KR101668105B1 - miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물 - Google Patents

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이형철
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박헌주
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인하대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 miR-770-5p는 방사선 조사시 암세포의 생존도를 감소시키며 암세포 자살을 유도하는 등 우수한 방사선 민감성 증진 효과 및 항암 치료 보조 효과가 우수하므로, 방사선 민감성 증진제 및 항암 치료 보조제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물{Composition for enhancing radiation sensitivity comprising miR-770-5p}
본 발명은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.
암의 치료법은 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있는데, 현재 국내에서 방사선치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세에 있어 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.
방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법으로 알려져 있으나, 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량의 방사선 치료시 정상조직의 손상 등이 방사선치료의 효율을 저하시키는 문제점으로 지적되어 왔다. 따라서,방사선 치료의 효율을 증진시키기 위한 방사선 치료 민감제에 대한 연구가 시도되고 있으나, 현재까지 보고된 방사선 치료 민감제는 주로 항암제들로서, 예를 들어 탁솔(Taxol)과 시스플라틴(cisplatin) 등이 보고되어 있다.
또한, 항암제로서의 성질은 지니지 않고 방사선 치료에만 사용되는 방사선 치료 효과 증진제로는 티라파자민(tirapazamine)이 있으나 저산소증의 종양세포에만 효과가 있으며, 저산소상태 특유의 종양 내부 압력 때문에 종양 조직 내부로의 약물전달이 미흡하여 임상적 방사선 치료에서 효과가 미약하다고 알려져 있다.
그러나, 상기와 같이 방사선치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들을 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료시 나타나는 부작용, 즉, 방사선 치료부위의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있다. 특히, 중추신경계의 암은 성상세포(astrocyte)와 희돌기세포(oligodendrocyte) 같은 신경교(glia)를 포함한 다른 세포 계열로부터 발생한다. 성상세포종(astrocytic tumor, astrocytomas)은 인접한 미세환경과 어떻게 상호작용을 하는가에 따라 미만성 성상세포종(diffuse astrocytoma)와 국소성 성상세포종(localized astrocytoma)으로 나눌 수 있다. 국소성 성상세포종은 주위의 미세환경과 경계가 뚜렷한 증식과 제한적인 침윤 잠재성을 가지는 반면에 종양 등급(tumor grade)과는 상관없이 미만성 성상세포종은 peritumoral margin과 주된 종양 형성부위로부터 먼 곳에서 세포침윤의 특성을 가지고 있다. 미만성 성상세포종(diffuse astrocytoma)은 astrocytoma(World Health Organization[WHO] grade), anaplastic astrocytoma(WHO grade), glioblastoma multiform(GBM, WHO grade)의 세 가지로 분류된다. 세 가지 등급의 미만성 성상세포종은 침윤 특성을 가지고 있으며 특히 GBM(신경교종)은 더 높은 증식률, 괴사와 저산소증, 혈관형성, 뇌의 지지구조에 높은 침윤 및 암 재발율이 높은 특성을 가지고 있고, 다른 조직으로의 전이가 용이하기 때문에 이들의 암 치료능을 높이기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만, 화학치료만으로는 한계가 있으며, 방사선 치료시에도 암세포가 방사선 저항성을 획득하게 되어 제대로 치료되지 않은 문제점이 있었다.
또한, 뇌종양 치료에 있어 수술적 치료 및 항암제 치료와 더불어 방사선 치료는 뇌종양 치료에 있어 중요한 치료법이다. 뇌종양 중 WHO grade인 GBM 뇌종양 환자는 수술적 치료, 항암제 치료, 방사선 치료 또는 복합적인 치료 (e.g. 방사선 치료와 항암제 치료 또는 수술적 치료와 방사선 치료)에도 불구하고 예후 (암 재발)가 좋지 않으며 평균 생존율이 1년이며 5년 생존율은 5% 미만이다. 뇌종양 치료법 중 방사선 요법은 방사선에 의한 DNA 손상에 대하여 세포는 세포 주기를 지연 (DNA damage checkpoint)시키거나 세포사멸 (apoptosis)을 유도하여 비정상 세포를 제거하는 방법이다. 그러나 방사선 요법의 문제점은 암세포의 내재적인 방사선 저항성과 방사선 치료에 따른 내성증가로 인해서 방사선 저항성 암세포들이 암의 재발을 유발시키며 방사선 저항성 세포는 항암제에도 내성을 가진다.
