevenci artritidy a s artritidou spojených poruch a nemocí, o kterých se zde pojednává.

Dále se inhibitory PARP jeví jako užitečné pro léčbu cukrovky. Heller a kol.,

Inactivation of

Póly(ADP-Ribose)Polymerase

Gene Affects Oxygen Radical and Nitric

Oxide Toxicity in

Islet

Cells,

J. Biol. Chem.,

270 (19),

11176 až 11180 (květen 1995), pojednávají o tendenci PARP vyčerpat buněčnou NAD+ a indukovat odumření ostrůvkovitých buněk produkujících insulin. Heller a kol. používali buňky získané z myší s deaktivovanými geny PARP a zjistili, že tyto mutantní buňky nevykazují vyčerpání NAD+ poté co jsou vystaveny působení radikálů poškozujících DNA. Zjistilo se také, že mutantní buňky jsou více resistentní vůči toxicitě

NO. Inhibitory PARG by měly pomocí snížení aktivity PARP ovlivňovat s PARP spojený diabetes a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu nebo prevenci diabetů a poruch a nemocí s diabetem spojených, o kterých se zde pojednává.

Ještě dále se inhibitory PARP ukázaly jako užitečné pro léčbu endotoxického šoku nebo septického šoku. Zingarelli a kol., Protective Effects of Nicotinamide Against Nitric Oxide-Mediated Delayed Vascular Failure in Endotoxic Shock: Potential Involvement of PolyADP Ribosyl Synthetase, Shock, 5, 258 až 264 (1996), naznačuje, že inhibice reparačního cyklu DNA spouštěná póly(ADP-ribosa)syntetázou má ochranný účinek proti vaskulárnímu selhání při endotoxickém šoku. Zingarelli a kol., zjistili, že nikotinamid chrání proti zpožděnému vaskulárnímu selhání zprostředkovanému působením NO při endotoxickém šoku. Zingarelli a kol., také zjistili, že • ·· ·

působení nikotinamidu může být spojeno s inhibicí aktivace, zprostředkované pomocí NO, reaparčního cyklu DNA, který spotřebovává energii, spuštěného póly(ADP-ribosa)syntetázou. Viz také Cuzzocrea, Role of Peroxynitrite and Activation of Póly(ADP-Ribose)Synthetase in the Vascular Failure Induced by Zymosan-activated Plasma, Brit. J. Pharm., 122, 493 až 503 (1997). Inhibitory PARG by měly ovlivňovat endotoxický nebo septický šok, spojený s PARP, pomocí snížení aktivity PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu nebo prevenci endotoxického šoku nebo septického šoku a spojených poruch nebo nemocí, jak se zde o nich pojednává.

Ještě další známé použití inhibitorů PARP je léčba rakoviny. Suto a kol., Dihydroisochinoliny: The Design and Synthesis of a New Series of Potent Inhibitors of Póly(ADPRibose) Polymerase, Anticancer Drug Des., Ί_, 107 až 117 (1991), popisuje způsoby syntézy řady různých inhibitorů PARP. Navíc Suto a kol., US patent č. 5 177 075, pojednává o několika isochinolinech používaných pro zesílení letálních účinků ionizujícího záření nebo chemoterapeutických činidel na nádorové buňky. Weltin a kol., Effect of 6(5H)Phenanthridinone, an Inhibitor of Póly(ADP-ribose) Polymerase, on Cultured Tumor Cells, Oncol. Res., 6 (9), 399 až 403 (1994), pojednává o inhibici aktivity PARP, snížené proliferaci nádorových buněk a zaznamenaného synergistického účinku, když jsou nádorové buňky současně ošetřeny alkylační látkou. Je známo, že inhibitory PARG jsou účinné při léčbě rakoviny jak je popsáno v japonských patentech Tanumy. Avšak v přímém kontrastu k předkládanému vynálezu, důkazy z literatury naznačují, že mechanismus průběhu léčby rakoviny inhibitory PARG, je takový, že inhibitory PARG zabraňují degradaci PAR spojené s PARG, která normálně blokuje transkripci a aktivaci onkogenů.

O způsobech a sloučeninách pro inhibici PARG se pojednává v Tanuma a kol., JP 042-75223-A2, Poly(ADPribose)glycohydrolase Inhibitors Containing Glucose Derivates, j), 30 (1992), Tanuma a kol., JP 042-7 52 96-A2, Adenosine Derivates and their Use in Cancer Immunotherapy, 3_, 4 (1991), Tanuma, JP 032-054 02-A2, Lignin Glycoside and Use, (9, 6 (1991), Tanuma, JP 04-013684-A2, Lignin glycoside and Use, 17 (1992), Slama a kol., J. Med. Chem. , 38, 389 až 393 (1995), Slama a kol., J. Med. Chem., 38, 4332 až 4336 (1995), Maruta a kol., Biochemistry, 30, 5907 až 5912 (1991, Aoki a kol., Biochim. Biophys. Acta, 1158, 251 až 256 (1993), Aoki a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm. , 210, 329 až 337 (1995), Tsai a kol., Biochemistry Intl., 24, 889 až 897 (1991) a Concha a kol., Biochemistry Intl., 24, 889 až 897 (1991).

O použití inhibitoru PARG taninu pro léčbu infekce HIV se pojednává v Uchiumi a kol., Inhibitory Effect of Tannic Acid on Human Immunodeficiency Virus Promotér Activity Induced by

12-O-Tetra Decanoylphorbol-13-acetate in Jurkat

T-Cells,

Biochem. Biophys. Res. Comm., 220, 411 až 417 (1996).

Ještě dalším použitím pro inhibitory PARP je léčba poškození periferálních nervů a výsledného syndromu patologické bolesti známého jako neuropatická bolest, jako jsou bolesti vyvolané chronickým konstrikčním poškozením (CCI) běžného sedacího nervu a při kterém se objeví transynaptická změna dorsálního výběžku míchy charakterizovaná hyperchromatózou cytoplasmy a nukleoplasmy (tzv. černé neurony). Viz Jianren Mao a kol., 72, 355 až 366 (1997).

Inhibitory PARG by měly snížením aktivity PARP ovlivňovat neuropatickou bolest spojenou s působením PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro léčbu nebo prevenci poškození periferálních nervů a výsledného syndromu patologické bolesti, • · známého jako neuropatická bolest a spojených poruch nebo nemoci, o kterých se zde pojednává.

Inhibitory PARP se také používají k zvětšení životnosti a proliferační schopnosti buněk včetně léčby nemocí jako jsou stárnutí pokožky, Alzheimerova choroba, ateroskleróza, osteoartritida, osteoporóza, svalová dystrofie, degenerativní nemoci kosterních svalů včetně replikativní senescence, skvrnová degenerace stářím, senescence imunitního systému, AIDS a jiných nemocí spojených se senescencí imunitního systému a k změně genové exprese senescentních buněk. Viz WO 98/27975. Inhibitory PARG by snížením aktivity PARP měly ovlivňovat zvětšení životnosti a proliferační kapacity buněk spojené s PARP a tak jsou inhibitory PARG užitečné pro zvětšení životnosti a proliferační schopnosti buněk v řadě okolností včetně nemocí a poruch, o kterých se zde pojednává.

Velký počet známých inhibitorů PARP byl popsán v práci Banasik a kol., Specific Inhibitors of Póly(ADP-Ribose) Synthetase and Mono(ADP-Ribosyl)-Transferase, J. Biol. Chem., 2 67 (3), 1569 až 1575 (1992) a v Banasik a kol., Inhibitors and Activators of ADP-Ribosylation Reactions, Molec. Cell. Biochem., 138, 185 až 197 (1994). Několik inhibitorů PARG bylo popsáno v Tavassoli a kol., Effect of DNA intercalators on póly(ADP-ribose) glycohydrolase activity, Biochim. Biophys. Acta, 827, 228 až 234 (1985).

Avšak, přístup k použití těchto inhibitorů PARG k snížení stimulace receptoru NMDA nebo k léčbě nebo k prevenci poškození tkáně, vzniklého z poškození nebo odumření buněk z důvodu nekrózy nebo apoptózy, nebo k léčbě nebo prevenci poškození nervové tkáně způsobeného působením NO; ischemie a reperfúze srdečního nebo kosterního svalu; poškození nervové tkáně pocházejícího z poškození ischemií a reperfúzí; neurologických poruch a neurodegenerativních nemocí; k prevenci nebo léčbě mozková mrtvice; k léčbě nebo prevenci kardiovaskulárních poruch; k léčbě ostatních stavů a/nebo poruch jako jsou makulární degenerace působená stářím, nemoci působené senescencí imunitního systému, artritida, ateroskleróza, kachexie, degenerativní onemocnění kosterních svalů zahrnující replikativní senescencí, diabetes, úraz hlavy, senescence imunitního systému, zánětlivá onemocnění střev (jako jsou kolitida a Krohnova nemoc), svalová dystrofie, osteoartritida, osteoporóza, bolesti (jako jsou neuropatické bolesti), selhání ledvin, retinální ischemie, septický šok (jako je endotoxický šok) a stárnutí pokožky; k prodloužení životnosti a proliferační schopnosti buněk; k změně genové exprese senescentních buněk; nebo k radiosenzitizaci hypoxických nádorových buněk, byl limitován účinkem. Například u některých nejlépe známých inhibitorů PARP byly pozorovány vedlejší účinky, jak byly popsány v Milam a kol., Inhibitors of Póly(Adenosine Diphosphate-Ribose) Synthesis: Effect on Other Metabolic Processes, Science, 223, 589 až 591 (1984). Zvláště inhibitory PARP 3-aminobenzamid a benzamid nejen inhibují činnost PARP, ale ukázalo se také, že ovlivňují životachopnost buněk, metabolismus glukózy a syntézu DNA. Tak byl učiněn závěr, že užitečnost těchto inhibitorů PARP může být těžce omezena obtížností nalézt dostatečně malé dávky, aby inhibovaly enzym bez vytváření vedlejších metabolických účinků. Podobné závěry o dávkách mohou být také učiněny o inhibitorech PARG.

Podle toho trvá potřeba nalézt sloučeniny, které inhibují aktivitu PARG, prostředky obsahující tyto sloučeniny a způsoby použití těchto sloučenin, ve kterých sloučeniny silněji a spolehlivěji působí s méně vedlejšími účinky, z hlediska

inhibice aktivity zde pojednává.	PARG a léčby	nemocí a	stavů,	o kterých se
Podstata vynálezu
Předkládaný	vynález se	zaměřuj e	na	farmaceutický
prostředek obsahující inhibitor	PARG nebo	j eho	farmaceuticky
přijatelnou sůl,	hydrát, ester	, solvát,	předchůdce účinné

látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, ve kterém je inhibitor PARG přítomný v množství, které je účinné pro inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie, poškození buňky nebo odumření buňky způsobeného volnými radikály a/nebo pro léčbu nebo prevenci nemoci nebo stavů vyvolaných poškozením nebo odumřením buňky z důvodu nékrózy nebo apoptózy, a způsoby jeho použití.

Ve výhodném ztělesnění, zahrnují specifická onemocněni a stavy vhodné pro léčbu při použití farmaceutických přípravků a způsobů podle předkládaného vynálezu akutní bolest, artritidu, aterosklerózu, kachexii, kardiovaskulární poruchy, chronickou bolest, degenerativní onemocnění, cukrovku, nemoci nebo poruchy týkající se životnosti nebo schopnosti proliferace buněk, nemoci nebo stavy nemocí vyvolané nebo posílené buněčnou senescencí, úraz hlavy, senescenci imunitního systému, infekci HIV, AIDS (získaný syndrom poruchy imunity), ARDS, záněty, zánětlivá onemocnění střev, ischemii, skvrnovou degeneraci, poškození nervové tkáně pocházející z poškození ischemii nebo reperfúzí, neurologické poruchy a neurodegenerativní nemoci, neurony zprostředkované poškození tkáně nebo nemoci, neuropatickou bolest, poškození nervů, osteoatritidu, osteoporózu, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemii, septický šok, stárnutí pokožky a mozkovou mrtvici.

Ve výhodných ztělesněních tohoto vynálezu mohou být inhibitory PARG deriváty glukózy, ligninové glykosidy, hydrolyzovatelné taniny včetně gallotaninů a ellagitaninů, adenosidových derivátů, akridinových derivátů včetně 6,9-diamino-2-ethoxyakridinlaktátmonohydrátu, tiloronové analogy včetně tiloronu R10.556, daunomycin nebo daunorubicin hydrochlorid, ellipticin, proflavin a jiné inhibitory PARG.

Ve výhodném ztělesnění je inhibitorem PARG derivát glukózy, přesněji sloučenina obecného vzorce I:

CH^-O-Rs ve kterém:

Ri, Rž, R3, R4, Rs představují jednotlivě atom vodíku nebo

X,

X představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ci až Ce alkoxy skupin, za předpokladu, že Ri až R₅ nepředstavují současně atom vodíku.

V ještě jiném výhodném ztělesnění je inhibitorem PARG ligninový glykosid, zvláště ligninový glykosid, který má následující strukturální vzorec:

V dalším výhodném ztělesnění je inhibitorem

PARG hydrolyzovatelný tanin, zvláště hydrolyzovatelný tanin, který má následující vlastnosti:

(i) tanin a polysacharid jsou vázány, (ii) molekulární hmotnost je od 500 do 140 000, (iii) vazebný poměr taninu k polysacharidu je od 1:1 do 20:1, jako molekulární poměr, a (iv) polysacharid se skládá z od 60 do 70 % uronové kyseliny a od 30 do 40 % neutrálního cukru.

Obzvláště výhodné hydrolyzovatelné taniny zahrnují gallotaniny a ellagitaniny, zvláště ty, které mají následující vlastnosti:

(i) jsou multřesterovou sloučeninou gallových kyselin a/nebo egallových kyselin a glukózy, a ·· »♦·· (ii) mají molekulární hmotnost přibližně od 700 do 8000.

V ještě dalším výhodném ztělesnění obsahuje inhibitor PARG derivát adenosinu a podrobněji derivát adenosinu. Ve výhodnějším ztělesnění je adenosinovým derivátem adenosindifosát-hydroxy-methyl-pyrrolidin-diol (také označovaný jako ADP-HPD) nebo sloučenina, která má obecný vzorec II:

II ve kterém:

Ri obecným	představuje vzorcem III:	atom vodíku,	skupinu představovanou
				III
			o—r5
		0 — Re

nebo X, ve kterém X je sloučenina obecného vzorce IV:

O

IV • · · ··· ve kterém, Z je vazba, Ci-Ce alkylová skupina nebo Ci-Ce alkenylová skupina;

R₇, Rg, Rg, Rio a Rn jsou nezávisle vybrané ze souboru skládajícího se z vodíku, hydroxylové skupiny nebo Ci-Cg alkoxy skupiny, za předpokladu že R7-R11 nejsou současně čtyři nebo pět atomů vodíku a R2, R3, R4, Rs a R7 nezávisle představují atom vodíku nebo X, při čemž X představuje stejnou sloučeninu, která je popsána výše; za předpokladu, že R_x, R₂ a R3 nepředstavují současně atom vodíku; a dále za předpokladu, že R₂, R3, R4, R5 a Rg nepředstavuj i současně atom vodíku.

V dalším výhodném ztělesnění podle předkládaného vynálezu, mohou inhibitory PARG zahrnovat akridinové deriváty včetně 6,9-diamino-2-ethoxyakridinlaktátmonohydrátu, tiloronové deriváty včetně tiloronu R10.556, daunomycin a daunorubicin hydrochloridu, ellipticinu, proflavinu a ostatních inhibitorů PARG.

Tento vynález dále zahrnuje způsoby inhibice nebo snížení vyčerpání buněčné energie, poškození nebo odumření buněk indukovaného volnými radikály a/nebo léčbu nebo prevenci nemocí nebo stavů způsobených poškozením nebo odumřením buněk nekrózou nebo apoptózou podáváním účinného množství inhibitoru PARG. Ve výhodném ztělesnění, specifické nemoci a stavy vhodné pro léčbu použitím farmaceutických prostředků a způsobů podle předpokládaného vynálezu zahrnují akutní bolest, artritidu, aterosklerózu, kachexii, kardiovaskulární poruchy, chronickou bolest, degenerativní nemoci, cukrovku, nemoci nebo poruchy týkající se životnosti nebo proliferativní schopnosti buněk, nemoci nebo stavy nemocí vyvolané nebo zesílené buněčnou senescencí, úraz hlavy, senešcenci imunitního systému, zánětlivá onemocnění střev, ischemii, skvrnovou degeneraci, svalovou dystrofii, poškození nervové tkáně pocházející z • · ·· «9·9 9 ♦ · · · ♦ 9 999 9 • · 9 9 9

9» • 999· • ♦9 9 9 ·* 99 ischemického nebo reperfúzního poškození, neurologické poruchy a neurodegenerativní nemoci, neurony zprostředkované poškození tkáně nebo nemoc, neuropatickou bolest, poškození nervů, osteoartritidu, osteoporézu, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemíi, septický šok, stárnutí pokožky a mozkovou mrtvici.

V obzvláště výhodném ztělesnění jsou prostředky popsané výše jako inhibitory PARG používány způsoby podle předkládaného vynálezu.

Popis obrazové přílohy vynálezu

Obr. 1 je graf ukazující ochranný účinek farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu proti cytotoxicitě způsobené peroxidem vodíku.

Obr. 2 ukazuje EC₅o stanovenou z křivky závislosti cytotoxicity na dávce.

Obr. 3 je schematicky zjednodušeným představením cyklu PARP/PARG zachování póly(ADP-ribosyl)-ace a jejího vztahu k buněčnému energetickému metabolismu a různým použitím, nemocem a poruchám zde popsaným.

Detailní popis vynálezu

Neočekávaně bylo zjištěno, že inhibitory PARG mohou být použity k inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie, poškození buněk nebo odumření buněk indukovaného volnými radikály a/nebo léčbě nebo prevenci nemocí nebo stavů pocházejících z poškození nebo odumření buněk nekrózou nebo apoptózou. Zvláště mohou být inhibitory PARG podávány v • · · ·· ···· • · • ··· účinných množstvích k léčbě nebo prevenci specifických nemocí nebo stavů zahrnujících akutní bolest, artritidu, aterosklerózu, kachexii, kardiovaskulární poruchy, chronickou bolest, degenerativní nemoci, cukrovku, nemoci nebo poruchy životnosti nebo proliferační schopnosti buněk, stavy nemocí indukované nebo zesílené buněčnou úraz hlavy, senescenci střev, ischemií, týkající se nemoci nebo senescenci, zánětlivá onemocnění svalovou imunitního systému, skvrnovou degeneraci, tkáně pocházející z poškození nerodegenerativní nemoci, tkáně nebo nemoci, dystrofii, poškození nervové ischemií nebo reperfůzí, neurologické poruchy a neurony zprostředkované poškození neuropatickou bolest, poškození nervů, osteoartritidu, osteoporózu, poranění periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemií, septický šok, stárnutí pokožky a mozkovou mrtvici.

Například původci zjistili, že inhibitory PARG mohou být použity k léčbě nebo prevenci poškození kardiovaskulární tkáně pocházejícího ze srdeční ischemie nebo poškození reperfůzí. Poškození reperfůzí se například objevuje při ukončování procesu instalace srdečního bajpásu nebo během zástavy srdce, kdy se srdce, kterému je zabráněno přijímat krev, začíná opětovně zapojovat do krevního oběhu.

