KR102041042B1

KR102041042B1 - 말산-아스파르트산 왕복수송 억제제 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102041042B1
Application number: KR1020180043351A
Authority: KR
Inventors: 김수열
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2019-11-05
Also published as: KR20180116160A; EP3610866A4; EP3610866A1; JP7016883B2; JP2020513024A; CN110636841A; WO2018190676A1; US20200263184A1

Abstract

본 발명은 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS) 억제제를 암 치료제로서 사용하는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로 MAS 억제제인 페닐숙신산(Phenyl Succinic Acid), 메틸말론산(Methyl Malonic Acid), N-(1- 피레닐)말레이미드(N-(1-pyrenyl)maleimide) 및 프탈로닉산(Phthalonic Acid), 또는 상기 MAS 및 항암제의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

말산-아스파르트산 왕복수송 억제제 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물{pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer comprising malate-aspartate shuttle inhibitor and chemotherapy}

본 발명은 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS) 억제제를 암 치료제로서 사용하는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로 MAS 억제제, 또는 상기 MAS 및 항암제의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

암이란 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 무제한의 증식을 하는 암 세포는 주위의 조직으로 침투하고 더 심각한 경우는 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래하는 난치병이다.

암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 췌장암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생하며, 이들의 치료방법으로 최근 글리벡 또는 허셉틴과 같은 소수의 표적치료제가 특정암의 치료에 이용되고 있으나 현재까지는 수술이나 방사선 요법 및 세포증식을 억제하는 화학요법제를 이용한 항암제 치료가 주된 방법이다. 그러나 표적치료제가 아니기 때문에 기존 화학요법제의 가장 큰 문제는 세포독성으로 인한 부작용과 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 따라서, 이러한 화학요법제의 한계를 극복하기 위해서는 항암작용 기전이 명확한 표적 치료제 개발이 지속적으로 필요하다.

정상 세포와 암세포에서 ATP를 합성하는 경로는 상이하다. 정상 세포에서는 포도당이 흡수되면 당화작용으로 분해된 당이 미토콘드리아 내부에서 TCA cycle을 통해 NADH를 생산하고, 이를 이용하여 미토콘드리아 막전위로 ATP를 생산하여 세포가 이를 사용할 수 있다. 이에 반해, 암세포에서는 당화 작용이 나타나지 않아 LDH에 의해 젖산이 생산되어 세포 외부로 배출되며, 대신 ALDH가 과발현되어 ATP 생산에 관여하게 된다. 따라서, 암세포만을 사멸하고자 하는 경우, ALDH의 발현 또는 활성을 억제하여 세포 내에서 ATP의 결핍을 유도하고, 이에 따라 세포의 증식이 차단되면서 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 것을 타겟으로 하는 약물들이 개발되고 있다.

이러한 세포 내 경로를 사용한 항암 화합물로서 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)이 알려져 있다(대한민국 등록공보 제 10-1579371호, 대한민국 등록특허 제 10-145806호).

고시폴은 조면실유 (Gossypium sp.)로부터 유도되는 천연적으로 존재하는 이중 비페놀성 화합물이다. 생체 내에서 Aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 억제제로서 알려져 있어, 이를 이용한 치료 용도에 대하여 연구되고 있다. 남성 피임제로서의 고시폴의 인체 실험은 이들 화합물의 장기간 투여의 안전성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다.

펜포르민(Phenformin)은 메트포르민(Metformin)과 같은 바이구아나이드(biguanide) 계열의 약물로 당뇨병 치료제로 알려져 있다. 그러나, 펜포르민과 같은 바이구아나이드 계열 약물들이 탄수화물 대사와 지질 대사를 생리적으로 조절하는 핵심 효소인 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시켜 p53 유전자가 결여된 암의 치료에 효과적인 것으로 알려지기 시작하면서, 펜포르민 약물의 항암 효과에 대한 연구가 진행되었고, 펜포르민은 미토콘드리아의 막전위를 감소시켜 NADH가 ATP로 전환되는 경로를 차단하는 것을 통해 ATP 결핍을 유도하여 항암 효과를 나타냄이 입증되었다.

한편, 미토콘드리아 내막의 외부에서 내부로 물질의 이동 통로로 관여하는 구조체를 Malate-Aspartate Shuttle(MAS)이라 한다. MAS는 미토콘드리아 내막에 발현된 통로 단백질 MAT 및 GAT를 통해 말레이트와 아스파테이트의 이동에 관여하며, 이 때 NADH의 이동을 돕는 역할을 한다. MAS는 다양한 종양 세포에서 발생한다는 것이 공지된 바 있는데, 공지된 바에 따르면 종양 세포주에서 미토콘드리아의 NADH 산화-환원에 MAS가 관여할 수 있어 암 세포의 세포질에서는 당화과정을 통한 NADH 산화가 감소하고 MAS를 통한 미토콘드리아 내 NADH 산화가 나타나는 것으로 공지된 바 있다(Greenhouse, Walter VV, and Albert L. Lehninger. Cancer Research 36.4 (1976): 1392-1396).

