KR20010113632A - 폴리(ａｄｐ-리보오스) 글리코하이드롤라제 억제제를포함하는 약학적 조성물 및 그 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, PARG 억제제라고도 알려져 있는 폴리(ADP-리보오스) 글루코하이드로라제를 포함하는 약학적 조성물과, 자유 라디칼에 의해 유발된 세포 에너지 소모, 세포 손상, 또는 세포 죽음을 억제하거나 감소시키기 위해 이와 동일한 것을 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 글루코스 유도체; 리그닌 글리코시드; 갈로타닌과 엘라기타닌을 포함하는 가수분해되는 타닌; 아데노시드 유도체; 6,9-디아미노-2-에톡시아크리딘 락테이트 단일수화물을 포함하는 아크리딘 유도체; 티로론 R 10.556, 다우노마이신 또는 다우노루비신 염산염을 포함하는 티로론 유사체; 엘립티신; 프로플라빈; 및 다른 PARG 억제제와 같은 폴리(ADP-리보오스) 글리코하이드로라제를 포함하는 약학적 조성물과, 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모 및/또는 괴사, 세포자멸사, 또는 이들의 결합으로 인한 세포 손상 또는 세포 죽음으로부터 발생하는 조직 손상으로 인한 질병이나 상태를 치료 또는 예방하기 위한 상기 물질들의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

폴리(ＡＤＰ-리보오스) 글리코하이드롤라제 억제제를 포함하는 약학적 조성물 및 그 사용 방법{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING POLY(ADP-RIBOSE) GLYCOHYDROLASE INHIBITORS AND METHODS OF USING THE SAME}

현재 생물 의학 연구의 주요 중심은 세포 사멸의 메카니즘(mechanism)에 있는데, 이는 이러한 작용들을 조절하는 특정한 새로운 치료제가 끊임없이 발전하기 때문이다. 세포의 사멸은 일반적으로 세포자멸사와 괴사의 2가지 종류로 분류된다. 프로그램화된 세포 사멸(programmed cell death)으로 보통 불리는 세포자멸사는, 발생(development)에 있어서 특히 잘 특징지어져 있는데 반해, 괴사는 극히 해로운 손상에 대한 초기 반응으로서 보다 두드러진다. 프로그램화된 세포 사멸은 유전자적으로 조절된 과정으로, 각각의 세포에서 생리학적 자극의 결과로 일어나고, 일반적으로 세포막의 파동운동(ruffling), 핵과 세포질 농축, DNA의 뉴클레오솜 내 분열(intranucleosomal cleavage), 및 심각한 염증 없이 세포의 최종 식세포작용(phagocytosis)을 수반한다. 괴사는 보다 빠르고 심각한 과정으로, 병적인 상해에 대한 반응으로 세포군에서 발생한다. 이러한 형태의 세포 사멸은, 미토콘드리아와 소포체의 팽창에 이은 막의 손상과 DNA의 무작위적 파괴 및 다른 거대분자가 실질적인 염증성 반응에 도달하는 것을 특징으로 한다. 비록 광범위한 세포 사멸에 관한 문헌들이, 세포 사멸의 모든 예들은 세포자멸사 또는 괴사 중 하나로 분류될 수 있다고 제안하고 있지만, 양쪽 메카니즘의 양상은 다양한 세포 사멸의 예로 존재한다. 한 가지 예는 뇌졸중(stroke)과 일부 신경퇴행성질병(neurodegenerative disorder)에 이은 흥분신경독성(excitotoxicity)으로, 흥분 신경전달체 글루타메이트(excitatory neurotransmitter glutamate)가 국소적으로 높은 농도 축적됨으로써 적어도 부분적으로 신경 세포의 사멸이 일어난다. 저산소증(hypoxia)에 이어 발생하는 세포 사멸의 즉각적인 현상은 괴사와 상당히 유사하지만, 손상의 전달은 전형적인 세포자멸사의 특징을 많이 지닌 2차적 장애(lesion)를 일으킨다. 앞으로 신경 세포 사멸에 대한 합리적인 치료 접근 방법을 개발하기 위해, 연구원들은 아마도 세포자멸사와 괴사의 극단 사이의 연속체 어딘가에 유일한 위치를 점유하면서 개별적인 질병의 예들에 주의를 기울여야 할 것이다.

폴리(ADP-리보오스) 신테타제(synthetase) 또는 폴리(ADP-리보오스) 트랜스퍼라제(transferase)(PADRT)로도 알려져 있는, DNA 복구 효소인 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라제(polymerase)(PARP)(EC 2.4.2.30)가, 세포 사멸의 상기 연속체에 있어 주요 작용제로 등장했다. 카스파제-3(caspase-3)에 의한 PARP의 절단이 세포자멸사의 분명한 특징이고, PARP는 또한 전형적인 괴사 세포 사멸에서도 중추의 역할을 한다. 핵 PARP는 DNA 가닥의 절단부위(break)에 의해 선택적으로 활성화되어, 길고 분기된(branched) 폴리 (ADP-리보오스)(PAR) 사슬이 그 기질인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)로부터 다양한 핵단백질, 가장 현저하게는 PARP 자신으로 첨가되도록 촉매한다. 일반적으로 괴사 자극으로부터 발생하는 것과 같은 광범위한 DNA 손상은, 세포의 NAD 레벨을 빠르게 소모시키는 PARP 활성을 상당히 증가시킨다. 에너지 대사에서 중요한 조효소(co-enzyme)인 NAD의 소모는 보다 낮은 ATP생성을 일으킨다. 또한, 세포는 NAD를 재합성하기 위해 ATP를 소비하고, 이러한 에너지 위기가 세포 사멸에 이르게 한다. 과다한 DNA 손상에 이어 발생하는 PARP에 의한 세포 사멸의 개념은, 선택적인 PARP 억제제에 의한 세포 사멸의 방지와 PARP 유전자가 결실된 쥐에서의 보호를 보여주는 많은 연구에 의해 지지된다. 다양한 질병의 동물 모델에서 PARP 억제에 의해 제공되는 극적인 보호는 새로운 치료의 실체가 될 수 있다.

폴리(ADP-리보실)화 반응에는, 염색질의 풀림(decondensation), DNA 복제, DNA 복구, 유전자 발현, 악성 형질전환(malignant transformation), 세포의 분화, 및 세포자멸사와 같은 다양한 생리학적 반응들과 관련된다. 핵 PARP 활성은 신체에 두루 풍부하고, 특히 뇌, 면역 시스템 및 생식세포(germ line cell)에 풍부하다. PARP 효소는 3개의 주요 도메인으로 나뉘어질 수 있다. 46 kD N-말단부는, 2개의 아연 핑거 모티프(zinc finger motif)와 핵의 위치결정 신호(nuclear localization signal)를 포함하는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 이 부분은 제 1과 제 2 아연 핑거를 통해 서열에 관계없이 이중- 및 단일-가닥의 DNA 절단부위(break) 모두를 각각 인식한다. 22 kD 중앙 자동보정 도메인(central automodification domain)은 자가 폴리(ADP-리보실)화 반응[self-poly(ADP-ribosyl)ation]의 타겟으로 생각되는 15개의 보존성이 큰 글루타메이트 잔기(highly conserved glutamate residues)를 포함하고, 54 kD C-말단 부위는 NAD 결합 자리와 PAR을 합성하는 촉매 영역(catalytic domain) 모두를 포함한다.

PARP가 ADP-리보오스 유닛을 ADP-리보오스 유닛 그 자신과, 히스톤 및 DNA토포아이소머라제 I, II(DNA topoisomerase I, II)를 포함하는 다른 핵단백질 모두로 전달 및 중합하는 반응을 촉매함에 있어서, PARP가 DNA의 절단부위에 결합한다면, 그 활성이 500배 증가한다. PARP 자신이 생체내의 주요 폴리(ADP-리보실)화된 단백질이다. PARP의 N-말단부가 DNA 가닥의 절단부위에 결합함으로써 어떻게 촉매 영역을 알로스테릭하게(allosterically) 활성화시키는지는 명확하지 않으나, PAR 중합체의 개시(initiation) 및 뒤이은 신장(elongation)은 아마도 단백질 이량체화와 같은 분자간 메카니즘에 의해 진행된다. 개시 후에, PARP는 신장과 분기(branching) 반응을 촉매하여, 고도로 분기되고 복잡한 구조의 200개 이상의 ADP-리보오스 잔기를, 구조적으로 핵산과 유사한 대형 호모중합체에 합성시킨다.

단백질의 폴리 (ADP-리보실)화 반응은 일반적으로 그 단백질의 억제를 가져오고 염색질 단백질이 DNA로부터 분리되도록 할 수 있다. 예컨대, 히스톤의 폴리 (ADP-리보실)화 반응은 염색질 구조를 풀고, 반면에 뒤이은 상기 중합체의 분해는 염색질을 응축된 형태로 회복시킨다. 염색질의 풀림은 복제 기점과 전사 개시 부위뿐만 아니라 손상된 부위에서도 DNA 반응을 매개할 것이다. 한 가설은 PARP가 절단된 DNA의 부적절한 상동 재조합을 방지함으로써 염색체의 완전성(integrity)을 돕는다는 것이다. PARP가 DNA 말단에 결합하면 DNA 말단이 유전적 재조합 기구(genetic recombination machinery)와 결합하는 것이 방해되며, 음(-)으로 하전된 PAR은 다른 DNA 분자를 정전기적으로 밀쳐낼 것이다. 자가-폴리 (ADP-리보실)화 반응은, 음으로 하전된 효소-결합 ADP-리보오스 중합체와 DNA간의 정전기적 반발을 통해 PARP를 불활성화시키며, DNA로부터 PARP의 방출은 DNA 복구 효소가 손상부위에 접근하는 것을 가능하게 한다 (도 1).

대량의 DNA 손상에 반응하여 합성된 PAR은 폴리 (ADP-리보오스) 글리코하이드롤라제(PARG) 효소에 의해 리보오스-리보오스 결합이 빠르게 가수분해되어 자유 ADP-리보오스로 전환되기 때문에 거의 1분 정도의 짧은 반감기를 갖는다. PAR 합성에 대한 PARG의 빠른 반응은 PAR 분해 또한 DNA 손상에 대한 중요한 핵반응임을 나타낸다. 따라서, 여기서 보여지는 결과는, PARG에 의한 PAR의 자유 ADP-리보오스로의 전환이 PARP에 부가적인 기질 (ADP-리보오스)을 제공하고, 폴리 (ADP-리보실)화 반응에 부가적인 타겟 (PARG가 ADP-리보오스 유닛을 절단시키는 부위)을 제공함으로써 PARP 활성을 더욱 더 촉진시킬 수 있음을 나타낸다. 그로 인한 PARG의 활성화는 PARP에 의한 세포 에너지의 소모, 여기서 기재한 바와 같이 PARP 활성과 결합된 질병 및 질환과 연관된 세포의 손상과 사멸의 증가를 촉진한다. 비록 이것이 작용의 양태라고 믿어지지만, 다른 작용 메카니즘이, 여기에 기재된 질환이나 질병을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 포함하여 여기에 기재된 PARG 억제제의 유용성을 담당하고 있거나 그 유용성에 기여할 수도 있다. 최근, PARG를 인코딩(encoding)하는 소(bovine)의 cDNA가 클론되었다. PARG의 양이 PARP보다 약 13-50배 적지만 그 특이적 활성은 약 50-70배 더 높다. 세포는 PAR 중합체의 빠른 합성 및 분해시 상당한 에너지를 소비하는데, 이는 PARP와 마찬가지로 PARG도 약학적 개입(pharmacologic intervention)의 유용한 타겟이 될 수 있음을 나타낸다.

PARP 활성화는 DNA 손상에 대한 극도로 민감한 지표(indicator)로서 말단-데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(terminal-deoxynucleotidyl transferase)에 의해탐지되는 DNA 닉(nicks)의 양에 있어서의 증가율을 웃돌며 훨씬 빨리 나타난다. DNA 절단 후에 바로 많은 핵단백질이 PAR과의 공유결합에 의해 변형되기 때문에, 세포손상에 대한 세포반응에 있어서 폴리(ADP-리보실)화 반응이 중요한 역할을 담당할 것으로 생각된다. PARP 발현이 감소된 돌연변이 세포계는 절충된 DNA 복구를 보여, PARP 억제제에 의해 세포가 DNA를 손상시키는 약품에 대해 과민하게 된다. 또한, 안티센스 PARP mRNA의 발현에 의한 PARP의 감소로, 손상된 DNA의 절단된 가닥의 재결합이 억제된다.

PARP가 결실된 별개의 두 그룹의 쥐에 의한 발생실험을 통해 DNA 복구에 있어서 이 효소의 역할이 보다 명확하게 알려지게 되었다. Wang 등은 엑손 2를 파괴하여 낙아웃 쥐(knock out mice)를 만든 반면, Menissier de Murcia 등은 엑손 4를 단절(interruption)하였다. 두 계통의 돌연변이 쥐는 건강하고 생식력이 있으며, 상기 Wang PARP -/- 쥐의 섬유아세포(fibroblast)는 UV조사 또는 알킬화제에 의한 DNA 손상 후 정상적인 DNA 복구를 보이는데, 이는 각각 뉴클레오티드 절삭 복구시스템과 염기 절삭 복구시스템의 효능을 나타내는 것이다. 반면에 PARP -/- 제 1차 섬유아세포(primary fibroblast)의 증식 또는 생체 내 흉선세포(thymocytes)는 γ-조사 후 다소 손상되었는데, Wang 등이 그들의 낙아웃 쥐에서 관찰한 유일한 주목할 만한 이상은 표피증식(epidermal hyperplasia)에 대한 증가된 감수성이다. Wang 등은 말피기세포(keratinocytes)에서의 PARP 활성의 결핍은 손상된 DNA를 다량 보유하는 세포의 제거를 방해하여 이들 세포가 과증식(hyperproliferation)에 보다 더 민감해지도록 한다는 것을 제안하였다. 그러나, 다른 계통의 PARP -/- 쥐에서는피부질병이 관찰되지 않는다는 것은 표피증식이 유전적 원인에 대해 부차적일 수 있음을 나타낸다.

한편, Menissier de Murcia 그룹의 PARP -/- 쥐는 DNA 손상에 대해 비정상적인 반응을 보인다. 이들 PARP -/- 세포는 알킬화제인 N-메틸-N-니트로우레아( N-methyl-N-nitrosourea)(NMU)의 처리에 이은 세포자멸사에 극도로 민감하다. 이들 세포는 또한 p53의 증가된 축적을 보이는데, 이는 아마도 DNA 복구의 결핍 또는 지연에 의한 것이다. 이것은 이들 쥐에서 PARP의 결핍이 DNA 손상에 대한 p53 반응을 촉진함을 나타내는 것이다. 이것은, Wang PARP -/- 쥐에서 관찰된 것, 즉 이들 쥐의 섬유아세포가 야생형 DNA 손상시 p53의 적절한 감소를 보인 것과는 대조적이다. 다른 것들도 폴리(ADP-리보실)화 반응이 야생형 세포의 p53 신호에서 조절 역할을 한다는 것을 증명하고 있다. p53 농도가 PARP 활성에 의해 부분적으로 결정되는 반면, p53 활성화는 PARP에 충분히 독립적인 것으로 보인다. 상기 de Murcia PARP -/- 쥐에서의 자매 염색분체 교환율(the rate of sister chromatid exchange)은 기본적 레벨 및 다음의 DNA 손상에서 야생형 쥐에서의 교환율에 비해 4-5배 더 높다. 이것은 DNA 손상 후 나타나는 자매 염색분체 교환을 제한함에 있어서 PARP의 역할을 제안한, 우성인 인간-PARP의 음성 돌연변이체를 가지고 한 초기의in situ결과를 확증하는 것이다. 메틸화제 MNU로 처리하거나 몸 전체를 γ-조사한 경우, 두 타입의 낙아웃 쥐가 야생형 쥐보다 일찍 죽는다. PAR 합성과 PARP 활성화에 대한 PARG의 빠른 활성화는, PARG를 통한 PAR분해가 PARP 활성과 관련된 질환 및 질병을 촉진함을 의미한다. 따라서, PARG 억제제는 PARP 활성에 대한 기질 및 타겟을 감소시킴으로써 감소조절하는(down-regulating) PARP에 유용할 것이므로 PARG 억제제는 PARP 활성과 관련된 질환 및 질병, 특히 여기에 기재된 질환 및 질병을 치료하는 데 유용하다. PARG 억제제는 PARP 억제제의 사용이 유용한, 어떠한 방법 및 치료법에서도 유용할 것이다.

PARP 활성화가 NMDA 및 NO에 의해 유발된 신경독성(neurotoxicity)에서 중요한 역할을 한다는 것이, 그와 같은 독성을 방지하기 위해 그 효소의 억제제로서의 효능에 비례하여 피질 배양체(cortical cultures)[Zhang 등,Science, 263:687-89 (1994)에 게재된 "Nitric Oxide Activation of Poly(ADP-Ribose) Synthetase in Neurotoxicity"] 및 해면체 조각(hippocampal slices)[Wallis 등,NeuroReport, 5:3, 245-48 (1993)에 게재된 "Neuroprotection Against Nitric Oxide Injury with Inhibitors of ADP-Ribosylation"]에 PARP 억제제를 사용한 실험에서 볼 수 있듯이, 보고되어 있다. 따라서 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환 및 머리 외상(head trauma)의 치료에 있어서 PARP 억제제의 가능한 역할이 알려져 있다. 그러나 연구는 대뇌국소 빈혈(cerebral ischemia)[Endres 등,J. Cereb. Blood Flow Metabol., 17:1143-51 (1997)에 게재된 "Ischemic Brain Injury is Mediated by the Activation of Poly(ADP-Ribose) Polymerase"] 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)[Wallis 등,Brain Res., 710:169-77 (1996)에 게재된 "Traumatic Neuroprotection with Inhibitors of Nitric Oxide and ADP-Ribosylation"]에 있어서의 이로운 효과에 대한 정확한 메카니즘을 정확하게 알아내기 위해 계속되고 있다. PARG 억제제는 PARP 활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된, NMDA 및 NO에 의해 유발된 신경독성에 영향을 줄 것이고, 따라서 PARG 억제제는 신경퇴행성 질환, 머리 외상 및 대뇌국소 빈혈을 치료하는 데 유용하다.

PARP의 억제제의 주사만으로 토끼의 심장근 또는 골격근의 국소 빈혈과 재관류(reperfusion)에 의한 경색(infarct) 크기를 줄인다는 것이 증명되고 있다. 이들 연구에서, PARP 억제제, 3-아미노-벤자미드(10㎎/㎏)를 폐색(occlusion) 1분전 또는 재관류 1분전에 한번 주사한 경우 심장의 경색 크기를 유사하게 감소(32-42%)시켰다. 또 다른 PARP 억제제, 1,5-디히드록시이소퀴놀린(1㎎/㎏)은 경색 크기를 필적할 만한 정도(38-48%)로 감소시켰다. [Thiemermann 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:679-83 (1997)에 게재된 "Inhibition of the Activity of Poly(ADP Ribose) Synthetase Reduces Ischemia-Reperfusion Injury in the Heart and Skeletal Muscle"]. 이러한 발견은 PARP 억제제가 이미 경색된 심장이나 골격근 조직을 회생시킬 수도 있음을 나타낸다. 마찬가지로, PARG 억제제는 PARP 활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된 경색된 심장 또는 골격근 조직 손상에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 PARG 억제제는 이미 경색된 심장 또는 골격근 조직을 회생시키는 데 유용하다.

PARP 활성화는 또한 글루타메이트(NMDA 수용체 자극을 통함), 반응성(reactive) 산소 매개체, 아밀로이드(amyloid) β-단백질, n-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(n-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)(MPTP) 및 그 활성 대사산물 N-메틸-4-페닐피리딘(MPP^*) -이것들은 뇌졸중, 알츠하이머 질환 및 파킨슨 병과 같은 질병 상태에 관여한다- 에 의한 신경독성 손상 후의 손상의 지수를 제공하는 것으로 제시되고 있다[Zhang 등,J. Neurochem., 65:3, 1411-14 (1995)에 게재된 "Poly(ADP-Ribose) Synthetase Activation: An Early Indicator of Neurotoxic DNA Damage"]. 시험관 내(in vitro) 소뇌과립세포(cerebellar granule cells) 및 MPTP 신경독성에서의 PARP 활성화의 역할을 상세히 조사하기 위한 다른 연구들이 계속되고 있다[Cosi 등,Ann. N. Y. Acad. Sci., 825:366-79 (1997)에 게재된 "Poly(ADP-Ribose) Polymerase(PARP) Revisited. A New Role for an Old Enzyme: PARP Involvement in Neurodegeneration and PARP Inhibitors as Possible Neuroprotective Agents"; 및 Cosi 등,Brain Res., 729:264-69 (1996)에 게재된 "Poly(ADP-Ribose) Polymerase Inhibitors Protect Against MPTP-induced Depletions of Striatal Dopamine and Cortical Noradrenaline in C57B1/6 Mice"]. PARG 억제제는 PARP가 관련된, 글루타메이트(NMDA 수용체 자극을 통함), 반응성 산소 매개체, 아밀로이드 β-단백질, n-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 및 그 활성 대사산물 N-메틸-4-페닐피리딘(MPP^*) -이것들은 뇌졸중, 알츠하이머 질환 및 파킨슨 병과 같은 질병 상태에 관여한다- 에 의한 신경독성 손상에, PARP 활성을 감소조절함으로써 영향을 줄 것이므로, PARG 억제제는 이와 같은 질병 상태를 치료 또는 예방하는 데 유용하다.