따라서, 방사선에 대해서 내재적인 방사선 저항성을 가진 암세포의 방사선 민감성을 증진시키면서 부작용은 최소화되어 방사선 요법을 최적화할 수 있는 방사선 민감성 증진제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 작은 RNA(small RNA: 이하 ＂sRNA"라 칭함)는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17 내지 25 뉴클레오티드(nucleotide: 이하 "nt"라 칭함) 정도 길이의 리보핵산을 말한다. sRNA는 그 생성되는 방식에 따라 크게 마이크로 RNA(microRNA: 이하 ＂miRNA"라 칭함)와 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: 이하 ＂siRNA"라 칭함)으로 분류된다. miRNA는 부분적으로 이중나선을 이루는 헤어핀 RNA(hairpin RNA)로부터 생성되며, siRNA는 긴 이중가닥 RNA(double strand RNA: 이하 ＂dsRNA"라 칭함)로부터 유래한다. 일반적으로 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 하는 sRNA는 miRNA이며, 실험 기술적으로 특정 유전자의 발현을 조절하는데 사용되는 sRNA는 siRNA로 분류된다.
miRNA는 19-25 nt 길이의 단일 가닥 RNA(single strand RNA: 이하 ＂ssRNA"라 칭함) 분자로서 내재적(endogenous) 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)(Bartel, D.P., Cell 116:281-297, 2004; Kim,V.N., Mol. Cells. 19:1-15, 2005)에 의해 생성된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTRs)에 상보적 으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도함으로써 표적 유전자를 억제한다.
miRNA는 발전(development), 분화, 증식, 세포사멸 및 신진대사(metabolism)와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 한다. 이러한 과정들은 가끔 종양형성 동안 교란되며, 많은 miRNA들이 인간 암에서 낮게 유지되는 것으로 볼 때, miRNA는 종양형성에서 역할을 하는 것으로 보인다. miRNA와 암 사이의 강한 연관이 최근 증명되어 암 생물학 분야에서 새로운 연구 분야로 떠오르고 있으며, miRNA의 발현은 발달과 세포 분화 과정 중에 극적으로 변화하고, miRNA의 프로파일(profiling)은 발달 계통과 질병 단계에서 믿을만한 결과를 나타낸바 있다. miRNA 생합성은 RNA 폴리머라제 Ⅱ에 의한 전사를 통해 개시된다.
이에 본 발명자들은 새로운 방사선 민감성 증진용 조성물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, miR-770-5p 처리 후 방사선 조사시 암세포의 생존도를 감소시키며 암세포 자살을 유도하는 등 우수한 방사선 민감성 증진 효과 및 항암 치료 보조 효과를 가지고 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 치료 보조용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 치료 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 치료 보조용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 miR-770-5p는 방사선 조사시 암세포의 생존도를 감소시키며 암세포 자살을 유도하는 등 우수한 방사선 민감성 증진 효과 및 항암 치료 보조 효과가 우수하므로, 방사선 민감성 증진제 및 항암 치료 보조제로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 miR-770-5p를 주입한 MCF7 및 A549 세포주와 대조군의 상대적인 세포수 및 형성된 집락의 개수를 비교하여 나타낸 도이다.
도 2 본 발명의 miR-770-5p를 주입한 MCF7 및 A549 세포주의 트리판 블루 염색 분석 및 c-PARP 발현 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 miR-770-5p를 주입한 MCF7 및 A549 세포주에 방사선을 처리한 후 형성된 집락의 개수를 나타낸 도이다.
본 발명은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.
본 발명의 miR-770-5p는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있으며, 이는 하기와 같다.
[서열번호 1]
UCCAGUACCACGUGUCAGGGCCA
상기 miR-770-5p는 작용성 등가물을 포함하며, 작용성 등가물은 miR-770-5p의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.
sRNA(small RNA)는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17 내지 25 뉴클레오티드(nucleotide) 정도 길이의 리보핵산으로, 그 생성되는 방식에 따라 크게 miRNA(microRNA)와 siRNA(small interfering RNA)로 분류된다. 이 중 miRNA(microRNA)는 발전, 분화, 증식, 세포사멸 및 신진대사와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하며, 이러한 과정들은 가끔 교란되어 종양 형성에 영향을 미친다.
본 발명의 miR-770-5p는 직접 화학적으로 합성하거나, 인비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.