따라서, 본 발명자들은 MAS를 차단하여 미토콘드리아 내부로 NADH가 유입되는 것을 차단한다면 고시폴 또는 펜포르민의 처리를 통한 암세포 내 ATP 결핍 현상에서 보다 현저한 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대하고, MAS 억제제를 고시폴 또는 펜포르민과 병용 처리하여 폐암 및 흑색종 세포주에서 세포 사멸이 증가함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명자들은 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS) 억제제를 투여하였을 때 세포 내 ATP 생산을 억제하며 세포 증식을 억제하는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 또한, MAS 억제제를 고시폴 또는 펜포르민과 혼합 처리하였을 때 암세포 증식 억제 및 사멸 유도 효과에서 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS) 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물 및 항암제를 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 MAS 억제제는 MAS에 포함되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 MAS에 포함되는 단백질은, 말산-알파-케토글루탐산 수송체(MAT; malate-a-ketoglutarate transporter), 굴루탐산-아스파르트산 수송체(GAT; glutamate-aspartate transporter), 말산 디하이드로게나제 1(malate dehydrogenase 1), 말산 디하이드로게나제 2(malate dehydrogenase 2), 글루타믹 옥살아세틱 트랜스아미나제 1(glutamic oxaloacetic transaminase 1) 및 글루타믹 옥살아세틱 트랜스아미나제 2(glutamic oxaloacetic transaminase 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 또한, 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 정방향 siRNA 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열인 역방향 siRNA; 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열인 정방향 siRNA 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열인 역방향 siRNA; 중 어느 하나이고, 상기 shRNA는 서열번호 5로 표시되는 염기서열 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 중 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 MAS 억제제는 페닐숙신산(Phenyl Succinic Acid), 메틸말론산(Methyl Malonic Acid), N-(1- 피레닐)말레이미드(N-(1-pyrenyl)maleimide) 프탈로닉산(Phthalonic Acid), 메틸3-(3-(4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시)-프로판아미도)벤조에이트(Methyl 3-(3-(4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy)- propanamido)benzoate), LW6, 2-테노일-트리플루오르아세톤(2-Thenoyl-trifluoroacetone), 클로로트리신 (chlorothricin), 암모니오옥시아세트산(aminooxyacetic acid, AOA), 히드라지노숙신산(hydrazinosuccinate), 2-아미노-3-부테노익산(2-amino-3-butenoic acid) 및 머큐리얼 화합물(mercurial reagent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 암은 폐암, 흑색종, 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 피부암, 혈액암, 간암, 난소암, 신장암, 전립선암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 항암제는 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 에토목실(etomoxir)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있으며, 항암제 및 MAS 억제제는 1 : 10 내지 500의 몰비율로 혼합하는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명은 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS) 억제제; 또는 MAS 억제제 및 항암제의 혼합된 약물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 MAS 억제제는 세포 내 ATP 생성을 억제하여 암세포 생장을 억제할 수 있다. 또한, 상기 MAS 억제제를 고시폴 또는 펜포르민과 같은 항암제와 함께 암세포에 처리하는 경우, 암세포에 특이적으로 세포 내 ATP 결핍을 유도하므로 세포 증식을 억제함에 있어서 MAS 억제제와 상기 항암제가 시너지 효과를 나타내어, 세포 증식을 억제하여 종양 성장을 억제할 뿐 아니라 유의적으로 암세포 사멸 효과를 나타내어 생성된 암을 사멸시키는 데 효과적일 수 있다. 이 때, 정상 세포에 대하여는 유의적인 세포 사멸을 나타내지 않는 반면, 암세포에 대하여는 MAS 억제제 및 항암제의 시너지 효과를 통해 이들을 각각 단독 처리하는 경우에 비해 상승된 암 치료 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 암세포주에서 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS)에 포함된 단백질의 발현을 억제하였을 때의 세포 증식 억제 효과를 나타낸다:
도 1a는 폐암 세포주 및 흑색종 세포주에서 MAS에 포함되는 단백질인 SLC25A11 단백질의 발현 억제에 따른 세포 증식 억제 효과를 확인한 도이고;
도 1b는 폐암 세포주 및 흑색종 세포주에서 SLC25A11 단백질의 발현 억제에 따른 세포 사멸을 확인한 도이며; 및
도 1c는 폐암 세포주 및 흑색종 세포주에서 SLC25A11 shRNA를 통한 SLC25A11 단백질의 발현 수준 감소를 확인한 도이다.
도 2는 암세포주에서 MAS를 억제하였을 때 세포 내 ATP 생산 저해 효과를 나타낸다:
도 2a는 암 세포주에서 SLC25A11의 발현 억제에 따른 ATP 발현 수준의 감소를 확인한 도이고; 및
도 2b는 암 세포주에서 SLC25A11의 발현 억제에 따른 세포 내 대사과정 관여 단백질의 발현 수준 변화를 확인한 도이다.
도 3은 폐암 동물 모델에서 MAS 억제에 따른 종양 성장 억제 효과를 나타낸다:
도 3a는 SLC25A11의 발현이 억제됨에 따라 폐암 세포주가 이식된 마우스에서 종양 크기의 변화를 확인한 도이고; 및
도 3b는 SLC25A11의 발현이 억제됨에 따라 폐암 세포주가 이식된 마우스의 종양 중량을 비교한 도이다.
도 4는 MAS 활성 억제제 처리에 따른 암세포 생장 억제 효과의 확인을 나타낸다:
도 4a는 페닐 숙신산(PSA)을 폐암 세포주에 처리했을 때 암 세포 생장 억제 효과를 확인한 도이고;
도 4b는 PSA를 흑색종 세포주에 처리했을 때 암 세포 생장 억제 효과를 확인한 도이며; 및
도 4c는 PSA를 처리한 정상 대조군 세포의 세포 증식률을 비교한 도이다.
도 5는 MAS 억제제 처리에 따른 세포 내 ATP 생산 저해 효과를 확인한 도이다.
도 6은 MAS 억제제 및 고시폴의 병용 처리를 통한 암세포 사멸의 시너지 효과를 나타낸다:
도 6a는 암 세포주에 MAS 억제제인 PSA 또는 PA를 고시폴과 병용 처리하였을 때 세포 증식 억제 및 세포사멸 유도 효과를 확인한 도이고;
도 6b는 암 세포주에 MAS 억제제 및 고시폴을 병용 처리하였을 때 세포 내 ATP 결핍의 시너지 효과를 확인한 도이며;
도 6c는 암 세포주에 MAS 억제제인 NPM을 고시폴과 병용 처리하였을 때 세포 증식 억제 및 세포사멸 유도 효과를 확인한 도이다.
도 7a 및 도 7b는 MAS 억제제 및 고시폴의 병용 투여를 통한 미토콘드리아 막 전위 감소의 시너지 효과 확인한 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 MAS 억제제 및 고시폴의 병용 처리에 의한 세포 사멸(apoptosis)을 확인한 결과이다.
도 9a, 도 9b 및 도 9c는 MAS 억제제 및 펜포르민의 병용 투여를 통한 암세포 증식 억제의 시너지 효과 확인한 결과이다.
도 10은 MAS 억제제 및 에토목실(etomoxir) 의 병용 투여를 통한 암세포 증식 억제의 시너지 효과 확인한 결과이다.
도 11은 말산-아스파르트산 왕복수송의 과정을 나타내는 모식도이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 본 발명자들은 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS)을 차단하여 미토콘드리아 내부로 NADH가 유입되는 것을 차단한다면 고시폴 또는 펜포르민의 처리를 통한 암세포 내 ATP 결핍 현상에서 보다 현저한 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대하였다.