Inhibitory PARG podle předpokládaného vynálezu mohou být také použity k prodloužení nebo zvýšení životnosti nebo proliferace buněk a tak k léčbě nebo prevenci nemocí s nimi spojených a indukovaných nebo zesílených buněčnou senescenci včetně stárnutí pokožky, aterosklerózy, osteoartritidy, osteoporózy, svalové dystrofie, degenerativních onemocnění kosterních svalů zahrnujících replíkační senescenci, skvrnové degenerace spojené se stárnutím, senescence imunitního systému a ostatních nemocí spojených s buněčnou senescenci a

··		♦ 4	«4	··
• ·		• 4	4	* 4 ·
9	•	···	4	4	444	4 ·
•	•	• ·	•	4	« ·	• 4 4
• 4	•	4 ·	4 ·	4 ·
··	• ··	• 4	44	«· 4

stárnutím, stejně jako se změnou genové exprese senescentních buněk.

Výhodně jsou v předkládaném vynálezu inhibitory PARG použity k léčbě nebo prevenci poškození tkáně pocházejícího z odumření nebo poškození buněk způsobeného nekrózou nebo apoptózou; k léčbě nebo prevenci poškození nervové tkáně pocházejícího z cerebrální ischemie a poškození reperfúzí nebo neurodegenerativních nemocí u savců; k rozšíření nebo zvýšení životnosti a proliferační schopnosti buněk; a k změně genové exprese senescentních buněk.

Nadměrný obsah vápníku a aktivace póly(ADP-ribosa)polymerázy hrají úlohu při přerušení energetické homeostázy vedoucí k odumření buňky, zvýšený mezibuněčný obsah vápníku (Ca²⁺) působí cytotoxicitu prostřednictvím zpětné tvorby reaktivních dusíkových a kyslíkových sloučenin, které přeruší energetickou homeostázu prostřednictvím několika způsobů poškození buněk. Ca²⁺ může proniknout do cytoplasmy přes napěťově nebo ligandově ovládané iontové kanály, jako je NMDA-podtyp glutamátového receptoru. ATP je potřeba k odstranění vápníku z cytoplasmy přes iontově-pohyblivé ATPfáze, které buď odčerpávají Ca z buňky nebo do endoplazmatického retikula (ER). Také mitochondrie pomáhají tlumit vápník v cytoplasmě. Nadměrná akumulace Ca²⁺ mitochondriemi snižuje oxidační fosforylaci, zatímco také podporuje produkci reaktivních kyslíkových sloučenin, takových jako jsou hyperoxid (O^2-) a peroxid vodíku (H2O2) prostřednictvím transportního elektronového řetězce. Vysoká mitochondriální akumulace Ca²⁺ také mění permeabilitu mitochondriální membrány, což inhibuje mitochondriální produkci ATP a podporuje nekrózu. Navíc, selektivní permeabilita vnější membrány uvolňuje cytochrom C (Cyt C) , který aktivuje kaspázy¹⁰¹. Kaspázy střídavě odštěpují • ·

specifické substráty cytoplasmických a jaderných proteinů tak, že řídí apoptózu (viz text). Ca²⁺ také přímo aktivuje několik buněčných enzymů, které iniciují cytotoxické kaskády. To zahrnuje endonukleázu (DNase) aktivovanou Ca²⁺/Mg²⁺ stejně jako na Ca²⁺ senzitivní fospolipázy a proteázy. Navíc je několik enzymů aktivovaných Ca²⁺ zapojeno do tvorby volných radikálů. Proteázy aktivované Ca²⁺ známé jako kalpainy mění xanthindehydrogenázu na xanthinoxidázu (XO), která podporuje enzymatickou degeneraci hyperoxidu. Dalším zdrojem hyperoxidu jsou cykloxygenázy. Peroxid vodíku (H2O2) se může tvořit z hyperoxidu a může se reakcemi katalyzovanými železem sám přeměnit na vysoce reaktivní hydroxylový radikál (OH) . Tyto reaktivní kyslíkové skupiny poškozují lipidy, proteiny a nukleové kyseliny. Ca²⁺ také aktivuje kalmodulinem regulovaný enzym syntázy kysličníku dusičného (NOS), aby produkoval velké množství kysličníku dusičného (NO). Hyperoxid a kysličník dusičný se spojují, přičemž vytvářejí mnohem reaktivnější peroxinitritový aniont (00N0-). Peroxynitrit poškozuje buněčnou membránu a to vede k oxidaci a nitraci proteinů obsahujících aromatické aminokyseliny jako je tyrosin. Peroxynitrit také poskytuje další způsob tvorby hydroxylových radikálů, nejpravděpodobněji přes meziprodukty kyseliny peroxodusité. Poškození DNA způsobené buď endonukleázou aktivovanou Ca²⁺/Mg²⁺, 00N0- nebo hydroxylovými radikály má za následek silnou aktivaci PARP s následným vyčerpáním hladin NDA. Jelikož je NAD potřeba pro tvorbu ATP a jelikož ATP je následně potřeba pro syntézu NAD, nadměrná aktivace PARP vyčerpává zásobník molekulární energie a má za následek odumření buňky.

Důkazy v literatuře naznačují, že inhibitory PARG inhibují PARG přímou interakcí s enzymem PARG, polymerem PAR nebo oběma. Inhibitory PARG mohou být také pro zde popsané • · • · • · způsoby užitečné pomoci mechanismu působeni nezávislého na přímé interakci mezi inhibitorem a PARG.

Ve výhodném ztělesnění předkládaného vynálezu inhibitory póly(ADP-ribosa)glykohydrolázy obsahují jako aktivní složky deriváty glukózy, glykosidy ligninu, hydrolyzovatelné taniny včetně gallotaninů a ellagitaninů, deriváty adenosidu, deriváty akridinu včetně 6,9-diamino-2-ethoxyakridinlaktátmonohydrátu, daunomycin proflavin ztělesnění tiloronové analogy včetně tiloronu R10.556, daunorubicinhydrochlorid, ostatní inhibitory PARG. Ostatní nebo ellipticin, výhodná inhibitorů předkládaného

PARG, zvláště použití ostatních dobře známých v vynálezu jsou zaměřena na těch, které jsou popsané oboru, a způsob jejich použití při zde a léčbě nebo prevenci nemocí nebo stavů vznikajících z důvodu vyčerpání buněčné energie volnými radikály a/nebo poškození tkáně pocházejícího z poškození nebo odumření buňky způsobeného nekrózou, apoptózou nebo jejich kombinací.

Zvláště výhodné inhibitory PARG zahrnují deriváty glukózy, zvláště glukózové deriváty typu, který představuje obecný vzorec (I):

(I) ve kterém, Ri až R₅ jednotlivě představují atom vodíku nebo skupinu X, skupina X představuje karbonyl, který má fenyl substituovaný množstvím skupiny vybraných ze souboru, který se • · skládá z hydroxylové skupiny a nižších alkoxylových skupin, za předpokladu, že Ri až Rs nepředstavují současně atom vodíku.

V dalším výhodném ztělesnění podle předkládaného vynálezu obsahuje nižší alkoxylová skupina představovaná skupinou X od jednoho do čtyř atomů uhlíku a zvláště zahrnuje methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sek.butoxy, terc.butoxy a podobné skupiny. Zvláště výhodná je methoxy skupina.

Pokud jde o skupiny X, jsou zvláště výhodné takové, ve kterých je fenyl vázán ke karbonylu přes alkylen nebo alkenylen a takové, ve kterých je fenyl ke karbonylu vázán přímo. Pokud jde o alkyleny, jsou příkladem doloženy ty, které obsahují od jednoho do čtyřech atomů uhlíku, jako jsou methylen, ethylen, trimethylen a tetramethylen a zvláště výhodné jsou methylen a ethylen. Pokud jde o alkenyleny, jsou doloženy příkladem ty, které obsahují od jednoho do čtyř atomů uhlíku a zvláště výhodný je vinylen.

Výhodnými příklady částice X jsou skupiny představované následujícím obecným vzorcem:

ve kterém, Z představuje přímou vazbu, alkylen nebo alkenylen, R7 až R11 jednotlivě představují atom vodíku, hydroxylovou skupinu nebo nižší alkoxylovou skupinu, za předpokladu, že R7 až Rn nepředstavuj i současně 4 nebo 5 atomů vodíku.

• · • · • ·

Zvláštními příklady částice X, které jsou zvláště výhodné, jsou galloyl, 4-hydroxy-3-methoxybenzoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5-trimethoxybenzoyl, 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trihydroxybenzylkarbonyl a 3,4,5-trihydroxyfenetylkarbonyl.

Výhodným ztělesněním derivátů glukózy je 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-glukóza, která má následující vzorec:

Tyto deriváty glukózy, které jsou podle předkládaného vynálezu užitečné jako inhibitory PARG, mohou být připraveny ze snadno dostupných látek jakýmkoliv vhodným způsobem známým osobě znalé oboru. Zvláště mohou být připraveny následujícím způsobem:

CH₂OH

(i)

+

A-OH (ii)

ch₂-o-r₅

R₄-0

(I) ve kterém, má částice X stejný význam jako je uvedený výše.

Výše uvedená reakce probíhá způsobem běžné esterifikace.

Jako výchozí materiály jsou sloučenina (i) a sloučenina (ii) jak dobře známé v oboru tak jsou snadno dostupné. Výše uvedená sloučenina (i) je glukóza a sloučenina (ii) je karboxylová kyselina.

Hydrolyzovatelné taniny a ligninové glykosidy vhodné pro použití v rámci tohoto vynálezu mohou být připraveny jakýmkoliv způsobem známým v oboru a mohou být připraveny následujícím způsobem.

Jako výchozí látka, může být zpracováván jakýkoliv organický materiál, jako jsou borové šišky, čajové lístky, svída, trisacharidový základ a podobné, vhodným rozpouštědlem, jako je horká voda, ethanol, aceton po dobu asi od 1 do 15 hodin. Zpracovávaný materiál je extrahován alkalickým roztokem (0,1 až 1N hydroxid sodný, amonný a podobné). Extrahovaná kapalina je upravena na pH 4 až 6 a přidá se ekvivalentní množství ethanolu a oddělí se kapalná frakce nad usazeninou. Kapalná frakce se čistí gelovou filtrací a oddělí se aktivovaný podíl. Získaný hydrolysovatelný tanin nebo ligninový glykosid může být zpracován dialýzou, separačním odstředěním, vymrazením atd.

Vhodné hydrolyzovatelné taniny a ligninové glykosidy mají inhibiční účinek na póly(ADP-ribosa)glykohydrolázu a představují inhibitory aktivity póly(ADP-ribosa)glykohydrolázy vůči savcům a jsou užitečné pro inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie, poškození nebo odumření buňky indukovaného volnými radikály. Hydrolyzovatelné taniny a ligninové glykosidy jsou užitečné ve farmaceutických • · prostředcích a způsobech podle tohoto vynálezu, které mohou být podávány buď orálně nebo parenterálně, výhodně s vhodným nosičem ve formě farmaceutického prostředku. Takové hydrolyzovatelné taniny a ligninové glykosidy mohou být podávány, například orálním způsobem, obvykle asi od 0,1 do 100 mg/kg tělesné hmotnosti za den, jednou nebo v několika oddělených dávkách, ale dávka se může lišit v závislosti na věku, tělesné hmotnosti a/nebo závažnosti onemocnění, které se má léčit a reakci na léčbu.

Byla zkoumána toxicita těchto hydrolyzovatelných taninových glykosidů a při orálním podávání byla hodnota LD50 100 mg/kg nebo více, což je v široké oblasti bezpečnosti extrémně vysoký výsledek.

Vhodné akridinové deriváty zahrnují sloučeniny, které mají následující obecný strukturální vzorec:

ve kterém, R je nezávisle vybrán z vodíku, halogenu, alkylhalogenu, hydroxyskupiny, C1-C6 přímého nebo rozvětveného alkylového řetězce, alkenylové skupiny,

C2-C6 přímého nebo rozvětveného

Ci-Ce přímého nebo rozvětveného řetězce řetězce alkoxyskupiny,

C₂-C6 přímého nebo rozvětveného řetězce alkenoxyskupiny, aminoskupiny, alkylthioskupiny, thioskupiny,

C1-C6 alkylaminoskupiny, C1-C6 nitroskupiny, nitrososkupiny, karboxyskupiny, ve kterém řečené alkylové, alkenylové, alkoxylové, alkenoxylové, alkylaminové, alkylhalogenové a alkylthiové skupiny jsou nezávisle substituované jedním nebo více substituentem(y) vybraným(y) z halogenu, hydroxyskupiny, aminoskupiny, thioskupiny, nitroskupiny, C1-C4 alkoxyskupiny nebo C2-C4 alkenyloxyskupiny.

Ostatní vhodné inhibitory PARG zahrnují adenosinové deriváty, akridinové deriváty včetně 6,9-diamino-2-ethoxyakridínlaktátmonohydrát, tiloronové analogy včetně tiloronu R10.556, daunomycin nebo daunorubicinhydrochlorid, ellipticin, proflavin a ostatní inhibitory PARG známé v oboru.

Inhibitory PARG, zvláště podle výše uvedeného popisu, ovládají aktivitu póly(ADP-ribosa)glykohydrolázy, jak ukazují výsledky pokusů udané níže a jsou zvláště užitečné jako inhibitory póly(ADP-ribosa)gylkohydrolázy pro inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie, poškození buňky nebo odumření buňky indukovaného volnými radikály a/nebo léčbě nebo prevenci nemoci nebo stavů pocházejících z poškození nebo odumření buňky způsobeného nekrózou nebo apoptózou. Zvláště mohou být inhibitory PARG podávány v účinných množstvích k léčbě nebo prevenci specifických nemocí a stavů včetně akutní bolesti, artritidy, aterosklerózy, kachexie, kardiovaskulárních poruch, chronické bolesti, degenerativních nemocí, diabetů, nemocí nebo poruch týkajících se životnosti nebo proliferační schopnosti buněk, nemocí nebo stavů nemocí indukovaných nebo zesilovaných buněčnou senescencí, úrazu hlavy, senescence imunitního systému, zánětlivých onemocnění střev, ischemie, makulární degenerace, svalové dystrofie, poškození nervové tkáně pocházejícího z ischemie a poškození reperfúzí, neurologických poruch a neurodegenerativních nemocí, neurony zprostředkovaného poškození nebo onemocnění tkáně, neuropatické bolesti, poškození nervů, osteoartritidy, osteporózy, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinálni ischemie, septického šoku, stárnuti pokožky a mozkové mrtvice.

Inhibitory PARG vhodné pro použití v rámci předkládaného vynálezu zahrnují deriváty glukózy, glykosidy ligninu, hydrolyzovatelné taniny včetně gallotaninů a ellagitaninů, adenosinové deriváty, akridinové deriváty včetně 6,9-di-amino-2-ethoxyakridinlaktátmonohydrátu, analogy tiloronu včetně tiloronu R10.556, daunomycin nebo daunorubicinhydrochlorid, ellipticin, proflavin a ostatní inhibitory PARG. Vynález zahrnuje farmaceutické prostředky, které obsahují inhibitory PARG a způsob jejich použití při léčbě nebo prevenci nemocí nebo stavů způsobených vyčerpáním buněčné energie indukovaného volnými radikály a/nebo poškození tkáně pocházejícího z ^poškození nebo odumření buňky způsobeného nekrózou, apoptózou nebo jejich kombinací.

Inhibitory PARG vhodné pro použití v rámci předkládaného vynálezu mohou být užitečné ve formě volné základní sloučeniny, formě farmaceuticky přijatelných solí, farmaceuticky přijatelných hydrátů, farmaceuticky přijatelných esterů, farmaceuticky přijatelných solvátů, farmaceuticky přijatelných předchůdců účinné látky, farmaceuticky přijatelných metabolitů a ve formě farmaceuticky přijatelných stereoisomerů. Všechny tyto formy jsou zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu. V praxi se použití těchto forem rovná použití neutrální sloučeniny.

Pojmy farmaceuticky přijatelná sůl, hydrát, ester nebo solvát se týkají soli, hydrátu, esteru nebo solvátu inhibitorů PARG podle vynálezu, které mají požadované farmakologické účinky a které nejsou ani biologicky nebo jinak nežádoucí. K přípravě solí jako jsou acetáty, adipáty, algináty, aspartáty, benzoáty, benzensulfonáty, p-toluensulfonáty, bisulfáty, sulfamáty, sulfáty, naftyláty, butyráty, citráty, kafráty, kafrosulfonáty, cyklopentanpropionáty, diglukonáty, dodecylsulfáty, ethansulfonáty, fumaráty, glukoheptanoáty, glycerofosfáty, hemisulfátoheptanoáty, hexanoáty, 2-hydroxyethansulfonáty, laktáty, maleáty, methansulfonáty, 2-naftalensulfonáty, nikotináty, oxaláty, p-toluensulfonáty a undekanoáty mohou být použity organické kyseliny. K přípravě solí jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy a thiokyanáty mohou být použity kyseliny anorganické.

Příklady vhodných bazických solí zahrnují hydroxidy, uhličitany a hydrogenuhličitany amoniaku, solí alkalických kovů jako jsou sodné, lithné a draselné soli, soli kovů alkalických zemin jako jsou vápenaté a hořečnaté soli, hlinité soli a zinečnaté soli.

Soli se mohou také tvořit s organickými bázemi. Organické báze vhodné pro přípravu farmaceuticky přijatelných bazických adičních solí inhibitorů PARG podle předkládaného vynálezu zahrnuji takové, které nejsou toxické a jsou dostatečně silné, aby takové soli vytvořily. Pro ilustrativní účely třída takových bází může zahrnovat mono-, di- a trialkylaminy jako jsou methylamin, dimethylamin, trimethylamin a dicyklohexylamin, mono-, di- nebo trihydroxyalkylaminy jako jsou mono-, di- a triethanolamin, aminokyseliny jako jsou arginin a lysin, guanidin, N-methyl-glukosamin,

N-methyl-glukamin,

L-glutamin,

N-methyl-piperazin, morfolin, ethylendiamin, N-benzyl-fenetylamin, (trihydroxy-methyl)amino ethan a podobné. Viz například, Pharmaceutical Salts, J.

Pharm. Sci., 66 (1J , 1 až 19 (1997). Podle toho bazické • · 9 99 9 · · · ··· • 99 * · ·o·· • · · 9 9 « 9 9 9 9φ φ ·9··»999 ·· ··· ·· 99 φφ9 9» skupiny obsahující dusík mohou být kvartovány činidly zahrnujícími: nižší alkylhalogenidy, jako jsou methyl, ethyl, propyl a butylchloridy, bromidy a jodidy, dialkylsulfáty, jako jsou dimethyl, diethyl, dibutyl a diamylsulfáty, halogenidy s dlouhým řetězcem, jako jsou decyl, lauryl, myristyl a stearylchloridy, bromidy a jodidy a arylalkylhalogenidy jako jsou benzyl a fenetylbromidy.

Adiční soli kyselin bazických inhibitorů PARG mohou být připraveny buď rozpuštěním volné báze odvozené od inhibitoru PARG ve vodném nebo vodném roztoku alkoholu nebo jiném vhodném rozpouštědle obsahujícím příslušnou kyselinu nebo zásadu a izolací soli odpařením roztoku. Alternativně může volná báze odvozená od inhibitoru PARG zreagovat s kyselinou, stejně jako může inhibitor PARG obsahující kyselinové skupiny na nich zreagovat s bází tak, že reakce jsou prováděny v organickém rozpouštědle, v kterémžto případě se sůl oddělí přímo nebo může být získána koncentrováním roztoku.