뇌졸중 및 기타 다른 신경퇴행성 과정 후 나타나는 신경 손상은 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체 및 다른 서브타입의 수용체에 작용하는 흥분성 전달물질(excitatory neurotransmitter)인 글루타메이트의 대량 방출의 결과라고 생각된다. 글루타메이트는 중추신경계(CNS)의 주된 흥분성 전달물질로서 작용한다. 뉴런은 뇌졸중 또는 심장마비와 같은 국소 빈혈성 뇌손상(ischemic brain insult) 동안에 발생될 수 있는 산소 결핍시 대량의 글루타메이트를 방출한다. 이러한 과도의 글루타메이트 방출은 차례로 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA), AMPA, 카이네이트(kainate) 및 MGR 수용체의 과도한 자극(흥분독성)을 유발한다. 글루타메이트가 이들 수용체에 결합하면 이들 수용체의 이온통로가 열리게 되어 세포막을 가로지르는 이온의 흐름, 예컨대 Ca²⁺및 Na⁺의 세포내로의 유입과 K⁺의 세포 밖으로의 유출을 가능케 한다. 이러한 이온의 흐름, 특히 Ca²⁺의 유입은 뉴런의 과도자극을 유발한다. 과도하게 자극된 뉴런은 더 많은 글루타메이트를 분비하고, 이는 피드백 고리 내지는 도미노 현상을 일으켜 결국 프로테아제, 리파아제 및 자유라디칼의 생산에 의한 세포손상 또는 사멸을 가져온다. 글루타메이트 수용체의 지나친 활성화는, 저산소증(hypoxia), 저혈당증(hypoglycemia), 국소 빈혈(ischemia), 외상(trauma) 및 신경 손상 후 나타나는, 간질, 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 병, 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)(ALS), 헌팅톤 병, 정신분열증, 만성질환, 국소 빈혈 및 뉴런 손실(neuronal loss)을 포함하는 다양한 신경성 질환 및 이상에 관련된다. 최근 연구는 또한 충동성 정신질환, 특히 약물의존에 대한, 글루타메이트에 의한 신경전달 원리(glutamatergic basis)를 진전시켰다.증거에는, 글루타메이트 또는 NMDA로 처리된 대뇌피질 배양체(cerebral cortical cultures)에서 뿐만 아니라, 많은 동물 중에서도 글루타메이트 수용체 길항제가 혈관성 뇌졸중(vascular stroke) 후에 나타나는 신경손상을 방지한다는 발견들이 포함된다[Dawson 등,Cerebrovascular Disease, 319-25 (H. Hunt Batjer ed., 1997)에 게재된 "Protection of the Brain from Ischemia"]. NMDA, AMPA, 카이네이트 및 MGR 수용체를 차단시킴으로써 흥분독성을 방지하고자 하는 시도는, 각 수용체가 글루타메이트가 결합될 수 있는 부위를 여러개 가지고 있기 때문에 어렵다고 밝혀졌다. 이들 수용체를 차단하는 데 효과적인 많은 조성물은 또한 동물에게도 유독하다. 이런 이유로 글루타메이트 이상에 대한 효과적인 치료법이 알려져 있지 않다.

NMDA 수용체의 자극은 차례로 신경세포성 산화질소 합성효소(neuronal nitric oxide synthase)(NNOS)를 활성화시켜 산화질소(NO)의 생성을 야기시키며, 이것은 보다 직접적으로 신경독성을 매개한다. NMDA 신경독성의 방지는 NOS 억제제 처리 후에 나타난다[Dawson 등,Proc. nat1. Acad. Sci. USA, 88:6368-71(1991)에 게재된 "Nitric Oxide Mediates Glutamate Neurotoxicity in Primary Cortical Cultures"; 및 Dawson 등,J. Neurosci., 13:6, 2651-61 (1993)에 게재된 "Mechanism of Nitric Oxide-mediated Neurotoxicity in Primary Brain Cultures" 참조]. NMDA 신경독성의 방지는 또한 목표된 NNOS를 파괴시킨 쥐의 피질 배양체에서도 나타날 수 있다 [Dawson 등,J. Neurosci., 16:8, 2479-87 (1996) "Resistance to Neurotoxicity in Cortical Cultures from Neuronal Nitric Oxide Synthase-Deficient Mice" 참조]. 혈관성 뇌졸중 후 나타나는 신경손상은 NOS 억제제로 처리한 동물 또는 NNOS 유전자를 파괴시킨 쥐에서 현저하게 감소된다고 알려져 있다[Iadecola,Trends Neurosci., 20:3, 132-39 (1997)에 게재된 "Bright and Dark Sides of Nitric Oxide in Ischemic Brain Injury"; 및 Huang 등,Science, 265:1883-85 (1994)에 게재된 "Effects of Cerebral Ischemia in Mice Deficient in Neuronal Nitric Oxide Synthase" 참조. 또한, Beckman 등,Biochem. Soc. Trans., 21:330-34 (1993)에 게재된 "Pathological Implications of Nitric Oxide, Superoxide and Peroxynitrite Formation" 참조]. NO나 과산화아질산염(peroxynitrite)도 DNA 손상을 유발하여 PARP를 활성화시킬 수 있다. 이에 대한 추후 증거가 Szabo 등에 의해 제공되었다[Szabo 등, "DNA Strand Breakage, Activation of Poly(ADP-Ribose) Synthetase, and Cellular Energy Depletion are Involved in the Cytotoxicity in Macrophages and Smooth Muscle Cells Exposed to Peroxynitrite",Proc. Nat1, Acad. Sci. USA,93:1753-58 (1996) 참조].

Zhang 등은 1996. 12. 24.자 미국 특허 제5,587,384에서 벤자미드(benzamide) 및 1,5-디하이드록시-이소퀴놀린(1,5-dihydroxy-isoquinoline)과 같은 특정 PARP 억제제의 사용으로 NMDA에 의해 매개되는 신경독성을 방지하여 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 병 및 헌팅톤 병을 치료하는 것을 논의하고 있다. 그러나 Zhang 등이 신경독성을 NMDA에 의해 매개되는 신경독성으로 분류하는 오류를 범했다는 것이 밝혀지고 있다. 생체내 신경독성은 오히려 글루타메이트 신경독성으로 분류하는 것이 더 적합했을 것이다[Zhang 등, "NitricOxide Activation of Poly(ADP-Ribose) Synthetase in Neurotoxicity",Science, 263:687-89 (1994). 및 Cosi 등, "Poly(ADP-Ribose) Polymerase Inhibitors Protect Against MPTP-induced Depletions of Striatal Dopamine and Cortical Noradrenaline in C57B1/6 Mice",Brain Res., 729:264-69 (1996) 참조]. PARG 억제제는 PARP 활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된 글루타메이트 신경독성에 영향을 미칠 것이고, 따라서 PARG 억제제는 여기서 논의된 글루타메이트 신경독성이 관련된 질환 및 질병을 치료 또는 예방하는 데 유용하다.

또한 PARP 억제제는 일반적으로 DNA 복구에 영향을 미친다는 것이 알려져 있다. Cristavao 등은 PARP의 강력한 억제제인 3-아미노벤자미드(3-aminobenzamide)의 존재시 및 부재시 DNA 가닥의 절단 부위에 미치는 과산화수소 및 γ-조사의 영향을 논의하고 있다[Cristovao 등,Terato., Carcino., and Muta., 16:219-27 (1996)에 게재된 "Effect of a Poly(ADP-Ribose) Polymerase Inhibitor on DNA Breakage and Cytotoxicity Induced by Hydrogen Peroxide and γ-Radiation," 참조]. Cristovao 등은 과산화수소로 처리한 백혈구의 DNA 가닥 절단 부위의 회복이 PARP에 의존적임을 관찰하였다. PARG 억제제는 PARP 활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된 DNA 복구에 영향을 미칠 것이고, 따라서 PARG 억제제는 여기서 논의된 DNA 손상 및 DNA 복구와 관련된 질환 및 질병을 치료 또는 예방하는 데 유용하다.

PARP 억제제는 방사선에 민감한(radiosensitizing) 저산소증 종양세포(hypoxic tumor cell)에 효과적이고, 또한 아마도 PARP 억제제의 DNA 복구 억제력에 의해 종양세포가, 방사선 치료 후의 치명적일 수 있는 DNA 손상으로부터회복되는 것을 막는 데 효과적인 것으로 보고되고 있다. 미국특허 제5,032,617; 5,215,738; 및 5,041,653을 참조하라. PARG 억제제는 PARP 활성을 감소조절함으로써 PARP가 연관된 방사선 민감(radiosensitization)에 영향을 미칠 것이고, 따라서 PARG 억제제는 방사선 민감물질(radiosensitizer), 즉 방사선 민감과 관련된 제제로서 유용하다.

또한 PARP억제제가 염증성 장질환(inflammatory bowel disorders)을 치료하는 데 유용하다는 증거가 있다. Salzman 등은 "Japanese J. Pharm., 75. Supp. I:15 (1997)"에 게재된 "Role of Peroxynitrite and Poly(ADP-Ribose) Synthase Activation Experimental Colitis"에서, 대장염을 예방 또는 치료하는 PARP 억제제의 효능을 논의하고 있다. 50% 에탄올에 녹아있는 합텐 트리니트로벤젠 술폰산(hapten trinitrobenzene sulfonic acid)을 쥐(rat)에 관내(intraluminal) 투여함으로써 대장염을 유발하였다. 처리된 쥐에 PARP 활성의 특이억제제인 3-아미노벤자미드를 투여했다. PARP 활성의 억제가 염증반응을 감소시켰고 원위부 결장(distal colon)의 형태와 에너지 상태를 회복시켰다[또한, Southan 등,Br. J. Pharm., 117:619-32 (1996)에 게재된 "Spontaneous Rearrangement of Aminoalkylithioureas into Mercaptoalkylguanidines, a Novel Class of Nitric Oxide Synthase Inhibitors with Selectivity Towards the Inducible Isoform"; 및 Szabo 등,J. Biol.Chem., 272:9030-36 (1997)에 게재된 "Mercaptoethylguanidine and Guanidine Inhibitors of Nitric Oxide Synthase React with Peroxynitrite and Protect Against Peroxynitrite-induced Oxidative Damage" 참조]. PARG 억제제는 PARP 활성을 감소조절하여 PARP가 관련된 대장염(colitis)에 영향을 미칠 것이고, 따라서 PARG 억제제는 여기에 기재된 대장염과 관련된 증상, 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 데 유용하다.

또한 PARP 억제제가 관절염 치료에 유용하다는 증거가 있다. Szabo 등은 "Japanese J. Pharm.,75, Supp. I:102 (1997)"에 게재된 "Protective Effects of an Inhibitor of Poly(ADP-Ribose) Synthetase in Collagen-Induecd Arthritis"에서 콜라겐에 의해 유발되는 관절염의 예방 또는 치료에 대한 PARP 억제제의 효능을 논의하고 있다[또한, Szabo 등,Proc. Nat1. Acad. Sci. USA,93:1753-58 (1996.3)에 게재된 "DNA Strand Breakage, Activation of Poly(ADP-Ribose) Synthetase, and Cellular Energy Depletion are Involved in the Cytotoxicity in Macrophages and Smooth Muscle Cells Exposed to Peroxynitrite"; Bauer 등,Intl. J. Oncol., 8:239-52 (1996)에 게재된 "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-1,2-benzopyrone (INH₂BP)"; 및 Hughes 등,J. Immuno., 153:3319-25 (1994)에 게재된 "Induction of T Helper Cell Hyporesponsiveness in an Experimental Model of Autoimmunity by Using Nonmitogenic Anti-CD3 Monoclonal Antibody" 참조]. PARG 억제제는 PARP활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된 관절염에 영향을 줄 것이고, 따라서 PARG 억제제는 관절염 및 여기서 논의된 질환 및 질병과 관련된 관절염을 치료 또는 예방하는 데유용하다.

게다가, PARP 억제제는 당뇨병의 치료에도 유용한 것으로 보인다. Heller 등은 "J. Biol. Chem., 270:19, 11176-80 (1995.5)"에 게재된 "Inactivation of the Poly(ADP-Ribose)Polymerase Gene Affects Oxygen Radical and Nitric Oxide Toxicity in Islet Cell"에서 세포내 NAD⁺를 감소시키고 인슐린 생성세포의 사멸을 유발하는 PARP의 경향을 논의하고 있다. Heller 등은 불활성화된 PARP 유전자를 가지는 쥐의 세포를 사용했고, 이들 돌연변이 세포가 DNA를 손상시키는 라디칼에 노출된 후에 NAD⁺소모를 보이지 않는다는 것을 발견했다. 돌연변이 세포는 또한 NO의 독성에 대해 보다 큰 저항성이 있음도 발견되었다. PARG 억제제는 PARP활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된 당뇨병에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 PARG 억제제는 당뇨병 및 여기서 논의된 질환 및 질병과 관련된 당뇨병의 치료 및 예방에 유용하다.

또한 PARP 억제제는 내독소성 쇼크(endotoxic shock) 또는 패혈성 쇼크(septic shock)를 치료하는 데 유용한 것으로 알려져 있다. Zingarelli 등은 "Shock, 5:258-64 (1996)"에 게재된 "Protective Effects of Nicotinamide Against Nitric Oxide-Mediated Delayed Vascular Failure in Endotoxic Shock: Potential Involvement of PolyADP Ribosyl Synthetase"에서 폴리(ADP 리보오스) 신테타제에 의해 촉발된 DNA 복구사이클의 억제가 내독소형 쇼크에서 혈관 고장(vascular failure)에 대한 보호효과를 가지고 있음을 제안하고 있다. Zingarelli 등은 니코틴아미드가 내독소형 쇼크시 NO에 의한, 지연된 혈관 고장에 대해 보호효과를 가지고 있음을 제안하고 있다. Zingarelli 등은 또한 니코틴아미드의 작용이 폴리(ADP-리보오스) 신테타제에 의해 촉발된, 에너지를 소비하는 DNA 복구사이클의, NO에 의해 매개되는 활성화의 억제와 관련될 수 있음을 발견했다[또한, Cuzzocrea,Brit. J. Pharm., 122:493-503 (1997)에 게재된 "Role of Peroxynitrite and Activation of Poly(ADP-Ribose) Synthetase in the Vascular Failure Induced by Zymosan-activated Plasma" 참조]. PARG 억제제는 PARP 활성을 감소조절함에 의해 PARP가 관련된 내독소형 쇼크나 패혈성 쇼크에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 내독소형 쇽이나 패혈성 쇽 및 여기에 기재된 관련된 질환 또는 질병의 치료 또는 예방에 유용하다.

또한 PARP 억제제의 또 다른 알려진 용도는 암을 치료하는 것이다. Suto 등은 "Anticancer Drug Des., 7:107-17 (1991)"에 게재된 "Dihydroisoquinolinones: The Design and Synthesis of a New Series of Potent Inhibitors of Poly(ADP-Ribose) Polymerase"에서 수많은 다른 PARP 억제제를 합성하는 공정을 개시하고 있다. 또한 Suto 등은 미국 특허 제5,177,075에서 종양세포에 대한 전리방사선 또는 화학요법제(chemotherapeutic agent)의 치사 효과를 증진시키는 데 사용되는 여러 이소퀴놀린(isoquinoline)을 논의하고 있다. Weltin 등은 "Oncol. Res., 6:9, 399-403 (1994)"에 게재된 "Effect of 6(5H)-Phenanthridinone, an Inhibitor of Poly(ADP-ribose) Polymerase, on Cultured Tumor Cells"에서 PARP 활성의 억제, 종양세포의 증식감소 및 종양세포에 알킬화 약물을 함께 처리시의 현저한 상승효과를 논의하고 있다. PARG 억제제는 Tanuma의 일본 특허에 개시된 바와 같이 암을 치료하는 데 효과적이라고 알려져 있다. 그러나, 본 발명과는 정반대로 상기 문헌의 증거는, PARG 억제제에 의한 암치료의 작용 메카니즘은, PARG 억제제가, 일반적으로 종양유전자(oncogenes)의 전사와 활성화를 차단시키는 PAR의, PARG가 관련된 분해를 방해한다는 것을 제시한다.

PARG를 억제하는 방법 및 화합물은; Tanuma 등,JP 042-75223-A2, "Poly(ADP-ribose)glycohydrolase Inhibitors Containing Glucose Derivatives", 9/30/92; Tanuma 등,JP 042-75296-A2, "Adenosine Derivatives and their Use in Cancer Immunotherapy", 3/4/91; Tanuma,JP 032-05402-A2, "Lignin Glycoside and Use", 9/6/91; Tanuma,JP 04-013684-A2, "Lignin glycoside and Use", 1/17/92; Slama 등,J. Med. Chem.38: 389-393 (1995); Slama 등,J. Med. Chem. 38: 4332-4336 (1995); Maruta 등,Biochemistry30:5907-5912 (1991); Aoki 등,Biochim. Biophys. Acta1158:251-256 (1993); Aoki 등,Biochem. Biophys. Res. Comm.210:329-337 (1995); Tsai 등,Biochemistry Intl. 24:889-897 (1991); 및 Concha 등,Biochemistry Intl.24:889-897 (1991)에 논의되어 있다.

HIV 감염치료를 위한 PARG 억제제 타닌산의 사용은; Uchiumi 등,Biochem. Biophys. Res. Comm.220:411-417 (1996)에 게재된 "Inhibitory Effect of Tannic Acid on Human Immunodeficiency Virus Promoter Activity Induced by 12-0-Tetra Decanoylphorbol-13-acetate in Jurkat T-Cells' 에 논의되어 있다.

또한 PARP 억제제의 또 다른 용도는 말초신경 손상 및 그 결과로서 생기는,공통좌골신경(common sciatic nerve)의 만성 수축 손상(chronic constriction injury)에 의해 유발되는 것과 같은, 신경병증성 통증(neuropathic pain)으로 알려진 병적 통증 증후군(pathological pain syndrome)의 치료이다. 여기서 세포질과 핵질의 과색소증 (hyperchromatosis)[소위 "어두운(dark)" 뉴런]에 의해 특징지어지는 척수 등쪽뿔(spinal cord dorsal horn)의 트랜스시냅스 변화(transsynaptic alteration)가 발생한다[Jianren Mao 등, 72:355-366(1997) 참조]. PARG 억제제는 PARP활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된 신경병증성 통증에 영향을 줄 수 있고, 따라서 PARG 억제제는 말초신경 손상 및 그 결과로서 생기는, 신경병증성 통증으로 알려진 병적 통증 증후군 및 여기서 기재된 관련된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 데 유용하다.

PARP 억제제는 또한 피부노화, 알츠하이머 질환, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 근이영양증(muscular dystrophy), 복제노화(replicative senescence)를 포함하는 골격근의 퇴행성 질환, 노화와 관련된 황반변성(macular degeneration), 면역노화(immune senescence), AIDS 및 다른 면역 노화 질환과 같은 질환의 치료를 포함하는, 세포의 수명 및 증식능력을 늘리는 데 및 노화세포의 유전자 발현을 변경시키는 데 사용되어져 왔다. WO 98/27975를 참조하라. PARG 억제제는 PARP활성을 감소조절함으로써 PARP가 관련된, 세포의 수명 및 증식력의 증대에 영향을 줄 수 있고, 따라서 PARG 억제제는, 여기서 논의된 질환과 질병을 포함하는 다양한 환경조건하에 있는 세포의 수명 및 증식력을 늘리는 데 유용하다.

다수의 알려진 PARP 억제제는 Banasik 등의J. Biol. Chem., 267:3, 1569-75 (1992)에 게재된 "Specific Inhibitors of Poly(ADP-Ribose) Synthetase and Mono(ADP-Ribosyl)-Transferase", 및 Banasik 등의Molec. Cell. Biochem.,138:185-97 (1994)에 게재된 "Inhibitors and Activators of ADP-Ribosylation Reactions"에 기재되어 있다. 여러 PARG 억제제는 Tavassoli 등의Biochim Biophys. Acta827:228-234 (1985)에 게재된 "Effect of DNA intercalators on poly(ADP-ribose) glycohydrolase activity"에 기재되어 있다.