본 발명의 MAS 억제제는 세포 내 ATP 생성을 억제하여 암세포 생장을 억제할 수 있다. 또한, 상기 MAS 억제제를 고시폴 또는 펜포르민과 같은 항암제와 함께 암세포에 처리하는 경우, 암세포에 특이적으로 세포 내 ATP 결핍을 유도하므로 세포 증식을 억제함에 있어서 MAS 억제제와 상기 항암제가 시너지 효과를 나타내어, 세포 증식을 억제하여 종양 성장을 억제할 뿐 아니라 유의적으로 암세포 사멸 효과를 나타내어 생성된 암을 사멸시키는 데 효과적일 수 있다.

따라서, 본 발명은 말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS) 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 MAS 억제제 및 항암제를 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 "MAS 억제제"는 MAS에 포함되는 단백질의 발현 또는 활성 억제제인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 "MAS에 포함되는 단백질"은, 말산-아스파르트산 왕복수송의 구성 요소로서 당업계에 공지된 단백질을 말한다. 구체적으로, 도 10에서 나타난 바와 같이 말산-아스파르트산 왕복수송에는 총 6 종의 단백질이 포함되어, 이 중 하나 이상의 단백질에 대하여 활성을 억제할 수 있는 것으로 당업자에게 이해될 수 있는 것이라면, 제한없이 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 "MAS에 포함되는 단백질"은 상기 MAS에 포함되는 단백질은, 말산-알파-케토글루탐산 수송체(MAT; malate-a-ketoglutarate transporter), 굴루탐산-아스파르트산 수송체(GAT; glutamate-aspartate transporter), 말산 디하이드로게나제 1(MDH1; malate dehydrogenase 1), 말산 디하이드로게나제 2(MDH2; malate dehydrogenase 2), 글루타믹 옥살아세틱 트랜스아미나제 1(GOT1; glutamic oxaloacetic transaminase 1) 및 글루타믹 옥살아세틱 트랜스아미나제 2(GOT2; glutamic oxaloacetic transaminase 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 MAT는 인간 SLC25A11 유전자로 암호화되는 수송단백질(transpoter)로서, Mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein으로도 지칭할 수 있다. 상기 GAT는 인간 SLC25A12 유전자로 암호화되는 수송단백질로서, Calcium-binding mitochondrial carrier protein Aralar1으로도 지칭할 수 있다. 상기 말산 디하이드로게나제에 있어서, MDH1은 세포질에 존재하고(cytosolic form), MDH2는 미토콘드리아 내부에 존재한다(mitochondrial form). 또한, 상기 글루타믹 옥살아세틱 트랜스아미나제에 있어서, GOT1는 세포질에 존재하고, GOT2는 미토콘드리아 내부에 존재한다. 상기 GOT1 및 GOT2는 각각 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제 1(AST1; aspartate aminotransferase 1) 및 AST2로도 지칭할 수 있다.

본 발명에 따르는 "MAS에 포함되는 단백질의 발현 또는 활성 억제제"는, 구체적으로 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 MAS에 포함되는 단백질의 발현을 억제하거나, MAS 단백질의 활성을 억제하는 화합물을 사용할 수 있다.

상기 "siRNA 또는 shRNA를 사용하여 MAS에 포함되는 단백질의 발현을 억제"하는 것에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 정방향 siRNA 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열인 역방향 siRNA; 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열인 정방향 siRNA 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열인 역방향 siRNA; 중 어느 하나이고, 상기 shRNA는 서열번호 5로 표시되는 염기서열 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, MAS 에 포함되는 단백질의 발현을 억제하기 위해 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있는 siRNA 또는 shRNA 라면 제한없이 사용될 수 있다.

상기 "MAS 단백질의 활성을 억제하는 화합물"로서, 페닐숙신산(Phenyl Succinic Acid), 메틸말론산(Methyl Malonic Acid), N-(1- 피레닐)말레이미드(N-(1-pyrenyl)maleimide) 프탈로닉산(Phthalonic Acid), 메틸3-(3-(4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시)-프로판아미도)벤조에이트(Methyl 3-(3-(4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy)- propanamido)benzoate), LW6, 2-테노일-트리플루오르아세톤(2-Thenoyl-trifluoroacetone), 클로로트리신 (chlorothricin), 암모니오옥시아세트산(aminooxyacetic acid, AOA), 히드라지노숙신산(hydrazinosuccinate), 2-아미노-3-부테노익산(2-amino-3-butenoic acid) 및 머큐리얼 화합물(mercurial reagent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, MAS에 포함되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 것으로 통상의 기술자에게 선택되어 사용될 수 있는 물질이라면 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상술된 MAS 단백질의 활성을 억제하는 화합물에 있어서, 메틸3-(3-(4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시)-프로판아미도)벤조에이트, LW6, 2-테노일-트리플루오르아세톤, 클로로트리신은 MDH 효소의 억제제로서 공지되어 있다(Naik, Ravi, et al. Journal of medicinal chemistry 60.20 (2017): 8631-8646; Eleftheriadis, Theodoros, et al. Experimental and therapeutic medicine 10.5 (2015): 1959-1966; Gutman, Menachem, and Ester Hartstein. FEBS letters 49.2 (1974): 170-173.; SCHINDLER, Peter W. The FEBS Journal 51.2 (1975): 579-585.). 또한, AOA, 히드라지노숙신산, 2-아미노-3-부테노익산은 GOT 효소의 억제제로서 공지되어 있다(Wang, Caixia, et al. Cancer letters 378.1 (2016): 1-7.; Yamada, Ryo-Hei, et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects 801.1 (1984): 151-154.; Rando, Robert R. Biochemistry 13.19 (1974): 3859-3863.). 또한, N-(1- 피레닐)말레이미드를 포함하는 말레이미드 계열의 화합물 및 머큐리얼 계열의 화합물은 SLC25A11의 억제제인 것을 공지되어 있다(Capobianco, Loredana, et al. Biochemistry 35.27 (1996): 8974-8980.).