Termín farmaceuticky přijatelný předchůdce účinné látky se týká derivátu odvozeného od inhibitorů PARG podle tohoto vynálezu, který před získáním svého farmakologického účinku(ů) prodělává biotransformaci. Předchůdce účinné látky je vytvářen s cílem(y) zlepšené chemické stability, zlepšeného příjmu a snášenlivosti pacientem, zlepšené biodostupnosti, prodlouženého účinku, zlepšené selektivity působení na orgány, zlepšené tvárnosti (např. zvýšené rozpustnosti vodou) a/nebo snížení vedlejších účinků (např. toxicity). Předchůdce účinné látky může být snadno připraven z inhibitorů PARG podle tohoto vynálezu při použití způsobů známých v oboru, jako jsou způsoby popsané Burger's Medicinal Chemistry and Drug Chemistry, 5. vyd., sv. 1^, str. 172 až 178 a 949 až 982 (1995). Například inhibitory PARG podle tohoto vynálezu mohou být na předchůdce účinné látky transformovány konverzi jedné nebo více z hydroxy nebo karboxy skupin na ester.

Po vstupu do těla, je většina účinných látek pro chemické reakce substrátem, který může měnit své fyzikální vlastnosti a biologické účinky. Tyto metabolické konverze, které obvykle ovlivňují polaritu inhibitoru PARG, ovlivňuje způsob, kterým jsou účinné látky distribuovány a vylučovány z těla. Avšak v některých případech je metabolismus účinné látky pro terapeutické účinky potřebný. Například, protirakovinové látky antimetabolické třídy musí být poté co jsou dopraveny do rakovinných buněk převedeny na své aktivní formy,.

Jelikož transformaci většina účinných látek prodělává metabolickou určitého druhu, mohou být biochemické reakce, které hrají úlohu v metabolismu početné a různé. Hlavním místem metabolismu účinných látek jsou játra, ačkoliv se mohou podílet také jiné tkáně.

Základními rysem mnohých z těchto transformací je to, že metabolické produkty nebo metabolity jsou polárnější než mateřské látky, ačkoliv polární látky někdy dávají méně polární produkt. Látky s vysokými rozdělovacími koeficienty lipid/voda, které snadno procházejí přes membrány také snadno difundují zpět z tubulární moči přes ledvinové tubulární buňky do plasmy. Tak, takové látky směřují k tomu mít dlouhou dobu průchodu ledvinami a dlouhou dobu setrvání v těle. Jestliže se účinná látka metabolizuje na polárnější sloučeninu, která má nižší rozdělovači koeficient, bude její zpětná tubulární readsorpce značně omezena. Navíc, specifické mechanismy vylučování aniontů a kationtů v proximálních tubulech ledvin a v parenchymálních buňkách jater působí na vysoce polární látky.

Jako specifický přiklad, fenacetin (acetofenetidin) a acetanilid jsou jak mírná analgetická tak atipyretická činidla, ale jsou v těle transformována na polárnější a účinnější metabolity, p-hydroxyacetanilid (acetaminofen), který je v současnosti široce používán. Když je pacientovi podána dávka acetanilidu, postupně se v plasmě hromadí a rozkládají následné metabolity. Během první hodiny je acetanilid hlavní složkou plasmy. Druhou hodinu, jak klesá hladina acetanilidu, dosahuje vrcholu koncentrace acetaminofenu'. Nakonec po několika hodinách, je hlavní složkou plasmy další metabolit, který je inertní a může být vyloučen z těla. Tak může být koncentrace jednoho nebo více metabolitů v plasmě, stejně jako samotné účinné látky farmakologicky významná.

Jak ukazuje tabulka II jsou reakce zapojené do metabolismu účinné látky často klasifikovány ve dvou skupinách. Reakce fáze I jsou funkcionalizační reakce a obecně se skládají z:

(1) oxidačních a redukčních reakcí, které mění a tvoří nové funkční skupiny, a (2) hydrolytických reakcí, které štěpí estery a amidy tak, že uvolňují chráněné funkční skupiny.

Tyto změny probíhají obecně ve směru zvýšené polarity.

Fáze II reakcí jsou slučovací reakce, při kterých je účinná látka nebo často metabolit účinné látky vázán k endogennímu substrátu, jako jsou kyselina glukoronová, kyselina octová nebo kyselina sírová.

Tabulka II

Reakce fáze I (funkcionalizační reakce):

(1) Oxidace prostřednictvím hepatického mikrosomálního systému P450:

- alifatická oxidace,

- aromatická hydroxylace,

- N-dealkylace,

- O-dealkylace,

- S-dealkylace,

- epoxidace,

- oxidační deaminace,

- tvorba sulfoxidu,

- desulfurace,

- N-oxidace a N-hydroxylace, a

- dehalogenace, (2) Oxidace prostřednictvím nemikrosomálního mechanismu:

- oxidace alkoholů a aldehydů,

- oxidace purinů,

- oxidační deaminace (monoaminovou oxidázou a diaminovou oxidázou), (3) Redukce:

- redukce azo- a nitroskupin, (4) Hydrolýza:

- hydrolýza esterů a amidů,

- hydrolýza peptidových vazeb, a

- hydratace epoxidů.

Reakce fáze II (slučovací reakce):

···· (1) glukoronizace, (2) acetylace, (3) tvorba kyseliny merkapturové, (4) slučováni se sulfátem, (5) methylace na heteroatomu N-, 0- a S-, a (6) trans-sulfurizace.

Kde mají inhibitory PARG jedno nebo více asymetrických centrum(er), mohou být tak připraveny jako směsi (racemické a neracemické) stereoisomerů nebo jako jednotlivé R- a Sstereoisomery. Jednotlivé stereoisomery se mohou získat použitím opticky aktivních výchozích látek, pomocí znovurozpuštění racemické nebo neracemické směsi meziproduktu v určitém vhodném stadiu syntézy nebo znovurozpuštěním požadované sloučeniny inhibitoru PARG. Termín isomery se týká sloučenin, které obsahují stejný počet a druh atomů, a tudíž mají stejnou molekulární hmotnost, ale liší se z hlediska uspořádání nebo konfigurace atomů. Stereoisomery jsou isomery, které se liší pouze prostorovým uspořádáním atomů. Enantiomery jsou pár stereoisomerů, které jsou navzájem se nepřekrýváj ícím zrcadlovým obrazem.

Diastereoisomery jsou stereoisomery, které nejsou vzájemným zrcadlovým obrazem. Racemická směs znamená směs obsahující stejné nebo zhruba stejné díly jednotlivých enantiomerů. Neracemické směs je směs obsahující nestejné nebo značně nestejné díly jednotlivých enantiomerů nebo stereoisomerů.

• 9 *· ·♦·· • · • · 9 ·

9999

9 99

999· 9·

9 999···

99999 99 99 999

Příklady provedení vynálezu

Syntéza sloučenin:

Inhibitory PARG vhodné pro použití ve farmaceutických prostředcích a způsobech podle předkládaného vynálezu se mohou syntetizovat pomocí známých způsobů z výchozích látek, které jsou známé, jsou komerčně dostupné nebo se mohou připravit způsoby používanými v literatuře k přípravě odpovídajících sloučenin.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou rovněž snadno připravit standardními technikami organické chemie, využívajícími obecné způsoby syntézy popsané níže. Primární sloučeniny se mohou připravit způsoby známými v oboru. Následující schémata jsou zamýšlena jako vysvětlení přípravy vhodných inhibitorů PARG užitečných ve výhodných ztělesněních tohoto vynálezu a nemají význam omezující tento vynález.

Příklad 1

1. Syntéza 1-0-benzyl-D-glukopyranózy (sloučenina 1)

D-glukóza (15,0 g) se přidá k benzylalkoholu (100 ml) a takto získaná suspenze se ochladí na O °C. Poté se do suspenze vhání po 30 minut chlorovodík. Poté se výsledný roztok 2 dny míchá při teplotě místnosti, přidá se ether (500 ml) a slije se kapalina nad usazeninou. Tento proces se opakuje 3-krát. Takto získaná olejovitá látka se podrobí sloupcové silikagelové chromatografii (silikagel, rozpouštědlo : chloroform : methanol = 8/1, 5/1), čímž se získá sloučenina 1 (11,7 g, 52 %).

999999 ·9 ··99 • 99 ♦ · ·99«

9 999 9 9 999 99 • 9 ·······*

999 99 99 99 999

2. Syntéza 3,4,5-Tribenzyloxybenzoové kyseliny (sloučenina 2)

Roztok získaný smícháním dimethylformamidu (50 ml), kyseliny gallové (10

g) a benzylchloridu

g) , bezvodého uhličitanu draselného (44 (27 ml) v dusíkové atmosféře se zředí ethylacetátem (1 litr). Potom °C. Ethylacetátová vrstva se se směs promyj e přes noc míchá při 140 vodou a saturuje se nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se síranem hořečnatým. Po oddestilování rozpouštědla za sníženého tlaku se získá surový produkt. K takto získanému surovému produktu se přidá ethanol (200 ml) a 1,6N vodný roztok hydroxidu sodného (50 ml) a směs se při zahřívání refluxuje po dobu 2 hodin. Po skončení reakce se oddestiluje asi 50 % ethanolu. Výsledná sedlina se ochladí na 0 °C a 0,5N kyselinou chlorovodíkovou se upraví na pH 2. Takto usazené pevné částice se odfiltrují a suší se, čímž se získá sloučenina 2 (15,6 g,

%) .

3. Syntéza l-O-Benzyl-2,3,4,6-tetrakis-(3,4,5-tribenzyloxy benzoyl)-D-glukopyranózy (sloučenina 3)

Sloučenina 2 (7,0 g) , thionylchlorid (40 ml) a dimethylformamid (1 ml) se smíchají za chlazení ledem. Poté se výsledný roztok přes noc za zahřívání refluxuje, přebytečný thionylchlorid se oddestiluje za normálního a sníženého tlaku, čímž se připraví chlorid kyseliny sloučeniny 2. V dusíkové atmosféře se sloučenina 1 (0,83 g) přidá k pyridinu (10 ml) a směs se míchá. K roztoku se přikape roztok chloridu kyseliny sloučeniny 2 (surový produkt získaný při použití 7,0 g sloučeniny 2) v pyridinu (30 ml) . Směs se přes noc míchá při teplotě místnosti, zředí se ethylacetátem (0,6 1). Takto získaná suspenze se filtruje. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou, 0,05N chlorovodíkovou kyselinou, nasyceným vodným ·· ···· ·· · · ·· • · · · · · ··· • 4··· 4 4444 44 • 4 4 4 4 4 4 444

444 44 44 44444 roztokem hydrouhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného a potom se suší síranem horečnatým. Po oddestilování rozpouštědel za sníženého tlaku se získá surový produkt. Takto získaný surový produkt se podrobí silikagelové sloupcové chromatografii (silikagel, rozpouštědla : ethylacetát : hexan = 1/4 , 1/3, 1/2), přičemž se získá sloučenina 3 (2,85 g, 49 %) · ^-NMR (CDC1₃)5: 4,2 až 4,8 (m, 3H) , 4,8 až 5,1 (m, 24 H), 5,1 až 5,7 (m, 3H), 6,1 až 6,3 (m, 1H) a 7,1 až 7,6 (m, 72 H) .

IR (KBr, cm¹): 1,718 a 1,580.

4. Syntéza 2,3,4,6-Tetrakis-O-galloyl-D-glukopyranózy (sloučenina 4)

Po smíchání sloučeniny 3 (2,85 g) , ethylacetát/methanol (3/1, 150 ml) a paladiové černě (3,0 g) se iniciuje substituce vodíku. Poté co se reakční směs míchá asi 1 hodinu při teplotě místnosti, se odstraní paladiová čerň. Výsledný filtrát se koncentruje a podrobí se silikagelové sloupcové chromatografii (silkagel, rozpouštědlo : hexan : tetrahydrofuran : methanol = 60/30/10, 50/37,5/12,5, 40/45/15), přičemž se získá sloučenina 4 (0, 94 g, 86 %) .

^XH-NMR (DMSO-d6)5: 4,3 až 4,5 (m, 2H) , 5,0 až 5,2 (m, 2H) , 5,3 až 5,5 (m, 2H) , 5,8 až 6,2 (m, 1H, H¹) , 6,7 až 7,1 (m, 8H) a 9,19 (brs, 12H) .

IR (KBr, cm¹): 3,300, 1,700 a 1,610.

¹³C-NMR (DMSO-de)ě: 62,0, 66,2, 67,0, 68,4, 69, 4, 89, 5,

104,2, 108,8,	116,2, 116,3, 116,5, 116,6,	119,1,	138,6,	138,7,
139,0, 142,8,	143,0, 145,3, 145,5, 145,6,	164,5,	164,7,	165,0,
165,2 a 165,5	(směs a a β).
Příklad 2
Syntéza 1,2,3,	4,5-Penta-0-galloyl-B-D-glukopyranosy (sloučeni-

·· · ··· ·· ·· · · • · · · · · ··· • · · · · · · · · · · · ·· · · · · · ··· ·· ··· ·· ·· ·· ··· na 5)

Kyselina třislová (25 g), methanol a O,1M kyselina octová-natrium acetát (pH 6,0, 200 ml) se smíchají a reakce se nechá probíhat po 7 dní v termostatu při 37 °C za občasného míchání. Po skončení reakce se roztok koncentruje a objem se sníží na asi 50 % a výsledný koncentrovaný roztok se extrahuje ethylacetátem. Výsledný extrakt se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a pak se suší síranem hořečnatým. Po oddestilování rozpouštědla se získá surový produkt (asi 20 g). Výsledný surový produkt (10 g) se podrobí silikagelové sloupcové chromatografii (silikagel, rozpouštědla : hexan : tetrahydrofuran : methanol = 6/3/1, 50/37,5/12,5, 4/4,5/1,5), čimž se získá sloučenina 5 (1,39 g).

¹H-NMR (DMSO-ddč: 4,3 (brs), 4,5 až 4,6 (m) , 5,94 (d, d,

J = 9,7), 6,35 (d, J =	8,3 Hz, 1H), 6,77	(s, 2H), 6,82 (s,
2H) , 6,85 (s, 2H),	6, 92	(s, 2H), 6,98 (s,	2H), nalezeno 9,11
(brs, 15 H).
IR (KBr, cm'1)	: 3,350, 1,700 a 1,610.
13C-NMR (DMSO-	•d4) δ:	61,3, 67,6, 70,5,	71,9, 72,2, 91,7,

108,8, 117,4, 118,0, 118,1, 118,9, 138,8, 139,0, 139,5, 145,3,

145,3, 145,4, 145,6, 163,9, 164,4, 164,6, 164,8 a 165,4.

Příklady 3 až 5

Následující 3 sloučeniny se syntetizují podle příkladu 1.

Příklad 3

1,2,3,4,6-Penta-O-(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamoyl)-D-gluko- pyranóza ·· ···· *· ·· ·· • · · · * · B ·· • ···· · · »· · f· ♦ · · · · · · 9 99

9 99 9 9 9 9 9 999 9 ¹H-NMR (CDCI3/D2O) δ: 3,78 až 4,01 (m, 3OH) , 4,27 až 6,90 (m, 7H) , 6,13 až 6,55 (m, 5H) , 6,60 až 6,90 (m, 1OH) a 7,46 až 7,80 (m, 5H).

IR (KBr, cm’¹): 2,950, 2,850, 1,710, 1,630, 1,600, 1,510, 1,460, 1,280 a 1,220.

Přiklad 4

1,2,3,4,6-Penta-O-(3,4,5-Trimethoxybenzoyl)-D-glukopyranóza

1H-NMR (CDC13)ó	: 3,8	až	4,l (m, 45H), 4,3 až 4,	9 (m, 3H),
5,57 (dd, 0,4H), 5,	7 až	5,9	(m, l,6H), 5,9 až 6,2	(m, 0,6H),
6,2 až 6,4 (m, ÍH),	6, 81	(d,	0,4H) a 7,1 až 7,5 (m,	1OH) .

IR (KBr, cm¹): 1,720, 1,580, 1,330, 1,210 a 1,125 teplota táni 85 až 90 °C.

Příklad 5

1,2,3,4,6-Penta-O-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)-D-glukóza ^-NMR (CDC1₃)5: 3,60 až 4,05 (m, 45H) , 4,30 až 6,97 (m,

7H), 6,19 až 6,55 (m, 5H) a 6,60 až 6,97 (1OH).

IR (KBr, cm¹): 2,930, 1,720, 1,630, 1,580, 1, 500, 1,270, 1,240 a 1,130.

Příklad 6

Příprava hydrolyzovatelných taninů z borových šišek

Borové šišky se extrahují v horké vodě vařením, s dobou vaření lišící se podle množství borových šišek a/nebo množství vody, ale obvyklá doba je 3-krát 2 hodiny. Po extrakci borových šišek horkou vodou, se šišky napůl usuší a ponoří se do ethanolu a nechají se stát přes noc při teplotě místnosti. Po extrakci borových šišek v ethanolu se borové šišky napůl usuší a výsledný hydrolyzovatelný tanin nebo ligninový

9999

9

9 9 glykosid se extrahuje ponořením do acetonu a ponecháním odstát přes noc při teplotě místnosti, sušením lampou a extrakcí v IN roztoku hydroxidu sodného po dobu 6 hodin (nebo přes noc) za míchání. K tomuto vyextrahovanému roztoku se přidá kyselina octová a pH se vrátí na 5,0. Sraženina se odstraní operací odstředění za vysoké rychlosti. K vyetrahovanému roztoku se přidá stené množství ethanolu a nechá se stát přes noc v chladné místnosti. Sraženina se odstraní operací odstředění za vysoké rychlosti a kapalina nad sedlinou se dialyzuje ve vodě. Dialyzovaný roztok se suší vymrazením a získá se prášek. Prášek získaný vymrazením se čistí kolonou Sepharose CL-4B ( pohyblivé lože tvoří O,1N NaOH). Jímají se aktivní frakce, dialyzují se ve vodě, suší se vymrazením a tak se získá prášek. Tento vymrazený prášek se rozpustí v 10% ethanolu a dále se čistí kolonou Toyopearl HW-40F (pohyblivé lože tvoří 10% ethanol) . Jímají se aktivní frakce, dialyzují se ve vodě, suší se vymrazením a tím se získá finální prášek.

Příklad zkoušky 1

Účinek inhibitoru na póly(ADP-ribosa)glykohydrolázu

K pufru pro zkoušku (0,01 % albuminu z hovězího séra, 10 mM merkaptoethanolu, 50 mM fosforečnanu draselného, pH 7,0) se přidá 3H- (ADP-ribosa) n=15 tak, až směs dosáhne 27 pl, dále se přidá látka, která se má zkoušet a až do celkového objemu 30 pl roztok z buněčného jádra odvozené póly-(ADP-ribosa)glykohydrolázy připravený z lidské placenty, který byl inkubován po 1 hodinu při 37 °C. Později se reakční směs absorbuje filtračním papírem DE81 a filtrační papír se promyje vodou, ethanolem a acetonem a suší se a nezreagovaný substrát 3H(ADP-ribosy) se měří kapalným scintilačním počítadlem a zkoumá se inhibiční účinek testované látky na tento enzym. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1, která uzkazuje inhibici

99*9 • 9

999 póly-(ADP-ribosa)glykohydrolasy všemi zkoušenými látkami v závislosti na dávce.