암세포 사멸 경로는 암세포 자멸사(apoptosis, programmed cell death type Ⅰ) 및 암세포 자가소화(autophagy, programmed cell death type Ⅱ) 경로로 분류된다. 본 발명에 따른 miR-770-5p는 암세포 자멸사에 관여하여 방사선 조사시 암세포 자살을 유도하며 암세포의 생존도 및 방사선 저항성을 감소시켜 방사선 민감성 증진 효과를 가진다.
본 발명의 "방사선 저항성"은 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선 조사에도 불구하고 비정상 세포를 사멸시키지 못하거나, 혹은 사멸시키는 정도가 미비한 것을 의미한다. 또는, 방사선 치료 시, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 질병 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 치료 효과가 상실되는 것을 말한다.
본 발명의 "방사선 민감성 증진"은 방사선 치료에 있어서 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료 효율을 상승시킬 수 있는데, 특히 암 치료 시 병용할 경우 종양세포의 방사선 민감성이 증진되어 종양세포에 대한 방사선의 살상 효과 및 증식 억제 효과를 낼 수 있다.
본 발명의 "방사선 치료"는 암세포에 본 발명의 조성물을 투여한 뒤 방사선을 조사하는 것을 포함하며, 상기 "방사선 조사"는 이온화 방사선, 특히, 통상적으로 사용되는 선형 가속기 (linear accelerators) 또는 방사핵종 (radionuclides)에 의해 방사되는 감마 방사선을 의미할 수 있다. 방사핵종에 의한 방사선 조사는 외부적 또는 내부적으로 이루어질 수 있으며, 투여되는 siRNA 또는 항바이러스제의 양, 방사선 조사량 및 방사선 조사량의 간헐성은 종양의 종류, 위치, 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 변수들에 의해 달라질 수 있다.
또한, 본 발명의 방사선 조사를 위한 기술로는 근접치료, 방사선 핵종치료, 외부 빔 방사선 요법 (external beam radiation therapy), 온열치료 (냉동절제 치료 및 고열 치료를 포함), 방사선 수술, 하전입자 방사선 치료 (charged-particle radiotherapy), 중성자 방사선 요법 및 광역동 치료 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 방사선 민감성 증진 및 방사선 치료는 암이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용 가능하며, 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 고양이 등의 가축을 포함한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 miR-770-5p는 방사선 민감성 증진 효과가 우수하므로, 방사선 민감성 증진에 유용한 의약품 또는 의약외품으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 치료 보조용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.
상기 miR-770-5p는 방사선 민감성을 증진시키므로 방사선을 이용하는 항암 치료에 사용될 수 있으며, 항암 치료의 효율을 높일 수 있으므로 항암 치료 보조에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 암은 제한이 없으며, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 구강암, 구강인두암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 유방암, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 간암, 대장암 또는 뇌종양일 수 있고, 바람직하게는 유방암 또는 폐암일 수 있다.
상기 유방암은 유방 관상피내암, 침윤성 관암종, 침윤성 소엽암,점액성 악종, 수질성 악종, 유두상 악종 및 관상 악종 등을 포함한다.
상기 폐암은 소세포폐암, 비소세포폐암, 편평상피세포암, 선암 및 대세포암 등을 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 miR-770-5p과 함께 방사선 민감성 증진 또는 항암 치료 보조 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 방사선 민감성 증진 또는 항암 치료 보조를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 방사선 민감성 증진 또는 항암 치료 보조를 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물을 외약외품 조성물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서, "건강기능식품"이란, 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야 한다.
본 발명의 조성물은 방사선 민감성 증진 또는 항암 치료 보조를 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 miR-770-5p를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 miR-770-5p를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 miR-770-5p는 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 배양 및 형질 전환
인간 유방암 세포주(MCF7) 및 폐암 세포주(A549)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin, Streptomycin)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지 또는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 항온 세포 배양기에서 배양하였다.
그 후 서열번호 1의 miR-770-5p를 각각의 세포주에 주입한 후 과발현시켜 실험군을 제조하고, miR-770-5p를 주입하지 않은 군을 대조군(miR-control)으로 하였으며, 대조군의 서열은 5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU(dTdT)-3'로 하였다.
실험예 1. 세포수 측정 및 집락형성 분석
상기 실시예 1에서 miR-770-5p를 주입한 각각의 세포주를 채취하여 1일, 2일 및 3일째의 상대적인 세포수를 대조군과 비교하였으며, 그 결과를 도 1A 및 1B에 나타내었다.
도 1A 및 1B에 나타낸 바와 같이, miR-770-5p를 주입한 경우 대조군에 비해 상대적인 세포수가 현저히 감소함을 확인하였다.