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 "암"은 폐암, 흑색종, 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 피부암, 혈액암, 간암, 난소암, 신장암, 전립선암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 "항암제"는 암 세포 내 미토콘드리아의 막전위를 조절하거나 이에 따라 암 세포 내 ATP의 결핍을 유도할 수 있는 항암제를 사용하는 경우에 MAS 억제제와 함께 사용하여 암 치료의 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 항암제는 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 에토목실(etomoxir)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 "고시폴"은 세포 내에서 ALDH의 발현 억제제 및 활성 억제제로서 역할을 가진다. 구체적으로, 고시폴은 세포 내 serine-folate 기작에서 ALDH가 NDAH를 생성하여 이로부터 ATP가 생성되는 세포 기작에서, 고시폴이 ALDH 발현 및 활성 억제제로서 작용하여 세포 내 ATP 결핍을 유발함에 따라 암세포가 사멸될 수 있다. 상기 고시폴은 하기 [화학식 1]의 구조를 가진다:

[화학식 1]

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본 발명에서 제공하는 조성물의 "펜포르민"은 세포 내에서 미토콘드리아 복합체 I의 억제제 역할을 한다. 구체적으로, 펜포르민은 미토콘드리아 복합체 I의 활성 억제를 통해 미토콘드리아 막 전위를 감소시킬 수 있으며, 결과적으로 세포 내 ATP의 합성이 저하되기 때문에 암세포가 효과적으로 사멸될 수 있다. 상기 펜포르민은 하기 [화학식 2]의 구조를 가진다:

[화학식 2]

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본 발명에서 제공하는 조성물의 "에토목실(etomoxir)"은 세포 내에서 b-산화(b-oxidation)를 억제하는 역할을 한다. 구체적으로, 에토목실은 미토콘드리아 내막의 외부에 위치하는 카르니틴 팔미토일 전이효소(carnitine palmitoyltransferase-1; CPT-1)의 활성을 비가역적으로 억제할 수 있고, 이를 통해 세포질로부터 미토콘드리아 막 내부로 지방산 아실고리가 이동하는 것을 차단해, 지방산 산화를 통한 APT 생성을 저해하는 역할을 한다. 상기 에토목실은 하기 [화학식 3]의 구조를 가진다:

[화학실 3]

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본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 "MAS 억제제"는 항암제와 함께 병용 처리하기 위해 혼합된 형태로 제공하는 것이 보다 바람직하다. 혼합에 있어서, MAS 억제제는 항암제와 10:1 내지 500:1의 몰비율로 혼합하는 것이 바람직하고, 구체적으로 30:1 내지 450:1의 몰비율로 혼합하는 것이 더욱 바람직하며, 보다 구체적으로 40:1 내지 400:1의 몰비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

보다 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 MAS 억제제를 0.1 내지 10 mM의 농도로 포함할 수 있으며, 이 때 항암제는 상술한 혼합 비율로 혼합할 수 있어, 0.2 μM 내지 1 mM, 바람직하게는 1 μM 내지 500 μM, 보다 바람직하게는 10 μM 내지 100 μM의 농도 범위에서 통상의 기술자에 의해 선택적으로 사용 가능하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 먼저 MAS 발현을 억제하는 것에 따른 암 치료 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다. 본 발명에서 MAS에 포함된 단백질로는 GAT를 대상으로 하였으며, MAS 단백질의 발현을 억제하기 위해 GAT의 아형인 SLC25A11에 대한 발현을 억제하기 위해 siRNA 또는 shRNA를 폐암 세포주 및 흑색종 세포주에 도입하였다. 그 결과, MAS 단백질인 SLC25A11의 발현을 억제하였을 때 정상 대조군에 비해 세포 내 ATP의 생산이 저해되면서 세포의 증식률이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2). 또한, 본 발명자들은 MAS 단백질의 발현을 억제하였을 때 생체 내에서도 종양 생장을 억제할 수 있는지 확인하고자 암세포주를 이종이식한 마우스에서 형성된 종양의 성장 정도를 확인한 결과, MAS 단백질의 발현이 억제된 암세포를 이식한 마우스에서 종양 생장 정도가 미비한 것을 확인하였다(도 3).

MAS 단백질의 발현 뿐 아니라, 활성을 차단하는 경우에서도 동일한 암치료 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위해서 MAS 활성 억제제 처리에 따른 암 세포 생장 억제 효과를 확인하였다. MAS 활성 억제제로서는 페닐 숙신산(PSA)을 배지에 첨가하여 암세포주를 배양한 결과, MAS 단백질의 활성을 억제하였을 때 세포 내 ATP 생산이 저해되면서(도 5), 세포 증식 또한 억제되는 것을 확인하였다(도 4).

또한, 본 발명자들은 MAS 억제제가 암세포의 미토콘드리아 내막에서 ATP 생성을 억제하는 것을 통해 암세포 증식을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 이에 따라 미토콘드리아 막전위 및 세포 내 ATP 생산을 조절할 수 있는 항암제 약물을 MAS 억제제와 함께 처리하였을 때 유의적인 암 치료 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다. 이에, MAS 억제제인 PSA 또는 프탈론산(PA)을, 항암제인 고시폴과 함께 혼합하여 처리하였을 때, 미토콘드리아 막 전위 감소에서 단독 처리에 비해 상승된 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 7). 이와 함께, 암세포 증식 억제 뿐 아니라 증가된 세포 사멸 효과를 확인하여, 암의 성장을 억제할 뿐 아니라 암 사멸 효과를 함께 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 6 및 도 8). MAS 억제제와 펜포르민을 혼합하여 병용 투여한 경우에서도 암세포 증식 억제의 시너지 효과를 유의적으로 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 9). 이에 비해, MAS 억제제 및 상기 항암제를 혼합하여 정상 세포에 처리하는 경우에는 세포 증식 억제 및 세포 사멸 유도가 나타나지 않는 것을 확인하여, 본 발명의 MAS 억제제 및 항암제의 혼합 처리에 의해 암세포만을 특이적으로 사멸할 수 있는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 MAS 억제제는 세포 내 ATP 생성을 억제하여 암세포 생장을 억제할 수 있다. 또한, 상기 MAS 억제제를 고시폴 또는 펜포르민과 같은 항암제와 함께 암세포에 처리하는 경우, 암세포에 특이적으로 세포 내 ATP 결핍을 유도하므로 세포 증식을 억제함에 있어서 MAS 억제제와 상기 항암제가 시너지 효과를 나타내어, 세포 증식을 억제하여 종양 성장을 억제할 뿐 아니라 유의적으로 암세포 사멸 효과를 나타내어 생성된 암을 사멸시키는 데 효과적일 수 있다. 이 때, 정상 세포에 대하여는 유의적인 세포 사멸을 나타내지 않는 반면, 암세포에 대하여는 MAS 억제제 및 항암제의 시너지 효과를 통해 이들을 각각 단독 처리하는 경우에 비해 상승된 암 치료 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에는 항암제를 추가로 더 포함할 수 있다. 이 때, 사용 가능한 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙,네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게 상기 항암제는 고시폴과 같은 ALDH 억제 활성을 가지거나, 펜포르민과 같은 바이구아나이드(biguanide) 계열의 약물일 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 고시폴 및 펜포르민을 포함하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 발명의 MAS 억제제 및 항암제를 포함하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 고시폴 및 펜포르민을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 MAS 억제제 또는 이를 고시폴 및/또는 펜포르민과 혼합한 약물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 MAS 억제제 또는 이를 고시폴 및/또는 펜포르민과 혼합한 약물을 포함하는 약학적 조성물에 있어서, 상기 MAS 억제제, 고시폴 및 펜포르민은 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 경구 투여제제를 제공할 수 있다.