그러나 이들 PARG 억제제를 사용하여 NMDA-수용체 자극을 감소시키거나 괴사나 세포자멸사에 의한 세포 손상 또는 사멸의 결과인 조직 손상을 치료 또는 예방; 또는 NO에 의한 신경조직 손상, 심장 또는 골격근의 국소 빈혈 또는 재관류, 국소 빈혈 재관류손상에 의한 신경조직손상, 신경성 질환 및 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방;혈관성 뇌졸중의 예방 또는 치료; 심장 혈관 질환의 치료 또는 예방; 노화와 관련된 황반변성, 면역노화증, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 악액질, 복제노화를 포함하는 골격근의 퇴행성 질환, 당뇨병, 머리외상, 면역 노화, 염증성 장 질환(대장염, 크론병 등), 근이영양증, 골관절염, 골다공증, 통증(신경성 통증 등), 신부전증, 망막국소 빈혈, 패혈증성 쇼크(내독성 쇼크 등), 및 피부 노화와 같은 다른 이상 및/또는 질환의 치료; 세포의 수명과 증식력 증대; 노화 세포의 유전자 발현 변경; 또는 저산소증 종양세포를 방사선에 민감하게 하기 위한 접근방식은 사실상 제한되어 있다. 예컨대, 가장 잘 알려진 PARP 억제제의 몇몇은 Milam 등이 "Science, 223:589-91 (1984)"에 게재된 "Inhibitors of Poly(AdenosineDiphosphate-Ribose) Synthesis: Effect on Other Metabolic Processes"에서 논의하였듯이 부작용이 관찰되고 있다. 구체적으로, PARP 억제제 3-아미노벤자미드와 벤자미드는 PARP의 작용을 억제할 뿐만 아니라 세포의 생존능력, 포도당 대사 및 DNA 합성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 PARP 억제제의 유용성은 부작용 없이 상기 효소를 제한하기에 충분한 소량의 1회 투여량을 발견하기가 어렵기 때문에 철저히 제한될 수 있다는 결론에 도달했다. PARG 억제제에 대해서도 유사한 1회 투여량이 고려되어야 한다는 결론에 도달될 것이다.

따라서 PARG 활성을 제한하는 화합물로서, PARG 활성의 억제 및 여기서 논의된 전환 및 이상의 치료에 관해서, 부작용이 거의 없으면서 보다 강력하고 신뢰할 수 있는 효능을 제공하는 화합물과, 이들 화합물을 함유하는 조성물 및 이들 화합물을 이용하는 방법에 대한 요구가 여전히 남아 있다.

본 발명은, PARG 억제제라고도 알려져 있는 폴리(ADP-리보오스) 글루코하이드롤라제 억제제(glucohydrolase inhibitors)를 포함하는 약학적 조성물, 및 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모, 세포 손상, 또는 세포 사멸을 억제하거나 감소시키기 위해 상기의 것을 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 글루코스 유도체; 리그닌 글리코시드(lignin glycosides); 갈로타닌(gallotannins)과 엘라기타닌(ellagitannins)을 포함하는 가수분해되는 타닌(tannins); 아데노시드 유도체(adenoside derivatives); 6,9-디아미노-2-에톡시아크리딘 락테이트 단일 수화물(6,9-diamino-2-ethoxyacridine lactate monohydrate)을 포함하는 아크리딘 유도체(acridine derivatives); 틸로론(tilorone) R 10.556, 다우노마이신(daunomycin) 또는 다우노루비신 염산염(daunorubicin hydrochloride)을 포함하는 틸로론 유사체(tilorone analog); 엘립티신(ellipticine); 프로플라빈(proflavine); 및 다른 PARG 억제제와 같은 폴리(ADP-리보오스) 글루코하이드롤라제 억제제를 포함하는 이상적 조성물에 관한 것이고, 또한 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모에 따른 질병이나 이상,및/또는 괴사(necrosis), 세포자멸사(apoptosis) 또는 이들의 결합에 의한 세포의 손상 또는 사멸로부터 기인하는 조직 손상의 치료 또는 예방시 사용하는 방법에 관한 것이다.

도 1은, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 과산화수소 세포독성에 대한 보호 효과를 나타내는 그래프.

도 2는, 세포독성 투여량 반응 곡선으로부터 정해지는 EC₅₀을 나타내는 그래프.

도 3은, 폴리(ADP 리보실)화 반응의 유지를 위한 PARP/PARG 사이클 및 세포에너지 대사 및 다양한 용도, 여기에 기재된 질병 및 질환과의 관련성을 도식적으로 간단하게 나타낸 도면.

본 발명은 PARG 억제제, 즉 약학적으로 수용 가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매(solvate), 프로드러그(prodrug), 대사산물(metabolite), 또는 이것들의 입체 이성질체 및 약학적으로 수용 가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 이용하는 방법에 대한 것으로, 여기서 PARG 억제제는 자유라디칼에 의한 세포의 에너지 소모, 세포 손상 또는 세포 사멸의 억제 또는 감소, 및/또는 괴사 또는 세포자멸사로 인한 세포손상 또는 사멸로부터 발생되는 질환 또는 상태의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 존재한다.

바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물 및 방법을 이용하는 치료에 적합한 특정 질환 및 이상로서 급성 통증(acute pain), 관절염, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 악액질(cachexia), 심장 혈관 장애, 만성통증(chronic pain), 퇴행성 질병, 당뇨병, 세포의 수명 또는 증식력과 관련된 질병 또는 질환, 세포노화에 의해 유발되거나 악화된 질병이나 질병상태, 두부외상(head trauma), 면역노화(immune senescence), HIV 감염, AIDS(후천성 면역 결핍증), ARDS, 염증, 염증성 내장 장애, 국소 빈혈(ischemia), 황반변성(macular degeneration), 근이영양증(muscular dystrophy), 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적 장애와 신경퇴행성 질병, 뉴런 매개 조직 손상 또는 질병, 신경병증성 통증(neuropathic pain), 신경 손상, 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 피부 노화 및 혈관성 뇌졸중을 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 실시예에서 PARG 억제제는 글루코스 유도체; 리그닌 글리코시드(lignin glycosides); 갈로타닌(gallotannins)과 엘라기타닌(ellagitannins)을 포함하는 가수분해되는 타닌(tannins); 아데노시드 유도체(adenoside derivatives); 6,9-디아미노-2-에톡시아크리딘 락테이트 단일 수화물(6,9-diamino-2-ethoxyacridine lactate monohydrate)을 포함하는 아크리딘 유도체(acridine derivatives); 틸로론(tilorone) R 10.556, 다우노마이신(daunomycin) 또는 다우노루비신 염산염(daunorubicin hydrochloride)을 포함하는 틸로론 유사체(tilorone analog); 엘립티신(ellipticine); 프로플라빈(proflavine); 및 다른 PARG 억제제일 수 있다.

바람직한 일 실시예에서, 상기 PARG 억제제는 포도당 유도체, 보다 구체적으로는 화학식 I의 화합물이다.

(I)

여기서,

R₁- R₅가 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅는 각각 수소 원자 또는 X를 나타내고,

X는 수산기와 C₁-C₈알콕시기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹에 의해 각각 치환된 페닐(phenyl)을 갖고 있는 카르보닐(carbonyl)을 나타낸다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 PARG 억제제는 리그닌 글리코시드, 그 중에서도 다음과 같은 구조를 갖는 리그닌 글리코시드이다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 PARG 억제제는 가수분해되는 타닌, 그중에서도 다음과 같은 특성을 갖는 가수분해되는 타닌이다.

(i) 타닌과 다당류가 결합되고;

(ii) 분자량은 500 내지 140,000이며;

(iii) 타닌과 다당류의 결합비는 분자비로서 1:1 내지 20:1이고;

(iv) 상기 다당류는 60 내지 70%의 우론산(uronic acid)과 30 내지 40%의 중성당(neutral sugar)으로 구성된다.

그 중에서도 바람직한 가수분해되는 타닌은 갈로타닌(gallotannins)과 엘라기타닌(ellagitannins)을 포함하며, 특히 이들은 다음과 같은 특성을 갖는다.

(i) 갈산(gallic acids) 및/또는 이갈산(egallic acids) 및 글루코스의 멀티에스테르 형성; 및

(ii) 약 700 내지 8000의 분자량.

또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 PARG 억제제는 아데노신 유도체를 포함한다. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 아데노신 유도체는 디포스페이트-하이드록시-메틸-피롤리딘-디올(diphosphate-hydroxy-methyl-pyrrolidine-diol)(ADP-HPD라고도 함) 또는 화학식 II를 갖는 화합물이다.

(II)

여기서,

R₁은 수소 원자, 화학식 III으로 표시된 그룹,

(III)

또는 X를 나타내는데, 여기서 X는 화학식 IV의 화합물이고,

(IV)

여기서 Z는 C₁-C₈알킬(alkyl), 또는 C₂-C₈알켄일(alkenyl) 결합으로서;

R₇- R₁₁이 동시에 4개나 5개의 수소 원자가 아니고, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 각각 수소 원자 또는 X를 나타내며, X는 위에서 설명된 바와 같이 동일한 것을 나타내고; R₁, R₂, 및 R₃이 동시에 수소 원자를 나타내지 않으며; 또한 R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면, R₇, R₈, R₉, R₁₀, 및 R₁₁은 수소, 수산기, 또는 C₁-C₈알콕시로부터 독립적으로 선택된다.

본 발명에 따른 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 PARG 억제제는, 6,9-디아미노-2-에톡시아크리딘 락테이트 단일 수화물(6,9-diamino-2-ethoxyacridine lactate monohydrate)을 포함하는 아크리딘 유도체(acridine derivatives);틸로론(tilorone) R 10.556, 다우노마이신(daunomycin) 또는 다우노루비신 염산염(daunorubicin hydrochloride)을 포함하는 틸로론 유사체(tilorone analog); 엘립티신(ellipticine); 프로플라빈(proflavine); 및 다른 PARG 억제제를 포함하는 아크리딘 유도체를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포의 에너지 소모, 세포 손상, 또는 세포 사멸을 억제하거나 감소시키는 방법 및/또는 PARG 억제제의 유효량을 투여함으로써 괴사 또는 세포자멸사에 의한 세포 손상 또는 죽음에 기인한 질환이나 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물 및 방법을 사용하는 치료법에 적합한 특정 질병 및 이상은 급성 통증(acute pain), 관절염, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 악액질(cachexia), 심장 혈관 장애, 만성통증(chronic pain), 퇴행성 질병, 당뇨병, 세포의 수명 또는 증식력과 관련된 질병 또는 질환, 세포노화에 의해 유발되거나 악화된 질병이나 질병상태, 두부외상(head trauma), 면역노화(immune senescence), 염증성 내장 장애, 국소 빈혈(ischemia), 황반변성(macular degeneration), 근이영양증(muscular dystrophy), 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 뉴런 매개 조직 손상 또는 질병, 신경병증성 통증(neuropathic pain), 신경 손상, 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 피부 노화 및 혈관성 뇌졸중을 포함한다.

특히 바람직한 실시예에서, PARG 억제제로서 기재된 상기 조성물이 본 발명의 방법에 사용된다.

PARG 억제제가 자유라디칼에 의해 유발된 세포에너지 감소, 세포 손상, 또는 세포 죽음을 억제 또는 감소시키는 데 및/또는 괴사 또는 세포자멸사에 의한 세포 손상 또는 죽음으로부터 기인한 질환 또는 이상을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다는 것이 우연히 발견되었다. 특히 PARG 억제제가, 급성 통증(acute pain), 관절염, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 악액질(cachexia), 심장 혈관 장애, 만성통증(chronic pain), 퇴행성 질병, 당뇨병, 세포의 수명 또는 증식력과 관련된 질병 또는 질환, 세포노화에 의해 유발되거나 악화된 질병이나 질병상태, 두부외상(head trauma), 면역노화(immune senescence), 염증성 내장 장애, 국소 빈혈(ischemia), 황반변성(macular degeneration), 근이영양증(musculardystrophy), 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 뉴런 매개 조직 손상 또는 질병, 신경병증성 통증(neuropathic pain), 신경 손상, 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 피부 노화 및 혈관 뇌졸중을 포함하는 특정 질환 및 이상을 치료 또는 예방하기 위해 유효량이 투여될 수 있다.

일례로, 우리는 PARG 억제제가 심장 국소 빈혈 또는 재관류 손상으로부터 기인한 심혈관 조직의 손상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있음을 발견했다. 예컨대, 재관류 손상은 심장의 우회 과정(cardiac bypass procedures)의 말미나 심장이 일단 혈액을 받는 것이 방해되어 재관류를 시작할 때 발생한다.

본 발명에 따른 PARG 억제제는 세포의 수명 또는 증식력을 증대시키므로, 노화된 세포의 유전자 발현을 변경하는 데뿐만 아니라, 그것과 관련되고, 피부노화, 아테롬성 동맥 경화증, 골관절염, 골다공증, 근이영양증, 복제노화를 포함하는 골격근의 퇴행성 질환, 노화와 관련된 황반변성, 면역노화, 및 다른 세포 노화와 관련된 질환을 포함하는, 세포 노화에 의해 유발되거나 악화되는 질병을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 PARG 억제제는, 괴사 또는 세포자멸사에 의한 세포 죽음 또는 손상으로부터 기인하는 조직 손상을 치료 또는 예방하고; 포유동물에서 뇌국소 빈혈과 재관류 손상 또는 신경퇴행성 질병으로부터 기인하는 신경조직손상을 치료 또는 예방하고, 세포의 수명과 증식력을 증대시키며; 노화된 세포의 유전자 발현을 변경시키는 데 사용된다.

칼슘 과부하와 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라제 활성은 에너지 항상성을 파괴시켜 세포를 죽음에 이르게 한다. 상승된 세포내 칼슘이온(Ca²⁺)은 여러 양태의 세포 손상을 통해 에너지 항상성을 파괴하는 반응성 질소 및 산소의 하류발생(downstream generation)을 통해 세포독성을 방출한다. Ca²⁺은 NMDA-서브타입 글루타메이트 수용체와 같은 전압- 또는 리간드-관문 이온 통로(voltage- or ligand-gated ion channels)를 통해 세포질로 유입될 수 있다. Ca²⁺을 세포 밖으로 방출하거나 소포체(ER) 안으로 유입시키는 이온-모티브 ATPase(ion-motive ATPase)를 통해, 칼슘을 세포질로부터 제거하기 위해서는 ATP가 필요하다. 미토콘드리아도 또한 세포내 칼슘의 완충을 돕는다. 미토콘드리아에 의한 지나친 Ca²⁺의 축적은 산화적 인산화를 손상시키는 반면, 전자전달계를 통해 과산소(O^2-) 및 과산화수소(H₂O₂)와 같은 반응성 산소의 생산을 촉진한다. 미토콘드리아내 Ca²⁺의 고농도 축적 또한 미토콘드리아 막의 투과성을 변경시켜 미토콘드리아의 ATP 생산을 저해하고 괴사를 촉진한다. 또한, 외막(outer membrane)의 선택적 투과성에 의해 카스파제(caspases)를 활성화시키는 시토크롬 C(Cyt C)이 방출된다. 카스파제는 차례로, 특정 세포질 및 핵 단백질 기질을 절단하여 세포자멸사를 조정한다. Ca²⁺은 또한 세포독성 연쇄증폭반응(cytotoxic cascades)을 개시하는 여러 세포효소를 직접적으로 활성화시킨다. 이 효소에는 Ca²⁺에 민감한 포스포리파제(phospholipase) 및 프로테아제 뿐만 아니라 Ca²⁺/Mg²⁺에 의해 활성화되는 엔도뉴클레아제(DNase)가 포함된다. 또한 Ca²⁺에 의해 활성화되는 여러 효소는 자유라티칼 생산에 관여된다. 칼파인(calpains)이라고 알려진, Ca²⁺에 의해 활성화되는 프로테아제는 크산틴 탈수소 효소(xanthine dehydrogenase)를, 과산소의 효소적 발생을 촉진하는 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)(XO)로 전환시킨다. 사이클로옥시게나제(cyclooxygenases)는 과산소의 또 다른 원인이다. 과산화수소(H₂O₂)는 과산소로부터 생성될 수 있고, 그 자신은 철(iron)에 의해 촉매되는 반응을 통해 보다 반응성이 큰 수산기(OH)로 전환될 수 있다. 이들 반응성 산소는 지질, 단백질 및 핵산을 손상시킨다. Ca²⁺도 또한 칼모듈린(calmodulin)에 의해 조절되는 효소인 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)(NOS)를 활성화시켜 대량의 산화질소(NO)를 생산토록 한다. 과산소 및 산화질소는 결합되어 보다 더 반응성이 큰 과산화아질산염 음이온(peroxynitrite anion)(OONO^-)을 형성한다. 과산화아질산염은 세포막을 손상시키고 티로신과 같은 방향족 아미노산을 포함하는 단백질의 산화 및 니트로화를 일으킨다. 과산화아질산염은 또한 수산화 기의 형성을 위한, 아마도 과산화아질산(peroxynitrous acid) 중간체를 거치는 또 다른 경로를 제공한다. Ca²⁺/Mg²⁺에 의해 활성화되는 엔도뉴클레아제, OONO^-, 또는 수산화 기에의한 DNA 손상은 강력한 PARP 활성화와 NAD 의 감소를 가져온다. ATP 생산에 NAD가 필요하고, 차례로 ATP는 NAD 합성에 필요하기 때문에, 과도한 PARP 활성화는 세포 에너지 풀을 고갈시키고 결국 세포를 죽음에 이르게 한다. 상기 문헌에서의 증거는 PARG 억제제가 PARG 효소, PAR 중합체, 또는 양쪽 모두와 직접적으로 작용하여 PARG를 억제한다는 것을 나타낸다. PARG 억제제는 또한 억제제와 PARG 사이의 직접적인 작용과 관계없는 작용메카니즘에 의한, 여기에 기재된 방법에도 유용하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 폴리(ADP-리보오스) 글리코하이드롤라제 억제제는 활성성분으로서 글루코스 유도체; 리그닌 글리코시드(lignin glycosides); 갈로타닌(gallotannins)과 엘라기타닌(ellagitannins)을 포함하는 가수분해되는 타닌(tannins); 아데노시드 유도체(adenoside derivatives); 6,9-디아미노-2-에톡시아크리딘 락테이트 단일 수화물(6,9-diamino-2-ethoxyacridine lactate monohydrate)을 포함하는 아크리딘 유도체(acridine derivatives); 틸로론(tilorone) R 10.556, 다우노마이신(daunomycin) 또는 다우노루비신 염산염(daunorubicin hydrochloride)을 포함하는 틸로론 유사체(tilorone analog); 엘립티신(ellipticine); 프로플라빈(proflavine); 및 다른 PARG 억제제를 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, PARG 억제제의 용도, 특히 여기에 기재된 것과 당업계에 잘 알려진 것이 제시되고 또한 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모에 따른 질병이나 이상, 및/또는 괴사, 세포자멸사 또는 이들의 결합에 의한 세포의 손상 또는 사멸로부터 기인하는 조직 손상의 치료 또는 예방시 사용하는 방법이 제시된다.

특히 바람직한 PARG 억제제는 글루코스 유도체, 특히 화학식 I로 표시되는 글루코스 유도체를 포함한다:

(I)

여기서,

R₁- R₅가 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면, R₁-R₅는 각각 수소 원자 또는 X를 나타내고, X는 수산기와 저급 알콕시기(lower-alkoxy groups)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹에 의해 치환된 페닐(phenyl)을 갖고 있는 카르보닐(carbonyl)을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, X로 표시되는 저급 알콕시는 1 내지 4개의 탄소를 함유하며, 특히 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소-프로폭시, 부톡시, 이소-부톡시, 2-부톡시, 3-부톡시 등을 포함한다. 이 중에서도 메톡시가 바람직하다.

X로는 페닐이 알킬렌 또는 알케닐렌을 통하여 카르보닐과 결합된 것과 페닐이 직접 카르보닐에 결합된 것이 특히 바람직하다. 알킬렌으로는, 메틸린, 에틸렌 트리메틸렌 및 테트라메틸렌과 같은 1개 내지 4개의 탄소를 함유하는 것을 예로 들 수 있으며, 이 중에서도 메틸린과 에틸렌이 바람직하다. 알케닐렌으로는 1개 내지 4개의 탄소를 함유하는 것을 예로 들 수 있으며, 이 중에서도 비닐렌이 바람직하다.

X의 바람직한 예는 다음의 화학식으로 표시되는 그룹이다.

여기서 Z는 직접 결합, 알킬렌, 또는 알케닐렌을 나타내고, R₇- R₁₁는, R₇- R₁₁이 동시에 4개나 5개의 수소 원자가 아니라면, 각각 수소원자, 수산화기 또는 저급 알콕시를 나타낸다.