Tabulka 1 - Inhibični účinek taninového glykosidu na poly(ADP-ribosa)glykohydrolázu

Koncentrace taninu

0,3

1,0

3, 0

Aktivita PARG (%)

100

Jiné variace a modifikace tohoto vynálezu při použití, mezi jinými, způsobů syntéz popsaných výše jsou osobě znalé oboru zřejmé.

Obraz 1 ukazuje buňky P388D1 (ATCC, kCCL-46), odvozené z tumoru podobného myšího makrofágu, které se uchovávají v Dulbekově modifikovaném orlím mediu (DMEM) s 10 % koňského séra, 2 mM L-glutaminu. Zkouška toxicity se provádí na plotně s 96 jamkami. V každé jamce se umístí 190 μΐ buněk s hustotou 2 x 10°/ml. Provede se zkouška citlivosti na dávky. K buňkám se přidávají různé koncentrace inhibitorů PARG. Obecný pokus zahrnuje dávky s konečnými koncentracemi 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,3, 10, 30, 100, 200 μΜ. Každý parametr se průměruje ze 4 údajů. Po 15 minutách inkubace se k buňkám přidá 5 μΐ čerstvě připraveného peroxidu vodíku tak, že konečná koncentrace je 2 mM. Soubor jamek neobsahující sloučeninu se pro stanovení pozadí nevystavuje působení peroxidu vodíku. Buňky se na 4 h vrátí do inkubátoru udržovaného na 37 °C. Na závěr inkubace se z buněčného media vzorkuje 25 μΐ kapaliny nad usazeninou, aby se stanovila hladina laktátdehydrogenázy (LDH) uvolněné z odumřelých buněk. Používáme zkoušku pomocí laktátdehydrogenázy

4444 • 4 · • 4 ♦·· • · 4 9 • 4 ·

444

44	4«	♦ ·
*	•	•	• 4
•	9	444	4	4
•	•	« 4	4 4	•
4	• ··	• · • 4	4 4 • 4

·· • 44 přejaté od Sigma Co., po které následuje postup experimentu podle výrobce. Účinky laktátdehydrogenázy se stanoví sledováním rychlosti snížení absorbance NADH při 340 nm. Snímá se aktivita pozadí LDH. Skupina bez ošetření účinnou látkou se použije k výpočtu celkového odumření buněk z důvodu působení peroxidu vodíku. Ochranné účinky inhibitorů PARG se vyjádří jako procento přežití buněk.

Obraz 2 ukazuje veličinu EC50, která byla stanovena z křivky cytotoxicity v závislosti na dávkách. K stanovení ECso, byla z křivky závislosti na dávkách odvozena koncentrace sloučeniny potřebná k dosažení 50% snížení úmrtnosti buněk. Procentické hodnoty aktivity PARG jsou rovnocené procentickému snížení úmrtnosti buněk způsobenému při zkoušce cytotoxicity konečnou koncentrací 2 mM peroxidu vodíku. Všechny metody jsou stejné jako v popisu obrazu 1.

Obraz 3 ukazuje zjednodušenou představu významu cyklu PARP/PARG pro zachování póly(ADP-ribosyl)ace, jeho vztahu k metabolismu buněčné energie a jeho různým použitím, nemocem a poruchám zde popsaným. Diagram naznačuje 2 obecné mechanismy pro to jak by měla být inhibice PARG užitečná pro různá použití zde popsaná, včetně zde navržené léčby nebo prevence různých nemocí a poruch. Předkládaný vynález se také zabývá jinými zde nepopsanými způsoby použití inhibitorů PARG pro užitečné zde popsané metody, jako jsou působení inhibitorů PARG na mechanismus nemoci nebo poruchy nezávisle na metabolismu PAR. Zkratky: NAD, nikotinamidadenosindinukleotid; NAM, nikotinamid; ATP, adenosintrifosfát; ROS, reaktivní kyslíkové sloučeniny; NOS, syntáza oxidu dusičného.

Příklady použití vynálezu

Farmaceutické prostředky

Další aspekt předkládaného vynálezu je zaměřen na farmaceutický prostředek obsahující farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo a terapeuticky účinné množství inhibitoru PARG nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer.

Inhibitory PARG jsou užitečné při výrobě farmaceutických prostředků obsahujících jejich účinné množství v konjunkci nebo jako směs s excipienty nebo nosiči vhodnými buď pro enterální nebo parenterální aplikaci. Jako takové mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu vhodné pro podávání orálně ve formě jednotlivých dávek, jako jsou kapsle, tobolky, tablety, pilulky nebo pastilky, z nichž každá obsahuje předem určené množství aktivní složky; ve formě prášku nebo granulí; ve formě roztoku nebo suspenze ve vodné kapalině nebo nevodné kapalině; nebo ve formě emulze olej ve vodě nebo emulze voda v oleji. Aktivní složka může být také ve formě jednorázové dávky, electuary nebo pasty.

Prostředek se obvykle utváří do formy jednotlivých dávek, jako jsou tablety, kapsle, vodné suspenze nebo roztoky. Takové prostředky obvykle obsahují pevný, polopevný nebo kapalný nosič. Příklady nosičů zahrnují laktózu, dextrózu, sacharózu, sorbitol, mannitol, škroby, arabskou gumu, fosforečnan vápenatý, minerální olej, kokosové máslo, teobromový olej, algináty, tragakant, želatinu, sirup, methylcelulózu, polyoxyethylensorbitanmonolaurát, methylhydroxybenzoát, propyl hydroxybenzoát, mastek, magnesiumstearát a podobné.

Zvláště výhodné prostředky zahrnují tablety a želatinové kapsle obsahující aktivní složku společně s (a) ředidly, jako • · · • ♦ · · · ·· ··· · · • · · · · · · ·· · ·· · · · · · ·· ·· ··· je laktóza, dextróza, sacharóza, mannitol, sorbitol, celulóza, sušený obilní škrob a glycin a/nebo (b) mazadla jako jsou oxid křemičitý, práškový mastek, kyselina stearová a její hořečnaté nebo vápenaté soli a polyethylenglykol.

Tablety mohou také obsahovat pojivá, jako jsou křemičitan hořečnato-hlinitý, škrobová pasta, želatina, tragakant, methylcelulóza, natriumkarboxymethylcelulóza a polyvinylpyrrolidon; nosiče, jako jsou laktóza a obilní škrob; desintegranty, jako jsou škroby, agar, kyselina alginová nebo její sodná sůl a šumivé směsi; a/nebo absorbenty, barviva a sladidla. Prostředky podle tohoto vynálezu se mohou sterilizovat a/nebo obsahují adjuvans, jako jsou konzervační, stabilizační, bobtnací nebo emulgační činidla, promotory roztoku, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Navíc může prostředek také obsahovat jiné terapeuticky hodnotné látky. Vodné suspenze mohou obsahovat emulgační a suspenzní činidla kombinovaná s aktivními složkami. Všechny formy orálních dávek mohou také obsahovat sladidla a/nebo příchuti a/nebo barviva.

Tyto prostředky se připravují běžnými způsoby míchání, granulace nebo potahování a obsahují od asi 0,1 do 75 % aktivní složky, výhodně od asi 1 do 50 %. Tablety se mohou připravit stlačením nebo lisováním aktivní složky popřípadě s jednou nebo více pomocnými složkami. Stlačené tablety se mohou připravit stlačením aktivní složky ve volně-tekuté formě, jako je prášek nebo granule, ve vhodném stroji, popřípadě se aktivní složka smíchá s pojivém, mazadlem, inertním ředidlem, povrchově aktivním nebo disperzním činidlem. Lisované tablety se mohou připravit lisováním směsi, práškové aktivní složky a vhodného nosiče zvlhčeného inertním kapalným ředidlem, ve vhodném stroji.

• ·

Když se podává parenterálně, bude prostředek normálně ve formě jednotkových dávek, sterilních inijekčnich prostředků (vodný isotonický roztok, suspenze nebo emulze) s farmaceuticky přijatelným nosičem. Takové nosiče jsou výhodně netoxické, parenterálně přijatelné a obsahují neléčivá ředidla nebo rozpouštědla. Příklady takových nosičů zahrnují vodu, vodné roztoky, jako jsou solanka (isotonický roztok chloridu sodného), Ringersův roztok, roztok dextrózy a Hanksův roztok a nevodné nosiče, jako jsou 1,3-butandiol, stabilní oleje (např. kukřičný, bavlníkový, arašídový, sezamový olej a syntetické mono- nebo di-glyceridy), ethyloleát a isopropylmyristát.

Olej ovité suspenze se mohou vytvářet technikami známými v oboru, použitím vhodných disperzních nebo zvlhčovačích činidel a suspenzních činidel. Mezi přijatelnými rozpouštědly nebo suspenzními médii jsou sterilní stabilní oleje. Pro tento účel může být použit jakýkoliv lehký stabilní olej. Mastné kyseliny, jako jsou kyselina olejová a její glyceridové deriváty, včetně olivového oleje a ricinového oleje, zvláště v jejich polyethoxylovaných formách jsou také užitečné při přípravě inijekčnich prostředků. Tyto olejnaté roztoky nebo suspenze mohou také obsahovat alkoholová ředidla s dlouhým řetězcem nebo disperzanty.

Výhodným nosičem je sterilní solanka a sloučeniny jsou často dostatečně rozpustné ve vodě, aby vytvořily roztoky pro všechny předvídatelné potřeby. Nosič může obsahovat menší množství aditiv, jako jsou látky, které zesilují rozpustnost, isotonicitu a chemickou stabilitu, např. antioxidanty, pufry a konzervační činidla.

Když se podávají rektálně, utváří se prostředek obvykle do formy dávkové jednotky, jako je čípek nebo tobolka. Tyto • · • · · · · *··· · · ····· ·· · · «« · prostředky se mohou připravit mícháním sloučenin s vhodnými nedráždivými vehikuly, které jsou pevné při teplotě místnosti, ale kapalné při teplotě rekta, takže sé rozpustí v rektu a uvolní sloučeninu. Běžná vehikula zahrnují kakaové máslo, včelí vosk a polyethylenglykoly nebo jiné tukové emulze nebo suspenze.

Mimoto mohou být sloučeniny podávány lokálně, zvláště když stavy určené k léčbě zahrnují oblasti nebo orgány snadno dostupné lokální aplikací, včetně neurologických poruch oka, pokožky nebo dolního zažívacího traktu.

Pro lokální aplikaci do oka nebo oftalmické použití, může být sloučenina formována jako mikronizovaná suspenze v isotonické, sterilní solance s upraveným pH nebo výhodně, jako roztok v isotonické sterilní solance s upraveným pH buď s nebo bez konzervačních činidel, jako je benzylalkoniumchlorid. Alternativně mohou být sloučeniny formovány do podoby mastí, jako je petrolatum.

Pro lokální aplikaci na kůži se mohou sloučeniny formovat do podoby vhodných mastí obsahujících sloučeniny suspendované nebo rozpuštěné v, například, směsích s jednou nebo s více z následujících látek: minerální olej, kapalné petrolatum, bílé petrolatum, propylenglykol, sloučenina polyoxyethylenu, sloučenina polyoxypropylenu, emulgační vosk a voda. Alternativně mohou být sloučeniny formovány do podoby vhodných pleťových vod nebo krémů obsahujících aktivní sloučeninu suspendovanou nebo rozpuštěnou v, například, směsi jedné nebo více z následujících látek: minerální olej, sorbitanmonostearát, polysorbát 60, cetylesterový vosk, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol a voda.

Lokální podávání do dolního zažívacího traktu se může uskutečnit ve formě rektálních čípkových prostředků (viz výše) nebo ve formě vhodných klystýrových prostředků.

Prostředky vhodné pro nasální nebo bukální podávání, (takové jako prostředky z tlakových práškových dávkovačů), mohou obsahovat od asi 0,1 % do asi 5 % hmotnost/hmotnost aktivní složky nebo například asi 1 % hmotnost/hmotnost této složky. Navíc některé prostředky mohou být zamíchány do pilulky nebo pastilky podávané pod jazyk.

Prostředky mohou jednotkových dávek a způsobů dobře známých zahrnují krok přivedení který tvoří jedna nebo prostředky připravují aktivní složky ke spojení s rozptýleným pevným nosičem nebo tvářením produktu do požadované být výhodně předkládány ve formě mohou být připraveny jakýmkoliv ze v oboru farmacie. Všechny způsoby s nosičem, aktivní složky ke spojení více pomocných složek, rovnoměrným a dokonalým kapalným nosičem oběma a pak, je-li formy.

Obecně se přivedením nebo jemně to potřeba,

Ve výhodném ztělesnění je nosič pevný biodegradovatelný polymer nebo směs biodegradovatelných polymerů s vhodnou charakteristikou časového uvolňování a kinetikou uvolňování. Prostředky podle tohoto vynálezu mohou pak být lisovány do tvaru pevného implantátu vhodného pro poskytováni účinných koncentrací sloučenin podle tohoto vynálezu po prodlouženou časovou periodu, aniž by vyžadoval časté doplňování. Prostředek podle předkládaného vynálezu může být zabudován do biodegradovatelného polymeru nebo směsi polymerů jakýmkoliv vhodným způsobem známým osobě znalé oboru a může tvořit s biodegradovatelným polymerem homogenní matrici nebo může být nějakým způsobem zapouzdřen do polymeru nebo může být zalisován do pevného implantátu. V jednom ztělesnění je biodegradovatelný polymer nebo směs polymerů použita ve formě měkkého lože obsahujícího farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu, které může být podáváno jako pohyblivá kapalina například inijekcí, ale které zůstává dostatečně viskozní, aby udrželo farmaceutický prostředek v oblasti lokalizované kolem místa inijekce. Doba degradace takto vytvořeného lože se může pohybovat od několika dní do několika let, v závislosti na vybraném polymeru a jeho molekulární hmotnosti. Použitím polymerního prostředku v inijekční formě může být odstraněna dokonce potřeba vytvoření incise. V každém případě, se pružné nebo tekuté doručovací lože upraví do tvaru prostoru, který zaujímá v těle s minimálním poškozením okolních tkání. Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu se používají v množstvích, která jsou terapeuticky účinná a použitá množství mohou záviset na požadovaném průběhu uvolňování, koncentraci farmaceutického prostředku požadované pro vyvolání senzitizačního účinku a délce času, ve kterém má být farmaceutický prostředek uvolněn pro léčbu.

Inhibitory PARG podle tohoto vynálezu jsou výhodně podávány jako kapsle nebo tablety obsahující jednoduchou nebo dělenou dávku sloučeniny nebo pro parenterální podávání jako sterilní roztok, suspenze nebo emulze v jednoduchých nebo dělených dávkách.

V jiném výhodném ztělesnění mohou být inhibitory PARG podle tohoto vynálezu připraveny v lyofilizované formě. V tomto případě, může být v jednotlivých lékovkách lyofilizováno od 1 do 100 mg inhibitoru PARG, společně s nosičem a pufrem, jako jsou mannitol a fosforečnan sodný. Prostředek se pak může před podáváním v lékovkách rekonstituovat bakteriostatickou vodou.

• · ··· · · · ·

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se používají v prostředku v množstvích, která jsou terapeuticky účinná. Zatímco účinné množství inhibitoru PARG závisí na jednotlivé sloučenině, která je použita, množství těchto sloučenin pohybující se od asi 1 do asi 65 % může být snadno zabudováno do kapalných nebo pevných doručovacích systémů.

Prostředky a způsoby inhibice nebo snížení vyčerpání buněčné energie, poškození buněk nebo odumření buněk indukovaného volnými radikály.

Výhodně se podle tohoto vynálezu podávají účinná množství sloučenin a prostředků popsaných výše živočichům, pro zastavení nebo snížení vyčerpání buněčné energie, poškození buněk nebo odumření buněk vyvolaného volnými radikály. V jiném ztělesnění tohoto vynálezu ovlivňují farmaceutické přípravky a způsoby podle předkládaného vynálezu využívající inhibitory PARG činnost neuronů, která může nebo nemusí být přenášena

NMDA neurotoxicitou nebo glutamátovou neurotoxicitou. Takové působení neuronů, a léčbu vynález živočichů, na neurony může zahrnovat stimulaci poškozených podporu regenerace neuronů, prevenci neurodegenerace neurologických poruch. Podle dále týká způsobu zahrnuj ícího farmaceutického prostředku ovlivnění podávání podle zmíněnému živočichovi za účelem léčby zvláště poškození poškození reperfúzí toho se předkládaný neuronů u činnosti účinného množství vynálezu předkládaného poškození nervové tkáně, cerebrální ischemie a pocházejícího z nebo neurodegenerativních nemocí u savců.

Výraz nervová tkáň se týká různých složek, které tvoří nervový systém, včetně bez omezení, neuronů, nervových podpůrných buněk, glie, Schwanových buněk, systému cév v nich obsaženého a zásobujícího tyto struktury, centrálního nervového systému, mozku, mozkového kmene, míchy, spojení centrálního nervového systému s periferním nervovým systémem, periferního nervového systému a spojených struktur.

Výraz poškození nervové tkáně pocházející z ischemie a poškození reperfúzí a neurodegenerativních nemocí zahrnuje neurotoxicitu, tak jak je pozorována při mozkové mrtvici, globální a fokální ischemii a retinální ischemii.

Výraz ischemie se týká lokalizované anemie tkáně vyvolané obstrukcí přítoku arteriální krve. Globální ischemie se objeví, když se tok krve do celého mozku na určitou dobu zastaví. Globální ischemie může vzniknout ze srdeční zástavy. Fokální ischemie se objeví, když je část mozku zbavena normální dodávky krve. Fokální ischemie může vzniknout z tromboembolytické mozkové cévy, traumatického úrazu hlavy, oedemu nebo mozkového nádoru. Dokonce i když je přechodná, jak globální tak fokální ischemie může způsobit rozsáhlé poškození neuronů. Ačkoliv se poškození nervové tkáně projeví po hodinách nebo dokonce dnech po ischemickém záchvatu, určité stálé poškození nervové tkáně se může vyvinout v počátečních minutách, které následují po zastavení toku krve do mozku. Hodně z těchto poškození se připisuje glutamátové toxicitě a sekundárním následkům reperfúze tkáně, jako jsou uvolnění vasoaktivních produktů poškozeným endotheliem a uvolnění cytotoxických produktů, jako jsou volné radikály a leukotriny poškozenou tkání. Ischemie se také může objevit v srdci při infarktu myokardu a jiných kardiovaskulárních poruchách, při kterých se ucpou koronární arterie v důsledku aterosklerózy, trombu nebo spasma.

Výraz neurodegenerativní nemoci zahrnuje Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu chorobu a Huntingtonovu nemoc.

• · ···· «· · · ·· • · · · · · ··· • · · · · · · · · · · · • · · ···· ·· · ·· 9 99 · · · · · · · · ·

Výraz poškozeni nervů se týká jakéhokoliv poškození nervové tkáně a jakékoliv ztráty schopností nebo smrti z něj pocházející. Příčina poškození nervů může být metabolická, toxická, neurotoxická, iatrogenická, tepelná nebo chemická a bez omezení zahrnuje ischemii, hypoxii, mozkovou příhodu, trauma, chirurgický zákrok, tlak, nadváhu, krvácení, radiaci, vasospasma, neurodegenerativní nemoci, infekci, Parkinsonovu chorobu, amyotropickou laterální sklerózu (ALS), proces myelinace/demyelinace, epilepsii, ztrátu vědomí, glutamátovou abnormalitu a jejich sekundární účinky.