본 발명의 경구 투여제제는 서방성 또는 제어방출성 제제일 수 있다. 서방성 제제의 경우에는 MAS 억제제 및 항암제가 동시 방출될 수 있으며, 제어방출성 제제의 경우에는 MAS 억제제 및 항암제, 또는 항암제 및 MAS 억제제가 순차적으로 방출될 수 있도록 조절될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

MAS 억제에 따른 암 세포 생장 억제 효과의 확인

<1-1> MAS 억제에 따른 폐암 및 흑색종 세포 생장 억제 효과의 확인

Malate Aspartate Shuttle에 포함되는 단백질인 GAT의 아형인 SLC25A11의 발현을 억제하였을 때 암세포에 대하여 증식 억제효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, 폐암 세포주인 A549 세포, H522 세포, H226 세포, H23 세포 또는 EKVX 세포; 또는 흑색종 세포주인 UACC62 세포, UACC257 세포, A375 세포, SK-MEL-5 세포 또는 MALME-3M 세포를 각각 배양하였다. 각각의 세포를 100 ㎖ 용량으로 배양하여 각각의 세포주의 배가시간에 따라 5,000 내지 20,000 세포/㎖의 농도 범위로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 그런 다음, 세포를 접종한 플레이트에 20 μM SLC25A11 siRNA를 첨가하고 2 주간 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양을 종결하고, SRB 분석을 수행하기 위해, 냉각시킨 50% TCA 수용액을 각 웰에 최종 농도 10%가 되도록 첨가하고 4℃? 냉장 상태에서 60 분 동안 배양하여 세포를 고정하였다. 배양 후, 상층액을 제거하고 수돗물로 5 회 세척한 다음 건조시켰다. 건조된 시료에, 0.4% 술포로다민 B(Sulforhodamine B)이 포함된 1% 아세트산 수용액을 각각의 웰에 첨가하고 10 분 동안 실온에서 방치하여 세포를 염색하였다. 염색 뒤, 착색되지 않은 염색약은 1% 아세트산 용액으로 세척하여 제거한 후 다시 플레이트를 건조시켰다. 착생된 염색약은 10 mM 트리즈마 염기 용액으로 용해시킨 다음, 515 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

siRNA의 형질도입 외에도, 세포 내에서 shRNA를 발현시켜 SLC25A11의 발현 억제를 유도하였다. SLC25A11를 표적하는 shRNA 발현 벡터를 대상 암세포주에 형질도입한 후, 세포를 크리스탈 바이올렛 염색하여 생존 세포의 수를 관찰하였으며, 세포를 파쇄하고 웨스턴블럿을 수행하여 발현량을 비교하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 폐암 및 흑색종 세포주에서 MAS 단백질인 SLC25A11의 발현을 억제하였을 때, SLC25A11 단백질의 발현이 정상 대조군에 비해 유의적으로 감소하였으며(도 1c), 이에 따라 생존 세포가 감소하고 세포 증식률이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 1a 및 도 1b).

<1-2> MAS 억제에 따른 세포 내 ATP 생산 저해 효과의 확인

암 세포주에서 MAS 단백질의 발현을 억제하였을 때 세포 생장이 억제됨을 확인하였으므로, 세포 내 ATP 생산 수준을 확인하였다.

구체적으로, 폐암 세포주인 A549 세포, IMR90 세포, H23 세포, H226 세포, H522 세포 또는 EKVX 세포; 또는 흑색종 세포주인 UACC62 세포, MALME-3M 세포, A357 세포, M14 세포 또는 UACC257 세포를 각각 배양하였다. 배양한 세포에 40 nM SLC25A11 siRNA를 첨가하고 48 시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한 후, ATP Colorimetric/Fluorometric 분석 키트(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조사의 제공하는 프로토콜에 따라 세포 내 ATP 수준을 확인하였다. 상기 배양한 세포를 1Х10⁶ 세포로 나누어 100 ㎕의 ATP 분석 완충용액을 가해 세포를 용해한 다음, 4℃?에서 15,000Хg로 2 분간 원심분리하여 상층액 만을 분리하였다. 분리한 상층액 2 내지 50 ㎕를 96 웰 플레이트에 옮긴 후, 최종 부피가 웰당 50 ㎕가 되도록 ATP 분석 완충용액을 가하였다. 그런 다음, 44 ㎕ ATP 분석 완충용액, 2 ㎕ ATP 프로브, 2 ㎕ ATP 컨버터 및 2 ㎕ 전개제 혼합물을 포함하는 ATP 반응 혼합물을 상기 96 웰 플레이트의 각 웰당 50 ㎕ 씩 가하여 혼합하였다. 혼합 후, 암실에서 30 분 동안 플레이트를 실온 방치한 다음, 마이크로플레이터 리더기를 사용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 값에서 상대적인 ATP 수준을 비교하기 위해, 고시폴 및 펜포르민을 첨가하지 않은 암 세포에 대한 흡광도 값을 기준으로 하고, 각각의 약물을 처리한 경우의 상대적인 흡광도 값을 비교하여, 세포 내 ATP 수준을 비교하였다.

UACC62 세포에 대하여, ATP 뿐 아니라 MAS 단백질의 발현 억제에 따라 다양한대사 경로의 대사 물질의 발현 수준도 비교하였다. UACC62 세포에 40 nM SLC25A11 siRNA를 첨가하고 24 시간 동안 CO2 배양기에서 배양한 후, LC-MS/MS 분석으로 TCA 회로 대사경로(TCA cycle metabolism) 및 펜토오즈 인산화 경로(pentose phoshate metabolism)의 대사 물질 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 SLC25A11 siRNA를 처리하여 MAS을 억제한 암세포주에서 미처리 대조군에 비해 세포 내 ATP 수준이 감소하는 것을 확인하였으며(도 2a), 대사 경로의 대사 물질의 발현 수준 또한 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2b).

