KR20180099540A - 암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 NRF2의 발현을 억제하는 NRF2 발현 억제제 또는 활성 억제제는, 암세포의 방사선에 대한 민감성을 증가시키는 효과가 우수하므로, 암, 특히 대장암의 치료를 위한 감작제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진용 조성물{A Composition for Increasing Radiosensitivity of Cancer Cells}

본 발명은 암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진용 조성물에 관한 것이다.

암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비조절적인 방식으로 증식하고 불사화되어 발생하는 질병이다. 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이 등의 내적 요인을 들 수 있다.

특히, 고형암의 경우, 암조직 내 세포들이 저산소, 산성화 및 영양소 결핍과 같은 미세환경에 쉽게 노출되며, 영양소, 성장인자, 산소 농도 및 pH 등의 증감이 암조직 내 세포와 세포, 세포와 기질간의 상호작용에 주요하게 작용한다. 고형암 내 미세환경 중 가장 중요한 요인인 저산소 환경은 혈관형성(angiogenesis) 과정을 통한 신생혈관형성(neovasculature)과 연계가 되며, VEGF, angiopoietin 등과 같은 혈관형성 유도 인자의 증가와 angiostatin, endostatin 등과 같은 혈관형성 억제 인자의 감소에 의해 조절을 받는다.

또한, 유전자 수준에서의 다양한 변이는 정상 세포가 악성종양으로 전이되는데 관여하는 다양한 형질들을 획득하도록 원인을 제공하며, 이러한 세포 내 분자 신호 기전들은 암의 진단 및 치료를 위한 중요한 역할을 할 것으로 여겨진다.

이러한 암의 치료법으로는 수술, 방사선 치료법 및 항암 화학 요법으로 크게 나눌 수 있는데, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있다. 국내에서 방사선 치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세에 있으므로 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성도 증가하고 있다. 그러나 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량 방사선 치료시 정상 조직의 손상 등이 방사선 치료의 효율을 저하시키는 문제점으로 지적되어 왔다. 따라서 방사선 치료의 효율을　증진시키기 위한 방사선 치료 민감제에 대한 연구가 시도되고 있다.

현재까지 보고된　방사선 치료 민감제는 주로 항암제들로서, 예를 들어 택솔(Taxol)과 시스플라틴(cisplatin)이 유방암, 자궁암, 폐암, 위암, 대장암 등의 고형암에서 방사선 치료 민감제로 사용될 수 있다고 개시된 바 있다(Amorino et al., Radiat Oncol Investig, 1999, 7(6); 343-352; Choy H., Oncology, 1999, 13; 22-38; Safran H. et al., Cancer Invest, 2001, 19(1); 1-7).

그러나, 이들 방사선 치료 민감제들은 높은 부작용을 가지므로 그 사용이 제한적이라는 문제점이 있다. 암세포에 대한 방사선 치료시 감수성의 차이가 존재하지만, 상기 감수성을 증진시킬 수 있다면 환자에게 더 적은 양의 방사선을 조사하여 동일한 치료 효과를 얻을 수 있으므로 바람직하다.

종래, 감수성 증진제로서 암관련 유전자의 발현을 조절하는 물질을 사용하는 것에 대한 연구가 진행되어왔다. 암세포에서 bcl-2가 과발현 되었을 경우 방사선 저항성을 나타낸다거나(N Hamada et. al. Radiother Oncol, 1, 2008, 89(2); 231-236), gp96 및 GDF15에 대한 shRNA로 형질감염시킨 후 방사선을 조사시켜 주었을 때, 방사선에 대한 민감도가 증가된다(Joseph Tung-ChiehChang et. al. Mol Cancer Ther, 2007, 6(8); 22712279)는 연구가 보고된 바 있으나, 저산소/산성 환경에서 산화환원효소들을 표적으로 하여 방사선의 노출된 세포의 치료 및 암의 방사선 치료에 응용하고자 한 바는 전무하다.

한편, NRF2는 산화환원효소들의 상위인자이며, 세포내의 산화적 스트레스에 반응하는 대표적인 전사 인자(transcription factor)로서 이에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. Nrf2에 의하여 산화적 스트레스에 저항하기 위한 다양한 단백질들의 발현이 유도된다. 산화적 스트레스가 존재하지 않을 때는 Keap1과 결합하고 있다. 산화적 스트레스에 의하여 Keap1의 cystein이 산화되어 분해되면 protein kinase C, phosphatidylinositol 3-kinase, 및 MAP kinase에 의하여 Nrf2가 활성화(phosphorylation)되어 핵내로 이동하여 다양한 산화환원효소들의 유전자 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Saito, 2013).