특히 바람직한 X의 특정예는, 갈로일(galloyl), 4-하이드록시-3-메톡시벤조일(4-hydroxy-3-methoxybenzoyl), 4-하이드록시-3,5-디메톡시벤조일(4-hydroxy-3,5,-dimethoxybenzoyl), 3,4,5-트리메톡시벤조일(3,4,5-trimethoxybenzoyl), 4-하이드록시-3-메톡시신나모일(4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl), 4-하이드록시-3,5-디메톡시신나모일(4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamoyl), 3,4,5-트리메톡시신나모일(3,4,5-trimethoxycinnamoyl), 3,4,5-트리하이드록시벤질카르보닐(3,4,5-trihydroxybenzylcarbonyl) 및 3,4,5-트리하이드록시페네틸카르보닐(3,4,5-trihydroxyphenetylcarbonyl)이다.

글루코스 유도체의 바람직한 예는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-글루코스(1,2,3,4,6-Penta-O-Galloyl-Glucose)이고 다음의 화학식을 갖는다.

이러한 PARG 억제제로써 유용한 본 발명의 글루코오스 유도체는 쉽게 구할 수 있는 재료로써 본 발명의 분야에 관련된 보통의 기술을 갖는 자에게 알려진 임의의 방법에 의해서 제조될 수 있다. 특히, 이러한 유도체는 아래의 방법에 의해서 제조될 수 있다.

여기서 X는 상기 설명된 것과 같은 것이다. 상기 반응은 평범한 에스테르 반응에 의해서 일어난다.

출발 물질인 화합물(ⅰ)과 화합물(ⅱ)는 기술분야에서 공지된 물질이고 쉽게 이용 가능하다. 상기 화합물(ⅰ)은 글루코오스이고 화합물(ⅱ)는 카르복시산이다.

본 발명에서 사용에 적합한 가수분해 가능한 타닌(tannins)과 리그닌(lignin) 글리코사이드는 기술분야에 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있고 아래와 같은 방법으로 제조될 수도 있다. 출발 물질로서, 솔방울(pinecones), 찻잎, 풀 말채나무(grass dogwood), 트리사카라이드 뿌리(trisaccharide root)등과 같은 임의의 적절한 유기 물질이 뜨거운 물, 에탄올, 아세톤 등과 같은 적절한 용매에서 약 1시간 내지 15시간동안 처리될 수 있다. 처리된 물질은 알칼린 용액(0.1내지 1N의 수산화나트륨, 암모늄 등)에서 추출된다. 추출된 액체는 pH 4 내지 6으로 조정되고, 동량의 에탄올이 부가되고, 상층액 분류(supernatant fraction)로 회수된다. 상층액 분류는 겔 여과에 의해 정련되고, 활성화된 부분이 회수된다. 얻어진 가수분해 가능한 타닌 또는 리그닌 글리코사이드는 투석(dialysis),원심분리(centrifugal separation), 냉동건조(freeze-drying), 등에 의해서 처리될 수 있다.

적절한 가수분해 가능한 타닌과 리그닌 글리코사이드는 폴리-(ADP리보오스) 글리코하이드롤라아제 억제 작용을 갖으며, 포유동물에게 폴리-(ADP리보오스) 글리코하이드롤라아제 억제 활성을 나타내며, 그리고 자유 라디칼에 의해 유도되는 세포 에너지 고갈, 세포 손상 또는 세포 사멸을 억제하거나 또는 감소시킨다. 의약 조성과 본 발명에 따른 방법에 유용한 가수분해 가능한 타닌과 리그닌 글리코사이드는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있으며, 바람직하기는 의약 조성물의 형태를 가진 적절한 캐리어와 함께 투여된다. 그러한 가수분해 가능한 타닌과 리그닌 글리코사이드는, 예를 들면 경구적 방법으로, 보통 약 몸무게의 1kg당 0.1 내지 100mg을 하루에 한번 또는 여러 번에 나누어 투여될 수 있는데, 여기서 투여량은 나이, 몸무게 및/또는 치료될 병과 치료에 대한 반응의 격렬함에 따라 다르다.

이러한 가수분해 가능한 타닌 글리코사이드의 독성은 조사되었으며, 경구적 투여에 의해서 LD50 수치가 100mg/kg 이상이었는데, 이는 극히 높아서 광범위한 안전 영역에 귀착한다.

적절한 아크리딘 유도체는 아래와 같은 구조를 갖는 구조식의 화합물을 포함한다.

여기서 R은 수소, 할로, 알킬할로, 하이드록시, C₁-C₆의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C₂-C₆의 직쇄 또는 측쇄 알케닐기, C₁-C₆의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, C₂-C₆의 직쇄 또는 측쇄 알케녹시기, 아미노, C₁-C₆알킬아미노, C₁-C₆알킬시오(alkylthio), 시오(thio), 니트로, 니트로소, 카르복시로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 상기의 알킬, 알케닐, 알콕시, 알케녹시, 알킬아미노, 알킬할로 및 알킬시오기들은 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 시오, 니트로, C₁-C₄알콕시 또는 C₂-C₄알케닐록시 중에서 선택된 하나 이상의 치환기와 치환된다.

다른 적절한 PARG 억제제는 아데노시드(adenoside) 유도체; 6,9-디아미노-2-에톡시아크리딘 락테이트 단일 수화물을 포함하는 아크리딘 유도체; 틸로론(tilorone) R10.556, 다우노마이신(daunomycin) 또는 다우노루비신(daunorubicin) 염산염을 포함하는 틸로론 유사체; 엘립티신; 프로플라빈; 그리고 기술분야에서 알려진 다른 PARG 억제제를 포함한다. PARG 억제제, 특히 상기 기술된 것은, 아래에 주어진 실험적 예에 의하여 보여지듯이 폴리(ADP-리보오스) 글리코하이드롤라아제 활성을 가지며, 특히 자유 라디칼이 유도하는 세포 에너지 고갈, 세포 손상 또는 세포 사멸을 감소시키거나 또는 억제하고 및/또는 괴사(necrosis) 또는 세포자멸(apoptosis)에 의한 세포 손상 또는 사멸의 결과인 질병이나 상황을 치료하거나 혹은 방지하는 폴리 (ADP-리보오스) 글리코하이드롤라아제 억제제로서 유용하다. 특히, PARG 억제제는 급성 통증(acute pain), 관절염(arthritis), 동맥경화증(atherosclerosis), 악액질(cachexia), 심장혈관 장애(cardiovascular disorder), 만성통증(chronic pain), 퇴행성 질환(degenerative disease), 당뇨병(diabetes), 세포의 수명 또는 증식 능력과 관계된 질병 또는 장애, 세포 노화, 두부외상(head trauma), 면역 노화, 염증성 내장 장애, 국소 빈혈(ischemia), 황반 변성(macular degeneration), 근이영양증(muscular dystrophy), 국소 빈혈과 재관류 손상(reperfusion injury)로 인한 신경 조직 손상(neuronal tissue damage), 신경학상의 중재된(neuronal mediated) 조직 손상 또는 병, 신경성 통증(neuropathic pain), 신경 손상(nervous insult), 골관절염(osteoarthritis),골다공증( osteoporosis), 말초 신경 손상(peripheral nerve injury),신장기능 부전(renal failure), 망막의 국소 빈혈, 패혈증성(septic) 쇼크, 피부 노화, 그리고 혈관성 뇌졸중(vascular stroke)을 포함하는 특정의 질병 또는 질병 상태를 방지하거나 치료하기 위해 유효량이 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 PARG 억제제는 글루코오스 유도체; 리그닌 그리코사이드; 갈로타닌과 엘라기타닌을 포함하는 가수분해 가능한 타닌; 아데노시드 유도체; 6,9-디아미노-2-에톡시아크리딘 락테이트 단일 수화물을 포함하는 아크리딘 유도체; 틸로론 R10.556, 다우노마이신 또는 다우노루비신 염산염을 포함하는 틸로론 유사체; 엘립티신; 프로플라빈; 그리고 다른 PARG 억제제들을 포함한다. 본 발명은 PARG 억제제를 포함하는 조제 조성물(pharmaceutical compositions)과 자유 라디칼이 유도하는 세포 에너지 고갈 및/또는 괴사, 세포자멸 또는 이들의 결합으로 인한 세포의 손상 또는 사멸으로부터 일어나는 조직 손상에 의한 질병 또는 상황을 치료하거나 예방하는데 PARG 억제제를 사용하는 방법을 포함한다.

본 발명에의 사용에 적합한 PARG 억제제는 약학적으로 수용 가능한 염, 수산화물, 에스테르, 용매, 프로드러그(prodrug), 대사산물(metabolities), 및 입체 이성체(stereoisomers)의 형태로, 자유 염기(base) 형태인 것이 유용하다. 이러한 형태는 본 발명의 범위 내이다. 실제로, 이러한 형태들의 사용은 중성 화합물의 사용에 달한다.

"약학적으로 수용 가능한 염", "수산화물", "에스테르" 또는 "용매"는 요구되는 약학적 활성을 갖고 생물학적으로 또는 다른 점에서도 바람직한 본 발명의 PARG 억제제의 염, 수산화물, 에스테르 또는 용매를 말한다.유기산이 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 바이술포네이트, 술포메이트, 술페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시클로펜탄-프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-하이드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 염을 생산하는데 사용 될 수 있다. 무기산이 염산염, 브롬산염, 요오드산염, 및 티오시아네이트와 같은 염을 생산하는데 사용될 수 있다.

적절한 염기 염의 예는 암모니아의 수산화물, 카보네이트 및 바이카보네이트, 나트륨, 리튬 및 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 염, 칼슘과 마그네슘 염, 알루미늄 염 및 아연 염과 같은 알칼리 토금속 염을 포함한다.

염은 또한 유기 염기로도 만들어질 수 있다. 본 발명의 PARG 억제제의 약학적으로 수용 가능한 염기 첨가 염의 제제에 적합한 유기 염기는 독성이 없고 그러한 염을 형성하기에 충분히 강한 유기 염기이다. 예를 들면, 그러한 유기 염기의 부류는 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민 및 디시클로헥실아민과 같은 모노-, 디-, 트리알킬아민; 모노-, 디-, 트리에탄올아민과 같은 모노-, 디-, 트리하이드록시알킬아민; 아르기닌, 리신과 같은 아미노산; 구아니딘; N-메틸-글루코스아민; N-메틸-글루카민; L-글루타민; N-메틸-피페라진; 모르폴린; 에틸렌디아민; N-벤질-페네틸아민; (트리하이드록시-메틸)아미노에탄; 등을 포함할 수 있다. 예를 들어 J.Pharm.Sci.,66:1, 1-19(1977)의 "약학적 염"을 보자. 이에 따르면, 염기성 질소-함유기는 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 염화물, 브롬화물, 및 요오드화물과 같은 낮은 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트와 같은 디알킬 술페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 염화물, 브롬화물 및 요오드화물 같은 긴 사슬 할라이드; 그리고 벤질 및 페네틸 브롬화물과 같은 아랄킬 할라이드를 포함하는 약제들로 콰터나이즈(quaternized)될 수 있다.

염기성 PARG 억제제의 산 첨가 염은 PARG 억제제의 자유 염기를 수용액 또는 물-알콜 용액 또는 적절한 산 또는 염기를 함유하는 다른 적당한 용매에 용해하는 방법에 의하거나, 용액을 증발시킴으로써 염을 분리해 내는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 대안적으로, 산성 기를 가진 PARG 억제제가 염기와 반응하는 것처럼, PARG 억제제의 자유 염기는 산과 반응하며, 반응은 유기 용매에서 이루어질 것이므로, 이 경우에 염은 직접 분리되거나 또는 용액을 농축시킴으로써 얻어진다.

"약학적으로 수용 가능한 프로드러그"는 그 약학적 효과를 나타내기 전에 생물학적 변형(biotransformation)을 하는 본 발명의 PARG 억제제의 유도체를 말한다. 프로드러그는 화학적 안정성의 향상, 환자의 수령과 순응의 향상, 생물학적 사용가능성의 향상, 활성의 기간 연장, 기관 선택성의 향상, 제제(formulation)의 향상(예를 들면, 수용성의 향상), 및/또는 부작용의 감소(예를 들면 독성)의 목적을 갖고 제제된다. 프로드러그는 본 발명에 의한 PARG 억제제로부터 Burger의 '의학 화학과 제약 화학', 제 5판, 1 권, p 172-178, 949-982(1995)에 기술된 것과 같이, 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 쉽게 제조된다. 예를 들면, 본 발명의 PARG 억제제는 하나 이상의 히드록시 또는 카르복시기를 에스테르로 전환함으로써 프로드러그로 변환된다.

체내에 들어가고 난 후에, 대부분의 약물은 그들의 물리적 성질과 생물학적효과를 변화시킬 화학 반응을 위한 기질(substrate)이 된다. PARG 억제제의 극성(polarity)에 보통 영향을 미치는 이러한 대사의(metabolic) 전환은 약물이 분배되고 체내로부터 배출되는 방식을 변화시킨다. 그러나, 어떤 경우에는, 약물의 변형(metabolism)이 치료상의(therapeutic) 효과를 위해서 요구된다. 예를 들면, 안티-대사산물(antimetabolite) 부류의 항암 약물은 그들이 암세포에 전달된 후에 활성 형태로 전환되어야 한다.

대부분의 약물이 어떤 종류의 대사의 변형을 겪기 때문에, 약물 대사에서 역할을 담당하는 생화학 반응은 다양하고 가지각색이다. 비록 다른 조직이 역시 참여하겠지만 약물 대사의 주요 위치는 간이다.

이러한 변형의 특징적 성격은 대사의 생산물 즉 "대사산물(metabolite)"이, 비록 극성 약물이 덜 극성인 생산물을 산출하기도 하지만 원래(parent) 약물보다 더 극성이라는 것이다. 막(membrane)을 쉽게 통과할 수 있는 높은 액체/물 부분 계수를 갖는 물질(substance)은 또한 세뇨관의 오줌(tubular urine)으로부터 신장부의 세뇨관 세포를 통해서 혈장 안으로 쉽게 역확산 될 수 있다. 그러므로, 그러한 물질은 신장에서의 배출이 낮고 몸에서 오래 머문다. 만약 약물이 더 극성인 화합물, 낮은 부분 계수를 가진 물질로 변형되면, 그 세뇨관의 재흡수는 크게 감소될 것이다. 더욱이, 기부의(proximal) 신장 세뇨관과 선세포조직(parenchymal) 간세포에서의 음이온과 양이온을 위한 특정 분비선(secretory) 기구는 높은 극성 물질에 작용한다. 특정 예로서, 페나세틴(아세토페네티딘)과 아세트아닐라이드는 둘 다 자극성이 적은(mild) 진통제(analgesic) 및 해열제(antipyretic) 약제이나, 체내에서더 극성이고 더 효과적인 대사물질이며 요즘 널리 사용되는 p-히드록시아세트아닐리드(아세트아미노펜)로 변한다. 아세트아닐리드의 일정량을 사람에게 투여했을 때, 그 연속하는 대사 산물은 혈장에서 순차적으로 최고조에 올랐다가 감소한다. 처음 1시간 동안에, 아세트아닐리드는 주요한 혈장 성분이다. 그 다음 시간에는, 아세트아닐리드의 레벨이 떨어지며, 대사산물 아세트아미노펜의 농도가 최고조에 이른다. 최종적으로, 몇 시간이 지나고 나면, 주요한 혈장 성분은 불활성이고 몸에서 배출될 수 있는 더 진전된 대사산물이 된다. 그러므로, 하나이상의 대사산물의 혈장에서의 농도는 약물의 농도처럼 약학적으로 중요하다.

약물 대사에 관련된 반응은 종종 아래의 표 1에 보여지는 것처럼 두 개의 그룹으로 분류된다. 상(phase) Ⅰ의 반응은 작용기화(functionalization) 반응이고 일반적으로 새로운 작용기를 창조하거나 변환하는 산화-환원 반응(1)과 에스테르와 아마이드를 차폐(mask)된 작용기를 해제하기(release) 위해서 분열시키는(cleave) 가수분해 반응(2)으로 구성된다. 이러한 변화는 극성이 증가하는 방향으로 일어난다. 상 Ⅱ의 반응은 결합(conjugation) 반응이며, 이 반응에서 약물 또는 종종 약물의 대사산물은 글루쿠로닉산, 아세트산 또는 황산과 같은 내생적인(endogenous) 기질로 연결된다(coupled).

상 Ⅰ의 반응(작용기화 반응)	(1) 간장의 마이크로솜(hepatic microsomal) P450 시스템을 통한 산화: 지방족 산화, 방향족 히드록시화, N-탈알킬화, O-탈알킬화, S-탈알킬화, 에폭시화, 산화적 탈아민화, 술폭시화물 형성, 탈황화, N-산화 및 N-히드록시화, 탈할로겐화(2) 마이크로솜 기구가 아닌 것을 통한 산화: 알콜과 알데히드 산화, 퓨린 산화, 산화적 탈아민화(모노아민 산화효소와 디아민 산화효소)(3) 환원: 아조와 니트로 환원(4) 가수분해: 에스테르와 아미드 가수분해, 펩티드 결합 가수분해, 에폭사이드 수화
상 Ⅱ의 반응(결합 반응)	(1) 글루쿠로니드화(2) 아세틸화(3) 메르캅튜릭 산 형성(4) 황산염 결합(5) N-,O-,및 S-메틸화(6) 트랜스-황화

여기서 PARG 억제제는 하나 이상의 비대칭 중심을 갖고 그러므로 입체이성질체(라세믹과 논-라세믹)의 혼합으로서 또는 개개의 R-, S-입체이성질체로서 생산될 수 있다. 개개의 입체이성질체는 광학적으로 활성화된 출발 물질을 사용함으로써, 합성의 적절한 단계에서 중간물질의 라세믹 또는 비라세믹(non-racemic) 혼합물을 용해함으로써, 또는 요구되는 PARG 억제제 화합물을 용해함으로써 얻어질 것이다. "이성질체" 라는 용어는 같은 수와 같은 종류의 원자를 갖고, 같은 분자량을 갖으나, 원자의 배열이나 구성(configuration)에서 차이가 있는 화합물을 말한다. "입체이성질체"는 공간에서의 원자의 배열만이 다른 이성질체이다. "거울상 이성질체(enantiomers)"는 포개지지 않는(non-superimposable) 서로의 거울상의 입체이성질체의 짝이다. "부분입체이성질체(Diastereoisomers)"는 서로의 거울상이 아닌 입체이성질체이다. "라세믹 혼합물"은 개개의 거울상 이성질체의 같은 또는 대충 같은 부분을 함유하는 혼합물을 의미한다. "비라세믹 혼합물"은 개개의 거울상 이성질체 또는 입체이성질체의 같지 않은, 또는 실질적으로 같지 않은 부분을 함유하는 혼합물이다.

화합물의 합성

약학적 조성으로 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 PARG 억제제는 공지되고 상업적으로 이용 가능한 출발 물질로부터 공지된 방법으로 합성되거나 문헌에서 대응되는 화합물을 제조하는데 사용된 방법에 의해서 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 아래에 서술된 일반적인 합성 방식을 사용하여, 유기화학의 표준 기술에 의해서 쉽게 제조될 수 있다. 전구물질(precursor) 화합물은 기술분야에 알려진 방법에 의해서 제조될 수 있다. 아래의 도식(schemes)은 본 발명의 바람직한 실시예에서 유용한 적절한 PARG 억제제의 제조를 보여주기 위한 것이며, 발명의 범위를 한정짓는 것은 아니다.

실시예 1

1. 1-O-벤질-D-글루코피라노즈 (화합물 1)의 합성

D-글루코오스(15.0g)가 벤질 알콜(100ml)에 첨가되었고 이렇게 얻어진 현탁액(suspension)은 0℃까지 냉각된다. 염화수소 가스가 현탁액에 30분동안 불어넣어졌다. 그 결과로 얻어진 용액이 상온에서 2일동안 교반된 후에, 에테르(500ml)가 첨가되고 그리고 상층액이 가만히 따라내 진다. 이 공정은 3번 반복된다. 그 결과로 얻어진 유성의 물질은 실리카 겔 관 크로마토그래피(실리카 겔, 용매:클로로포름:메탄올=8/1, 5/1)로 분리되어 화합물1(11.7g, 52%)이 얻어진다.

2. 3,4,5-트리벤질옥시벤조익 산(화합물 2)의 합성

디메틸포름아미드(50ml), 갈산(gallic acid)(10g), 무수 칼륨 탄산염(44g), 및 염화 벤질(27ml)을 질소 기류 하에서 혼합함으로써 얻어진 용액이 에틸 아세테이트(1 liter)로 희석된다. 그리고나서, 이 혼합물은 140℃에서 밤새 교반된다. 에틸 아세테이트 층이 물과 포화 살린 용액으로 씻겨지고, 마그네슘 황산염으로 건조된다. 용매가 감압 하에서 증류하여 제거된 후에 조제의(crude) 생산물이 얻어진다. 에탄올(200ml)와 1.6N의 나트륨 수산화물 수용액(50ml)이 얻어진 조제의 생산물에 첨가되고, 이 혼합물은 2시간 동안 가열 하에서 환류된다(refluxed). 반응 후에, 약 50%의 에탄올이 증류하여 제거되었다. 결과로 얻어진 침전물(sediment)은 0℃에서 냉각되고 0.5N 염산을 사용해 pH2로 조정된다. 침적된 고체는 화합물 2(15.6g, 64%)를 얻기 위해서 여과되고 건조된다.