Příklady neurologických poruch, které jsou léčitelné způsoby využívajícími předkládaný vynález zahrnují bez omezení trigeminální neuralgii, glosofaryngálni neuralgii, Bells Palsiovou nemoc, myastenii gravis, svalovou dystrofii, amyotropickou laterální sklerózu, progresivní svalovou atrofii, dědičnou progresivní atrofii svalů oční bulvy, příznaky uskřinutí, protržení nebo výhřeznutí meziobratlové ploténky, cervicální spondolýzu, poruchy plexu, příznaky destrukce hrudního kanálu, periferální neuropatie, jako jsou neuropatie způsobené olovem, dapsonem, klíšťaty, porfyrií nebo Guillain-Barrého syndromem, Alzheimerovu nemoc, Huntingtonovu nemoc a Parkinsonovu chorobu.

Způsob podle předkládaného vynálezu je zvláště užitečný pro léčbu neurologických poruch vybraných ze skupiny, která se skládá z: periférní neuropatie způsobené fyzickým poraněním nebo stavem nemoci; úrazu hlavy, jako je traumatické poranění mozku; fyzického poškození míchy; mrtvice spojené s poškozením mozku, jako je mozková mrtvice spojená s hypoxii a poškozením mozku, fokální mozkovou ischemii, globální mozkovou ischemii a poškozením mozku reperfúzí; demyelinačních nemocí, jako jsou rozptýlená skleróza; a neurologické poruchy týkající se ·· ···· neurodegenerace, jako jsou Alzheimerova nemoc, Parkinsonova choroba, Huntingtonova nemoc a amyotropická laterálni skleróza (ALS).

Výraz chránící nervy se týká účinku snižujícího, zastavujícího nebo odstraňujícího poškození nervů a ochrany, resuscitace nebo oživení nervové tkáně, která utrpěla poškození.

Výraz zabraňující neurodegeneraci zahrnuje schopnost zabránit neurodegeneraci u pacientů s diagnózou, že mají neurodegenerativní nemoc nebo kteří jsou v ohrožení, že dojde k vývoji neurodegenerativní nemoci. Tento výraz také obsahuje zabránění další neurodegeneraci u pacientů, kteří již trpí nebo mají příznaky neurodegenerativní nemoci.

Výraz léčení se týká:

(i) zabránění nemoci, poruše nebo stavu, aby se vyskytl u živočicha, který může být náchylný k nemoci, poruše a/nebo stavu, ale ještě u něj nebyla stanovena diagnóza, že je nemocný;

(ii) inhibice nemoci, poruchy nebo stavu, tj . zastavení jeho vývoje; a (iii) ulehčení nemoci, poruchy nebo stavu, tj. způsobení ústupu nemoci, poruchy a/nebo stavu.

Léčba ostatních poruch spojených s PARG

Sloučeniny, prostředky a způsoby podle tohoto vynálezu mohou být také použity k léčbě kardiovaskulárních poruch u

4··· ·

· živočichů, podáváním účinného množství farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu živočichovi.

Jak se zde používá, výraz kardiovaskulární poruchy se týká těch poruch, které mohou buď způsobit ischemii nebo jsou způsobeny reperfúzí srdce. Příklady zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, onemocnění koronárních arterií, angínu pektoris, infarkt myokardu, poškození kardiovaskulární tkáně způsobené zástavou srdce, poškození kardiovaskulární tkáně způsobené instalací srdečního bajpásu, kardiogenním šokem a příbuzné stavy, které by měly být známé osobě znalé oboru nebo které zvláště zahrnují disfunkci nebo poškození tkáně srdce nebo systému cév, ale neomezují se na tyto případy, poškození tkáně spojené s aktivací PARP.

Například, se věří, že způsoby podle tohoto vynálezu by měly být užitečné při léčbě poškození srdeční tkáně, zvláště poškození pocházejícího ze srdeční ischemie nebo způsobené poškozením reperfúzí u savců. Způsoby podle tohoto vynálezu jsou zvláště užitečné pro léčbu kardiovaskulárních poruch vybraných ze skupiny skládající se z: onemocnění koronárních arterií, jako je ateroskleróza; angíny pektoris; infarktu myokardu; srdeční ischemie a srdeční zástavy; instalace srdečního bajpásu a kardiogenního šoku. Způsoby podle tohoto vynálezu zvláště pomáhají při léčbě akutních forem výše uvedených kardiovaskulárních poruch.

Dále, způsoby podle tohoto vynálezu mohou být použity k léčbě poškození tkáně pocházejícího z poškození nebo odumření buněk způsobeného nekrózou nebo apoptózou, poškození nervové tkáně způsobeného ischemii a poškozením reperfúzí, neurologickými poruchami a neurodegenerativními nemocemi; k prevenci nebo léčbě mozkové mrtvice; k léčbě nebo prevenci ··· ♦ · · · · · • · • ··· •· •t • · · · · 9 9 9 9 99

9 · 9 9 9 9 99

99· 9 9 9 9 9 99 kardiovaskulárních poruch; k léčbě ostatních stavů a/nebo poruch jako jsou skvrnová degenerace pokožky stářím, nemoci způsobené stárnutím imunitního systému, artritida, ateroskleróza, kachexie, degenerativní nemoci kosterních svalů včetně replikační senescence, cukrovky, úrazu hlavy, stárnutí imunitního systému, zánětlivého onemocnění střev (jako jsou kolitida a Crohnova nemoc), svalová dystrofie, osteoartritida, osteoporóza, bolest (jako je neuropatická bolest), selhání ledvin, nedokrevnost sítnice, septický šok (jako je endotoxický šok) a stárnutí pokožky; k zvětšení životnosti a proliferační schopnosti buněk; k změně genové exprese senescentních buněk; nebo k radiosenzitizaci nádorových buněk.

Výraz léčení se týká:

(i) zabránění výskytu nemoci, poruchy nebo stavu u živočicha, který může být náchylný k nemoci, poruše a/nebo stavu, ale ještě u něj nebyla stanovena diagnóza, že je nemocný;

(ii) inhibice nemoci, poruchy nebo stavu, t.j . zastavení jejich vývoje; a (iii) ulehčení nemoci, poruchy nebo stavu, tj . způsobení ústupu nemoci, poruchy a/nebo stavu.

Podávání

Pro lékařské použití se množství inhibitoru PARG požadované k dosažení léčebného účinku liší podle jednotlivé podávané sloučeniny, způsobu podávání, ošetřovaného savce a jednotlivé poruchy nebo nemoci. Vhodná systémová dávka inhibitoru PARG pro savce, který trpí nebo pravděpodobně bude

9999 99 9999 • 99 9 9 9 9 99

9999 9 9999 99

9 9 9 9 9 9 · · 99

9 9 9 9 9 9 99

99999 99 99 999 trpět, kterýmkoliv zde popsaným stavem je obecně v rozsahu od asi 0,1 do asi 100 mg účinné látky na kilogram tělesné hmotnosti, výhodně od asi 1 do asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti savce. Rozumí se, že běžně kvalifikovaný lékař nebo veterinární lékař bude snadno schopen stanovit a předepsat množství sloučeniny účinné pro požadované profylaktické nebo terapeutické ošetření.

Při takovém postupu může lékař nebo veterinář použít nitrožilní bolus, po kterém následuje nitrožilní infuse a opakovaná podávání podle posouzeni. Při způsobech podle předkládaného vynálezu mohou být sloučeniny například podávány orálně, parenterálně, inhalačním sprejem, místně, rektálně, nasálně, bukálně, pod jazyk, vaginálně, nitroventrikulárně nebo přes implantovaný zásobník v dávkovačích prostředcích obsahujících běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans a vehikula.

Parenterálně zahrnuje, ale není na ně omezeno, následující příklady podávání: nitrožilní, podkožní, nitrosvalové, nitromíšní, nitrokostní, nitroperitonální, nitrotekální, nitroventrikulární, nitrosternální nebo nitrokranální inijekce a infúzní techniky, jako je subdurální pumpa. Výhodné jsou invasivní techniky, zvláště přímé podávání do .poškozené nervové tkáně. Přestože je možné, aby byl inhibitor PARG podáván samotný, je výhodné ho podávat jako součást farmaceutického prostředku.

Aby byly terapeuticky účinné na cíle v centrálním nervovém systému, měly by sloučeniny používané při způsobech podle předkládaného vynálezu, když jsou podávány periferálně, snadno pronikat bariérou krev-mozek. Sloučeniny, které nemohou ·· ··«· ·♦ ···4 ··· · · · · ·· • · ··· · · ··· ·· · * « · · · ··· • · · ·» · · e β·· · proniknout bariérou krev-mozek, však mohou být ještě účinně podávány nitroventrikulárnim způsobem.

Sloučeniny používané při způsobech podle předkládaného vynálezu se mohou podávat v jednotlivé dávce, násobných oddělených dávkách nebo kontinuální infuzi. Jelikož jsou sloučeniny malé, snadno difuzibilní a relativně stabilní, hodí se dobře pro kontinuální infuzi. Prostředky pro podávání pomocí pumpy, zvláště prostředky pro podávání podkožní nebo subdurální pumpou jsou pro kontinuální infuzi výhodné.

Pro způsoby podávání podle předkládaného vynálezu může být použit jakýkoliv účinný režim podávání, který reguluje časování a sled dávek. Dávky sloučenin výhodně zahrnují farmaceutické dávkové jednotky, které obsahují účinné množství aktivní sloučeniny. Účinným množstvím se rozumí množství dostatečné k inhibici působení PARP a/nebo dosahující jejich požadované příznivé účinky prostřednictvím podávání jedné nebo více farmaceutických dávkových jednotek. V obzvláště výhodném ztělesnění je dávka dostatečná, aby zabránila nebo snížila účinky mozkové mrtvice nebo jiných neurodegenerativních onemocnění.

Příkladná jednotka denní dávky pro příjemce, kterým je obratlovec obsahuje množství od asi 0,001 mg/kg do asi 50 mg/kg. Obecně, jsou úrovně dávek na předpis od asi 0,1 mg do asi 10 000 mg sloučeniny aktivní složky užitečné při léčbě výše uvedených stavů, s výhodnými úrovněmi, které se pohybují od asi 0,1 mg do asi 1000 mg. Specifická úroveň dávky se pro každého jednotlivého pacienta bude lišit v závislosti na řadě faktorů, včetně aktivity specifické použité sloučeniny; věku, tělesné hmotnosti, celkovém zdravotním stavu, pohlaví a výživě pacienta; době podávání; rychlosti vylučování; jakékoliv • · · » ·· ···· • · • · ·· kombinaci sloučeniny s ostatními složkami; závažnosti jednotlivého léčeného onemocnění; a formě a způsobu podávání. Obecně výsledky účinku dávky in vitro poskytuji užitečné vodítko ohledně správných dávek pro podávání pacientovi. Studie na živočišných modelech mohou být také užitečné. Úvahy pro stanovení správné úrovně dávek jsou v oboru dobře známé.

U způsobů léčby poškození nervů (zvláště akutní ischemické mrtvice a globální ischemie způsobené utopením nebo úrazem hlavy), mohou být sloučeniny podle tohoto vynálezu podávány společně s jedním nebo více jinými léčebnými činidly, výhodně činidly, které mohou snížit riziko mrtvice (jako je aspirin) a, výhodněji, činidly, které mohou snížit riziko druhé ischemické příhody (jako je ticlopidin).

Sloučeniny a prostředky mohou být podávány společně s jedním nebo více terapeutickými činidly buď (i) společně v jednom prostředku, nebo (ii) odděleně v individuálních prostředcích vytvořených pro optimální rychlost uvolňování jejich příslušného aktivního činidla. Každý prostředek může obsahovat od asi 0,01 % do asi 99, 99 % hmotnostních, výhodně od asi 3,5 % do asi 60 % hmotnostních, sloučeniny podle tohoto vynálezu, stejně jako jedno nebo více farmaceutických vehikul, jako jsou namáčecí, emulgační a pH tlumící činidla. Když jsou sloučeniny používané způsoby podle tohoto vynálezu podávány v kombinaci s jedním nebo více terapeutickými činidly, bude specifická úroveň dávek těchto činidel záviset na posouzení, jako jsou způsoby posouzení obecně zjištěné výše pro prostředky a způsoby podle tohoto vynálezu. Pro způsoby podle předkládaného vynálezu může být použit jakýkoliv režim regulující čas a sled podávání sloučeniny a opakován jestliže je to potřeba pro účinnou léčbu. Takový režim může zahrnovat před-léčbu a/nebo podáváni splečně s přídavnými léčebnými činidly.

Aby se maximalizovala ochrana nervové tkáně proti poškození, měly by být sloučeniny podle tohoto vynálezu podány do postižených buněk tak rychle, jak je to jen možné. Při situacích, kde se očekává poškození nervové tkáně, jsou sloučeniny výhodně podávány před očekávaným poškozením nervů. Takové situace zvýšené pravděpodobnosti poškození nervů zahrnují chirurgický zákrok, jako je endarterektomie karotidy, chirurgický zákrok na srdci, mozku, aortách, ortopedický chirurgický zákrok; endovaskulární procedury, jako jsou arteriální kateterizace (kartoidní, vertebrální, aortická, srdeční, ledvinová, míšní, Adamkiewiczova); inijekce embolických činidel; použití prstenců nebo balonů pro hemostázi; přerušení cévního systému pro léčbu mozkových lézí; a predispoziční medicínské stavy jako jsou crescendo přechodné ischemické záchvaty, embolické a sekvenční mrtvice.

Kde není před-léčba proti mrtvici nebo ischemii možná nebo proveditelná, je důležité přivést sloučeniny podle tohoto vynálezu do kontaktu s postiženými buňkami tak rychle, jak je to jen možné, buď v průběhu nebo po příhodě. V období mezi mrtvicemi, by však měly být diagnostické a léčebné procedury minimalizovány, aby se buňky ušetřily dalšího poškození nebo odumřeni. Proto zvláště výhodným způsobem podávání pacientovi s diagnózou, že trpí akutními násobnými mozkovými mrtvicemi je implantace subdurální pumpy, která dopraví sloučeninu(y) podle tohoto vynálezu přímo do infarktem stižené oblasti mozku. Dokonce i když je v komatu očekává se, že se by se měl pacient zotavit rychleji než kdyby on nebo ona zůstal(a) bez tohoto ošetření. Mimo to se při jakémkoliv stavu bezvědomí pacienta ·· ··<·· 99 9999

9 9 9 9 9 99 • · 999 9 9 999 99

9 9 9 9 9 9 99

999 99 9999 očekává, že by se měly snížit jakékoliv zbytkové neurologické příznaky, stejně jako opětný výskyt mrtvice.

Pokud jde o pacienty s diagnózou, že trpí jinými akutními poruchami, o nichž se věří, že jsou spojené s aktivitou PARP, jako jsou cukrovka a Crohnova nemoc, měla by se jim podat sloučenina podle tohoto vynálezu tak rychle, jak je to jen možné v jedné nebo dělené dávce.

V závislosti na pacientových příznacích a stupni reakce na počáteční podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu, pacient může dále dostat dodatečné dávky stejné nebo jiných sloučenin podle tohoto vynálezu jedním z následujících způsobů: parenterálně, jako inijekcemi nebo nitrožilním podáváním; orálně, jako kapslemi nebo tabletami; implantací biosnášenlivého, biodegradovatelného matričního doručovacího systému obsahujícího sloučeninu; nebo přímým podáváním do oblasti infarktu zavedením subdurální pumpy nebo hlavním řečištěm. Očekává se, že léčba by měla zmírnit poruchu, buď čístečně nebo celkově a že se vyvine méně dalších výskytů poruchy. Očekává se také, že pacient bude trpět menším množstvím zbytkových příznaků.

Když je u pacienta stanovena diagnóza, že trpí akutní poruchou, dříve než jsou inhibitory PARG podle tohoto vynálezu dostupné, může se pacientův stav zhoršit kvůli akutní poruše a stát se poruchou chronickou za dobu než jsou inhibitory PARG k dispozici. Dokonce, když pacient přijme pro léčbu chronické poruchy farmaceutický prostředek obsahující inhibitor PARG, očekává se také, že by se pacientův stav měl v důsledku přijímání inhibitoru PARG stabilizovat a ve skutečnosti zlepšit.

Inhibitory PARG mohou také být použity pro radiosenzitizaci nádorových buněk. Výraz radiosenzitizér, jak je používán zde, je definován jako molekula, výhodně molekula s nízkou molekulární hmotností, podávaná živočichům v terapeuticky účinném množství k zvýšení citlivosti buněk, aby se staly radiosenzitizované tj.citlivé na elektromagnetické záření a/nebo k podpoře léčby nemocí, které jsou léčitelné elektromagnetickým zářením. Nemoci, které jsou léčitelné elektromagnetickým zářením zahrnují neoplazmické nemoci, benigní a maligní nádory a rakovinné buňky. Léčba jiných zde neuvedených nemocí je také předkládaným vynálezem zvažována. Výrazy elektromagnetické záření a záření' zde používané zahrnují, ale nejsou tím limitovány, záření, které má vlnovou délku od 1O’²⁰ do 10° metrů. Výhodná ztělesnění podle předkládaného vynálezu používají elektromagnetické záření ze skupiny: gamma záření (od 1O²⁰ do 10’¹³ m) , rentgenové záření (od 10¹¹ do 10⁹ m) , ultrafialové zářeni (od 10 nm do 400 nm) , viditelné světlo (od 400 nm do 700 nm) , infračervené záření (od 700 nm do 1,0 mm) a mikrovlnné záření (od 1 mm do 30 cm).

O radiosenzitizérech je známo, že zvyšují senzitivitu rakovinných buněk na toxické účinky elektromagnetického zářeni. V literatuře bylo navrženo několik mechanismů způsobu působení radiosenzitizérů zahrnujících: radiosenzitizéry hypoxických buněk (např. 2-nitroimidazolové sloučeniny a benzotriazindioxidové sloučeniny),které podporují reoxigenaci hypoxické tkáně a/nebo katalyzují tvorbu škodlivých kyslíkových radikálů; radiosenzitizéry nehypoxických buněk (např. halogenované pyrimidiny), které mohou být analogy bází DNA a přednostně se zabudovávají do DNA rakovinných buněk a tím podporují radiací vyvolané zlomy molekul DNA a/nebo brání normálnímu reparačnímu mechanismu DNA; vyslovily se také ·· >··· 99 9999

999 999999

9 999 9 9999 99

9 9999 999 ♦ · 999 99 99 · 9999 hypotézy různých jiných možných mechanismů působeni radiosenzitizérů při léčbě nemoci.

V současnosti mnoho postupů léčby rakoviny využívá radiosenzitizéry aktivované elektromagnetickým zářením rentgenových paprsků. Příklady radiosenzitizérů aktivovaných rentgenovými paprsky zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, následující sloučeniny: metronidazol, misonidazol, desmethylmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomycin C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, nikotinamid, 5-bromodeoxyuridin (BUdR), 5-jododeoxyuridin (IUdR), bromodeoxycytidin, fluordeoxyuridin (FUdR), hydroxymočovinu, cisplatin a jejich terapeuticky účinné analogy a deriváty.