본 발명자들은 암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 NRF2가 저산소 상태의 암세포에서 과발현되고, 암세포에 NRF2 억제제를 처리한 경우, NRF2의 발현 수준이 억제되면서 NQO-1과 HO-1 발현 수준 또한 억제시켜, 암세포의 방사선 감수성이 증가하여 세포 성장 및 증식이 유의하게 억제되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 NRF2(Nuclear factor erythroid 2-related factor, Genbank numberQ16236) 유전자의 발현 억제제; 또는 NRF2 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 NRF2(Nuclear factor erythroid 2-related factor, Genbank numberQ16236) 유전자의 발현 억제제; 또는 NRF2 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 또는 암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 암은 저산소 상태이며, NRF2 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정한 경우 NRF2 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 과발현되는 것이다.

본 발명의 NRF2가 과다 발현된 암을 표현하기 위해 사용된 용어 "과발현(overexpression)"은 적합한 발현 분석법을 통해 NRF2의 발현 수준을 측정한 경우에 있어서, 비교 대상 세포(예컨대, 해당 기관인 정상 대장 세포)의 NQO1 발현 수준에 비하여 2 배 이상인 것을 의미한다.

따라서, 본 발명의 조성물의 가장 큰 특징은 NRF2 유전자를 타겟으로 하여 상기 NRF2 유전자의 발현 수준 또는 상기 NRF2 단백질의 발현 또는 활성 수준을 억제시키는 억제제를 도입하여 NRF2가 과발현된 저산소 상태에 있는 암의 방사선 민감도(감수성)를 증가시켜서 암 세포의 사멸을 유도한다는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 억제제는 NRF2의 뉴클레오티드의 발현 또는 NRF2 단백질의 활성을 억제하는 것을 모두 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 발현 억제제는 NRF2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상 일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 활성 억제제는, NRF2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 화합물은 NRF2 표적-억제제로서 작용할 수 있는 한, 제한되지 않는다.