3. 1-O-벤질-2,3,4,6-테트라키스-(3,4,5-트리벤질옥시벤조일)-D-글루코피라노스(화합물 3)의 합성

얼음냉각 하에 화합물2(7.0g), 티오닐 염화물(40ml), 및 디메틸 포름아미드(1ml)가 혼합되었다. 결과적 용액이 밤새 가열 하에 환류된 후에, 여분의 티오닐 염화물은 정상 압력과 감압 하에서 화합물2의 산 염화물을 제조하기 위해서 증류되어 제거된다. 질소 기류 하에서, 화합물1(0.83g)이 피리딘(10ml)에 첨가되고 그 혼합물은 교반된다. 상기 용액에, 화합물2의 산 염화물 용액(7.0g의 화합물2를 사용했을 때 얻어지는 조제의 생산물)을 피리딘(30ml)에 넣은 용액이 떨어뜨려진다. 상기 혼합물은 상온에서 밤새 교반되고 에틸 아세테이트(0.6 liter)로 희석된다. 이렇게 얻어진 현탁액은 여과된다. 상기 에틸 아세테이트 층은 물, 0.05N의 염산, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 살린 용액으로 씻어지고, 그리고 나서 황산 마그네슘으로 건조된다. 용매가 감압 하에서 증류되어 제거된 후에, 천연 그대로의 생산물이 얻어진다. 이렇게 얻어진 조제의 생산물은 화합물3(2.85g, 49%)을 얻기 위해서 실리카 겔 관 크로마토그래피(실리카겔, 용매: 에틸 아세테이트: 헥산 = 1/4, 1/3, 1/2)로 분리된다.

¹H-NMR (CDCl₃)δ: 4.2-4.8 (m,3H), 4.8-5.1(m,24H), 5.1-5.7(m,3H), 6.1-6.3(m,1H), 및 7.1-7.6(m,72H).

IR (KBr, cm^-1) : 1,718 및 1,580

4. 2,3,4,6-테트라키스-O-갈로일-D-글루코피라노스(화합물 4)의 합성

화합물3(2.85g), 에틸 아세테이트/메탄올(3/1, 150ml), 및 팔라듐-블랙(3.0g)의 혼합 후에, 수소 치환이 개시된다. 상온에서 약 1시간동안 반응 혼합물이 교반된 후에, 팔라듐-블랙이 제거된다. 결과로 얻어진 여과액(filtrate)이 농축되고 실리카겔 관 크로마토그래피(실리카겔, 용매: 헥산: 테트라하이드로퓨란: 메탄올 = 60/30/10, 50/37.5/12.5, 40/45/15)에 의해서 분리되어 화합물4(0.94g, 86%)가 얻어진다.

¹H-NMR (DMSO-d₆)δ: 4.3-4.5(m,2H), 5.0-5.2(m,2H), 5.3-5.5(m,2H), 5.8-6.2(m, 1H, H¹), 6.7-7.1(m,8H), 및 9.19(brs, 12H)

IR (KBr, cm^-1): 3,300, 1,700, 및 1,610

¹³C-NMR (DMSO-d₆)δ: 62.0, 66.2, 67.0, 68.4, 69.4, 89.5, 104.2, 108.8, 116.2, 116.3, 116.5, 116.6, 119.1, 138.6, 138.7, 139.0, 142.8, 143.0, 145.3, 145.5, 145.6, 164.5, 164.7, 165.0, 165.2, 및 165.5(α와 β의 혼합)

실시예 2

1,2,3,4,5-펜타-O-갈로일-β-D-글루코피라노스(화합물 5)의 합성

타닌산(25g), 메탄올(200ml) 및 0.1M 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 6.0, 200ml)가 혼합되고 반응은 온도조절장치(thermostat)에서 37℃에서 7일 동안 이따금씩 교반하면서 진행된다. 반응 후에, 상기 용액은 그 부피를 약 50% 정도로 줄이기 위해 농축되고 결과물인 농축액은 에틸 아세테이트로 추출된다. 결과적인 추출물은 물과 포화 살린 용액으로 세척되고, 그 후,황산 마그네슘으로 건조된다. 용매가 증류되어 제거된 후에, 조제의 생산물(약 20g)이 얻어진다. 얻어진 조제의 생산물(10g)이 실리카겔 관 크로마토그래피(실리카겔, 용매: 헥산: 테트라하이드로퓨란: 메탄올 = 6/3/1, 50/37.5/12.5, 4/4.5/1.5)에 의해서 분리되어 화합물5(1.39g)가 얻어진다.

¹H-NMR (DMSO-d₆)δ: 4.3(brs), 4.5-4.6(m), 5.94(d, d, J=9.7), 6.35(d, J=8.3Hz, 1H), 6.77(s, 2H), 6.82(s, 2H), 6.85(s, 2H), 6.92(s, 2H), 6.98(s, 2H), find9.11(brs, 15H).

IR (KBr, cm^-1): 3,350, 1,700, 및 1,610

¹³C-NMR (DMSO-d₆)δ: 61.3, 67.6, 70.5, 71.9, 72.2, 91.7, 108.8, 117.4, 118.0, 118.1, 118.9, 138.6, 138.8, 139.0, 139.5, 145.3, 145.3, 145.4, 145.6, 163.9, 164.4, 164.6, 164.8, 및 165.4.

실시예 3 내지 5

아래의 세 화합물은 실시예 1에 따라서 합성되었다.

실시예 3

1,2,3,4,6-펜타-O-(3,5-디메톡시-4-히드록시시나모일)-D-글루코피라노스

¹H-NMR (CDCl₃/D₂O)δ: 3.78-4.01(m, 30H), 4.27-6.90(m, 7H), 6.13-6.55(m, 5H), 6.60-6.90(m, 10H), 및 7.46-7.80(m, 5H).

IR (KBr, cm^-1): 2,950, 2,850, 1,710, 1,630, 1,600, 1,510, 1,460, 1,280,및 1,220.

실시예 4

1,2,3,4,6-펜타-O-(3,4,5-트리메톡시벤조일)-D-글루코피라노스

¹H-NMR (CDCl₃)δ: 3.8-4.1(m, 45H), 4.3-4.9(m, 3H), 5.57(dd, 0.4H), 5.7-5.9(m, 1.6H), 5.9-6.2(m, 0.6H), 6.2-6.4(m, 1H), 6.81(d, 0.4H), 및 7.1-7.5(m, 10H).

IR (KBr, cm^-1): 1,720, 1,580, 1,330, 1,210, 및 1,125 mp. 85-90℃

실시예 5

1,2,3,4,6-펜타-O-(3,4,5-트리메톡시시나모일)-D-글루코스

¹H-NMR (CDCl₃)δ: 3.60-4.05(m, 45H), 4.30-6.97(m, 7H), 6.19-6.55(m, 5H) 및 6.60-6.97(10H).

IR (KBr, cm^-1): 2,930, 1,720, 1,630, 1,580, 1,500, 1,270, 1,240, 및 1,130.

실시예 6

솔방울(pinecones)로부터 가수분해 가능한 타닌의 제조

솔방울은 뜨거운 물에서 물의 양 및/또는 솔방울의 양에 따라서 끓이는 시간을 다르게 하여 , 그러나 일반적으로는 2시간씩 3번, 끓임으로서 추출된다. 솔방울들이 뜨거운 물에서 추출된 후에, 그들은 반쯤 말려지고, 에탄올에 담가지고, 상온에서 밤새 놔두어진다. 에탄올에서 솔방울의 추출 후에, 상기 솔방울은 반쯤 말려지고, 결과적인 가수분해 가능한 타닌 또는 리그닌 글리코사이드는 아세톤에 담가서 추출되며, 상온에서 밤새 놔두어지고, 램프에 의해서 건조되고, 6시간동안 또는 밤새 교반하여서 1N의 수산화나트륨에서 추출된다. 아세트산이 상기 추출된 용액에 첨가되고, pH가 5.0으로 돌아간다. 침전물은 고속 원심력 작용에 의해서 제거된다. 에탄올의 당량이 추출된 용액에 첨가되고, 저온의 방에서 밤새 방치된다. 침전물은 고속 원심력 작용에 의해서 제거되고, 상층액은 물에 투석된다(dialyzed). 투석된 용액은 냉동-건조되고, 분말이 얻어진다. 상기 냉동-건조 분말은 세파로스 CL-4B(이동 bed는 0.1N 수산화나트륨이다.)에 의해서 정제된다. 활성 부분(fraction)은 수집되고 물에서 투석되며, 냉동-건조되어, 분말이 얻어진다. 이러한 냉동-건조 분말은 10% 에탄올에 용해되고, 토요펄 HW-40F(이동 bed는 10% 에탄올이다)에 의해서 더 정제된다. 활성 분류는 수집되고, 물에서 투석되고, 냉동-건조되고, 최종 분말이 얻어진다.

테스트 실시예 1

폴리-(ADP-리보오스) 글리코하이드롤라제에의 억제 효과

효력 검정(assay)을 위한 완충제(buffer)(0.01% 보빈 혈청 알부민, 10mM 메르캅토에탄올, 50mM 인산 칼륨, pH 7.0)에 3H-(ADP-리보오스)n=15 가 첨가되고, 그들의 27 pl에, 더하여, 시험되는 물질과 사람의 태반(placenta)에서 제조된 핵 유도체 폴리-(ADP-리보오스) 글리코하이드롤라제 용액이 총 30pl을 만들기 위해서 더해지며, 이는 1시간동안 37℃에서 배양된다. 그 후, 반응용액은 DE81 필터지에 흡수되고, 필터지는 물, 에탄올, 및 아세톤에서 세척되고, 건조되고, 반응되지 않은 기질 3H(ADP-리보오스)가 액체 섬광 계수기에 의해서 측정되고 시험되는 물질의 이 효소에 대한 억제 작용이 조사된다. 결과가 표 2에 보여지는데, 이는 모든 시험되는 물질이 폴리-(ADP-리보오스) 글리코하이드롤라제를 투여량에 의존하여 억제한다는 것을 보여준다.

타닌 글리코사이드의 폴리-(ADP-리보오스) 글리코하이드롤라제에 대한 억제 작용

타닌의 농도	PARG의 활성도(%)
0	100
0.3	86
1.0	24
3.0	4

다른 것들 중에서, 상기 언급된 합성 방법을 사용한 본 발명의 다른 변화(variations)와 변형(modification)은 기술분야에서 당업자에게 명백할 것이다.

도 1은 종양(tumor)같은 쥐과 동물의 대식세포(murine macrophage)에서 얻어내고, 10%의 말 혈청과 2mM의 L-글루타민이 포함된 둘베코 모디파이드 이글 미디엄(Dulbeco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 보관된, P388D1 세포(ATCC, #CCL-46)를 보여준다. 세포파괴(cytotoxicity) 효력 검정이 96-웰(well) 플레이트에 설정되었다. 각각의 웰에서, 190ul 세포가 2x10⁶/ml의 밀도로 뿌려졌다(seeded). 투여량 반응 실험이 행해졌다. 다양한 농도의 PARG 억제제가 세포들에 첨가되었다. 전형적인 실험은 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200uM의 최종 농도를 가진 투여량으로 구성된다. 각각의 데이터 점은 4번의 실험결과(quadruplicate)로부터 평균했다. 15분의 배양 후에, 5ul의 새로의 제조된 과산화수소가 세포들에 최종 농도 2mM로 첨가되었다. 화합물을 갖지 않는 웰의 세트는 배경 결정(background determination)을 위해서 과산화 수소에 노출되지 않았다. 세포들은 37℃의 배양기로 돌려보내져서 4시간 동안 배양된다. 배양의 끝에, 상층액의 25ul가 세포 배지(media)에서 죽은 세포로부터 방출되는 락테이트 탈수소화제(LDH)의 레벨을 결정하기 위해서 견본이 되었다. 우리는 시그마 사에서 개조된(adapted) LDH 효력 검정을 사용하였으며 제조에 따른 실험 공정을 따랐다. LDH의 활성은 340nM에서 NADH의 흡수도의 감소 비율을 조사함으로써 결정되었다. 배경 LDH 활성은 생략했다(subtracted). 약물 처리를 하지 않은 그룹은 과산화수소 처리로 인한 총 세포의 사멸을 계산하기 위해서 사용되었다. PARG 억제제의 보호 효과는 세포의 생존 비율로 표현되었다.

도 2는 세포 파괴 투여량의 반응 곡선에서 결정된 EC₅₀을 보여준다. EC₅₀을 결정하기 위해서, 세포 사멸의 50% 감소를 달성하기 위해 요구되는 화합물의 농도가 투여량 반응 곡선에서 나온다. PARG 활성의 퍼센트 값은 세포파괴 효력 검정에서 과산화수소 최종농도 2mM로 인한 세포 사멸의 감소 퍼센트와 같다. 모든 방법이 도 1에 묘사된 것과 같다.

도 3은 폴리 (ADP-리보실)화와 그의 세포 에너지 대사와 여기서 언급된 다양한 용도, 질병들에 관한 관계의 유지를 위한 PARP/PARG 순환기(cycle)의 단순화된 묘사이다. 이 도식은 RAPG 억제가 여기 언급된 다양한 질병의 예방과 치료를 위한 용도를 포함하는, 여기 언급된 다양한 용도를 위해 어떻게 유익할 수 있는지에 대한 두 개의 일반적인 기구를 제시한다. 본 발명은 또한 PAR 대사와 무관한 질병의 기구에 작용하는 PARG 억제제처럼, 본 출원서에서 언급되지 않은 PARG 억제제와 여기서 언급된 유용한 방법들의 다른 활성 모드들을 심사숙고한다. 생략용어의 설명: NAD, 니코틴아미드 아데노신 디뉴클레오티드; NAM, 니코틴아미드; ATP, 아데노신 트리포스페이트; ROS, 반응성 산소 종; NOS, 니트릭 옥사이드 신타제.

약학적 조성물

본 발명에 대한 한층 더한 관점은 약학적으로 수용 가능한 캐리어나 희석제 및 치료에 효과적인 양의 PARG 억제제 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매, 프로드러그, 대사산물 또는 입체이성질체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

PARG 억제제는 장의(enteral) 또는 비경구적인(parenteral) 적용을 위한 부형제(excipients)나 캐리어와 관련하여 또는 이의 혼합인 효과적인 양을 포함하는약학적 제제의 제조에 유용하다. 그러한 것으로서, 경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는, 분말이나 미립(granule)의 형태로; 수성 용액이나 또는 비수성 용액의 현탁액이나 용액의 형태로; 기름/물 에멀션 또는 물/기름 에멀션의 형태로; 각각이 미리 정해진 양의 활성 성분을 포함하는 캡슐, 교갑(cachet), 정제(tablet), 알약(troche) 또는 마름모꼴 정제(lozenges)와 같은 분리된 단위의 형태일 수 있다. 활성 성분은 또한 큰 환약(bolus), 연약(electuary), 또는 연고(paste)의 형태일 수 있다.

조성물은 보통 정제, 캡슐, 수화 현탁액 또는 용액과 같은 단위 투약 형태로 제제될 것이다. 그러한 제제는 대체로 고체, 반고체, 또는 액체 캐리어를 포함한다. 예시적인 캐리어는 락토스, 덱트로스, 수크로스, 소르비톨, 마니톨, 녹말, 아카시아 검, 인산칼슘, 광물유(mineral oil), 코코아 버터, 테오브라오마(theobraoma)의 기름, 알기네이트, 트라가칸스, 겔라틴, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 메틸 하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 등을 포함한다.

특히 바람직한 제제는 활성 성분과 (a)락토스, 덱트로스, 수크로스, 마니톨, 소르비톨, 셀룰로오스, 건조한 옥수수 녹말, 및 글리신과 같은 희석제; 및/또는 (b)실리카, 탈쿰, 스테아릭 산, 그의 마그네슘염 또는 캄슘염, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제; 를 더불어 포함하는 정제와 겔라틴 캡슐을 포함한다.

정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 녹말 풀, 겔라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 결합제(binder); 락토스, 옥수수 녹말과 같은 캐리어; 녹말, 아가르(agar), 알기닉산, 또는 그의 나트륨염, 및 비등성의(effervescent) 혼합물과 같은 붕괴제(disintegrants); 및/또는 흡수제, 착색제, 향료, 및 감미제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 살균되고 및/또는 보존제, 안정제, 팽윤제 또는 유화제와 같은 보조제(adjuvant), 용액 증진제(promoter), 삼투압을 조정하기 위한 염, 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 게다가, 조성물은 또한 다른 치료를 위해 유용한 물질들을 포함할 수 있다. 수화 현탁액은 활성 성분과 결합하여 유화제와 현수제(suspending agent)를 포함할 수 있다. 모든 경구 투여 형태는 감미제 및/또는 향료 및/또는 착색제를 또한 포함할 수 있다.

이러한 조성물들은 각각 일반적인 혼합, 과립화(granulating), 또는 코팅하는 방법에 의해서 제조되며, 0.1 - 75%의 활성 성분, 바람직하게는 약 1 - 50%의 활성성분을 포함한다. 정제는 활성 성분을 선택적으로 하나 이상의 부속 성분과 함께 압축하거나 주형함으로써 만들어질 수 있다. 압축 정제는 적절한 기계에서 분말 또는 과립(granule)과 같은 자유-흐름(free-flowing) 형태인 활성 성분을, 선택적으로 결합제, 윤활제, 비활성 희석제, 표면 활성제, 또는 분산제와 혼합하여 압축함으로써 제조될 수 있다. 조형 정제는 적절한 기계에서 분말로 된 활성 성분과 불활성 액체 희석제로 습윤된 적절한 캐리어의 혼합물을 조형(molding)함으로써 만들어질 수 있다. 비경구적으로 투여될 때, 조성물은 보통 단위 투여일 것이며, 약학적으로 수용 가능한 캐리어를 가진 살균 투입 형태(수화 이소토닉 용액, 현탁액, 에멀션)일 것이다. 그러한 캐리어는 비-독성, 비경구적-적용가능하고 그리고 치료법상의 희석제 또는 용매를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러한 캐리어의 예는 물; 살린(이소토닉 염화나트륨 용액), 링거(Ringer's) 용액, 덱트로스 용액, 한크(Hank's) 용액과 같은 수화 용액; 및 1,3-부탄디올, 불휘발성(fixed) 기름(예를 들면, 옥수수, 목화씨, 땅콩, 참깨 기름, 및 합성 모노-또는 디-글리세리드), 에틸 올레산염(oleate), 및 이소프로필 미리스테이트와 같은 비수화 캐리어를 포함한다.

유성의(oleaginous) 현탁액은 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현수제를 사용하여 조제될 수 있다. 수용 가능한 용매 또는 현탁 매개 중에는 멸균 불휘발성 기름이 있다. 이 목적을 위해서, 어떠한 자극성 적은(bland) 불휘발성 기름도 사용될 수 있다. 특히 그들의 폴리옥시에틸레이트된 형태인, 올리브 기름과 캐스터(castor) 기름을 포함하는 올레산과 그의 글리세리드 유도체와 같은 지방산이 또한 주사 가능 물질(injectables)의 제조에 유용하다. 이러한 기름 용액 또는 현탁액은 장쇄(long-chain) 알콜 희석제 또는 분산제를 포함할 수도 있다.

멸균 살린은 바람직한 캐리어이고, 이 화합물은 종종 모든 예지할 수 있는 필요에 대해 용액을 만들만큼 충분히 수용성이다. 이 캐리어는 용해성, 등장성(isotonicity), 및 화학적 안정성을 증가시키는 물질, 예를 들면 산화 방지제, 완충제 및 방부제와 같은 첨가제를 적은 양으로 포함할 수 있다. 직장에(rectally) 투여된 경우, 조성물은 일반적으로 좌약(suppository)이나 교갑(cachet)과 같은 단위 투여 형태로 제제될 것이다. 이러한 조성물은 상온에서는 고체이나 직장의 온도에서는 액체이어서 직장 안에서 녹아서 화합물을 방출하는 적절한 비 염증성(non-irritating) 부형제를 화합물과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 일반적인 부형제는 코코아 버터, 밀랍(beeswax), 및 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 지방 에멀션이나 혼탁액을 포함한다.

게다가, 상기 화합물은 눈 , 피부, 또는 하부 장 영역(tract)의 신경학적인 질병을 포함하는, 국소 적용이 수월한 영역이나 기관과 관련된 치료를 위한 상황의 경우에 특히 국소적으로 투여될 수 있다.