Fotodynamická léčba (PDT) rakoviny používá viditelné světlo jako radiační aktivátor senzitizačních činidel. Příklady fotodynamických radiosenzitizérů zahrnují následující sloučeniny, ale nejsou na ně omezeny: deriváty hematoporfyrinu, Fotofrin, deriváty benzoporfyrinu, NPe6, etioporfyrincínatý SnET2, feoborbid-a, bakteriochlorofyl-a, naftalocyaniny, ftalocyaniny, ftalocyaninzinečnatý a jejich terapeuticky účinné analogy a deriváty.

Radiosenzitizéry mohou být podávány ve spojení s terapeuticky účinným množstvím jedné nebo více sloučenin, bez omezení na ně, včetně: sloučenin, které podporují zabudování radiosenzitizérů do cílových buněk; sloučenin, které regulují přísun léčiv, živin a/nebo kyslíku do cílových buněk; chemoterapeutických činidel, které působí na nádor s nebo bez dodatečného ozařování; nebo jiných terapeuticky účinných sloučenin pro léčbu rakoviny nebo jiných nemocí. Příklady přídavných terapeutických činidel, které mohou být použity ve spojení s radiosenzitizéry zahrnují, ale nejsou na ně omezeny:

·· ··««

5-fluoruracil, leucovorin, 5'-amino-5'deoxythymidin, kyslík uhlík, transfúzi erythrocytů, perfluorované uhlovodíky (např. Fluosol-DA) , 2,3-DPG, BW12C, blokační činidla kalciového kanálu, pentoxyfylin, antiangiogenézní sloučeniny, hydralazin a L-BSO. Příklady chemoterapeutických činidel, které mohou být použity ve spojení s radiosenzitizéry zahrnují, ale nejsou na ně omezeny: adriamycin, camptothecin, carboplatin, cisplatin, daunorubicin, docetaxel, doxorubicin, interferon (alfa, beta, gama), interleukin-2, irinotecan, paclitaxel, topotecan a jejich terapeuticky účinné analogy a deriváty.

Příklady použití vynálezu

Následující příklady jsou ilustrativní pro výhodná ztělesnění podle příbuzných vynálezů a neměla by být chápána jako omezení předkládaného vynálezu.

Všechny molekulární hmotnosti polymerů jsou míněny jako průměrné hmotnosti. Všechna procentická vyjádření jsou, molekulární pokud není jinak uvedeno, založena na procentech hmotnostních konečného připraveného doručovacího systému nebo prostředku a všechny součty se rovnají 100 % hmotnostním.

Příklad 1: Zkouška ochranných účinků na nervy při fokální cerebrální ischemii u krys

Zkoušky s fokální cerebrální ischemii se provádějí na krysích samcích rodu Wistar, vážících 250 - 300 g, kteří jsou anestetizováni 4% halotanem. Anestéze se udržuje dávkami 1,0 až 1,5% halotanu do konce chirurgického zákroku. Zvířata jsou umístěna v teplém prostředí, aby se zabránilo snížení tělesné teploty během chirurgického zákroku.

ΊΟ

4·	4444	4«	44	• 4
4 4	4	V 4	*	4	4
4 4	444	4	4	• 4 4	•	4
• 4	4	4 4	4	4 4	4 4	4
4 4	4	4 4	4 4	4	4
44	444	• 4	• 4	• 4

Nejdříve se provede střední cervicální incise. Vyhledá se a od bludného nervu odizoluje pravá společná karotidní arterie (CCA). Kolem CCA se v blízkosti srdce ovine a utáhne hedvábný steh. Potom se vyhledá vnější kartoidní arterie (ECA) a podváže se hedvábným stehem. Provede se punktura CCA a do lumenu vnitřní kartoidní arterie (ICA) se jemně zavede malý katetr (PE 10, Ulrich & Co., St-Gallen, Švýcarsko). Pterygopalatinová arterie není uzavřena. Katetr se na místě upevní hedvábným stehem. Potom se do lumenu katetru zavede 4-0 nylonový vlasec a zasouvá se dokud konec nezablokuje přední cerebrální arterii. Délka katetru v ICA je přibližně 19 mm od ústí ECA. Vlasec se v této pozici udržuje pomocí okluze katetru teplem. Jeden cm katetru a nylonového vlasce se nechají vyčnívat, takže se vlasec může vytáhnout, aby se umožnilo obnovení krevního oběhu. Kožní incise se potom uzavře sponkou.

Během zotavení z anestezie se zvířata drží v teplém prostředí. Po uplynutí dvou hodin se zvířata znovu anestezují, odstraní se sponky a rána se znovu otevře. Katetr se odstřihne a vlasec se vytáhne. Katetr se potom znovu teplem uzavře a sponky se vrátí na ránu. Zvířata se nechají přežívat po dobu 24 hodin s volným přástupem k potravě a vodě. Krysy se potom utratí pomocí CO2 a pitvají se.

Okamžitě se vyjmou mozky, zmrazí se suchým ledem a skladují se při -80 °C. Mozky se pak v kryořezači při -19 °C rozřežou na díly silné 0,2 mm, přičemž se pro další zkoumání vybere jeden z každých 20 dílů. Vybrané díly se barví kresolovou violetí podle Nisslova postupu. Každý obarvený díl se zkoumá pod fotomikroskopem a podle přítomnosti buněk s morfologickými změnami se stanoví místní oblasti postižené infarktem.

	··	9 ···		«« ·«
	« ·	♦	•	•	• · · ·
	•	«	···	• ·	··· · ·
71	• ·	•	• ·	•	« · · 9 ·
•	•	•	• ·	• · ♦ ·
• 9	···	··	9· ·· ·

Podle tohoto modelu se zkoušejí různé dávky inhibitorů PARG. Sloučeniny se podávají buď v jedné dávce nebo v řadě násobných dávek, nitreoperitonálně nebo nitroventrikulárně, v různých časech, jak před tak po začátku ischemie. Zjistilo se, že inhibitory PARG podávané podle těchto způsobů podle předkládaného vynálezu poskytují proti ischemii ochranu v rozmezí od asi 20 do asi 80 %.

Příklad 2: Účinky na srdeční ischemii/ poškození reperfúzí u krys

Samice krys z rodu Sprague-Dawley, každá vážící asi 300 až 350 g se anestetizují nitroperitoneálně ketaminem v dávce 150 mg/kg. Krysý se endotracheálně intubují a vhání se do nich kyslíkem obohacený vzduch pomocí Harvardského tyčového ventilátoru. Pro sledování tlaku krve v arteriích, respektive dodávky tekutin se používají polyethylenové katetry vložené do kartoidní arterie a stehenní žíly. Arteriální tlak CO2 (PCO2) se úpravou rychlosti respirátoru udržuje mezi 4,66627 kPa a 5,99949 kPa. Hrudi krys se otevřou pomocí střední sternotomie, rozřízne se prekardium a srdce se umístí na latexový membránový tampon. Základní hemodynamická data se získají po nejméně 15-minutovém stabilizačním obodobí od skončení chirurgického zákroku. LAD (levá přední sestupná) koronární arterie se podváže po dobu 40 minut a pak se nechá oběh krve obnovovat po dobu 120 minut. Po 120 minutách reperfúze se LAD arterie znovu uzavře a k stanovení oblasti ischemického rizika se do levé síně injektuje 0,1 ml jednorázové dávky monoastrálního modrého barviva.

Potom se provede zástava srdcí chloridem draselným a srdce se rozřežou na pět 2 až 3 mm silných příčných plátků.

9

999

9

99

Každý plátek se váži a inkubuje se v 1% roztoku trimethyltetrazoliumchloridu, aby se zviditelnily infarkty miokardu lokalizované v rizikové oblasti. Velikost infarktu se vypočte sečtením hodnot pro každý plátek levé komory a vyjadřuje se dále jako podíl rizikové oblasti levé komory.

Tímto modelem se zkouší různé dávky inhibitorů PARG. Sloučeniny jsou podávány buď v jedné dávce nebo řadě násobných dávek, nitroperitoneálně nebo nitroventrikulárně, v různých časech, jak před, tak po začátku ischemie. Zjistilo se, že inhibitory PARG zabraňují ischemickému/reperfúznímu poškození v rozsahu od 10 do 40 %. Tudíž chrání proti degeneraci neuronů hippokampu vyvolané ischemií in vitro.

Příklad 3: Ochrana proti ischemii ledvin

Pacientovi s diagnózou náhlé ledvinové ischemie se okamžitě parenterálně podává, buď přerušovaným nebo kontinuálním nitrožilním podáváním, inhibitor PARG, buď jako jednoduchá dávka nebo řada oddělených dávek sloučeniny. Po této počáteční léčbě a v závislosti na pacientových současných neurologických příznacích, může pacient popřípadě dostávat stejný nebo jiný inhibitor PARG ve formě dalších parenterálních dávek. Původci tohoto vynálezu očekávají, že bude následovat významná ochrana proti poškození nervové tkáně a že se neurologické příznaky pacienta podstatně zmenší díky podávání sloučeniny, při zanechání menšího počtu doznívajících pomrtvičných neurologických účinků. Navíc se očekává, že bude zabráněno nebo sníženo opakované objevení ledvinové ischemie.

Příklad 4: Léčba ledvinové ischemie

Pacientovi byla právě stanovena diagnóza, že trpí náhlou ledvinovou ischemii. Okamžitě, lékař nebo sestra parenterálně podají inhibitor PARG, buď jako jednu dávku nebo jako řadu oddělených dávek. Pacient také dostane stejný nebo jiný inhibitor PARG přerušovaným nebo kontinuálním podáváním pomocí implantace biologicky přijatelného, biodegradovatelného doručovacího systému polymerní matrice obsahujícího inhibitor PARG, nebo pomocí subdurální pumpy vložené tak, aby podávala sloučeninu přímo do infarktové oblasti mozku. Původci tohoto vynálezu očekávají, že by se pacient měl probrat z komatu rychleji než kdyby se sloučenina podle tohoto vynálezu nepodávala. Očekává se také, že léčba sníží závažnost doznívajících neurologických příznaků pacienta. Navíc se očekává, že se sníží možnost opakovaného výskytu ledvinové ischemie.

Příklad 5: Ochrana proti vaskulární mrtvici

Pacientovi s právě stanovenou diagnózou náhlé mozkové mrtvice se okamžitě parenterálně podává, buď přerušovaně nebo kontinuálně nitrožilně, inhibitor PARG, buď jako jednoduchá dávka nebo řada oddělených dávek sloučeniny. Po této počáteční léčbě a v závislosti na pacientových současných neurologických příznacích, může pacient popřípadě dostávat stejnou nebo jinou sloučeninu podle tohoto vynálezu ve formě další parenterální dávky. Původci vynálezu očekávají, že se projeví významná ochrana proti poškození nervové tkáně a že se pacientovy neurologické příznaky výrazně sníží díky podávání sloučeniny, přičemž mrtvice zanechá po záchvatu méně doznívajících neurologických účinků. Navíc se očekává, že se zabrání nebo se sníží možnost toho, že se mozková mrtvice vyskytne znovu.

Příklad 6: Léčba mozkové mrtvice

U pacienta byla právě stanovena diagnóza náhlých mnohočetných mozkových mrtvic a je v komatu. Okamžitě, lékař nebo sestra parenterálně podají inhibitor PARG, buď jako jednotlivou dávku nebo jako řadu oddělených dávek. Z důvodu komatózního stavu pacienta, dostává pacient také stejný nebo jiný inhibitor PARG přerušovaným nebo kontinuálním podáváním prostřednictvím implantátu biologicky přijatelného, biodegradovatelného polymerního matricového doručovacího systému obsahujícího inhibitor PARG nebo prostřednictvím subdurální pumpy vložené tak, aby dodávala sloučeninu přímo do oblasti mozku stižené infarktem. Původci tohoto vynálezu očekávají, že se pacient probere z kómatu rychleji než kdyby mu sloučenina podle tohoto vynálezu nebyla podávána. Očekává se také, že léčba sníží závažnost doznívajících neurologických příznaků pacienta. Navíc se očekává, že se sníží možnost opakování výskytu mozkové mrtvice.

Příklad 7: Ochrana proti reperfusnímu poškození srdce

U pacienta je stanovena jako diagnóza život ohrožující kardiomyopatie a je potřeba transplantovat srdce. Dokud se nenajde srdce od dárce, udržuje se pacient pod přístrojem mimotělní oxidace (ECMO).

Když se pak lokalizuje srdce dárce, prodělá pacient proces chirurgické transplantace, během které je pacient připojen na srdečně-plicní pumpu. Pacient dostává během stanovené časové periody předcházející přesměrování jeho nebo jejího oběhu z srdečně-plicní pumpy na jeho nebo její nové srdce inhibitor PARG, čímž se zamezí poškození srdce reperfúzí, když nové srdce začíná bít nezávisle na externí srdečně-plicní pumpě.

Přiklad 8: Zkouška na septický šok

Skupině 10-ti myších samců vzorku C57/BL vážících od 18 do 20 g se podává inhibitor PARG v dávkách 60, 20, 6 a 2 mg/kg za den, interperitoneální (IP) injekcí po tři po sobě jdoucí dny. Každé zvíře se nejprve vystaví působení lipopolysacharidů (LPS, z E. Coli, LDioo po 20 mg/zvíře IV) . První dávka zkoušené sloučeniny ve vhodném vehikulu se podá 30 minut po vystavení a druhá a třetí dávka se podají po 24 hodinách druhý a třetí den, pouze přežívajícím zvířatům. Úmrtnost se zaznamenává každých 12 hodin od vystavení působení LPS po dobu třídenního zkušebního období. Inhibitory PARG poskytují ochranu proti úmrtí v důsledku septického šoku.

Příklad 9: Radiósenzitizace in vitro

Linie buněk rakoviny lidské prostaty, PC-3s, se umístí do ploten s 6 jamkami a pěstují se v jednovrstevných kulturách RPMI1640 doplněných 10 % FCS. Buňky se udržují při 37 °C v atmosféře 5 % CO₂ a 95 % vzduchu. Buňky se před ozařováním jednou podsmrtelnou dávkou vystaví reakci na dávky (od 0,1 mM do 0,1 μΜ) 3 různých inhibitorů PARG. Pro všechny zkoumané skupiny jsou šesti-jamkové plotny při teplotě místnosti vystaveny v Seifertově zářiči 250 kV/15 mA s 0,5 mm Cu/1 mm. Životaschopnost buněk se zkouší vyloučením 0,4 % trypanové modři. Vyloučení barviva je vyhodnoceno vizuálně mikroskopicky a počet životaschopných buněk se vypočte odečtením počtu buněk od počtu životaschopných buněk a dělením výsledku celkovým počtem buněk. Rychlosti proliferace buněk se vypočítají z množství zabudování ³H-thymidinu po ozáření. Inhibitory PARG vykazují radiosenzitizaci buněk.

Příklad 10: Radiósenzitizace in vivo

Před proděláním terapie ozařováním k léčbě rakoviny se pacientovi podává účinné množství farmaceutického prostředku obsahujícího inhibitor PARG. Sloučenina nebo farmaceutický prostředek působí jako radiosenzitizátor a zanechává nádorové buňky náchylnější k terapii ozařováním.

Příklad 11: Měření změněné genové exprese v mRNA senescentních buňkách

Lidské buňky BJ fibroblastů, při zdvojování populace (PDL) 94, jsou umístěny na plotnách v běžném prostředí pro růst a pak se prostředí změní na prostředí s nízkým obsahem séra, aby se dodržely fyziologické podmínky popsané v Linskens a kol., Nucleic Acids Res., 23, (16) , 3244 až 3251 (1995). Používá se prostředí DMEM/199 doplněné 0,5 % hovězího telecího séra. Buňky jsou denně po 13 dní ošetřovány inhibitorem PARG podle zde uvedeného popisu. Kontrolní buňky jsou ošetřovány s a bez rozpouštědla používaného k podávání inhibitoru PARG. Pro srovnání jsou testovány neošetřované staré a mladé kontrolní buňky. RNA se připraví z ošetřených a kontrolních buněk podle technik popsaných v PCT publikaci č. 96/13610 a provede se Northernův přenos. Analyzují se zkoušky specifické pro geny spojené se senescencí a srovnají se s ošetřenými a kontrolními buňkami. Při analýze výsledků se nejnižší úroveň exprese genů libovolně stanoví jako úroveň 1, aby se získal základ pro sorvnávání. Tři geny, které jsou zvláště důležité pro změny spojené se stářím v pokožce jsou kolagen, kolagenáza a elastin. West, Arch. Derm., 130, 87 až 95 (1994). Exprese elastinu buňkami ošetřovanými inhibitorem PARG je ve srovnání s kontrolními buňkami významně zvýšena. Exprese elastinu je ve srovnání se stárnoucími buňkami významně vyšší u mladých buněk a tak ošetření inhibitorem PARG způsobuje změnu úrovní exprese elastinu ve stárnoucích buňkách na úrovně podobné úrovním zjištěným v mnohem mladších buňkách. Podobně se při ošetření inhibitory PARG pozoruje příznivý účinek u kolagenázy a exprese kolagenu.

Příklad 12: Měření exprese proteinů změněnými geny v senescentních buňkách

Přibližně 105 BJ buněk, při PDL 95-100 se umístí na plotny a pěstuje se v jamkách s průměrem 15 cm. Pěstebním prostředím je DMEM/199 doplněné 10 % hovězího telecího séra. Buňky jsou denně po 24 hodin ošetřovány inhibitorem PARG (100 pg/l ml prostředí). Buňky se promyjí fosferečnanem tlumeným roztokem (PBS), potom se permeabilizuji 4% paraformaldehydem po dobu 5 minut, potom se promyjí PBS a po dobu 10 minut se zpracovávají se 100% studeným methanolem. Methanol se odstraní a buňky se promyjí PBS a potom se zpracují 10% sérem, aby se zamezilo vázání nespecifických protilátek. K buňkám se přidá asi 1 ml odpovídajících obchodně dostupných roztoků protilátek (zředění vektoru 1 : 500) a směs se inkubuje po dobu 1 hodiny. Buňky se omyjí a promyjí třikrát PBS. Sekundární protilátka, kozí protilátka myší protilátky IgG (1 ml) značkovaná biotinem se přidá společně s 1 ml roztoku obsahujícího streptavidin konjugovaný k alkalické fosfatáze a 1 ml NBT činidla (vektor). Buňky se promyjí a změny v expresi genů se stanoví kolorimetricky. Čtyři specifické geny senescence - kolagen I, kolagen III, kolagenáza a gama interferon - jsou v stárnoucích buňkách ošetřených inhibitorem PARG sledovány a výsledky ukazují snížení exprese interferonu gama bez jakékoliv pozorovatelné změny v úrovních exprese ostatních tří genů, což demostruje, že inhibitory PARG mohou změnit expresi specifických genů senescence.