바람직하게는, 퀴나크린 (quinacrine); ML385 (Small Molecule Inhibitor); 루테오린(luteolin); 알카로이드 트리고넬린 (alkaloid trigonelline); 부루사톨(brusatol); 크리신 (chrysin); 알데스루킨 (Aldesleukin); 알렘투쯔맙 (Alemtuzumab); 알리트레티노인 (alitretinoin); 알로푸리놀 (allopurinol); 알트레타민 (altretamine); 아미포스틴 (amifostine); 아나스트로졸 (anastrozole); 알세닉 트리옥사이드 (arsenic trioxide); 아스파라기나제 (Asparaginase); 생 BCG (BCG Live); 벡사로텐 캡슐 (bexarotene capsules); 벡사로텐 겔 (bexarotene gel); 블레오마이신 (bleomycin); 부설판 정맥내 투여제 (busulfan intravenous); 부설판 경구 투여제 (busulfan oral); 칼루스테론 (calusterone); 카페시타빈 (capecitabine); 카보플라틴 (carboplatin); 카무스틴 (carmustine); 폴리페프로산 (Polifeprosan); 셀레코시브 (celecoxib); 클로람부실 (chlorambucil); 시스플라틴 (cisplatin); 클라드리빈 (cladribine); 시클로포스파미드 (cyclophosphamide); 시타라빈 (cytarabine); 시타라빈 리포소말 (cytarabine liposomal); 다카르바진 (dacarbazine); 닥티노마이신 (dactinomycin); 악티노마이신 (actinomycin) D; 다베포에틴 알파 (Darbepoetin alfa); 다우노루비신 리포소말 (daunorubicin liposomal); 다우노루비신 (daunorubicin), 다우노마이신 (daunomycin); 데니루킨 디프티톡스 (Denileukin diftitox), 덱스라족산 (dexrazoxane); 도세탁셀 (docetaxel); 독소루비신 (doxorubicin); 옥소루비신 리포소말 (doxorubicin liposomal); 드로모스타노론 프로피오네이트 (Dromostanolone propionate); 엘리엇 비 용액 (Elliott's B Solution); 에피루비신 (epirubicin); 에포에틴 알파 에스트라무스틴 (Epoetin alfaestramustine); 에토포사이드 포스페이트 (etoposide phosphate); 에토포사이드 (etoposide) (VP-16); 엑세메스탄 (exemestane); 필그라스틴 (Filgrastim); 플록스우리딘 (floxuridine, 동맥내 투여); 플루다라빈 (fludarabine); 플루오로우라실 (fluorouracil) (5-FU); 풀베스트란트 (fulvestrant); 젬투쯔맙 오조가미신 (gemtuzumab ozogamicin); 글리벡 (gleevec); 고세렐린 아세테이트 (goserelin acetate); 히드록시우레아 (hydroxyurea); 이브리투모맙 티욱세탄 (Ibritumomab Tiuxetan); 이다루비신 (idarubicin); 이포스프아미드 (ifosfamide); 이마티닙 메실레이트 (imatinib mesylate); 인터페론 알파 (Interferon alfa)-2a; 인터페론 알파 (Interferon alfa)-2b; 이리노테칸 (irinotecan); 레트로졸 (letrozole); 루코보린 (leucovorin); 레바미솔(levamisole); 로무스틴 (lomustine) (CCNU); 메클로레타민 (meclorethamine) (질소 머스타드); 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate); 멜파란 (melphalan) (L-PAM); 메르캅토푸린 (mercaptopurine) (6-MP); 메스나 (mesna); 메토트렉세이트 (methotrexate); 메톡스살렌 (methoxsalen); 미토마이신 (mitomycin) C; 미토탄 (mitotane); 미톡산트론 (mitoxantrone); 난드롤론 펜프로피오네이트 (nandrolone phenpropionate); 노페투모맙 (Nofetumomab); LOddC; 오프레베킨 (Oprelvekin); 옥살리플라틴 (oxaliplatin); 팍클리탁셀 (paclitaxel); 파미드로네이트 (pamidronate); 페가데마제 (pegademase); 페가스파가제 (Pegaspargase); 페그필그라스팀 (Pegfilgrastim); 펜토스타틴 (pentostatin); 피포브로만 (pipobroman); 플리카마이신 (plicamycin); 미트라마이신 (mithramycin); 폴피머 소듐 (porfimer sodium); 프로카르바진 (procarbazine); 라스부리카세 (Rasburicase); 리툭시맙 (Rituximab); 사르그라모스틴 (Sargramostim); 스트렙토조신 (streptozocin); 수라페닙 (surafenib); 탈부비딘 (talbuvidine) (LDT); 탈크; 타목시펜 (tamoxifen); 타르세바 (tarceva); 테모졸로마이드 (temozolomide); 테니포사이드 (teniposide) (VM-26); 테스토락톤 (testolactone); 티오구아닌 (thioguanine) (6-TG); 티오테파 (thiotepa); 토포테칸 (topotecan); 토레미펜 (toremifene); 토시투모맙 (Tositumomab); 트라스투쯔맙 (Trastuzumab); 트레티노인 (tretinoin) (ATRA); 우라실 머스타드 (uracil Mustard);발루비신 (valrubicin); 발토르시타빈 (valtorcitabine) (monoval LDC); 빈블라스틴 (vinblastine); 비노렐빈 (vinorelbine); 및 졸레드로네이트 (zoledronate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 약물이며, 보다 바람직하게는 퀴나크린 (quinacrine); ML385 (Small Molecule Inhibitor); 루테오린(luteolin); 알카로이드 트리고넬린 (alkaloid trigonelline); 부루사톨(brusatol) 및 크리신 (chrysin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 약물이고, 가장 바람직하게는 퀴나크린 (quinacrine)이다.

본 발명에서 목적으로 하는 암세포에서의 방사선에 대한 감수성 증진 효과를 얻을 수 있는 한, NRF2 표적-억제제로서 상기 억제제들을 다양하게 조합 또는 단독으로 하여 이용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 NRF2 유전자의 발현 억제제 및 NRF2 단백질의 활성 억제제를 모두 포함할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NRF2 유전자의 발현 억제제로서 siRNA 및 NRF2 단백질의 활성 억제제로서 NRF2-표적 억제제인 퀴나크린을 병용처리할 수 있다.

본 발명의 대상 질환인 "암(cancer)"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)또는 악성 복수(malignant ascites)와 동일한 의미로도 사용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 암은 NRF2를 과발현하는 암세포로, 대장암(colon cancer), 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterinesarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 난관암(fallopian tubecarcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor),요도암(urethralcancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 암세포이며, 이에 한정되는 것은 아니나, 가장 바람직하게는 대장암이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 유효성분인 상기 억제제는 방사선 조사시 NRF2에 의해 조절되는 NQO1(NAD(P)H: quinoneoxidoreductase 1, Genbank numberP15559) 유전자 및 HO-1(Heme oxygenase-1, Genbank numberP09601) 유전자의 발현; 또는 이의 단백질의 발현을 억제하여 방사선에 대한 감수성을 증진시키고, 이에 따라, 암세포 성장 및 생존율이 감소 또는 억제되면서 항암 효과를 나타낸다.