눈에의 국소적 적용을 위해서, 또는 안과적 사용을 위하여, 화합물은 pH-적정된 멸균 살린 등장액의 미분된(micronized) 현탁액으로서 또는, 바람직하기는 벤질알코늄 염화물과 같은 방부제를 포함하거나 포함하지 않는 pH-적정된 멸균 살린 등장액의 용액으로써 제제될 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물은 바셀린(petrolatum)과 같은 연고로서 제제될 수도 있다.

피부에의 국소적 적용을 위해서 화합물은, 예를 들면, 광물유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 화합물, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화(emulsifying) 왁스 및 물 중의 하나 이상의 혼합물에 현탁되거나 또는 녹아있는 화합물을 포함한 적절한 연고로 제제될 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물은 예를 들면, 광물유, 소르비탄 모노에스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물 중의 하나 이상의 혼합물에 활성 화합물이 현탁되어 있거나 녹아있는 적절한 로션 또는 크림으로써 제제될 수 있다.

하부 장 영역에의 국소적 적용에 직장의 좌약 제제(상기 언급한) 또는 적절한 관장제(enema) 제제가 효과적일 수 있다.

코의(nasal) 또는 입의(buccal) 투여를 위해서 (자가-추진 분말 분산 제제와 같은) 적절한 제제는 활성 성분의 약 0.1% 내지 5% w/w 또는 예를 들면, 약 1% w/w를 포함할 수 있다. 그에 더하여, 어떤 제제들은 설하선(sublingual) 알약 또는 마름모꼴 정제의 형태로 만들어 질 수 있다.

제제는 편리하게 단위 투여 형태로 제공될 것이고 약학 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해서 제조될 수 있을 것이다. 모든 방법은 활성 성분을 하나 이상의 부가적 성분으로 구성되는 캐리어와 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 균일하고 친밀하게 액체 캐리어 또는 세세하게 분화된 고체 캐리어 또는 양자모두와 결합하고, 그후 필요하다면 생산물을 요구되는 제제 모양으로 만듦으로써 제조된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 캐리어는 고체의 생분해성 중합체 또는 적절한 시간 이완(release) 특징과 이완 운동학(kinetics)을 갖는 생분해성 중합체들의 혼합물이다. 본 발명의 조성물은 장기간동안 재투여를 자주 할 필요가 없는 본 발명의 화합물의 효과 있는 농도를 제공하기에 적절한 고체 임플란트(implant)로 조형될 수 있다. 본 발명의 조성물은 기술분야에서 일반적인 기술을 가진 자에게 알려진 임의의 적절한 방법으로 만든 생분해성 중합체 또는 중합체 혼합물로 구체화되고(incorporated), 생분해성 중합체와 균질(homogeneous) 매트릭스를 형성하거나 중합체 안에 어떤 방법으로 캡슐 안에 쌓일 수도 있고 또는고체 임플란트로서 조형될 수도 있다. 하나의 실시예에서, 상기 생분해성 중합체 또는 중합체 혼합물은 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 연한 "저장소(depot)"를 형성하는데 사용되며, 이러한 저장소는 예를 들면 주사에 의해서 유동성 액체로서 투여될 수 있으나, 약학적 조성물이 주사 맞은 곳의 주변 국소 지역에만 머무를 수 있을 만큼 충분히 점성이어야 한다. 이와 같이 형성된 저장소의 분해 시간은 선택된 중합체와 그의 분자량에 따라서 수일에서 수년까지 다양할 수 있다. 주사 가능한 형태의 중합체 조성물을 사용함으로써, 절개(incision)를 할 필요성조차 감소한다. 어떠한 경우라도, 유연한 또는 유동성의 운송 "저장소"는 주변 조직들에 최소의 충격을 주며 몸 안에서 그것이 차지하는 공간의 형상으로 조화시킬 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 치료상에 유효한 양으로 사용되는데, 상기 사용되는 양은 요구되는 이완 태도(profile), 항원에 민감해지는 효과(sensitizing effect)를 위해 요구되는 약학적 조성물의 농도, 및 약학적 조성물이 치료를 위해서 방출되어야 할 시간의 길이에 의존한다.

본 발명의 PARG 억제제는 화합물의 하나 또는 분화된 투여량을 포함하는 캡슐이나 정제, 또는 멸균 용액, 현탁액, 혹은 에멀션으로서 하나 혹은 분화된 투여량이 비경구적으로 투여되는 것이 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 PARG 억제제는 동결건조된(lyophilized) 형태로 제조될 수 있다. 이 경우에, PARG 억제제의 1 내지 100mg이 개개의 물약병(vials)에서 캐리어 및 마니톨이나 인산 나트륨과 같은 완충제와 같이 동결건조될 수 있다. 상기 조성물은 투여 전에 물약병에서정균성(bacteriostatic) 물과 함께 재구성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 치료상 유효한 양의 조성물로 사용된다. PARG 억제제의 유효량은 사용되는 특정 화합물에 따라 다르지만, 이러한 화합물의 약 1% 에서 약 65%사이를 변하는 양은 액체 또는 고체 캐리어 운송 시스템에 쉽게 혼합된다.

자유 라디칼이 유도하는 세포 에너지 고갈, 세포 손상 또는 세포 사멸을 억제하거나 또는 감소시키는 조성물과 방법

바람직하게, 본 발명에 따르면, 상기 설명한 화합물과 조성물의 치료에 유용한 양이 자유 라디칼이 유도하는 세포 에너지 고갈, 세포 손상 또는 세포 사멸을 억제하거나 또는 감소시키기 위해 동물에게 투여된다. 본 발명의 다른 실시예에서, PARG 억제제를 이용한 본 발명의 약학적 조성물과 방법은 뉴론의(neuronal) 활성에 영향을 미치는데, 이 활성은 NMDA 신경독성(neurotoxicity) 또는 글루타메이트 신경독성에 의해서 중재되거나 혹은 중재되지 않는다. 이러한 뉴론의 활성은 손상된 뉴론의 자극, 뉴론의 재생 촉진, 뉴론의 변성(degeneration) 방지, 및 뉴론의 질환 치료로 구성된다. 이에 따라, 본 발명은 뉴론의 손상을 치료하기 위해서, 특히 대뇌의 국소 빈혈과 재관류 손상으로 인한 손상과 또는 포유동물의 뉴런-퇴행성(neurodegenerative) 질환을 치료하기 위해서 상기 동물에게 본 발명의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 동물의 신경조직의 활성에 효과를 미치는 방법과 관련된다.

"신경조직(nervous tissue)"이란 용어는 뉴런(neurons), 신경 지지세포(neural support cells) ,신경교(glia), 슈완(Schwann) 세포, 이러한 구조 안에 포함되고 이를 제공하는 맥관구조(vasculature), 중앙신경계, 뇌, 뇌간(brain stem), 척수(spinal cord), 중심 신경계와 말초 신경계의 접합점(junction), 말초신경계, 및 동류의(allied) 구조를 제한 없이 포함하는, 신경계를 구성하는 다양한 구성요소들을 말한다.

"국소빈혈과 재관류 손상 및 뉴런-퇴행성 질환으로 인한 뉴런 조직 손상"이라는 용어는 혈관성 뇌졸중에서 보여지는 것과 같은 신경독성, 전체적(global) 및 국부의(focal) 국소빈혈, 및 망막의(retinal) 국소빈혈을 포함한다.

"국소빈혈(ischemia)"이란 용어는 동맥피의 유입의 장애로 인한 국소적 조직 빈혈증(anemia)을 말한다. 전체적 국소빈혈은 전체 뇌로 흘러가는 혈액이 잠시동안 멈춘 때에 일어난다. 전체적 국소빈혈은 심장 중지(cardiac arrest) 때문에 일어날 수도 있다. 국부의 국소빈혈은 뇌의 일부분에 정상적인 혈액 공급이 부족할 때 일어난다. 국부의 국소빈혈은 대뇌 맥관(cerebral vessel)의 혈전색전증적 폐색(thromboembolytic occlusion), 외상으로 인한 머리 손상, 부종(edema) 또는 뇌종양으로 인해서 일어날 수도 있다. 순간적일 지라도, 전체적 및 국부의 국소빈혈은 광범위한 뉴런의 손상을 야기할 수 있다. 비록 신경 조직 손상이 국소빈혈이 일어난 지 몇 시간 혹은 며칠 후에 일어나더라도, 일부의 영구적 신경 조직 손상은 혈액이 뇌로의 흐름이 정지된 최초 몇분간에 발생한다. 이러한 손상의 많은 부분이 글루타메이트 독성과 손상된 내피(endothelium)에 의한 혈관에 작용하는(vasoactive) 생산물의 방출과 세포 파괴(cytotoxic) 생산물의 방출과 같은, 그리고 손상된 조직에 의한 자유 라디칼과 류코트라이인(leukotrines)과 같은 조직 재관류의 제 2의 결과에 기여한다. 국소빈혈은 심근의골절(myocardial infraction)과 죽상동맥경화증(atherosclrerosis), 트롬비(thrombi), 또는 경련(spasm)의 결과로 관상 동맥(coronary arteries)이 방해되는 다른 심혈관의(cardiovascular) 병으로 심장에도 일어날 수 있다.

"뉴론-퇴행성 질병(neurodegenerative disease)"이란 용어는 알츠하이머 병(노망), 파킨슨 병과 헌팅턴 병을 포함한다.

"신경 손상(nervous insult)"란 용어는 신경 조직에 대한 어떠한 손상과 어떠한 장애(disability) 또는 그로 인한 사멸을 지칭한다. 신경 손상의 원인은 대사의(metabolic), 독성의, 뉴런독성의, 의원성의(iatrogenic),열적인 또는 화학적일 수 있고, 국소빈혈, 저산소증, 뇌맥관의 고장(cerebrovascular accident), 외상, 수술, 압력, 중량 효과, 출혈, 방사선, 혈관경련, 신경조직퇴행성 질병, 감염, 파킨슨 병, 근위축성 잠재성 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 수초발생/수초탈락(myelination/demyelination) 과정, 간질, 인식적인 질병(cognitive disorder), 글루타민산염 비정상 및 그들의 제2 효과를 제한 없이 포함한다.

본 발명을 이용한 방법에 의해서 치료 가능한 신경학상의(neurological) 질병의 예는 삼차신경의 신경통(trigeminal neuralgia); 설인두의(glossopharyngeal) 신경통; 벨의 마비(Bell's palsy); 근무력증 그레이비스 병(myasthenia gravis); 근육의 영양실조(muscular dystrophy); 근위축성 잠재성 경화증(ALS); 진행성 근육위축증(atrophy); 진행성 연수 의 유전 근육 위축증; 헤르니아가 되거나, 탈장되거나(ruptured), 또는 탈장된(prolapsed) 무척추동물의 디스크 증후군; 경추화증 척추강직(cervical spondylosis); 신경총(plexus) 질병; 흉곽의 방출구 파괴 증후군(thoracic outlet destruction syndromes); 납, 답손(dapsone), 진드기(ticks), 포르피린증(porphyria), 또는 길라인-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)에 의해 유발된 것과 같은 말초 신경장애(peripheral neuropathies); 알츠하이머 병; 헌팅턴 병 및 파킨슨 병을 제한 없이 포함한다.

본 발명의 방법은 특별히 외상 또는 병의 상태에 의해서 유발된 말초 신경장애; 외상적인 뇌 상처과 같은 머리 외상; 척수에 대한 물리적 손상; 저산소증, 뇌 손상과 관련된 혈관성 뇌졸중, 국부적 대뇌의 국소빈혈, 전체적 대뇌의 국소빈혈, 및 대뇌의 재관류와 관련된 뇌 손상과 관련된 뇌졸중; 복합 경화증(multiple sclerosis)과 같은 수초탈락 병; 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병 및 근위축성 잠재성 경화증(ALS)와 같은 신경조직퇴행에 관련된 신경학상의 질병으로 구성된 그룹에서 선택된 신경학상의 질병을 치료하는데 유용하다.

"뉴런-보호(neuroprotective)"라는 용어는 신경 손상을 감소하거나 정지(arresting) 또는 개선(ameliorating)하는 효과 및 신경 손상을 입은 신경 조직을 보호, 소생(resuscitating), 회생시키는 효과를 말한다.

"신경조직퇴행(neurodegeneration)을 방지"란 용어는 신경조직퇴행성 질병을 갖고 있다고 진단된 환자 또는 신경조직퇴행성 질병을 발달시킬 위험에 있는 사람의 신경조직의 퇴행을 방지할 수 있는 능력을 포함한다. 이 용어는 또한 이미 신경조직퇴행성 질병의 증상을 갖고 있거나 이로부터 고통받고 있는 환자들의 신경조직퇴행이 더 진행되는 것을 방지하는 것을 포함한다.

"치료(treating)"란 용어는 다음을 지칭한다:

(1) 질병, 질환, 및/또는 이상에 걸리기 쉬우나, 아직 이를 갖고 있다고 진단되지 않은 동물에게 질병, 질환 또는 이상이 일어나는 것을 방지;

(2) 질병, 질환 또는 이상을 억제, 즉, 그 발달을 저지하는 것; 및

(3) 질병, 질환 또는 이상을 완화, 즉 질병, 질환, 및/또는 이상의 퇴보를 야기하는 것, 즉 질병, 질환 및/또는 이상의 퇴화(regression).

다른 PARG와 관련된 질병의 치료

본 발명의 화합물, 조성물, 그리고 방법은 또한 본 발명의 약학적 조성물의 유효량을 동물에게 투여함으로써 동물의 심혈관의 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

여기에 사용된 것처럼, 상기 용어 "심혈관의 질병(cardiovascular disorders)"은 국소빈혈을 야기시키는 질병이거나 심장의 재관류에 의해서 야기되는 질병들을 지칭한다. 예는 관상 동맥 장애(coronary artery disease), 협심증(angina pectoris), 심근경색(myocardial infarction), 심장의 정지(cardiac arrest)에 의해서 야기되는 심혈관의 조직 손상, 심장의 대체혈관(bypass)에 의해서 야기되는 심혈관의 조직 손상, 심장성 쇼크, 및 해당분야의 일반적인 기술을 아는 자에게 공지된 관련 이상 또는 심장 또는 심혈관, 특히 PARP 활성에 관계된 (그러나 이에 제한되지는 않는) 조직 손상으로 인한 오작동을 수반하는 관련 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

예를 들면, 본 발명의 방법은 심장 조직 손상을 치료하는데 , 특히 심장의 국소빈혈로 인한 손상 또는 포유동물의 재관류 손상에 의해서 야기되는 손상을 치료하는데 유용하다고 믿어진다. 본 발명의 발명은 특히 죽상동맥경화증과 같은 관상 동맥 장애(coronary artery disease); 협심증(angina pectoris); 심근경색(myocardial infarction);심근 국소빈혈과 심장의 정지(cardiac arrest); 심장의 대체혈관(bypass); 심장성 쇼크로 구성된 그룹으로부터 선택된 심혈관의 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 특히 상기 심혈관의 장애의 급성의(acute) 치료에 유효하다.

더욱이, 본 발명의 방법은 괴사(necrosis) 또는 세포자멸로 인한 세포 손상 또는 세포 사멸로 인한 조직 손상, 국소빈혈과 재관류 손상으로 인한 뉴런 조직 손상, 신경학적 질환과 세포조직퇴행 질병을 치료하고, 혈관성 뇌졸중을 치료하거나 방지하며, 심장혈관의 질병을 치료하거나 방지하고, 노화-관련 황반 변성(macular degeneration), 면역 노화(immune senescence) 장애, 관절염, 동맥경화증(atherosclerosis), 악액질(cachexia), 증식(replicative) 노화와 관련된 골격(skeletal) 근육의 퇴행성 질병, 당뇨병, 두부 외상, 면역 노화, (대장염 및 크론 병과 같은)염증성 장염, 근육 장애, 골관절염, 골다공증, 신경병증의 통증(neuropathic pain)과 같은 통증, 심장부전, 레티날 국소빈혈, (내독소 쇼크와 같은) 패혈증성 쇼크, 및 피부노화와 같은 다른 이상 및/또는 질환을 치료하며,세포의 수명과 증식 능력을 확장시키고, 노화 세포의 유전자 발현(gene expression)을 바꾸며, 또는 종양 세포를 방사선 민감화하는데(radiosensitize) 사용될 수 있다.

"치료(treating)"란 용어는,

(1) 질병, 질환, 및/또는 이상에 걸리기 쉬우나, 아직 이를 갖고 있다고 진단되지 않은 동물에게 질병, 질환 또는 이상이 일어나는 것을 방지하고,

(2) 질병, 질환 또는 이상을 억제, 즉, 그 발달을 저지하며,

(3) 질병, 질환 또는 이상을 완화, 즉 질병, 질환, 및/또는 이상의 퇴보를 야기하는 것, 즉 질병, 질환 및/또는 이상의 퇴화(regression)를 의미한다.

투여

의학적인 용도로, 치료 효과를 나타내기 위해 필요한 PARG 억제제의 양은 투여되는 특별한 화합물, 투여 경로, 치료받는 포유 동물 및 특별한 질병 또는 관련 질환에 따라 다양할 것이다. 여기 설명되는 바와 같은 임의의 이상 상태로부터 고통받거나 또는 고통받기 쉬운 포유동물에 대한 PARG 억제제의 적절한 전신 투여량(systemic dose)은, 일반적으로 몸체 중량 킬로그램 당 약 0.1 내지 약 100mg 베이스(base) 범위에 있고, 포유동물 몸체 중량의 약 1 내지 약 10mg/kg 범위에 있는 것이 바람직하다. 당업 의사 또는 수의사는 바람직한 예방 또는 치료상의 치료에 효과적인 화합물의 양을 쉽게 결정하고 처방할 수 있을 것이라 이해된다.

이러한 과정 중에, 의사 또는 수의사는 적절하다고 생각되는 경우 정맥 환약(intravenous bolus)을 사용하고 뒤이어 정맥 주입(intravenous infusion)을 하여 반복적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 화합물은 예를 들어 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로(rectally), 코를 통해(nasally), 구강으로, 혀 밑으로(sublingually), 질을 통해(vaginally), 심실을 통해(intraventricularly), 또는 종래의 무독성인 약학적으로 수용 가능한 운반체, 보조제(adjuvant) 및 부형제(vehicle)를 포함하는 투약 제제(dosage formulation) 내의 이식된 저장소(implanted reservoir)를 통해 투여될 수 있다.

비경구적인 것은 다음과 같은 예의 투여, 즉 경막하 펌프(subdural pump)와 같은 것에 의한 정맥내, 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 척추내(intraspinal), 뼈 내부(intraosseous), 복막내(intraperitoneal), 포막내(intrathecal), 심실내(intraventricular), 흉골내(intrasternal) 또는 두개골내(intracranial) 주입과 주입 기술들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 특히 손상된 신경 조직에 대한 직접적인 투여와 같은 침입성 기술(invasive technique)이 바람직하다. PARG 억제제만이 투여되는 것이 가능하지만, 이것을 약학적인 제제의 일부로 제공하는 것이 바람직하다.

중앙 신경계 타깃으로서 치료적으로 효과가 있기 위해서는, 본 발명의 방법에 사용되는 화합물은 말초적으로 투여되었을 때 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 쉽게 통과해야만 한다. 그러나, 혈액-뇌 장벽을 통과하지 못하는 화합물도 심실내 경로에 의해 효과적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 화합물은 1회 투여량, 불연속적인 다중 투여량 또는 연속적인 주입에 의해 투여될 수 있다. 화합물은 작고 쉽게 확산되고 상대적으로 안정하기 때문에, 화합물은 연속적인 주입에 매우 알맞다. 특히 피하 또는 경막하 펌프 수단과 같은 펌프 수단이 연속 주입에 바람직하다.

본 발명의 방법에 따라, 투여량의 시간(timing)과 순서를 조절하여 효과적인 투여 섭생(regimen)을 할 수 있다. 화합물의 투여량은, 활성 화합물의 유효량을 포함하는 약학적 투약 단위(pharmaceutical dosage unit)를 포함하는 것이 바람직하다. 유효량이라는 것은, 하나 이상의 약학적 투약 단위의 투여를 통해 PARP 활성 억제 및/또는 바람직한 이로운 효과를 끌어내는데 충분한 양을 의미한다. 특히 바람직한 실시예에서, 투여량은 혈관성 뇌졸중(vascular stroke)이나 다른 신경퇴행성 질병의 효과를 예방하거나 또는 감소시키는데 충분하다.

척추동물 숙주(vertebrate host)에 대한 전형적인 하루 투여량 단위는 약 0.001mg/kg으로부터 약 50mg/kg의 양을 포함한다. 일반적으로, 약 0.1mg 내지 약 10,000mg의 활성 성분 화합물의 투약 수준이 상기 상태를 치료하는데 유용하고, 바람직한 수준은 약 0.1mg 내지 약 1,000mg이다. 어떤 특별한 환자에 대한 특정한 투여량 수준은, 사용되는 특정 화합물의 활성; 나이, 신체 중량, 일반적인 건강, 성별, 및 환자의 식사; 투여 시간; 배설율(rate of excretion); 화합물과 다른 약물의 임의 결합; 치료되는 특별한 질병의 심각성; 및 투여 형태와 투여 경로를 포함하는 여러 가지 요인들에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 생체외 투약 효과의 결과는 환자에 투여하기 위한 적절한 투여량에 대해 유용한 지침을 제공한다. 동물모델을 이용한 연구도 또한 유용할 수 있다. 적절한 투여량 수준을 결정하기 위한 연구가 종래의 기술에서 잘 알려져 있다.