Přiklad 13: Rozšíření nebo zvýšení schopnosti proliferace a doby životnosti buněk

K demostraci účinnosti předkládaného způsobu rozšíření schopnosti proliferace a životnosti buněk se rozmrazí linie buněk lidských fibroblastů (buď W138 při zdvojení populace (PDL) 23 nebo BJ buňky při PDL 71) a umístí se do baněk T57 a nechají se růst v normálním prostředí (DMEM/M199 plus 10 % hovězího telecího séra) asi týden, za kterýžto čas buňky tvoří souvislý narůst a jsou proto připravené k podrozdělení. V čase podrozdělení se prostředí odstraní odsátím a buňky se opláchnou solankou fosfátového pufru (PBS) a potom se tripsinizuji. Buňky se spočítají pomocí Coulterova počítadla a rozvrství se v hustotě 10⁵ buněk na cm² v 6-jamkové plotně pro kultivování tkáně v prostředí DMEM/199 doplněného 10 % séra hovězích telat a různá množství (0,1 μΜ a 1 mM; od 100X zásobního roztoku v prostředí DMEM/M199) inhibitoru PARG. Tento proces se opakuje každých 7 dní dokud se u buněk neprojeví zastavení dělení. Neošetřené (kontrolní) buňky dosáhnou senescence a zastaví dělení po asi 40 dnech v kultuře. Ošetření buněk 10 μΜ 3-AB se zdá mít malý nebo žádný účinek v protikladu k ošetření 100 μΜ 3-AB, které se zdá prodlužovat životnost buněk a k ošetření 1 mM 3-AB, které dramaticky zvyšuje životnost a proliferační schopnost buněk.

Buňky ošetřené 1 mM 3-AB se stále dělí po 40 dnech v kultuře.

Příklad 14: Neuroprotektivní účinky sloučeniny obecného vzorce

I na chronické konstrikční poškození (CCI) u krys

Dospělí samci krys rodu Sprague-Dawley, vážící 300 až 350 g, se anestetizují pomocí intraperitoneálně podaného natriumfenobarbitalu 50 mg/kg. Podvázáni nervů se provede tím, že se odkryje jedna strana sedacího nervu krysy a odpitvá se • · · ·

5-7 mm dlouhý segment nervu a uzavře se 4 volnými zaškrceními v délce 1,0 až 1,5 mm, následuje implantace intratekálniho katetru a vložení polyethylenové (PE-10) trubice promyté gentamicin sulfátem přes incisi v cisterna magna do subarachnoidního prostoru. Kaudální konec katetru se jemně provlékne do prodloužené míchy a rostrální konec se zajistí zubařským cementem ke šroubu zapuštěnému do lebky a poranění kůže se uzavře sponkami.

Použitím zkoušky odtahování packy se stanovuje zvýšená citlivost na sálavé teplo. Krysa se umístí do plastického válce na 3 mm silný skleněný plát se zdrojem sálavého tepla z žárovky projektoru umístěné přímo pod šlapkou zadní packy krysy. Čekací doba odtažení packy je definována jako čas, který uplyne od začátku stimulace sálavým teplem do odtažení packy krysy.

Zvýšená citlivost na mechanické dráždění se stanovuje umístěním krysy do klece se dnem vyrobeným z perforovaného plechu s mnoha malými čtvercovými dírami. Trvání odtahování packy se zaznamenává po píchnutí do středu plosky packy krysy bezpečnostním hrotem vloženým skrz dno klece.

Citlivost na mechanické dráždění se stanovuje umístěním krysy do klece podobné předchozímu testu a aplikací von Freyových vláken ve vzestupném pořádku ohýbací síly v rozsahu od 0,07 do 76 g na střed plosky packy krysy, von Freyovo vlákno se aplikuje kolmo ke kůži a pomalu se stlačuje dokud se neohne. Prahová síla reakce je definována jako první vlákno v sérii, které vyvolá nejméně jedno čisté odtažení packy z pěti pokusů.

• ·»

Černé neurony se pozoruji dvojstranné v zádovém rohu míchy, zvláště v lamině I-II, krys 8 dní po jednostraném podvázání sedacího nervu ve srovnání s imitované operovanými krysami. Různé dávky různých sloučenin obecného vzorce I se testují na tomto modelu a ukazuje se, že sloučeniny obecného vzorce I redukují jak účinek tmavých neuronů tak neuropatické bolestivé chování u krys s chronickým konstrikčním poškozením (CCI).

Příklad 15

Pacientovi je stanovena diagnóza, že trpí poruchou vyžadující podávání inhibitoru PARG. Pacientovi se potom může podávat inhibitor PARG tak jak je vysvětleno v příkladech 1 až 10, ve formě kapslí nebo tablet obsahujících jednoduchou nebo dělenou dávku inhibitoru. Po počátečním ošetření se může pacientovi popřípadě podávat stejný nebo jiný inhibitor PARG v kapslích nebo tabletách, přímou inijekcí, subdurální pumpou nebo implantátem matrice biologicky přijatelného polymerního doručovacího systému. Dá se očekávat, že ošetření zlehčí poruchu buď částečně nebo celkově a že by se nemělo vyvinout žádné nové objevení poruchy.

Příklad 16

Ošetření jako je popsáno v příkladě 15, ve kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí periferní neuropatií způsobenou fyzickým poraněním.

Příklad 17

Ošetření podle	popisu v	příkladu	15, při	kterém je
pacienta stanovena	diagnóza,	že trpí	periferní	neuropatií
způsobenou stavem nemoci.
Příklad 18

Ošetření	podle	popisu v	příkladu	15,	při	kterém je
pacientovi stanovena	diagnóza,	že trpí	syndromem	Guillain-
Barre.
Příklad 19
Ošetření	podle	popisu v	příkladu	15,	při	kterém je

pacientovi stanovena diagnóza, že trpí traumatickým poškozením mozku.

Příklad 20

Ošetření podle	popisu v	příkladu	15, při	kterém	je
pacientovi	stanovena	diagnóza,	že trpí	fyzickým	poškozením
míchy.
Příklad 21
Ošetření podle	popisu v	příkladu	15, při	kterém	je
pacientovi	stanovena	diagnóza,	že trpí	mrtvicí	spoj enou	s
poškozením	mozku.
Příklad 22
Ošetření podle	popisu v	příkladu	15, při	kterém	je
pacientovi	stanovena	diagnóza,	že trpí fokální isch	emií .

Přiklad 23

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí globální ischemií.

Příklad 24

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí poškozením reperfúzí.

Příklad 25

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí demyelinační nemocí.

Příklad 26

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí rozptýlenou sklerózu.

Příklad 27

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí neurologickou poruchou týkající se neurodegenerace.

Příklad 28

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí Alzheimerovou nemocí.

Příklad 29

Ošetřeni podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí Parkinsonovou chorobou.

Příklad 30

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí amyotropickou laterální sklerózou.

Příklad 31

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí kardiovaskulárním onemocněním.

Příklad 32

Ošetření	podle	popisu v příkladu 15,	při	kterém	je
pacientovi stanovena	diagnóza, že trpí agninou	pectoris.
Příklad 33
Ošetření	podle	popisu v příkladu 15,	při	kterém	je
pacientovi stanovena	diagnóza, že trpí infarktem myokardu.
Příklad 34

Ošetření podle popisu v příkladu 15, při kterém je pacientovi stanovena diagnóza, že trpí poškozením kardiovaskulární tkáně spojeným s aktivací PARG.

Příklad 35: Enzymatické stanovení PARG • · · ·

Sila inhibitoru PARG se určí emzymatickým stanovením PARG. Pro každou sloučeninu se k inhibici reakce PARG použijí různé dávky. K určení hodnoty IC50 koncentrace v μΜ, požadované k 50% inhibici reakce, se vytvoří křivka závislosti na dávkách.

Výraz inhibice v kontextu enzymatické inhibice se týká vratné enzymatické inhibice jako jsou kompetitivní inhibice, nedostatečně kompetitivní a nekompetitivní inhibice. Ta se může experimentálně stanovit podle účinků inhibitoru na kinetiku reakce enzymu, která se může analyzovat podle kritérií základní Michaelis-Mentenovy rovnice pro rychlost reakce. Kompetitivní inhibice se objevuje, když se inhibitor může spojovat s volným enzymem takovým způsobem, že to soupeří s vázáním normálního substrátu na aktivních místech.

Kompetitivní inhibitor	s enzymem reaguje	vratně a	tvoří
komplex enzym-inhibitor	(El), anologický ke	komplexu	enzym-
substrát:
E + I =	-- El
Vycházíme-li z	Michaelis-Mentenovy	rovnice,	můžeme

definovat konstantu inhibitoru Ki, jako disociační konstantu komplexu enzym-inhibitor:

[E] [I]

Ki =--------[El]

Tak podle výše uvedeného a jak je použita zde, je Ki hlavně měřením afinity mezi molekulou a jejím receptorem nebo v relaci k předkládanému vynálezu mezi sloučeninami podle předkládaného vynálezu a enzymem, který se má inhibovat. Měli • 9 • · ···· • · • · ·· bychom si povšimnout, že IC50 je vztažný termín používaný, když se definuje koncentrace nebo množství sloučeniny, které je potřeba k způsobení 50% inhibice cílového enzymu.

Celé stanovení se skládá z 1) přípravy radioaktivním ³²P označeného PARG jako substrátu, 2) čištění rekombinantního PARG, 3) inkubace sloučeniny reagující s PARG, 4) separace produktu ADP-ribosy chromatografii na tenké vrstvě (TL), a 5) kvantifikace radioaktivity ADP-ribosy pomocí scintilačního čítání.

1) Příprava ³²P-poly (ADP-ribosy) reakce se provádí v objemu 0,1 ml. Reakční směs se skládá z 20 mM trisHCl (pH 8,0), 10 mM MgC12, 5 pg/ml aktivované DNA (Sigma), 1 μΜ radioaktivní NAD (nicotinamid adenin[adenylat—³²P] dinukleotid [³²P]NAD (Amersham) se specifickou aktivitou 100 Ci/mol). Poslední se do reakční směsi jako iniciátor přidá 20 pg/ml inhibitoru PARG. Reakční směs se důkladně promíchá a inkubuje se po 30 minut při 25 °C. Reakce se potom zastaví přidáním 90 mM EDTA.

Na závěr reakce se pomocí třídící kolony separuje od [³²P]NAD oddělí polymer ³²P-poly (ADP-ribosa) . 0,1 ml reakční směsi se potom přímo naplní do předem připravené 6 ml kolony sefadex-G25 (BAKERBOND, Spe, J. T. Baker), která se předem ekvilibruje pomocí pufru lxTE s pH 7,5. polymer ³²P-poly(ADPribosa) se vymyje lxTE pufrem. Eluáty se jímají po 250μ1 frakcích. Jak se stanoví scintilačním čítáním, tvoří vzorek ³²P-poly (ADP-ribosa) primární pík.

2) Exprese a čištění rekombinantní PARG

Fragment cDNA kódující, od aminokyseliny 378 do aminokyseliny 976, karboxylovou koncovou část lidské PARG se amplifikuje reakcí řetězce polymerázy s cDNA lidského brzlíku (Clontech, Palo Alto, Kalifornie) jako matrice a pár primerů se sekvencemi 5'-GGGAATTCATGAATGATTTAAATGCTAAA-3' a 5

-CCCTCGAGTCAGGTCCCTGTCCTTTGCCC-3'. Primery obsahuji oblasti restrikčních enzymů EcoRI a Xhol. Fragment DNA PARG amplifikovaný pomocí PCR se digeruje pomocí EcoRI a Xhol a potom se liguje ke stejným místům v plasmidu pGEX-4Tl (Pharmacia) přičemž se použitím standardního postupu molekulární biologie vytvoří pGEX-PARG. pGEX-PARG se transformuje v prostředí bakteriálního kmene BL21 E. coli, aby se provedla exprese rekombinantního proteinu , který má na aminovém zakončení glutathion-S-transferázu a je v tomto úseku fúzovaný s kárboxylovým zakončením PARG. Dále původci postupují podle standardních prostupů pro expresi a čištění rekombinantního proteinu použitím, podle doporučení výrobce, Pharmacia, glutathion-sefadexových 4B kuliček.

3) Reakce PARG

Reakce se provádí v objemu 30 μΐ. Reakční směs obsahuje 0,3 ng (200 000 cpm) ³²P-poly (ADP-ribosy) , inhibitor PARG a přibližně 0,1 ng/ml PARG. Pro určení IC₅o se provedou běžné pokusy srovnávající dávky sloučeniny v konečných koncentracích 0,2, 2, 6, 20, 60 μΜ. Každá dávka se testuje dvakrát. Připraví se zásobní roztok inhibitorů PARG v 100% DMSO. Konečná koncentrace DMSO v reakční směsi je menší než 7 %. Enzym PARG se přidává nakonec jako iniciátor reakce, reakce se provádí pří 37 °C po dobu 10 minut a pak se ukončí přidáním 2 μΐ 3% (hmotnost/objem) natrium dodecylsulfátu.

4) TLC separace hydrolyzované ³²P-ADP-ribosy ·· ···· ·· ·· ·· • · · ··* 9 99 • · ··· · · ··· ·9 • · 9 9 9 9 9 9 9 99 • · ♦ · · 9 9 99 ·· ·99 99 99 999

Celá reakční směs se zastavenou reakcí se natečkuje na celulózový papír PEI-F (Darmstadt, Německo) o rozměrech 20 x 20 cm při zachování přibližně 3 cm od dolního konce a 2-cm prostoru mezi každým vzorkem. Papír PEI-F ponořený 2 cm, se nechá vyvíjet 1 hodinu v TLC tanku, předem ekvilibrovaném 0,3 M LiCI/0,9 M kyseliny octové, dokud vývojka nedosáhne přední stranu papíru. PEI-F papír se suší na vzduchu a pokryje se se plastickým obalem a exponuje se 3 hodiny na film Kodak X-OMAT.

5) Kvantifikace aktivit PARG

Film se vyvolá a použije jako matrice k lokalizaci poloh póly(ADP-ribosy) a ADP-ribosy na celulózovém papíru PEI-F. Horní tečka obsahuje ADP-ribosu a dolní tečka obsahuje póly(ADP-ribosu). Obecně se 10 až 20 % póly(ADP-ribosy) hydrolyzovalo na ADP-ribosu. Odpovídající tečky se vyřízly a stanovila se radioaktivita pomocí scintilačního čítání. Aktivita PARG se vyjádří jako procento póly(ADP-ribosy) přeměněné na ADP-ribosu tj. počet horních teček dělený součtem celkových počtů horních a dolních teček. Obecná křivka použití inhibitoru PARG podle předkládaného vynálezu v závislosti na dávkách je pro iliustraci uvedena na obr. 1.

Příklad 36: Zkouška cytotoxicity peroxidu vodíku

Model cytotoxicity peroxidu vodíku se používá k vyhodnocení účinnosti inhibitoru

PARG na prevenci odumření buňky. Ukazuje se, že přeměna póly(ADP-ribosy) může být mechanismem, podle Schraustatter a kol.,

Proč. Nati. Acad.

Sci., USA, 83, 4908 až 4912 (1986), který zprostředkovává odumření buňky způsobené působením peroxidu vodíku na buňky

P338D1.

·· ···· «· ·· ·· · ·♦· ··♦ · · ·« • · ··· · · ··· · · · ·· ········· · • · ········ ·· *·♦ ♦♦ ♦· ·· ···

Buňky P388D1 (ATCC, #CCL-46), odvozené od myšího makrofágu podobného nádoru se udržují v Dulbekově modifikovaném orlím prostředí (DMEM) s 10 % koňského séra, 2 mM L-glutaminu. Zkouška cytotoxicity se provádí na 96-jamkové plotně. V každé jamce se umístí 190 μΐ buněk při hustotě 2 x 10⁶/ml. Aby se stanovila hodnota EC50, koncentrace, která je potřeba, aby se dosáhlo 50% snížení úmrtnosti buněk, provede se pokus závislosti na dávkách. K buňkám se přidají různé koncentrace inhibitoru PARG. Obecně se pokus skládá z dávek s konečnou koncentrací 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 μΜ. Každá hodnota se průměruje ze 4 měření. Po 15-minutové inkubaci se k buňkám přidá 5 μΐ čerstvě připraveného peroxidu vodíku tak, že konečná koncentrace je 2 mM. Aby se stanovilo pozadí nevystaví se sada jamek bez sloučeniny působení peroxidu vodíku. Buňky se vrátí na 4 hodiny do inkubátoru udržovaného na 37 °C. Na konci inkubace se k stanovení laktát dehydrogenázy uvolněné z mrtvých buněk, odebere z buněčného prostředí vzorek 25 μΐ kapaliny nad usazeninou. Původci vynálezu používají zkoušku LHD přejatou od Sigma Co. a postupují podle postupu pokusu doporučeného výrobcem. Aktivita LDH se určí sledováním rychlosti snížení absorbance NADH při 340 nM. Odečte se aktivita LDH. K výpočtu celkového odumření buněk způsobeného působením peroxidu vodíku se použije skupina buněk neošetřených účinnou látkou. Protektivní účinky inhibitorů PARG se vyjadřují jako procento buněk, které přežijí. Hodnota EC₅o se stanoví z křivky závislosti na dávkách. Jako příklad je křivka závislosti na dávkách pro inhibitor PARG ukázána na obr. 1.

Tímto je popsán vynález, je zřejmé, že tento vynález může být variován mnoha způsoby. Takové variace by se neměly pokládat za odchylku od ducha a rozsahu tohoto vynálezu a ···· všechny takové modifikace jsou myšleny jako součást rozsahu následujících patentových nároků.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek zahrnující inhibitor PARG nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že inhibitor PARG je v prostředku přítomen v množství, které je účinné pro léčbu nebo prevenci nemoci nebo stavu pocházejícího z poškození nebo odumření buněk.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené poškození nebo odumření buněk je způsobeno nekrózou, apoptózou nebo jejich kombinací.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznaču- jící se tím, že uvedené nemoci nebo stavy jsou vybrány ze skupiny, která se skládá z akutní bolesti, artritidy, aterosklerózy, kachexie, kardiovaskulárních poruch, chronické bolesti, degenerativních onemocnění, diabetů, nemocí nebo poruch spojených s životností nebo se schopností proliferace buněk, nemocí nebo stavů nemocí vyvolaných nebo zesílených buněčnou senescencí, úrazu hlavy, senescence imunitního systému, zánětlivého onemocnění střev, ischemie, makulární degenerace, svalové dystrofie, poškození nervové tkáně pocházejícího z ichemie a poškození reperfúzí, neurologických poruch a neurodegenerativních nemocí, neurony zprostředkovaného poškození nebo onemocnění tkáně, neuropatické bolesti, poškození nervů, osteoartritidy, osteporózy, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemie, spetického šoku, stárnutí pokožky a mozkové mrtvice.
4. 4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznaču- ·· ♦·*· • 9

   9 999 jící se tím, že uvedený inhibitor PARG je vybrán ze skupiny, která se skládá z derivátů glukózy, glykosidů ligninu, hydrolyzovatelných taninů, derivátů adenosidu, derivátů akridinu, analogů tileronu, daunomycinu,ellipticinu a proflavinu.
5. 5. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačuj ící se tím, že uvedeným inhibitorem PARG je sloučenina obecného vzorce I:

   o-r₂ ve kterém:

   Ri, R2, R3, R4, R5 představují jednotlivě atom vodíku nebo

   X,

   X představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ci až C₈ alkoxy skupin, za předpokladu, že Ri až R₅ nepředstavují současně atom vodíku.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že částicí X jsou galloyl, 4-hydroxy-3-methoxybenzoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5-trimethoxybenzoyl, 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trihydroxybenzylkarbonyl nebo 3,4,5-trihydroxyfenetyl- ··♦·♦· 4 · · · · 4·

   9 9 9 · < 4 9 99 9 • 9 999 9 9 9 99 999 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 ··

   9 9 9 9 9 9 9 9 99

   99 999 99 99 99999 karbonyl.
7. 7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6, vyznačujíc! se tím, že sloučeninou obecného vzorce I je

   1.2.3.4.6- penta-O-galloyl-D-glukopyranóza, 1,2,3,4,6-penta-0-

   -(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamoly)-D-glukopyranóza nebo

   1.2.3.4.6- penta-0-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)-D-glukopyranóza.
8. 8. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedeným inhibitorem PARG je hydrolyzovatelný tanin.
9. 9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený hydrolyzovatelný tanin je vybrán ze skupiny, která se skládá z gallotaninů a ellagitaninů.
10. 10. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedený inhibitor PARG je glykosid ligninu.
11. 11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedený glykosid ligninu má následující vlastnosti:

    (i) tanin a polysacharid jsou vázány, (ii) molekulární hmotnost je od 500 do 140 000, (iii) vazebný poměr taninu k polysacharidu je od 1:1 do 20:1, jako molekulární poměr, a (iv) polysacharid se skládá z od 60 do 70 % uronové kyseliny a od 30 do 40 % neutrálního cukru.
12. 12. Farmaceutický prostředek podle nároku 11, vyzná

    44 4444 44 • 4 • 4 • 4 • • 9 • • • • · • 4 444 • • 44« • • • 4 • 4 • • • • · • • 44 444 44 44 • 4

    tím, že glykosid ligninu obsahuje s e
13. 13. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyzna čující se tím, že uvedený inhibitor PARG obsahuje sloučeninu obecného vzorce II:

    ve kterém:

    Ri představuje atom vodíku, skupinu představovanou obecným vzorcem III:

    • · · · • · · · · ·· ·· ·· · nebo X, ve kterém X je sloučenina obecného vzorce IV:

    ve kterém, Z je vazba, Ci-Cg alkylová skupina nebo C₂-Cg alkenylová skupina;

    R₇, Re, R9, R10 a R11 jsou nezávisle vybrané ze souboru skládajícího se z vodíku, hydroxylové skupiny nebo Ci-Cg alkoxy skupiny, za předpokladu že R7 až Rn nejsou současně čtyři nebo pět atomů vodíku a R2, R3, R₄, Rs a R₇ nezávisle představují atom vodíku nebo X, při čemž X představuje stejnou sloučeninu, která je popsána výše;

    za předpokladu, že Ri, R₂ a R3 nepředstavují současně atom vodíku;

    a dále za předpokladu, že R₂, R₃, R₄, Rs a R₉ nepředstavují současně atom vodíku.
14. 14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že X je galloyl, 4-hydroxy-3-- methoxybenzoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5-trimethoxybenzoyl, 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trihydroxybenzylkarbonyl nebo 3,4,5-trihydroxyfenetylkarbonyl.