상기 방사선은 X-선, 자외선, 알파 입자, 베타입자 및 감마선, 바람직하게는 감마선일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방사선 치료시 본 발명의 방사선 감수성 증진제를 투여하기 전 또는 후에 공지의 방사선 감수성제 또는 화학요법제를 추가로 투여하는 것이 모두 가능하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, NRF2-표적 억제제인 퀴나크린은 저산소 상태의 대장암 세포에서 대장암 세포의 NRF2 단백질 발현을 억제하고, NRF2에 의해 조절되는 NQO-1과 HO-1 단백질 발현 또한 억제시켜 방사선 민감도를 증가시킴으로써, 대장암 세포의 사멸을 유도한다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용되는 담체"는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적 유효량을 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "약학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 투여되는 억제제의 양이 치료하고자 하는 질환인 암의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감하는 것을 의미한다. 따라서, 약학적 유효량은, (1) 암의 진행 속도를 역전시키거나 (2) 암의 그 이상의 진행을 어느 정도 정지시키게 하는 것을 의미하며, (3) 암과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 양을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 NRF2 유전자의 발현 억제제 또는 NRF2 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명에서, "건강기능식품"이란, 암의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야한다.

본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 식품 조성물은 상술한 억제제를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 NRF2의 발현을 억제하는 NRF2 발현 또는 활성 억제제는, 저산소 상태의 암세포에서 방사선에 대한 민감성을 향상시키는 효과가 우수하므로, 암, 특히 대장암의 암 치료를 위한 감작제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a은 저산소 상태의 암세포에서 NRF2의 전사 활성에 대한 항암제의 영향을 보여준다. 도 1b는 저산소 상태의 암세포에서 NQO1 및 NRF2 타겟 유전자인 HO-1의 발현에 대한 NRF2 억제제의 영향을 보여준다. 도 1c는 저산소 상태의 암세포에서 HIF-1α, Nrf2, NQO1 및 Nrf2 타겟 유전자인 HO-1의 발현에 대한 NRF2 억제제의 영향을 보여준다.
도 2는 퀴나크린의 NRF2 단백질 및 NRF2에 의해 조절되는 NQO1과 HO-1 단백질 발현에 대한 저해 효과를 보여준다.
도 3은 퀴나크린의 대장암세포에 대한 방사선민감도 증가 효과를 보여준다.
도 4는 퀴나크린의 대장암세포 성장 억제 효과를 보여준다.
도 5는 퀴나크린의 대장암세포에 대한 방사선민감도 증가 메커니즘을 보여준다.
도 6은 NRF2 siRNA 및 퀴나크린의 병용 처리에 의한 방사선 민감도 증가 효과를 보여준다.
도 7은 NRF2 siRNA 및 퀴나크린의 병용 처리에 의한 대장암세포 사멸 효과를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 산화환원효소들을 표적으로 하는 약제의 발굴 및 선별

본 발명자들은 저산소 환경에서 암세포의 방사선 저항성에 중요한 영향을 미치는 요소로서, 산화환원효소들의 상위 인자에 해당하는 Nrf2를 표적으로 하는 약제를 발굴하기 위해, 프로모터 어세이(promoter assay), RT-PCR 및 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다.

또한, Sigma chemical library 중 Nrf2의 표적 가능성이 보고된 10 종의 약제를 사용하였다.

간략하게 다음과 같다:

Nrf2에 의해 발현되는 NQO1 유전자를 측정하기 위해 프로모터 어세이를 수행하였다. 이를 위해 NQO1 promoter 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드를 RKO 세포에 transfection 후, 24시간 배양한 다음, 10 종의 약제를 저산소배양기에서 8시간 처리하여 세포를 분해 하였고, 이로부터 추출된 추출물로부터 luciferase를 측정하였다. 또한 Nrf2 및 nrf2의 target proteins 중 NQO1와 HO-1의 유전자 또는 단백질 수준에서의 발현 변화를 관찰하기 위하여 10 종의 약제를 일정 수의 RKO 세포에 1시간 동안 전처리한 후 저산소배양기에서 8시간 동안 세포를 배양하여 배양된 세포로부터 유전자를 분리하였고, NQO1와 HO-1 primer를 사용하여 PCR로 유전자 발현정도를 확인하였다. 또한 단백질을 분리하여 NRF2 및 NQO-1과 HO-1 단백질 발현정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, Nrf2의 프로모터를 활용한 프로모터 어세이를 수행하였으며 약제 선별을 위해 저산소 환경을 이용했을 때, 7-10번 약제가 Nrf2의 전사(transcription) 억제능을 나타냈다.