폐암 동물 모델에서 MAS 억제에 따른 종양 성장 억제 효과의 확인

MAS 단백질의 발현 수준을 억제하는 것을 통해 암세포 생장 억제 효과를 나타낼 수 있음을 세포 수준에서 확인하였으므로, 이후 생체 내 수준에서도 암 생장 억제 효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.

먼저, 암 마우스 모델을 만들기 위하여 6 내지 8 주령의 Balb/c-nu 마우스(Central Lab. Animal, Highland Heights, KY, USA)를 준비하였다. 또한, Luciferase SLC25A11 shRNA를 A549 세포 또는 H226 세포에 도입하여 배양하고, 5.0Х10⁶의 각각의 세포를 상기 준비한 마우스에 1 ㎖ 실린지로 피하 주사하였다. 2 주 동안 마우스를 사육하여 각각의 마우스에서 종양의 크기를 확인하였다. 암 세포 주입 후 초기 종양의 크기는 캘리퍼(calliper)를 사용하여 측정하였다. 종양 부피는 하기 [수학식 1]을 사용하여 구하였다.

[수학식 1]

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 폐암 세포주를 이식하여 형성된 종양에 SLC25A11 shRNA를 도입한 마우스 모델에서는, SLC25A11 shRNA를 도입하지 않은 대조군 마우스 모델에 비해 종양 부피의 증가 수준 역시 낮은 것을 확인하였다(도 3a). 사육 종료 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, SLC25A11 shRNA를 도입한 모델군에서 대조군(PLKO)보다 종양 무게 및 크기의 증가 수준이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 3b).

MAS 활성 억제제 처리에 따른 암 세포 생장 억제 효과의 확인

<3-1> 페닐 숙신산(PSA) 처리에 따른 암 세포 생장 억제 효과의 확인

siRNA 또는 shRNA를 이용하여 MAS의 발현을 억제하였을 때, 시험관 내 및 생체 내 모두에서 암의 성장을 억제할 수 있음을 확인하였지만, 암세포주 생장 및 종양의 성장을 완벽하게 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 이에, MAS 억제제를 처리하는 경우에서는 효과적으로 암을 억제할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, A549 세포(폐암 세포주), UACC62 세포(흑색종 세포주) 또는 IMR90 세포(정상 대조군, 폐섬유아세포)를 각각 배양하였다. 각각의 세포의 배양 배지에 2, 4, 6, 8 또는 10 mM 농도로 SLC25A11 억제제인 페닐 숙신산(phenyl succicic acid, PSA)을 첨가하고, 100 ㎖ 용량으로 48 시간 동안 배양한 다음 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 세포의 증식 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 폐암 및 흑색종 세포주에서 MAS 단백질인 SLC25A11의 억제제인 PSA를 처리하였을 때, PSA의 첨가 농도에 의존적으로 암세포주 증식 수준이 감소하는 반면(도 4a 및 도 4b), 정상 세포주인 IMR90에서는 PSA을 처리하여도 유의적인 암세포 증식 억제가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 4c).

<3-2> MAS 억제제 처리에 따른 세포 내 ATP 생산 저해 효과의 확인

MAS 억제제를 처리하였을 때 암 세포주의 증식을 유의적으로 억제할 수 있는 것으로 확인하였으므로, MAS 억제제 처리에 따라 암 세포 내에서 ATP 수준이 감소하는지 확인하였다.

구체적으로, A549 세포(폐암 세포주) 또는 UACC62 세포(흑색종 세포주)를 각각 배양하였다. 배양한 세포에 2, 4, 6, 8 또는 10 mM의 PSA 또는 프탈론산(phthalonic acid, PA)를 첨가하고 48 시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 <1-2>과 동일한 방법을 수행하여 세포 내 ATP 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 PSA 또는 PA를 처리하여 MAS의 활성을억제한 암세포주에서 미처리 대조군에 비해 세포 내 ATP 수준이 감소하는 것을 확인하였다(도 5).

MAS 억제제 및 고시폴의 병용 처리를 통한 암세포 증식 억제의 시너지 효과 확인

<4-1> MAS 억제제 및 고시폴의 병용 처리를 통한 암세포 사멸의 시너지 효과 확인

암세포에 MAS 억제제를 처리하였을 때 암세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하였으나, 2 내지 10 mM의 농도로 PSA 또는 PA를 처리하였을 때에 완전한 항암 효과를 나타내지 못하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 암세포 내에서 ATP 생성 억제를 통해 암세포 증식을 억제할 수 있는 항암제인 고시폴(gossypol)을 MAS 억제제와 병용 처리하여 암세포의 증식을 보다 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 폐암 세포주인 EKVX 세포A549 세포, 또는 HOP-62 세포; 흑색종 세포주인 UACC62 세포, UACC257 세포 또는 A375 세포; 또는 정상 대조군의 폐섬유아세포인 IMR90 세포를 각각 배양하였다. 각각의 세포의 배양 배지에 4 mM PSA, 4 mM PA 또는 25 μM NPM(N-(1-pyrenyl)maleimide)를 10 μM의 고시폴과 혼합하여 배지에 첨가하고, 48 시간 동안 추가 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 세포의 증식 수준을 확인하였고, 상기 실시예 <1-2>과 동일한 방법을 수행하여 세포 내 ATP 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 MAS 억제제인 PSA 및 PA를 각각 4 mM 농도로 단독 처리한 것에 비해 10 μM의 고시폴을 단독으로 처리한 경우에서 세포 내 ATP의 생산 수준의 현저한 차이는 확인되지 않았지만(도 6b), 세포 증식 수준은 고시폴을 처리한 경우에서 보다 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6a). 또한, MAS 억제제인 NPM을 25 μM 농도로 처리한 것에 비해 고시폴을 단독으로 처리하는 경우에서 세포 증식 수준 억제 효과가 높은 수준으로 나타나는 것으로 확인하였다(도 6c). 그러나, MSA 억제제 및 고시폴을 혼합하여 병용 처리한 실험군에서 보다 현저한 세포 증식 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 세포의 증식이 억제될 뿐 아니라 세포 사멸을 나타내어, 암세포주의 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 6a 및 도 6c). 이에 비해, 정상 세포 대조군인 IMR90 세포주에서는 세포 증식의 감소가 일부 나타나나, 동일 농도의 MAS 억제제 및 고시폴을 처리한 것과 비교하였을 때는 세포 증식 감소 수준이 미미한 것으로 확인하였다(도 6a).