신경 손상(nervous insult)[특히 익사 또는 두부 외상에 의해 발생하는 급성 국소 빈혈 뇌졸중(acute ischemic stroke)과 전체적 빈혈(global ischemia)]을 치료하는 방법에 있어서, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 치료 약제(therapeutic agent), 바람직하게는 뇌졸중의 위험을 감소시킬 수 있는 약제(아스피린과 같은)와, 보다 바람직하게는 2차적인 국소 빈혈 질병의 위험을 감소시킬 수 있는 약제[티클로피딘(ticlopidine)과 같은]와 함께 공동 투여될 수 있다.

화합물과 조성물은, (i) 단일 제제로 함께, 또는 (ii) 이들 각각의 활성 성분의 최적의 방출 속도를 위해 디자인된 개별적인 제제로 각각, 하나 이상의 치료 약제와 공동으로 투여될 수 있다. 각각의 제제는 습윤제, 유화제 및 pH 완충제와 같은 하나 이상의 약학적인 부형제(excipient) 뿐만 아니라, 약 0.01 중량%부터 약 99.99 중량%까지, 바람직하게는 약 3.5 중량%부터 약 60 중량%까지의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 화합물이 하나 이상의 다른 치료 약제와 함께 투여되면, 이러한 약제에 대한 특정한 투여량 수준은 일반적으로 본 발명의 조성물과 방법에 대해 위에서 확인되었던 것과 같은 연구에 의존할 것이다.

본 발명의 방법에 대해, 화합물 전달의 시간과 순서를 조절하는 임의의 투여 섭생은 치료를 이루는데 필요한 만큼 사용되고 반복될 수 있다. 이러한 섭생은 사전조치(pretreatment) 및/또는 추가적인 치료 약제와의 공동 투여를 포함할 수 있다.

신경 손상으로부터 신경 조직을 최대한 보호하기 위해, 본 발명의 화합물이 가능한 한 빨리 영향을 받은 세포에 투여되어야 한다. 신경 손상이 예상되는 경우에는, 예상되는 신경 손상 전에 화합물이 투여되는 것이 유리하다. 신경 손상의 가능성이 증가되는 이러한 경우는, 경동맥의 동맥 내막 절제(carotid endarterectomy), 심장(cardiac), 혈관(vascular), 대동맥(aortic), 정형(orthopedic) 수술과 같은 수술; 동맥 카테테르화(arterial catheterization)[동맥 내막, 척추, 대동맥, 심장, 신장, 척수, 아담키에비쯔(Adamkiewicz)]와 같은 혈관내 조치(endovascular procedure); 색전 약제(embolic agent)의 주입; 지혈(hemostasis)을 위해 코일(coil) 또는 풍선(balloon)의 사용; 뇌 손상을 치료하기 위한 혈관질(vascularity)의 중단(interruption); 및 점점 커지는 일시적인 국소 빈혈성 침입(crescendo transient ischemic attack), 색전 및 이어서 발생하는 뇌졸중과 같이 병에 걸리게 하는 의학적인 상태(predisposing medical condition)를 포함한다.

뇌졸중 또는 국소 빈혈에 대한 사전조치가 불가능하거나 또는 실행할 수 없을 때, 본 발명의 화합물을 가능한 한 빨리, 병이 발생하는 도중이나 발생한 후에 영향을 받은 세포와 접촉하게 하는 것이 중요하다. 그러나, 뇌졸중 사이의 시간에, 세포를 추가적인 손상과 죽음으로부터 구해내기 위해서는 진단과 치료 조치가 최소화되어야 한다. 따라서, 급성 다중 혈관 뇌졸중(acute multiple vascular stroke)으로 진단받은 환자에게 특히 유리한 형태의 투여는, 본 발명의 화합물(들)을 뇌의경색부에 직접 전달하기 위해 경막하 펌프를 이식하는 것이다. 혼수상태(comatose)라 하더라도, 환자는 이러한 치료가 없을 때보다 더 빨리 회복될 것이다. 또한, 환자가 어떤 의식 상태에 있더라도, 뇌졸중의 재발뿐만 아니라, 남아있는 어떤 신경학적상의 증상도 감소될 것으로 예상된다.

당뇨병(diabetes), 관절염(arthritis)과 크론의 질병(Crohn's disease)과 같이 PARP 활성과 관련이 있는 것으로 생각되는 다른 급성 질병으로 진단받은 환자에 관해서, 본 발명의 화합물은 가능한 한 빨리 1회 또는 분리된 투여량으로 또한 투여되어야 한다.

환자의 현재 증상과 본 발명의 화합물의 초기 투여에 대한 반응도에 따라, 환자는 다음 경로 중 한 가지, 즉 주입 또는 정맥내 투여에 의한 것과 같이 비경구적으로; 캡슐 또는 정제에 의한 것과 같이 경구적으로; 화합물을 포함하는 생체적합하고 생분해성인 중합성 매트릭스 전달 시스템을 이식함으로써; 또는 경막하 펌프나 중앙선(central line)을 삽입함으로써 경색부에 직접 투여합으로써 본 발명과 동일하거나 또는 다른 화합물을 추가적으로 더 투여할 수 있다. 치료는 질병을 부분적으로 또는 완전히 경감시킬 것이고, 상기 질병의 추가적인 발생은 더 생기지 않을 것으로 예상된다. 또한 환자는 잔류 증상을 더 적게 겪을 것으로 예상된다.

본 발명의 PARG 억제제를 사용할 수 있기 전, 급성 질병으로 진단받은 환자의 경우에, 환자의 상태는 급성 질병으로 인해서 악화될 수 있고 PARG 억제제가 사용될 수 있을 때까지는 만성 질병이 될 수 있다. 환자가 만성 질병에 대해 PARG 억제제를 포함하는 약학 조성물을 받았을 때도, PARG 억제제를 받음으로써 환자의 상태는 안정화되고 실질적으로 향상될 것으로 또한 예상된다.

PARG 억제제는 종양 세포의 방사선민감화(radiosensitizing tumor cell)에 또한 사용될 수 있다. 여기에서 사용되는 것과 같은 "방사선 민감제(radiosensitizer)"는 분자, 바람직하게는 저분자량의 분자로 한정되고, 전자기선으로 방사선 민감화시키고자 하는 세포의 민감도(sensitivity)를 증가시키고/증가시키거나 전자기선으로 치료될 수 있는 질병의 치료를 촉진시키기 위해 동물에 치료 유효량이 투여된다. 전자기선으로 치료될 수 있는 질병은, 종양 질병(neoplastic disease), 양성과 악성 종양(benign and malignant tumor), 및 암 세포를 포함한다. 여기에 실려있지 않은 다른 질병을 전자기선으로 치료하는 것도 또한 본 발명에 의해 생각될 수 있다. 여기에서 사용되는 바와 같은 "전자기선"과 "방사선(radiation)"이라는 용어는, 10^-20내지 10⁰미터의 파장을 갖는 방사선을 포함하지만 여기에 제한되지는 않는다. 본 발명의 바람직한 실시예는, 감마-선(10^-20내지 10^-13m), x-선 방사선(10^-11내지 10^-9m), 자외광선(10nm 내지 400nm), 가시광선(400nm 내지 700nm), 적외선(700nm 내지 1.0mm), 및 마이크로파선(1mm 내지 30cm)의 전자기선을 사용한다.

방사선 민감제는 전자기선의 독성 효과에 대해 암세포의 민감도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 방사선 민감제의 작용 형태에 대한 다음을 포함하는 여러 가지 메카니즘이 문헌에서 제안되고 있다: 저산소 세포 방사선 민감제(예를 들어, 2-니트로이미다졸 화합물, 및 벤조트리아진 이산화 화합물)는, 저산소 조직의 재산화를 촉진하고/촉진하거나 손상된 산소 라디칼 생성을 촉진한다; 저산소세포가 아닌 방사선 민감제[예를 들어, 할로겐화 피리미딘(halogenated pyrimidine)]는 DNA 염기의 유사체가 될 수 있고, 바람직하게 암 세포의 DNA와 결합해서 이에 의해 DNA 분자의 방사선에 의해 유발된 절단을 촉진하고/촉진하거나 정상적인 DNA 치유 메카니즘을 억제할 수 있다; 작용의 기타 여러 가지 잠재적인 메카니즘이 질병을 치료하는 방사선 민감제에 대해 가정되고 있다.

많은 암 치료의 프로토콜(protocol)은 현재 x-선의 전자기선에 의해 활성화된 방사선 민감제를 사용한다. x-선 활성화된 방사선 민감제의 예는 메트로니다졸, 미소니다졸, 데스메틸미소니다졸, 피모니다졸, 에타니다졸, 니모라졸, 미토마이신 C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, 니코틴아미드, 5-브로모데옥시우리딘 (BUdR), 5-이오도데옥시우리딘 (IUdR), 브로모데옥시사이티딘, 플루오로데옥시우리딘 (FudR), 하이드록시우레아, 시스플라틴 및 치료적으로 유효한 유사체와 이와 동일한 것의 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

암의 광역학적 요법(photodynamic therapy)(PDT)은, 민감제(sensitizing agent)의 방사선 활성제로 가시광을 사용한다. 광역학적 방사선 민감제의 예는 헤마토포피린 유도체, 포토프린, 벤조포피린 유도체, NPe6, 주석 에티오포피린 SnET2, 페오보바이드-a, 박테리오클로로필-a, 나프탈로시아닌, 프탈로시아닌, 아연 프탈로시아닌 및 치료적으로 유효한 유사체와 이와 동일한 것의 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

방사선 민감제는, 타깃 세포에 대한 방사선 민감제의 결합을 촉진하는 화합물; 타깃 세포에 대한 치료제, 영양제, 및/또는 산소의 흐름을 조절하는 화합물; 추가적인 방사선이 있거나 없이 종양에 작용하는 화학요법 약제(chemotherapeutic agent); 또는 암이나 다른 질병을 치료하기 위한 기타 치료적으로 유효한 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 화합물의 치료 유효량과 함께 투여될 수 있다. 방사선 민감제와 함께 사용될 수 있는 추가적인 치료 약제의 예는, 5-플루오로우라실, 류코보린, 5'-아미노-5'-데옥시티미딘, 산소, 카보겐, 적혈구 세포 수혈(red cell transfusion), 퍼플루오로카본(예를 들어, 플루오솔-DA), 2,3-DPG, BW12C, 칼슘 채널 차단제, 펜톡시피린, 맥관형성차단 화합물(antiangiogenesis compound), 하이드라라진, 및 L-BSO를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 방사선 민감제와 함께 사용될 수 있는 화학요법 약제의 예는, 아드리아마이신, 캄토테신, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 인터페론(알파, 베타, 감마), 인터류킨 2, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 및 치료적으로 유효한 유사체와 동일한 것의 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

(실시예)

다음 실시예는 관련된 발명의 바람직한 실시예를 예시하고, 본 발명을 상기 실시예에 한정되는 것으로 구성되지는 않는다. 모든 중합체 분자량은 평균 분자량을 의미한다. 모든 비율은 다른 것이 표시되어 있지 않으면 최종 전달 시스템 또는 제조된 제제의 중량%를 기준으로 하고, 모든 총계는 100 중량%가 된다.

실시예 1- 쥐의 병소 대뇌 국소 빈혈(Focal Cerebral Ischemia)에 대한 신경보호 효과의 검정

4% 할로탄(halothane)으로 마취된 250 - 300g의 무게가 나가는 위스타르(Wistar) 숫쥐를 이용하여, 병소 대뇌 국소빈혈 실험이 수행되었다. 수술이 종료될 때까지 1.0 - 1.5%의 할로탄으로 마취가 지속되었다. 수술 중에 몸체의 온도가 감소하는 것을 막기 위해서 동물은 더운 환경에 놓여졌다.

전방 중심부의 경부 절개(anterior midline cervical incision)가 행해졌다. 우측의 일반적인 경동맥(CCA)이 노출되어 미주 신경(vagus nerve)으로부터 분리되었다. 실크 봉합사(silk suture)의 위치를 잡고 심장에 가깝도록 CCA 주위가 봉합된다. 다음으로 외부 경동맥(ECA) 노출되고 실크 봉합사로 봉합된다. CCA에 구멍이 생기고 작은 카테테르(catheter)(스위스 세인트 갈론에 위치한 Ulrich & Co사의 PE 10)는 내부 경동맥(ICA)의 루멘(lumen)으로 부드럽게 나아간다. 날개입천장 동맥(pterygopalatine artery)은 폐색되지 않는다. 카테테르는 실크 봉합사로 제자리에 봉합된다. 다음으로, a 4-0 나일론 봉합사(스위스 크리시어의 브라운 메디컬)가 카테테르 루멘에 도입되고, 그 끝부분(tip)이 전방 대뇌 동맥을 차단할 때까지 밀어준다. ICA에 대한 카테테르의 길이는 ECA의 기시점(origin)에서 약 19mm이다. 열에 의해 카테테르를 폐색시킴으로써 봉합사가 이 위치에 유지된다. 카테테르 1cm와 나일론 봉합사가 돌출되어 있어서, 봉합사는 재관류(reperfusion)를 허용하도록 뺄 수 있다. 다음으로 피부 절개를 상처 클립(wound clip)으로 봉한다.

동물은 마취에서 회복되는 중에 따뜻한 환경에서 유지되었다. 2시간 후, 동물은 다시 마취되었고, 클립을 빼서 상처를 다시 개봉하였다. 카테테르를 절단하고, 봉합사를 뽑아 내었다. 다음으로 카테테르를 열에 의해 다시 밀폐시키고, 상처 클립을 상처에 두었다. 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근하면서 24시간 동안 생존하도록 허용되었다. 다음으로 쥐를 CO₂로 죽이고 목을 베었다.

뇌를 즉시 제거하여, 드라이 아이스에 냉동하고 -80℃에 저장했다. 다음으로 뇌를 -19℃에서 극저온절단(cryocut)으로 0.02mm 두께의 박편(section)으로 절단하고, 추가 시험을 위해 20개 박편 중에서 하나를 택한다. 선택된 박편을 Nissl 공정에 따라 크레실 보라색(cresyl violet)으로 염색했다. 각각의 염색된 박편을 광 현미경으로 검사하고, 국소적인 경색부는 형태학상의 변화가 있는 세포의 존재에 따라 결정된다.

PARG 억제제의 여러 가지 투여량은 이러한 모델에서 시험되었다. 화합물은 서로 다른 시간에 모두 국소빈혈의 발병 전이나 또는 발병 후에, 1회 투여량이나 일련의 다중 투여량으로, i.p. 또는 i.v로 투여된다. 본 발명의 방법에 따라 투여되는 PARG 억제제는 약 20 내지 80%의 범위로 국소빈혈로부터 보호를 제공하는 것으로 발견되었다.

실시예 2- 쥐의 심장 국소빈혈/재관류 손상에 대한 효과

각각 약 300 - 350g의 무게가 나가는 스프라그-덜리(Sprague-Dawley) 암쥐들은, 150mg/kg의 투여량인 복막내 케타민(intraperitoneal ketamine)으로 마취되었다. 쥐는 기관 내를 통해(endotracheally) 관이 삽입되었고, 하바드 로던트 환기 장치를 사용해서 산소가 풍부한 실내 공기가 환기되었다. 경동맥과 대퇴부 정맥(femoral vein)에 삽입되는 폴리에틸렌 카테테르는, 동맥 혈압 모니터링(artery blood pressure monitoring)과 유체 투여(fluid administration) 각각에 사용된다. 호흡기 속도(respirator rate)를 조절함으로써 동맥의 pCO₂는 35와 45mmHg 사이로 유지된다. 중앙 스터노우절개술(median sternotomy)로 쥐의 흉곽(chest)을 절개하고, 심낭(pericardium)을 절개하여, 라텍스 막 텐트(latex membrane tent)에 심장을 둔다. 수술 작업이 끝나고 적어도 15분의 안정화 시기 후 베이스라인(baseline)에서 혈액역학적 자료(hemodynamic data)가 얻어진다. LAD[하강하는 좌측 전방의(left anterior descending)] 관상 동맥(coronary artery)을 40분 동안 결찰하고, 다음에 120분 동안 재관류시켰다. 120분 동안의 재관류 후에, LAD 동맥은 재폐색되고, 국소빈혈 위험부를 측정하기 위해 좌측 심방(left atrium)에 0.1ml의 모나스트랄 청색 염료(monastral blue dye) 환약을 주입한다.

다음에 염화칼륨으로 심장을 정지시키고, 5개의 2-3mm 두께 횡단 조각으로 절단한다. 각각의 조각의 무게를 재고, 위험부 내에 위치한 경색된 심근(infarcted myocardium)을 시각적으로 볼 수 있도록 하기 위해서 1% 트리메틸테트라졸륨 클로라이드 용액으로 배양한다. 각각의 좌측 심실 조각에 대한 값을 더해서 경색 크기를 계산하고, 경색 크기는 좌측 심실의 위험 부위의 비율로도 또한 표현된다.

PARG 억제제의 여러 투여량이 이러한 모델에서 시험되었다. 화합물은 서로다른 시간에 모두 국소빈혈의 발병 전이나 또는 발병 후에, 1회 투여량이나 일련의 다중 투여량으로, i.p. 또는 i.v로 제공된다. PARG 억제제는 10 내지 40%의 범위로 국소빈혈/재관류 손상을 보호하는 것으로 발견되었다. 따라서, PARG 억제제는 생체외에서 국소빈혈에 의해 유발된 쥐의 해마상 융기 신경세포(hippocampal neuron)의 퇴화를 막는다.

실시예 3- 망막의 국소빈혈 예방

급성 망막 국소빈혈로 진단 받은 환자는, 간헐적이거나 또는 연속적인 정맥 투여를 통해, 화합물의 1회 투여량이나 또는 일련의 다중 투여량으로 PARG 억제제가 비경구적으로 즉시 투여된다. 이러한 초기 치료 후, 환자의 현재 신경학상의 증상에 따라, 환자는 선택적으로 다른 비경구적인 투여량의 형태로 동일하거나 또는 이와 다른 PARG 억제제를 받을 수 있다. 신경 조직 손상의 상당한 예방이 일어날 것이고, 환자의 신경학적인 증상은 화합물의 투여에 의해 상당히 감소되어 뇌졸중 후 신경학적인 영향을 더 적게 남길 것으로 발명자에 의해 예상된다. 또한, 망막의 국소빈혈의 재발이 예방되거나 감소될 것으로 예상된다.

실시예 4- 망막의 국소빈혈 치료

환자가 급성 망막 국소빈혈로 진단을 받았다. 즉시, 의사 또는 간호사는 1회 투여량이나 또는 일련의 분할된 투여량으로 PARG 억제제를 비경구적으로 투여한다. 환자는 또한, PARG 억제제를 포함하는 생체에 적합하고, 생분해성인 중합성 매트릭스 전달 시스템을 이식하거나, 또는 뇌의 경색부에 화합물을 직접 투여하기 위해 삽입된 경막하 펌프를 통한 간헐적이거나 연속적인 투여에 의해 동일하거나 또는 이와 다른 PARG 억제제를 받을 수 있다. 환자는 본 발명의 화합물이 투여되지 않았을 때보다 더욱 빠르게 혼수상태로부터 깨어날 것으로 발명자에 의해 예상된다. 또한 이러한 치료는 환자의 남아있는 신경학적인 증상의 심각성을 감소시켜줄 것으로 예상된다. 또한, 망막의 국소빈혈의 재발은 감소될 것으로 예상된다.

실시예 5- 혈관 뇌졸중(vascular stroke)의 예방

급성 혈관 뇌졸중으로 진단 받은 환자는, 간헐적이거나 또는 연속적인 정맥 투여를 통해, 화합물의 1회 투여량이나 또는 일련의 다중 투여량으로 PARG 억제제가 비경구적으로 즉시 투여된다. 이러한 초기 치료 후, 환자의 현재 신경학상의 증상에 따라, 환자는 선택적으로 다른 비경구적인 투여량의 형태로 본 발명의 동일하거나 또는 이와 다른 화합물을 받을 수 있다. 신경 조직 손상의 상당한 예방이 일어날 것이고, 환자의 신경학적인 증상은 화합물의 투여에 의해 상당히 감소되어 뇌졸중 후 신경학적인 영향을 더 적게 남길 것으로 발명자에 의해 예상된다. 또한, 혈관 뇌졸중의 재발이 예방되거나 감소될 것으로 예상된다.