또한, 단백질 수준에서 약제들의 효능을 분석하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 약제들 중 8번 약제인 퀴나크린(quinacrine)에 의해 Nrf2와 Nrf2 유도 산화환원효소가 효과적으로 억제됨을 관찰하였다.

또한, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 퀴나크린은 암세포의 방사선 저항성 및 방사선 저항성 세포의 형성에 영향을 미치는 HIF-1α의 억제에도 영향이 있음을 관찰하였다.

이에, 상기 결과를 통해 퀴나크린이 저산소 환경 특이적 산화환원효소 제어에 의한 암세포의 방사선 민감도 증진에 효과가 있을 것이라 예측하고, 하기 실시예에 이용하였다.

해당 약제들은 기존 논문을 통해 nrf2 활성에 관계가 있는 것으로 보고된 약제들 선별한 것이며, 그 중 퀴나크린은 과거에 말라리아 약제로서 사용되었으나, 지금은 다른 약제로 대체된 상태이며 현재는 루푸스 치료제로 사용되고 있다.

실시예 2. 퀴나크린에 의한 NRF2 단백질 및 NRF2에 의해 조절되는 NQO-1 및 HO-1 단백질 발현에 대한 저해 효과 확인

본 발명자들은 퀴나크린이 NRF2 단백질 및 NRF2에 의해 조절되는 NQO-1과 HO-1 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

먼저, 대장암 세포주인 RKO 및 HCT116 세포를 T25 플라스크에 접종하고, 퀴나크린를 1시간 동안 전처리한 후 저산소배양기에서 4시간 동안 세포를 배양하였다.

상기 배양된 세포를 RIPA 완충액으로 용해하고, 상기 용해물을 SDS-PAGE에 로딩(loading)하여 전기영동을 실시하였고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane, Pall corporation, USA)으로 전이시킨 후, NRF2 및 NQO-1과 HO-1 단백질 발현을 확인하였다.

2-1. 농도 및 시간에 따른 효과

대장암 세포주인 RKO 및 HCT116 세포에 퀴나크린을 농도별(0, 1, 2, 5 μM)로 처리하고 산소 농도를 달리한 조건에서 각각 4시간 동안 세포를 배양하였다. 또한, 퀴나크린 5 μM을 처리하고 산소농도를 달리한 조건에서 각각 배양시간(0, 1, 2, 4, 8 시간)을 달리하여 세포를 배양하였다. 그 후 웨스턴 블롯팅을 통해 NRF2 및 NQO-1과 HO-1 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2a, 2b, 2c 및 2d에서 나타낸 바와 같이, 저산소 상태(0.5% O₂)하에서의 대장암 세포주인 RKO 및 HCT116 세포 모두에서 NRF2 및 NQO-1과 HO-1 단백질의 발현이 퀴나크린의 농도 및 시간 의존적으로 감소함을 확인하였다.

2-2. 방사선에 따른 효과

방사선에 의한 퀴나크린의 NRF2 저해 효과를 확인하기 위하여 저산소 조건에서 상기 대장암 세포주인 RKO 및 HCT116 세포에 퀴나크린을 5 μM로 처리하고 각각 4시간 동안 배양 후 방사선 조사기로 4 Gy의 방사선을 조사하였다. 그 후 웨스턴 블롯팅을 통해 NRF2 및 NQO-1과 HO-1 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2e와 2f에 나타낸 바와 같이, 방사선 조사된 RKO 및 HCT116 세포 모두에서 NRF2 및 NQO-1과 HO-1 단백질 발현이 퀴나크린에 의해 저해되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 퀴나크린의 대장암세포에 대한 방사선 민감도 증가 효과 확인