<4-2> MAS 억제제 및 고시폴의 병용 처리를 통한 미토콘드리아 막 전위 감소의 시너지 효과 확인

MAS 억제제 및 고시폴을 병용 처리하였을 때, MAS 억제제 및 고시폴을 각각 단독으로 처리한 것에 비해 현저하게 증가된 수준으로 암세포의 증식이 억제되고 세포 수가 감소할 뿐 아니라, 암세포의 사멸이 현저한 수준으로 나타나는 것을 확인하였고, 세포 내 ATP 수준 역시 유의적으로 감소하는 것을 확인한 바, MAS 억제제 및 고시폴을 병용 처리한 것에 따라 미토콘드리아 막 전위 수준에 변화가 있는지 확인하였다.

구체적으로, A549 세포, UACC62 세포 및 정상세포인 IMR90 세포를 배양하였다. 배양한 세포에 4 mM의 MAS 억제제인 SLC25A11 억제제(PSA 또는 PA) 및 10 μM 고시폴을 혼합한 혼합 약물, 또는 이들의 단독 약물을 각각의 세포에 처리하여 동일하게 48 시간 동안 배양한 후, 각각의 세포 배양액을 챔버 슬라이드(형광 현미경 분석용) 또는 6-웰 플레이트(유세포 분석기 분석용)에 분주하였다. 분주한 배양액에, 형광 프로브인 100 nM의 테트라메틸로다민 에스테르(tetramethylrodamine ester, TMRE)를 처리하고, 20 분동안 반응하였다. 반응 후, 냉각된 PBS로 세포를 세척하고, a Zeiss LSM510 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Baden-Wurttemberg, Germany)으로 세포의 형광 발색도를 측정하였다. 이와 함께 585 nm(FL-2) 채널을 이용하여 유세포 분석기에서 형광 강도를 분석하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 48 시간 동안 약물을 처리하여 세포를 배양한 결과, IMR90 세포(정상 대조군)에서는 MAS 억제제 또는 고시폴을 단독 처리하거나 병용 처리하는 것과 관계없이 미토콘드리아 막전위가 유의적으로 변화하지 않는 것에 비해, A549 세포 및 UACC62 세포에서는 미토콘드리아 막전위의 변화를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 변화와 관련하여, A549 세포에서는 MAS 억제제인 PSA 및 PA를 각각 단독 처리한 경우에서 유의적으로 미토콘드리아 막전위가 변화하지 않는 것에 비해 고시폴을 단독 처리한 대조군에서는 막전위가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, MAS 억제제 및 고시폴을 혼합 처리한 실험군 또한 미토콘드리아 막전위 수준의 유의적인 감소를 확인하였다(도 7a 및 도 7b).

<4-3> MAS 억제제 및 고시폴의 병용 처리에 의한 세포 사멸(apoptosis)의 확인

MAS 억제제 및 고시폴을 병용 처리하였을 때 세포 증식의 억제 뿐 아니라 세포 사멸에 있어서도 유의적인 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위해서, 세포 사멸 활성을 확인하였다.

먼저 A549 세포, UACC62 세포 및 정상세포인 IMR90 세포를 배양하였다. 배양한 세포에 4 mM의 MAS 억제제인 SLC25A11 억제제(PSA 또는 PA) 및 10 μM 고시폴을 혼합한 혼합 약물, 또는 이들의 단독 약물을 각각의 세포에 처리하여 동일하게 48 시간 동안 배양하였다. 배양한 세포는 배지를 제거하여 차가운 PBS로 2 회 세척하고, 1,400 rpm에서 3 분 동안 원심분리한 다음, 1Х10⁶ 세포/mLdml 농도로 결합 완충용액을 가하였다. 그리고, 100 μM의 완충용액을 5-mL 배양튜브에 옮겨서 아넥신 V-FITC 및 프로피듐 아이오드(PI)를 각각 5 ㎕씩 가하였다. 튜브를 천천히 볼텍싱 하여 혼합한 다음, 실온의 암실에서 15분간 배양하였다. 배양 후, 결합 완충용액(400 ㎕)을 가하고 유세포 분석기를 통해 세포 사멸증가 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 8에서 나타난 바와 48 시간 동안 약물을 처리하여 세포를 배양한 결과, IMR90 세포(정상 대조군)에서는 MAS 억제제 또는 고시폴을 단독 처리하거나 병용 처리하는 것과 관계없이 유의적으로 세포 사멸이 나타나지 않는 반면, A549 세포 및 UACC62 세포에서는 MAS 억제제 또는 고시폴을 단독 처리하는 경우 미미한 세포 사멸이 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 MAS 억제제 및 고시폴을 혼합하여 처리하는 경우에 단독 처리에 비해 세포 사멸 수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 8a 및 도 8b). 이러한 세포 사멸의 효과는 MAS 억제제 및 고시폴을 혼합하였을 때, 각각의 약물을 단독으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식을 보다 높은 수준으로 억제할 뿐 아니라 세포 사멸에 있어서도 시너지 효과를 나타낼 수 있어서 암세포 사멸에서 효과적임을 나타낸다.

MAS 억제제 및 펜포르민의 병용 처리를 통한 암세포 증식 억제의 시너지 효과 확인

MAS 억제제를 고시폴과 병용 처리하였을 때 암세포 증식 억제에 있어서 시너지 효과를 나타내어, 효과적으로 암 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도할 수 있음을 확인한 바, 미토콘드리아 복합체 I의 억제제로서 ATP 결핍을 유도할 수 있는 항암제로서 알려져 있는 펜포르민(phenformin)과도 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, A549 세포, UACC62 세포, HOP-62 세포, H226 세포, UACC62 세포 및 A375 세포를 각각 배양하였다. 각각의 세포의 배양 배지에 4 mM의 PSA, 4 mM PTA 또는 25 내지 50 μM NPM을 100 μM의 펜포르민과 혼합하여 배지에 첨가하고, 48 시간 동안 추가 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 세포의 증식 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 MAS 억제제 또는 펜포르민을 병용 처리하였을 때에 비해, PSA, PTA 또는 NPM; 및 펜포르민을 혼합 처리한 경우에서 세포 증식 억제 효과가 유의적으로 상승하는 것을 확인하였다(도 9).