    • ·
15. 15. Farmaceutický prostředek obsahující inhibitor PARG nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že inhibitor PARG je přítomen v množství, které je účinné pro inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie vyvolaného volnými radikály.
16. 16. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu obecného vzorce I:

    nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce aktivní látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce I je přítomna v množství, které je účinné pro léčbu nebo prevenci nemocí nebo stavů nemocí vybraných ze skupiny, která se skládá z: poškození tkáně pocházejícího z poškození buněk nebo jejich odumření způsobeného nekrózou nebo apoptózou, neurony zprostředkovaných poškození tkáně nebo nemocí, poškození nervové tkáně pocházejícího z ischemie a poškození reperfúzí, neurologických poruch a neurodegenerativních chorob, mozkové mrtvice, kardiovaskulárních poruch, makulární degenerace, artritidy, aterosklerózy, kachexie, degenerativních onemocnění kosterních svalů, diabetů, úrazu hlavy, zánětlivého onemocnění střev, svalové dystrofie, osteoartritidy, osteoporózy, neuropatické bolesti, poškození nervů, poškození periferálních nervů, • ··· • · • · selháni ledvin, retinální ischemie, spetického šoku a stárnutí pokožky, a ve kterém:

    Rir R2, R3, Ru R5 představují jednotlivě atom vodíku nebo

    A,

    A představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ci až C₈ alkoxy skupin, za předpokladu, že Ri až Rs nepředstavují současně atom vodíku.
17. 17. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že skupina A je galloyl, 4-hydroxy-3-methoxybenzoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5-trimethoxybenzoyl, 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 4-hydroxy-

    -3,5-dimethoxycínnamoyl, 3,4,5-trimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trihydroxybenzylkarbonyl nebo 3,4,5-trihydroxyfenetylkarbonyl.
18. 18. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce I je

    1.2.3.4.6- penta-O-galloyl-D-glukopyranóza, 1,2,3,4,6-penta-0-

    -(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamoly)-D-glukopyranosa nebo

    1.2.3.4.6- penta-0-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)-D-glukopyranóza.
19. 19. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu obecného vzorce I:

    • · · · • · nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce aktivní látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce I je přítomna v množství, které je účinné pro inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie indukovaného volnými radikály, a ve kterém:

    Ri, R2, R3, R4, R5 představují jednotlivě atom vodíku nebo A,

    A představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ciaž Cs alkoxy skupin, za předpokladu, že Ri až R5 nepředstavují současně atom vodíku.
20. 20. Farmaceutický prostředek obsahující glykosid ligninu nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že glykosid ligninu je přítomný ve množství, které je účinné pro léčbu nebo prevenci nemocí nebo stavů vybraných ze skupiny, která se skládá z: poškození tkáně pocházejícího z poškození buněk nebo jejich odumření způsobeného nekrózou nebo apoptózou, neurony zprostředkovaných poškození tkáně nebo nemocí, poškození nervové tkáně pocházejícího z ischemie a poškození reperfůzí, neurologických poruch a neurodegenerativních chorob, mozkové mrtvice, kardiovaskulárních poruch, makulární degenerace, artritidy, aterosklerózy, kachexie, degenerativních onemocnění kosterních svalů, diabetů, úrazu hlavy, zánětlivého onemocnění střev, svalové dystrofie, osteoartritidy, osteoporózy, neuropatické bolesti, poškození nervů, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemie, spetického šoku a stárnutí pokožky, a • · • · ve kterém:

    glykosid ligninu má následující vlastnosti:

    (i) tanin a polysacharid jsou vázány, (ii) molekulární hmotnost je od 500 do 140 000, (iii) vazebný poměr taninu k polysacharidu je od 1:1 do 20:1, jako molekulární poměr, a (iv) polysacharid se skládá z od 60 do 70 % uronové kyseliny a od 30 do 40 % neutrálního cukru.
21. 21. Farmaceutická kompozice podle nároku 20, vyznačující se tím, že glykosid ligninu obsahuje sloučeninu následujícího obecného strukturálního vzorce:
22. 22. Farmaceutický prostředek obsahující glykosid ligninu nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že glykosid ligninu je přítomný ve množství, které je účinné pro inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie vyvolaného volnými radikály a ve kterém: glykosid ligninu má následující vlastnosti:

    • · · ·· · ·· · * · · • · · ··· · · · • · · · · · ···· · · • · · · · · · · · · • · ·*♦ ·· ·· ·· ··· (i) tanin a polysacharid jsou vázány, (ii) molekulární hmotnost je od 500 do 140 000, (iii) vazebný poměr taninu k polysacharidu je od 1:1 do 20:1, jako molekulární poměr, a (iv) polysacharid se skládá z od 60 do 70 % uronové kyseliny a od 30 do 40 % neutrálního cukru.
23. 23. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu obecného vzorce II:

    nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce II je přítomna v množství, které je účinné pro léčbu nebo prevenci nemocí nebo stavů vybraných ze skupiny, která se skládá z: poškození tkáně pocházejícího z poškození buněk nebo jejich odumření způsobeného nekrózou nebo apoptózou, neurony zprostředkovaných poškození tkáně nebo nemocí, poškození nervové tkáně pocházejícího z ischemie a poškození reperfúzí, neurologických poruch a neurodegenerativních chorob, mozkové mrtvice, kardiovaskulárních poruch, makulární degenerace, artritidy, aterosklerózy, kachexie, degenerativních onemocnění kosterních svalů, diabetů, úrazu hlavy, zánětlivého onemocnění střev, svalové dystrofie, osteoartritidy, osteoporózy, neuropatické • · ··

    100 bolesti, poškozeni nervů, poškozeni periferálnich nervů, selháni ledvin, retinálni ischemie, spetického šoku a stárnuti pokožky, a ve kterém:

    Ri představuje atom vodíku, skupinu představovanou sloučeninou obecného vzorce III:

    III nebo skupinu A, ve kterém je A sloučenina obecného vzorce IV:

    IV ve kterém, Z je vazba, Ci-Ce alkylová skupina nebo C2-C8 alkenylová skupina;

    R₇, Re, R9, R10 a Rn jsou nezávisle vybrané ze souboru skládajícího se z vodíku, hydroxylové skupiny nebo Ci-Cs alkoxy skupiny, za předpokladu že R7-R11 nejsou současně čtyři nebo pět atomů vodíku a R₂, R3, Ro Rs a R7 nezávisle představují atom vodíku nebo X, při čemž X představuje stejnou sloučeninu, která je popsána výše; za předpokladu, že Ri, R2 a R3 nepředstavují současně atom vodíku; a dále za předpokladu, že R₂, R3, R4, Rs a R6 nepředstavují současně atom vodíku.
24. 24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, v y z n a č u

    101 jící se tím, že skupina A je galloyl, 4-hydroxy-3~methoxybenzoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5-trimethoxybenzoyl, 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trihydroxybenzylkarbonyl nebo 3,4,5-trihydroxyfenetylkarbonyl.
25. 25.

    Farmaceutický prostředek obsahuj ici sloučeninu obecného vzorce II:

    nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce II je přítomna v množství, které je účinné pro inhibici nebo snížení vyčerpání buněčné energie vyvolaného volnými radikály, a ve kterém:

    Ri představuje atom vodíku, skupinu představovanou sloučeninou obecného vzorce III:

    nebo skupinu A, ve kterém je A sloučenina obecného vzorce IV:

    102 ve kterém, Z je vazba, Ci-C₈ alkylová skupina nebo C₂-C₈ alkenylová skupina;

    Rv, Re, R9, R10 a R11 jsou nezávisle vybrané ze souboru skládajícího se z vodíku, hydroxylové skupiny nebo Ci-Ce alkoxy skupiny, za předpokladu že R7-R11 nejsou současně čtyři nebo pět atomů vodíku a R₂, R3, R4, R5 a R? nezávisle představují atom vodíku nebo A, při čemž A představuje stejnou sloučeninu, která je popsána výše;

    za předpokladu, že Ri, R₂ a R3 nepředstavují současně atom vodíku;

    a dále za předpokladu, že R₂, R3, R4, R5 a Rě nepředstavují současně atom vodíku.
26. 26. Způsob inhibice nebo snížení vyčerpání buněčné energie vyvolaného volnými radikály, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání živočichovi terapeuticky účinného množství inhibitoru PARG nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu, esteru, solvátu, předchůdce účinné látky, metablitu nebo stereoisomeru.
27. 27. Způsob inhibice nebo prevence poškození nebo odumření buňky vyvolaného volnými radikály, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání živočichovi terapeuticky účinného množství inhibitoru PARG nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu, esteru, solvátu, předchůdce účinné látky, metabolitu nebo stereoisomeru.

    103

    9 9 · · · · ·· · · ·· • · · · · · ··· • · · ·· · ···· ♦ · • ········

    99 99 9 9 9 9 9 99 99 9
28. 28. Způsob léčby nebo prevence nemoci nebo stavů vybraných ze skupiny, která se skládá z: poškození tkáně pocházejícího z poškození buněk nebo jejich odumření způsobeného nekrózou nebo apoptózou, neurony zprostředkovaných poškození tkáně nebo nemocí, poškození nervové tkáně pocházejícího z ischemie a poškození reperfúzi, neurologických poruch a neurodegenerativních chorob, mozkové mrtvice, kardiovaskulárních poruch, makulární degenerace, artritidy, aterosklerózy, kachexie, degenerativních onemocnění kosterních svalů, diabetů, úrazu hlavy, zánětlivého onemocnění střev, svalové dystrofie, osteoartritidy, osteoporózy, neuropatické bolesti, poškození nervů, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemie, spetického šoku a stárnutí pokožky, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání živočichovi terapeuticky účinného množství sloučeniny obecného vzorce I:

    nebo její farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu, esteru, solvátu, předchůdce účinné látky, metabolitu nebo stereoisomeru, ve kterém:

    Ri, R2, R3, R4, Rs představují jednotlivě atom vodíku nebo

    A,

    A představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ci až C₈ alkoxy skupin, za předpokladu, že R_x až R₅ nepředstavuj i současně atom vodíku.

    • φ

    104
29. 29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že skupina A je galloyl, 4-hydroxy-3--methoxybenzoyl,

    4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5—trimethoxybenzoyl, 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trihydroxybenzylkarbonyl nebo 3,4,5-trihydroxyfenetylkarbonyl.
30. 30. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce I je 1,2,3,4,6-penta-Ogalloyl-D-glukopyranóza, 1,2,3,4,6-penta-O-(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamoly)-D-glukopyranosa nebo 1,2,3,4,6-penta-O-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)-D-glukopyranóza.
31. 31. Způsob inhibice nebo prevence poškození nebo odumření buňky vyvolaného volnými radikály, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání živočichovi terapeuticky účinného množství sloučeniny obecného vzorce I:

    nebo její farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu, esteru, solvátu, předchůdce účinné látky, metabolitu nebo stereoisomeru, ve kterém:

    Ri, R2, R3, R«, Rs představuji jednotlivě atom vodíku nebo

    A,

    A představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ci až Cg alkoxy skupin,

    105 ·· · ··· ·· · · ·· • · · ··· « · · • · ··· · · ··· · · • 4 · · · · · · · · ·· ··· ·· ·· ·· ··· za předpokladu, že Ri až R₅ nepředstavuji současně atom vodíku.
32. 32. Způsob léčby nebo prevence nemocí nebo stavů vybraných ze skupiny, která se skládá z: poškození tkáně pocházejícího z poškození buněk nebo jejich odumřeni způsobeného nekrózou nebo apoptózou, neurony zprostředkovaných poškození tkáně nebo nemocí, poškození nervové tkáně pocházejícího z ischemie a poškození reperfúzí, neurologických poruch a neurodegenerativních chorob, mozkové mrtvice, kardiovaskulárních poruch, makulární degenerace, artritidy, aterosklerózy, kachexie, degenerativních onemocnění kosterních svalů, diabetů, úrazu hlavy, zánětlivého onemocnění střev, svalové dystrofie, osteoartritidy, osteoporózy, neuropatické bolesti, poškození nervů, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemie, spetického šoku a stárnutí pokožky, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání živočichovi terapeuticky účinného množství glykosidu ligninu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu, esteru, solvátu, předchůdce účinné látky, metabolitu nebo stereoisomeru, ve kterém: glykosid ligninu má následující vlastnosti:

    (i) tanin a polysacharid jsou vázány, (ii) molekulární hmotnost je od 500 do 140 000, (iii) vazebný poměr taninu k polysacharidu je od 1:1 do 20:1, jako molekulární poměr, a (iv) polysacharid se skládá z od 60 do 70 % uronové kyseliny a od 30 do 40 % neutrálního cukru.
33. 33. Farmaceutický prostředek podle nároku 32, vyznačující se tím, že glykosid taninu obsahuje sloučeninu s následujícím obecným strukturním vzorcem:

    106
34. 34. Způsob inhibice nebo snížení poškození nebo odumření buňky vyvolaného volnými radikály, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání živočichovi terapeuticky účinného množství glykosidu ligninu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu, esteru, solvátu, předchůdce účinné látky, metabolitu nebo stereoisomeru, ve kterém:

    glykosid ligninu má následující vlastnosti:

    (i) tanin a polysacharid jsou vázány, (ii) molekulární hmotnost je od 500 do 140 000, (iii) vazebný poměr taninu k polysacharidů je od 1:1 do 20:1, jako molekulární poměr, a (iv) polysacharid se skládá z od 60 do 70 % uronové kyseliny a od 30 do 40 % neutrálního cukru.
35. 35. Způsob léčby nebo prevence nemocí nebo stavů vybraných ze skupiny, která se skládá z: poškození tkáně pocházejícího z poškození buněk nebo jejich odumření způsobeného nekrózou nebo apoptózou, neurony zprostředkovaných poškození tkáně nebo • ·

    107 • · ··»· • · • · ·· ··· nemoci, poškození nervové tkáně pocházejícího z ischemie a poškození reperfúzí, neurologických poruch a neurodegenerativních chorob, mozkové mrtvice, kardiovaskulárních poruch, makulární degenerace, artritidy, aterosklerózy, kachexie, degenerativních onemocnění kosterních svalů, diabetů, úrazu hlavy, zánětlivého onemocnění střev, svalové dystrofie, osteoartritidy, osteoporózy, neuropatické bolesti, poškození nervů, poškození periferálních nervů, selhání ledvin, retinální ischemie, spetického šoku a stárnutí pokožky, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání živočichovi terapeuticky účinného množství sloučeniny obecného vzorce II:

    nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer, ve kterém:

    Ri představuje atom vodíku, skupinu představovanou sloučeninou obecného vzorce III:

    0-R₅

    III

    O—r₅

    9 ·

    108 nebo A, A představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ci až C₈ alkoxy skupin, a R₂, R3, R₄, R5 a R₆ nezávisle představují atom vodíku nebo A, při čemž A představuje stejnou sloučeninu, která je popsána výše;

    za předpokladu, že Ri, R₂ a R₃ nepředstavují současně atom vodíku;

    a dále za předpokladu, že R₂, R3, Ro R5 a R6 nepředstavují současně atom vodíku.
36. 36. Způsob podle nároku 35, , vyznačující se tím, že skupina A je galloyl, 4-hydroxy-3--methoxybenzoyl,

    4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5—trimethoxybenzoyl, 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trimethoxycinnamoyl, 3,4,5-trihydroxybenzylkarbonyl nebo 3,4,5-trihydroxyfenetylkarbonyl.
37. 37. Způsob inhibice nebo snížení vyčerpání buněčné energie vyvolaného volnými radikály, vyznačující se ti m, že zahrnuje podáváni živočichovi terapeuticky účinného množství sloučeniny obecného vzorce II:

    • ·

    109 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu, esteru, solvátu, předchůdce účinné látky, metabolitu nebo stereoisomeru, ve kterém:

    Ri představuje atom vodíku, skupinu představovanou sloučeninou obecného vzorce III:

    nebo A, A představuje karbonyl, který má fenyl individuálně substituovaný řadou skupin vybraných ze souboru, který se skládá z hydroxylové skupiny a Ci až C₈ alkoxy skupin, a R₂, R3, Rí, Rs a Rě nezávisle představují atom vodíku nebo A, při čemž A představuje stejnou sloučeninu, která je popsána výše;

    za předpokladu, že Ri, R₂ a R3 nepředstavují současně atom vodíku;

    a dále za předpokladu, že R₂, R3, R4, Rs a R6 nepředstavují současně atom vodíku.
38. 38. Farmaceutický prostředek obsahující inhibitor PARG nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát, ester, solvát, předchůdce účinné látky, metabolit nebo stereoisomer a farmaceuticky přijatelný nosič, vyznačující se tím, že inhibitor PARG je přítomen v množství, které je účinné pro radiosenzitizaci nádorových buněk.