본 발명자들은 대장암세포에 대한 퀴나크린의 방사선민감도 증가 효과를 확인하기 위하여 저산소 조건에서 대장암 세포주인 RKO 및 HCT116 세포에 퀴나크린을 농도별(0, 1, 2, 5 uM)로 처리하고 각각 4시간 동안 배양 후 방사선조사기로 방사선(0, 0.5, 1, 2, 4 Gy)을 조사하였다. 그 후 일정수의 세포를 계수하여 10일간 배양한 다음 염색하여 살아있는 세포들을 각각 계수하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 퀴나크린에 의해 방사선민감도가 RKO 및 HCT116 세포 모두에서 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 퀴나크린의 대장암세포 성장 억제 효과 확인

본 발명자들은 대장암 세포에 대한 퀴나크린의 세포성장 억제 효과를 확인하기 위하여 누드마우스에 대장암 세포주인 RKO 세포를 이식한 다음, 일주일 후 퀴나크린을 체중당 각각 150 mg/kg 경구 투여 하였고 방사선(12 Gy)과 병용 처리하여 36일 동안 종양의 크기 및 무게를 관찰하였다. 퀴나크린 또는 방사선과 병용 처리된 누드마우스를 36일 후 육안으로 관찰한 결과를 도 4a에 나타내었고, 종양 부피 변화와 무게 변화를 도 4b 및 4c에 나타내었다.

그 결과, 퀴나크린 투여 후 시간의 흐름에 따라 종양의 부피 및 무게가 감소한 것을 확인하였으며, 방사선(12 Gy)과 병용 처리 시 그 효과는 더욱 현저하였다.

실시예 5. 퀴나크린의 대장암세포에 대한 방사선민감도 증가 메커니즘 확인

본 발명자들은 대장암 세포에 대해 방사선민감도를 증가시키는 퀴나크린의 작용 메커니즘을 확인하기 위하여 저산소 조건에서 대장암 세포주인 RKO 및 HCT116 세포에 퀴나크린 5 μM 및 NRF2 활성제인 tert-Butylhydroquinone (t-BHQ) 50 μM을 병용 처리한 다음 각각 4시간 배양 후 웨스턴 블롯팅을 통해 NRF2 억제 효과를 관찰하였다. 또한 동일조건으로 처리된 RKO 및 HCT116 세포에 방사선조사기로 4 Gy의 방사선을 조사 후 일정수의 세포를 계수하여 10일간 배양한 다음 염색하여 살아있는 세포들을 각각 계수하였다.

그 결과 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, NRF2가 활성화된 RKO 및 HCT116 세포에서는 퀴나크린의 NRF2에 대한 저해 효과가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.

또한, 도 5c 및 5d에 나타낸 바와 같이, NRF2가 활성화된 대장암 세포에서는 퀴나크린의 방사선민감도 역시 현저하게 저하되는 것을 확인하였다.

이러한 결과들은 암성장에 필수적인 요소인 저산소 조건에서 퀴나크린의 대장암성장 저해효과가 NRF2 억제 효과에 의해 나타나는 것임을 보여주는 것이며, 대장암세포에 대한 퀴나크린의 방사선민감도 증가 역시 NRF2 발현 저해 효과에 의한 것임을 의미한다.

실시예 6. NRF2 siRNA 및 퀴나크린의 병용처리에 의해 증가된 대장암세포에 대한 방사선 민감도 증가

본 발명자들은 siNRF2를 이용하여 NRF2를 억제하고 퀴나크린을 병용 처리했을 때 대장암세포에 대한 방사선 민감도 증가 효과를 확인하기 위하여, western blot analysis을 실시하였다.

RKO와 HCT116 대장암 세포주에 100 nM의 siNRF2(서열번호 1; GAGACUACCAUGGUUCCAAdTdT) 및 siRNA 대조군(siCont)을 lipofectamine 2000을 이용하여 transfection하였다. 48시간 경과 후 5 μM의 퀴나크린을 1시간 동안 처치한 후 저산소 환경에 4 시간 동안 노출하여, NRF2의 발현 변화 뿐만 아니라 암세포 사멸의 증가와 직접적으로 관련된 cleaved PARP의 발현 변화를 western blot analysis으로 확인하였다.

그 결과, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, NRF2가 활성화된 대장암 세포에서 siRNA를 통한 NRF2 억제 및 퀴나크린의 병용처리에 의하여, siNRF2 또는 퀴나크린 단독 처리에 비해 방사선 민감도가 급격히 향상되어, cleaved PARP의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 7. NRF2 siRNA 및 퀴나크린의 병용처리에 의해 증가된 대장암세포 사멸

본 발명자들은 siNRF2를 이용하여 NRF2를 억제하였을 때 퀴나크린의 병용 처리 효과를 확인하기 위하여, western blot analysis 및 Clonogenic survivalassay를 실시하였다.