MAS 억제제 및 에토목실(Etomoxir) 병용 처리를 통한 암세포 증식 억제의 시너지 효과 확인

다른 항암제로서, b-oxidation을 표적하여 암세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있는 에토목실과 MAS 억제제의 시너지 효과 여부를 확인하였다. 에토목실은 미토콘드리아 내막의 외부에 위치하는 CPT-1(carnitine palmitoyltransferase-1) 등의 효소에 대한 활성 억제제로 알려져 있다.

구체적으로, 간암 세포주인 Huh7, 악성 교아세포종 세포주인 SNB19 세포, 흑색종 세포주인 UACC62 세포, 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포, 위암 세포주인 KATO III 세포, 또는 정상 대조군의 폐섬유아세포인 IMR90 세포를 각각 배양하였다. 각각의 세포의 배양 배지에 25 μM NPM 및 100 μM 엑토목실을 혼합하여 배지에 첨가하고, 24 시간 동안 추가 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 세포의 증식 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 MAS 억제제인 NPM을 처리하였을 때, 악성 교아세포종 세포주인 SNB19 세포 외의 암세포주에 대하여 암세포 증식 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이에 더하여, 에토목실 및 NPM을 혼합하여 병용 처리하였을 때, 각각을 단독 처리한 실험군에 비해 현저히 증가한 세포 증식 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 간암 세포주인 Huh7 세포의 경우, 세포의 증식이 억제될 뿐 아니라 세포 사멸을 나타내어, 암세포주의 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 10).

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer comprising malate-aspartate shuttle inhibitor and chemotherapy <130> 1063784 <150> KR 10-2017-0048558 <151> 2017-04-14 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC25A11_1_sense <400> 1 ggaauacaag aacgggcugg acguguu 27 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC25A11_1_antisense <400> 2 cacguccagc ccguucuugu auuccuu 27 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC25A11_2_sense <400> 3 acauugccaa gacccgaauc cagaauu 27 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC25A11_2_antisense <400> 4 uucuggauuc gggucuuggc aauguuu 27 <210> 5 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRCN0000322801 <400> 5 ccggtacccg ccttggcatc tatacctcga ggtatagatg ccaaggcggg tatttttg 58 <210> 6 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRCN0000044416 <400> 6 ccgggcagat gaacaaggcc tacaactcga gttgtaggcc ttgttcatct gctttttg 58

Claims

말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS)에 포함되는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로서,
상기 MAS에 포함되는 단백질의 발현 억제제는 MAS에 포함되는 단백질에 대한 siRNA 또는 shRNA 중 어느 하나 또는 둘 다인 것이고,
상기 MAS에 포함되는 단백질의 활성 억제제는 페닐숙신산(Phenyl Succinic Acid), 메틸말론산(Methyl Malonic Acid), N-(1-피레닐)말레이미드(N-(1-pyrenyl)maleimide), 프탈로닉산(Phthalonic Acid), 메틸3-(3-(4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시)-프로판아미도)벤조에이트(Methyl 3-(3-(4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy)-propanamido)benzoate), 메틸 3-[[2-[4-(1-아드만틸)페녹시]아세틸]아미노]-4-하이드록시벤조에이트(Methyl 3-[[2-[4-(1-adamantyl)phenoxy]acetyl]amino]-4-hydroxybenzoate), 2-테노일-트리플루오르아세톤(2-Thenoyl-trifluoroacetone), 클로로트리신(chlorothricin), 히드라지노숙신산(hydrazinosuccinate) 및 2-아미노-3-부테노익산(2-amino-3-butenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 MAS에 포함되는 단백질은, 말산-알파-케토글루탐산 수송체(MAT; malate-a-ketoglutarate transporter), 굴루탐산-아스파르트산 수송체(GAT; glutamate-aspartate transporter), 말산 디하이드로게나제 1(malate dehydrogenase 1), 말산 디하이드로게나제 2(malate dehydrogenase 2), 글루타믹 옥살아세틱 트랜스아미나제 1(glutamic oxaloacetic transaminase 1) 및 글루타믹 옥살아세틱 트랜스아미나제 2(glutamic oxaloacetic transaminase 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 정방향 siRNA 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열인 역방향 siRNA; 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열인 정방향 siRNA 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열인 역방향 siRNA; 중 어느 하나이고,
상기 shRNA는 서열번호 5로 표시되는 염기서열 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 암은 폐암, 흑색종, 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 피부암, 혈액암, 간암, 난소암, 신장암, 전립선암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
말산-아스파르트산 왕복수송(malate-aspartate shuttle, MAS)에 포함되는 단백질의 발현 또는 활성 억제제 및 항암제를 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로서,
상기 MAS에 포함되는 단백질의 발현 억제제는 MAS에 포함되는 단백질에 대한 siRNA 또는 shRNA 중 어느 하나 또는 둘 다인 것이고,
상기 MAS에 포함되는 단백질의 활성 억제제는 페닐숙신산(Phenyl Succinic Acid), 메틸말론산(Methyl Malonic Acid), N-(1-피레닐)말레이미드(N-(1-pyrenyl)maleimide), 프탈로닉산(Phthalonic Acid), 메틸3-(3-(4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시)-프로판아미도)벤조에이트(Methyl 3-(3-(4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy)-propanamido)benzoate), 메틸 3-[[2-[4-(1-아드만틸)페녹시]아세틸]아미노]-4-하이드록시벤조에이트(Methyl 3-[[2-[4-(1-adamantyl)phenoxy]acetyl]amino]-4-hydroxybenzoate), 2-테노일-트리플루오르아세톤(2-Thenoyl-trifluoroacetone), 클로로트리신(chlorothricin), 히드라지노숙신산(hydrazinosuccinate) 및 2-아미노-3-부테노익산(2-amino-3-butenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이고,
상기 항암제는 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 에토목실(etomoxir)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제8항에 있어서, 상기 암 예방 및 치료용 약학적 조성물은, 항암제 및 MAS에 포함되는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 1 : 10 내지 500의 몰비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 암은 폐암, 흑색종, 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 피부암, 혈액암, 간암, 난소암, 신장암, 전립선암 및 췌장암 으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.