또한, 집락형성 분석법(Clonogenic assays)을 이용하여 암세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 miR-770-5p를 주입한 각각의 세포주를 육안으로 세포집락이 확인될 때까지 약 8일 동안 배양하였다. 형성된 집락을 0.5%의 crystal violet으로 염색하고, 적어도 50개 이상의 세포를 포함하고 있는 집락의 개수를 세어 생존 분획을 계산하였으며, 그 결과를 도 1C에 나타내었다.
도 1C에 나타낸 바와 같이, miR-770-5p를 주입한 경우 대조군에 비해 형성되는 집락의 개수가 현저히 감소함을 확인하였다.
실험예 2. 암세포 사멸 증가여부 확인
miR-770-5p 과발현에 의한 암세포 사멸 여부를 확인하기 위하여, 트리판 블루 염색법 및 c-PARP 발현 여부 분석을 수행하였다. 먼저 상기 실시예 1에서 miR-770-5p를 주입한 각각의 세포주를 채취하여 1일, 2일, 3일 및 4일째의 세포사멸 정도를 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 대조군과 비교하였으며, 그 결과를 도 2A 및 2B에 나타내었다.
도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, miR-770-5p를 주입한 경우 대조군에 비해 세포사멸 정도가 현저히 증가함을 확인하였다.
또한, 상기 유방암 세포주(MCF7) 및 폐암 세포주(A549)에 miR-770-5p를 각각 0, 10, 20 및 100 nM씩 주입한 후 72시간 뒤 웨스턴블롯팅을 수행하여 Caspase-3의 지표물질인 c-PARP(c-poly(ADP-ribose) polymerase) 및 Actin의 발현여부를 측정하였으며, 이를 도 2C에 나타내었다.
도 2C에 나타낸 바와 같이, miR-770-5p를 주입한 경우 농도의존적으로 c-PARP의 발현이 증가함을 확인하였다. 이는 세포 자살에 의해 암세포의 세포사멸 현상이 증가되었음을 나타낸다.
실험예 3. 집락형성 분석을 통한 방사선 민감성 증진 효과 확인
상기 실시예 1에서 miR-770-5p를 주입한 각각의 세포주에 0 Gy, 2 Gy 및 4 Gy의 선량률로 방사선을 처리하였으며, 육안으로 세포집락이 확인될 때까지 약 8일 동안 배양하였다. 형성된 집락을 0.5%의 crystal violet으로 염색하고, 적어도 50개 이상의 세포를 포함하고 있는 집락의 개수를 세어 생존 분획을 계산하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, miR-770-5p를 주입한 경우 대조군에 비해 형성되는 집락의 개수가 현저히 감소함을 확인하였다. 이는 miR-770-5p 주입한 세포주의 경우 방사선 민감성이 증가되었음을 나타낸다.
이하 본 발명에 따른 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1-1. 산제의 제조
miR-770-5p 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
miR-770-5p 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
miR-770-5p 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
miR-770-5p 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
miR-770-5p 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 식품 조성물의 제조
2-1. 건강식품의 제조
miR-770-5p 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 g
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 g
비타민 C 10 mg
비오틴 10 g
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 g
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2-2. 건강음료의 제조
miR-770-5p 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Composition for enhancing radiation sensitivity comprising miR-770-5p <130> 1-161P <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> miR-770-5p <400> 1 uccaguacca cgugucaggg cca 23

Claims (6)

  1. miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 miR-770-5p는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 방사선 민감성 증진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 자살을 유도하는 것을 특징으로 하는, 방사선 민감성 증진용 조성물.
  4. miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 치료 보조용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 구강암, 구강인두암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 유방암, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 간암, 대장암 또는 뇌종양인 것을 특징으로 하는 항암 치료 보조용 약학적 조성물.
  6. miR-770-5p를 유효성분으로 포함하는 항암제 활성 증진을 위한 항암 치료 보조용 식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2010054386A2 (en) * 2008-11-10 2010-05-14 Battelle Memorial Institute Methods, compositions, and devices utilizing microrna to determine physiological conditions
KR101222057B1 (ko) * 2011-02-11 2013-01-14 경희대학교 산학협력단 ｍｉｃｒｏＲＮＡ을 유효성분으로 함유하는 방사선 민감성 증진용 조성물

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Non-Patent Citations (1)

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Title
Oncol Lett. 2013 May;5(5):1639-1642. Epub 2013 Mar 12. *

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