RKO와 HCT116 대장암세포주에 100 nM의 siNRF2(서열번호 1; GAGACUACCAUGGUUCCAAdTdT)를 lipofectamine 2000을 이용하여 transfection하였다. 48시간 경과 후 5 μM의 퀴나크린을 1시간 동안 처치한 후 저산소 환경에 4 시간동안 노출하여 NRF2의 발현 변화를 western blot analysis으로 확인하였다.

그 결과, 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, NRF2가 활성화된 대장암 세포에서 siRNA를 통한 NRF2 억제 및 퀴나크린의 병용처리에 의하여 NRF2 단백질 발현이 현저하게 억제된 것을 확인하였다.

또한, Clonogenic survivalassay는 transfection 방법과 동일하게 실시하였으며, 저산소 환경에 세포를 4시간 동안 노출한 후 5 μM의 퀴나크린을 1시간 동안 처치하고, 다시 저산소 환경에 4시간 동안 노출하고 PBS로 3회 세척한 후 배양하였다. 14일 경과 후 0.1% crystal violet (w/v methanol)에 염색하여 colony 숫자를 개수하였다. siNRF2의 대조군으로 상업용 siControl을 transfection하여 사용하였다.

그 결과, 도 7c 및 7d에 나타낸 바와 같이, NRF2가 활성화된 대장암 세포에서 siRNA를 통한 NRF2 억제 및 퀴나크린의 병용처리에 의하여 암세포의 생존율이 현저하게 저하되는 것을 확인하였다.

이상의 실험 결과들을 통하여, 저산소 조건에서 퀴나크린 및/또는 siNRF2에 의한 NRF2 발현을 억제하는 효과로 인해 대장암세포의 성장을 저해하며, 방사선에 대한 민감도를 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있음이 확인되었다.

<110> Inha University Research and Business Foundation <120> A Composition for Increasing Radiosensitivity of Cancer Cells <130> IHU1-215p-1 <150> KR 10-2017-0025592 <151> 2017-02-27 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siNRF2 <400> 1 gagacuacca ugguuccaad tdt 23

Claims (10)

1. NRF2(Nuclear factor erythroid 2-related factor, Genbank numberQ16236) 유전자의 발현 억제제; 또는 NRF2 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암세포의 방사선 치료에 대한 감수성 증진용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 발현 억제제는 NRF2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 siRNA는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 활성 억제제는 NRF2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 화합물은 퀴나크린 (quinacrine); ML385 (Small Molecule Inhibitor); 루테오린(luteolin); 알카로이드 트리고넬린 (alkaloid trigonelline); 부루사톨(brusatol); 크리신 (chrysin); 알데스루킨 (Aldesleukin); 알렘투쯔맙 (Alemtuzumab); 알리트레티노인 (alitretinoin); 알로푸리놀 (allopurinol); 알트레타민 (altretamine); 아미포스틴 (amifostine); 아나스트로졸 (anastrozole); 알세닉 트리옥사이드 (arsenic trioxide); 아스파라기나제 (Asparaginase); 생 BCG (BCG Live); 벡사로텐 캡슐 (bexarotene capsules); 벡사로텐 겔 (bexarotene gel); 블레오마이신 (bleomycin); 부설판 정맥내 투여제 (busulfan intravenous); 부설판 경구 투여제 (busulfan oral); 칼루스테론 (calusterone); 카페시타빈 (capecitabine); 카보플라틴 (carboplatin); 카무스틴 (carmustine); 폴리페프로산 (Polifeprosan); 셀레코시브 (celecoxib); 클로람부실 (chlorambucil); 시스플라틴 (cisplatin); 클라드리빈 (cladribine); 시클로포스파미드 (cyclophosphamide); 시타라빈 (cytarabine); 시타라빈 리포소말 (cytarabine liposomal); 다카르바진 (dacarbazine); 닥티노마이신 (dactinomycin); 악티노마이신 (actinomycin) D; 다베포에틴 알파 (Darbepoetin alfa); 다우노루비신 리포소말 (daunorubicin liposomal); 다우노루비신 (daunorubicin), 다우노마이신 (daunomycin); 데니루킨 디프티톡스 (Denileukin diftitox), 덱스라족산 (dexrazoxane); 도세탁셀 (docetaxel); 독소루비신 (doxorubicin); 옥소루비신 리포소말 (doxorubicin liposomal); 드로모스타노론 프로피오네이트 (Dromostanolone propionate); 엘리엇 비 용액 (Elliott's B Solution); 에피루비신 (epirubicin); 에포에틴 알파 에스트라무스틴 (Epoetin alfaestramustine); 에토포사이드 포스페이트 (etoposide phosphate); 에토포사이드 (etoposide) (VP-16); 엑세메스탄 (exemestane); 필그라스틴 (Filgrastim); 플록스우리딘 (floxuridine, 동맥내 투여); 플루다라빈 (fludarabine); 플루오로우라실 (fluorouracil) (5-FU); 풀베스트란트 (fulvestrant); 젬투쯔맙 오조가미신 (gemtuzumab ozogamicin); 글리벡 (gleevec); 고세렐린 아세테이트 (goserelin acetate); 히드록시우레아 (hydroxyurea); 이브리투모맙 티욱세탄 (Ibritumomab Tiuxetan); 이다루비신 (idarubicin); 이포스프아미드 (ifosfamide); 이마티닙 메실레이트 (imatinib mesylate); 인터페론 알파 (Interferon alfa)-2a; 인터페론 알파 (Interferon alfa)-2b; 이리노테칸 (irinotecan); 레트로졸 (letrozole); 루코보린 (leucovorin); 레바미솔(levamisole); 로무스틴 (lomustine) (CCNU); 메클로레타민 (meclorethamine) (질소 머스타드); 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate); 멜파란 (melphalan) (L-PAM); 메르캅토푸린 (mercaptopurine) (6-MP); 메스나 (mesna); 메토트렉세이트 (methotrexate); 메톡스살렌 (methoxsalen); 미토마이신 (mitomycin) C; 미토탄 (mitotane); 미톡산트론 (mitoxantrone); 난드롤론 펜프로피오네이트 (nandrolone phenpropionate); 노페투모맙 (Nofetumomab); LOddC; 오프레베킨 (Oprelvekin); 옥살리플라틴 (oxaliplatin); 팍클리탁셀 (paclitaxel); 파미드로네이트 (pamidronate); 페가데마제 (pegademase); 페가스파가제 (Pegaspargase); 페그필그라스팀 (Pegfilgrastim); 펜토스타틴 (pentostatin); 피포브로만 (pipobroman); 플리카마이신 (plicamycin); 미트라마이신 (mithramycin); 폴피머 소듐 (porfimer sodium); 프로카르바진 (procarbazine); 라스부리카세 (Rasburicase); 리툭시맙 (Rituximab); 사르그라모스틴 (Sargramostim); 스트렙토조신 (streptozocin); 수라페닙 (surafenib); 탈부비딘 (talbuvidine) (LDT); 탈크; 타목시펜 (tamoxifen); 타르세바 (tarceva); 테모졸로마이드 (temozolomide); 테니포사이드 (teniposide) (VM-26); 테스토락톤 (testolactone); 티오구아닌 (thioguanine) (6-TG); 티오테파 (thiotepa); 토포테칸 (topotecan); 토레미펜 (toremifene); 토시투모맙 (Tositumomab); 트라스투쯔맙 (Trastuzumab); 트레티노인 (tretinoin) (ATRA); 우라실 머스타드 (uracil Mustard);발루비신 (valrubicin); 발토르시타빈 (valtorcitabine) (monoval LDC); 빈블라스틴 (vinblastine); 비노렐빈 (vinorelbine); 및 졸레드로네이트 (zoledronate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 항암제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 암은 대장암(colon cancer), 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterinesarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 난관암(fallopian tubecarcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor),요도암(urethralcancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 NRF2 유전자의 발현 억제제; 또는 NRF2 단백질의 활성 억제제는, NQO1(NAD(P)H: quinoneoxidoreductase 1, Genbank numberP15559) 유전자 및 HO-1(Heme oxygenase-1, Genbank numberP09601) 유전자의 발현; 또는 이의 단백질의 활성을 억제하여 방사선에 대한 감수성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 NRF2 유전자의 발현 억제제; 및 NRF2 단백질의 활성 억제제를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
9. NRF2(Nuclear factor erythroid 2-related factor, Genbank numberQ16236) 유전자의 발현 억제제; 또는 NRF2 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
10. NRF2(Nuclear factor erythroid 2-related factor, Genbank numberQ16236) 유전자의 발현 억제제; 또는 NRF2 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 전이 억제용 약학적 조성물.

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