실시예 6- 혈관 뇌졸중의 치료

환자가 급성 다중 혈관 뇌졸중으로 진단을 받고, 혼수상태에 빠져 있다. 즉시, 의사 또는 간호사는 1회 투여량이나 또는 일련의 분할된 투여량으로 PARG 억제제를 비경구적으로 투여한다. 환자의 혼수상태로 인해서, 환자는 또한 PARG 억제제를 포함하는 생체에 적합하고, 생분해성인 중합성 매트릭스 전달 시스템을 이식하거나, 또는 뇌의 경색부에 화합물을 직접 투여하기 위해 삽입된 경막하 펌프를 통한 간헐적이거나 연속적인 투여에 의해 동일하거나 또는 이와 다른 PARG 억제제를 받는다. 환자는 본 발명의 화합물이 투여되지 않았을 때보다 더욱 빠르게 혼수상태로부터 깨어날 것으로 발명자에 의해 예상된다. 또한 이러한 치료는 환자의 남아있는 신경학적인 증상의 심각성을 감소시켜줄 것으로 예상된다. 또한, 혈관 뇌졸중의 재발은 감소될 것으로 예상된다.

실시예 7- 심장 재관류 손상의 예방

환자는 생명을 위협하는 심근증(cardiomyopathy)으로 진단받고 심장 이식을 필요로 한다. 기증 심장(donor heart)이 발견될 때까지, 환자는 특별한 신체상의 산화 모니터링(extra corporeal oxygenation monitoring)(ECMO)으로 생명이 유지된다.

다음으로 기증 심장이 전달되고, 환자는 외과적인 이식 수술을 받는데, 수술 도중에 환자는 심폐 펌프(heart-lung pump)에 놓인다. 환자는, 심폐 펌프로부터 환자의 새로운 심장에 대한 환자의 순환 경로를 재설정하기 전에, 특정한 시간 동안 심장 내에(intracardiac) PARG 억제제를 제공받고, 따라서 새로운 심장이 외부의 심폐 펌프와 무관하게 박동하기 시작하므로 심장의 재관류 손상을 예방한다.

실시예 8- 패혈증성 충격의 검정(septic shock assay)

18 내지 20g의 무게가 나가는 10 C57/BL 숫쥐들의 그룹은, 3일 동안 연속으로 복막내(IP) 주입에 의해, 매일 60, 20, 6 과 2mg/kg의 투여량으로 PARG 억제제가 투여되었다. 각각의 동물은 우선 지방다당류(lipopolysaccharide)(LPS, 20mg/동물 IV의 E. Coli, LD₁₀₀으로부터 얻어짐)와 갈락토사민(20mg/동물 IV)으로 자극된다. 적절한 부형제에 있는 시험 화합물의 제 1투여량은 자극 후 30분에 제공되고, 제 2와 제 3투여량은 각각 2일과 3일째 24시간이 지나서 제공되었는데, 생존한 동물만이 시험 화합물의 제 2 또는 제 3 투여량을 제공받았다. 3일간의 시험 기간 동안 자극 후 12시간마다 죽은 쥐의 수(mortality)가 기록되었다. PARG 억제제는 패혈증성 충격으로 죽는 것을 방지한다.

실시예 9- 생체외 방사선민감

인간의 전립선 암세포 라인인 PC-3s는, 6개의 웰 접시(well dish)에 플레이팅되고 10% FCS가 제공된 RPMI1640의 단일층 배양액(monolayer culture)에서 배양된다. 세포는 5% CO₂와 95% 공기인 37℃에서 보존되었다. 세포는 한 번의 치사량에 가까운 투여량 수준에서 조사(irradiation)하기 전에 3개의 서로 다른 PARG 억제제의 투여량 반응(0.1mM 내지 0.1μM)에 노출된다. 모든 치료 그룹에 대해, 실온에서 6개의 웰 접시는 0.5mm Cu/1mm인 Seifert 250kV/15mA 방사선 조사 장치(irradiator)에 노출된다. 세포의 생존능력(cell viability)은 0.4% 트리판 블루(trypan blue)를 배제함으로써 검사된다. 염료 배제는 현미경에 의해 시각적으로 평가되고, 생존가능한 세포의 수는 생존가능한 세포의 수에서 세포의 수를 빼고 전체 세포수로 이것을 나눠서 계산한다. 세포의 증식 속도는 조사 후³H-티미딘 결합의 양으로 계산한다. PARG 억제제는 세포의 방사선 민감을 나타낸다.

실시예 10- 생체내 방사선민감

암을 치료하기 위한 방사선 요법을 거치기 전에, 환자는 PARG 억제제를 함유하는 약학적 조성물 유효량이 투여된다. 화합물 또는 약학적 조성물은 방사선 민감제로 작용해서 종양을 방사선 요법에 보다 민감하도록 한다.

실시예 11- mRNA 노화 세포(senescent cell)에서 변화된 유전자 발현 측정

모집단 배가(population doubling)(PDL)가 94일 때, 인간의 섬유아세포(fibroblast) BJ 세포는, 일정한 성장 매질에 플레이팅되고, 다음으로 Linskens 등의 "Nucleic Acids Res. 23:16:3244-3251 (1995)에 설명되어 있는 생리학적인 이상을 반영하기 위해 낮은 혈청 매질로 변화된다. 0.5%의 송아지 혈청(bovine calf serum)이 제공된 DMEM/199 매질이 사용된다. 세포는 13일 동안 매일 여기 설명된 바와 같이 PARG 억제제로 처리된다. 조절 세포(control cell)는 PARG 억제제를 투여하는데 사용되는 용매가 있거나 없이 처리된다. 처리되지 않은 노화되고 어린 조절 세포는 비교를 위해 시험된다. RNA는 PCT 공고 96/13610호에설명되어 있는 기술에 따른 처리된 조절 세포로부터 제조되고 노던 블라팅(northern blotting)이 수행된다. 노화와 관련된 유전자에 특정한 탐침(probe)이 분석되고, 처리된 조절 세포가 비교된다. 결과를 분석할 때, 가장 낮은 수준의 유전자 발현은 비교에 대한 기준을 제공하기 위해 임의로 1로 설정된다. 특히 피부 세포의 나이에 따른 변화와 관련된 3개의 유전자는 콜라겐, 콜라게나제와 엘라스틴이다. West, Arch. Derm. 130:87-95 (1994). PARG 억제제로 처리된 세포의 엘라스틴 발현은 조절 세포와 비교해서 상당히 증가했다. 엘라스틴 발현은 노화된 세포와 비교했을 때 어린 세포에서 상당히 더 높고, 이에 따라 PARG 억제제로 처리하면 노화된 세포의 엘라스틴 발현 수준을 훨씬 더 어린 세포에서 발견되는 것과 유사한 수준으로 바뀌도록 한다. 이와 유사하게, PARG 억제제로 처리된 콜라게나제와 콜라겐에서 유리한 효과를 볼 수 있다.

실시예 12- 노화 세포에서 변화된 유전자 발현 단백질 측정

PDL이 95-100일 때, 대략 105 BJ 세포는 15cm의 접시에 플레이팅되고 배양된다. 배양 매질은 10%의 송아지 혈청이 제공된 DMEM/199이다. 세포는 24시간 동안 매일 PARG 억제제(100㎍/1ml 매질)로 처리된다. 세포를 인산염 완충 용액(PBS)으로 세척한 다음, 5분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 투과시키고, PBS로 세척한 다음, 10분 동안 100%의 차가운 메탄올로 처리한다. 메탄올이 제거되고 세포는 PBS로 세척된 다음, 불특정성 항체 결합을 차단하기 위해 10% 혈청으로 처리된다. 상업적으로 이용가능한 적절한 항체 용액(1:500 희석, Vector) 약 1ml를세포에 첨가하고 혼합물은 1시간 동안 배양된다. 세포를 헹구고 PBS로 3회 세척한다. 바이오틴 표지(biotin tag)가 있는 염소 항쥐(goat anti-mouse) IgG(1ml)인 2차 항체는, 알칼리성 인산염에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘(streptavidin)을 함유하고 있는 용액 1ml와 NBT 시약(Vector) 1ml와 함께 첨가된다. 세포가 세척되고 유전자 발현상의 변화가 비색적으로 관찰된다. PARG 억제제로 처리된 노화 세포에서 4개의 노화 특정 유전자인 콜라겐 I, 콜라겐 III, 콜라게나제와 인터페론 감마가 모니터되고, 결과에 의하면 다른 3개 유전자의 발현 수준의 변화 없이 인터페론 감마 발현의 감소가 나타났고, 이것은 PARG 억제제가 노화에 특정한 유전자 발현을 바꿀 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 13- 세포의 증식성(proliferative capacity)과 수명(lifespan)의 연장 및 증가

세포의 증식성과 수명을 연장하기 위한 본 발명의 효율을 증명하기 위해, 인간의 섬유아세포(fibroblast) 세포 라인[모집단 배가(PDL)가 23일 때 W138이거나 또는 PDL이 71일 때 BJ 세포]을 녹여서 T75 플라스크에 플레이팅하고, 약 1주일 동안 정상 매질(DMEM/M199와 10% 송아지 혈청)에서 배양하는데, 이 기간에 세포가 융합하고 따라서 배양물(culture)은 쉽게 세분된다. 세분될 때, 매질(media)을 빨아내고 세포를 인산염 완충 염수(phosphate buffer saline)(PBS)로 헹구어낸 다음 트립신처리한다(trypsinized). 세포는 쿨터 카운터(Coulter counter)로 계산하고, 10%의 송아지 혈청과 다양한 양의 PARG 억제제[DMEM/M199 매질의 100X 원액(stocksolution)으로부터 0.10μM과 1mM]가 제공된 DMEM/199 매질에서 6개의 웰 조직 배양 플레이트(well tissue culture plate)에 cm²당 10⁵개의 세포 밀도로 플레이팅한다. 이러한 과정을 세포가 분할을 멈추는 것으로 보일 때까지 7일마다 반복한다. 처리되지 않은(조절) 세포는 노화되고 배양액에서 약 40일 후 분할을 멈춘다. 10μM의 3-AB로 세포를 처리하는 것은, 세포의 수명을 연장시키는 것으로 보이는 100μM의 3-AB에 의한 처리와, 세포의 수명과 증식성을 상당히 증가시키는 1mM의 3-AB에 의한 처리에 비해 영향이 적거나 영향을 전혀 미치지 않는 것으로 보인다. 1mM의 3-AB에 의해 처리된 세포는 배양액에서 60일 후에도 분할될 것이다.

실시예 14- 쥐의 만성적인 수축 손상(constriction injury)(CCI)에 대한 화학식 I(formula I)의 신경 보호 효과

300 - 350g인 스프라그-덜리 어른 숫쥐들은, 복막내 50mg/kg의 소듐 펜토바비탈(sodium pentobarbital)로 마취되었다. 쥐의 좌골 신경(sciatic nerve)의 한 측면을 노출시키고, 5-7mm 길이의 신경부(nerve segment)를 절개해서, 1.0-1.5mm로 4번의 느슨한 봉합으로 봉합한 다음, 포막내 카테테르(intrathecal catheter)를 이식하고 시스터나 마그나(cisterna magna)를 절개함으로써 부아라크노이드 공간(subarachnoid space)에 젠타마이신 황산염으로 씻어낸(gentamicin sulfate-flushed) 폴리에틸렌(PE-10) 튜브를 삽입함으로써 신경 결찰(nerve ligation)을 실행한다. 카테테르의 꼬리쪽 말단(caudal end)을 요추 확장(lumbar enlargement)에부드럽게 뒤섞어 짜고, 주둥이쪽 말단(rostral end)은 치과용 접합제(dental cement)로 두개골에 삽입되어 있는 나사(screw)에 고정시키며 피부의 상처는 상처 클립으로 봉합한다.

발 빼기 테스트(paw-withdrawal test)를 이용해서 복사열(radiant heat)에 대한 열적인 통각과민(thermal hyperalgesia)을 평가한다. 쥐 뒷발의 발바닥 표면 밑에 직접 위치한 방사 전구에서 나오는 복사열 소스가 있는 3mm 두께의 유리 플레이트상의 플라스틱 실린더에 쥐가 놓여 있다. 발을 빼는 것이 보이지 않는 것(paw-withdrawal latency)은, 쥐의 뒷발을 빼는 것에 대해 복사열 자극을 시작해서 경과된 시간으로 정의된다.

기계적인 통각과민은, 쥐를 작은 정사각형의 구멍이 많이 있는 구멍난 금속 시트로 만들어진 바닥이 있는 우리(cage)에 넣어 둠으로써 평가된다. 우리 바닥을 통해 삽입되어 있는 안전핀의 끝으로 쥐의 뒷발의 중간 발바닥 표면을 찔러주면서, 발을 빼는 지속 기간을 기록한다.

기계화학적 이질통증(mechano-allodynia)은, 이전 테스트와 유사한 우리에 쥐를 넣고, 쥐의 뒷발의 중간 발바닥 표면에 0.07 내지 76g인 오름차순의 휨력(bending force)으로 폰 프레이 필라멘트(von Frey filament)를 가함으로써 평가된다. 폰 프레이 필라멘트는 피부에 수직으로 가해지고 휘어질 때까지 천천히 누른다. 반응의 문턱힘(threshold force)은, 5번 중에 적어도 한 번의 분명한 발 빼기를 일으키는 5번 중 첫 번째 필라멘트로 정의된다.

어두운 신경(dark neuron)은, 샴 수술된 쥐(sham operated rat)와 비교해서한 면만의 좌골 신경 결찰을 한지 8일 후, 특히 단층(laminae) I-II에 있는 쥐의 척수 배면각(spinal cord dorsal horn) 내의 좌우 양측에서 관찰되었다. 화학식 I의 서로 다른 화합물의 여러 투여량이 이러한 모델에서 시험되었고, 화학식 I의 화합물은 CCI 쥐에서 어두운 신경과 신경장애적 고통 반응(neuropathic pain behavior)의 발생률 모두를 감소시키는 것으로 나타났다.

실시예 15

환자는 PARG 억제제의 투여를 필요로 하는 질병으로 진단 받았다. 다음으로 환자는 실시예 1부터 10에 개시되어 있는 바와 같이, 1회용 또는 분할된 투여량의 억제제를 함유하는 캡슐 또는 정제 형태인 PARG 억제제가 투여될 수 있다. 이러한 초기 치료 후에, 환자는 캡슐 또는 정제, 직접 주입, 경막하 펌프에 의하거나, 또는 생체적합한 중합성 매트릭스 전달 시스템을 이식함으로써 동일하거나 서로 다른 PARG 억제제가 선택적으로 투여될 수 있다. 이러한 치료는 부분적이거나 또는 완전히 질병을 완화시키고 상기 질병의 추가적인 발생은 일어나지 않을 것으로 예상될 것이다.

실시예 16

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 물리적 손상에 의해 발생하는 말초적인 신경 장애(peripheral neuropathy)로 진단 받았다.

실시예 17

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 질병 상태에 의해 발생하는 말초적인 신경 장애로 진단 받았다.

실시예 18

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 구이리언-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)으로 진단 받았다.

실시예 19

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury)으로 진단 받았다.

실시예 20

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 척수에 대한 물리적 손상으로 진단 받았다.

실시예 21

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 뇌 손상과 관련된 뇌졸중(stroke)으로 진단 받았다.

실시예 22

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 병소 국소빈혈(focal ischemia)로 진단 받았다.

실시예 23

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 전체적인 국소빈혈(global ischemia)로 진단 받았다.

실시예 24

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 재관류 손상(reperfusion injury)으로 진단 받았다.

실시예 25

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 신경파괴 질병(demyelinating disease)으로 진단 받았다.

실시예 26

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 다중 경화증(multiple sclerosis)으로 진단 받았다.

실시예 27

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 신경퇴화(neurodegeneration)와 관련된 신경학적인 질병으로 진단 받았다.

실시예 28

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 알쯔하이머 질병(Alzheimer's disease)으로 진단 받았다.

실시예 29

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 파킨슨 질병(Parkinson's disease)으로 진단 받았다.

실시예 30

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 근위축성 측면 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)으로 진단 받았다.

실시예 31

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 심장 혈관 질병(cardiovascular disease)으로 진단 받았다.

실시예 32

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 협심증(angina pectoris)으로 진단 받았다.

실시예 33

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 심근 경색증(myocardial infarction)으로 진단 받았다.

실시예 34

실시예 15에서 설명된 바와 같은 치료로, 환자는 PARG 활성화와 관련된 심장혈관 조직 손상으로 진단 받았다.

실시예 35- PARG 효소에 의한 효력 검정

PARG 억제제의 효능은 PARG 효소에 의한 효력 검정으로 측정된다. 각각의 화합물에 대해, PARG 반응을 억제하기 위해 여러 가지 투여량이 사용되었다. 반응의 50% 억제를 얻기 위해 필요한 μM 단위의 농도인 IC₅₀값을 측정하기 위해, 투여량 반응 곡선이 생성되었다.

효소 억제라는 문맥에서, "억제"라는 용어는 경쟁적인, 경쟁적이 아닌, 비경쟁적인(uncompetitive), 경쟁적이 아닌(noncompetitive) 억제와 같은 가역적인 효소 억제를 의미한다. 이러한 것은, 기본적인 미하엘리스-멘텐 속도 방정식(Michaelis-Menten rate equation)에 의해 분석될 수 있는 효소의 반응 속도(reaction kinetics)에 대한 억제제의 효과에 의해 실험적으로 구분될 수 있다. 억제제가 활성자리에 결합하기 위해 정상적인 기질(substrate)과 경쟁하는 방식으로 자유 효소(free enzyme)와 결합할 수 있을 때, 경쟁적인 억제가 일어난다. 경쟁적인 억제제는 효소와 가역적으로 반응하여, 효소-기질 복합체와 유사한 효소-억제제 복합체(EI)를 형성한다.

E + I = = EI

미하엘리스-멘텐 형식에 따라, 효소-억제제 복합체의 해리 상수로 억제제 상수 K₁을 정의할 수 있다.

K₁= [E] [I] / [EI]

따라서, 상기에 따라 여기에서 사용되는 바와 같이, K₁은 기본적으로 분자와 분자 수용체, 또는 본 발명과 관련해서 본 발명의 화합물과 억제하고자 하는 효소 사이의 친화도의 척도이다. IC50은, 타깃 효소의 50% 억제를 일으키는데 필요한 화합물의 농도나 양을 정의할 때 사용되는 관련 용어라는 것을 주목해야만 한다.

전반적인 효력 검정은, 1)³²P가 표지된 방사성 PARG를 기질로 제조하는 단계, 2) 재조합형 PARG를 정제하는 단계, 3) PARG 반응으로 화합물을 배양하는 단계, 4) 박층 크로마토그래피(TL)에 의해 ADP-리보오스 생성물을 분리하는 단계, 및 5) 신틸레이션 카운팅(scintillation counting)에 의해 ADP-리보오스의 방사성을정량하는 단계로 구성되어 있다.

1)³²P-폴리(ADP-리보오스) 제조:

0.1ml의 반응물이 제조되었다. 이것은 20mM의 트리스 HCl(pH 8.0), 10mM의 MgCl₂, 5㎍/ml의 활성 DNA(시그마), 1μM의 방사성 NAD[100Ci/mmole의 특정한 활성이 있는 니코틴아미드 아데닌(아데닐레이트-³²P) 디뉴클레오티드(³²P)NAD (Amersham)]로 구성되어 있다. 반응을 시작하기 위해 20㎍/ml의 PARG 억제제가 마지막으로 첨가되었다. 반응물이 완전히 혼합되고 25℃에서 30분 동안 배양되었다. 90mM의 EDTA를 첨가함으로써 반응이 멈추었다.

반응이 종료되면,³²P-폴리(ADP-리보오스) 중합체가 사이징 컬럼(sizing column)에 의해 (³²P)NAD로부터 분리되었다. 0.1ml의 반응 혼합물이 미리 충전되어 있는 6ml의 sephdax-G25 컬럼(BAKERBOND, Spe, J.T. Baker)으로 직접 채워지는데, 상기 컬럼은 pH 7.5의 1xTE 완충액으로 미리 평형이 이루어졌다.³²P-폴리(ADP-리보오스)는 1xTE 완충액으로 용출되었다. 용출액(elute)은 250㎕ 분율(fraction)로 모여졌다.³²P-폴리(ADP-리보오스) 샘플은 신틸레이션 카운팅에 의해 측정된 바와 같이 초기 피크(peak)에 있었다.

2) 재조합형 PARG의 발현과 정제

아미노산 378에서 976까지의 인간 PARG의 카르복시 말단부를 엔코팅(encoding)하는 cDNA 단편은, 주형(template)으로서의 인간 흉선(thymus) cDNA(캘리포니아 팔로알토시의 Clontech사)와, 5'-GGGAATTCATGAATGATTTAAATGCTAAA-3'과 5'-CCCTCGAGTCAGGTCCCTGTCCTTTGCCC-3'의 서열을 갖는 한 쌍의 프리머(primer)와의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 확대된다. 프리머는 제한 효소 자리 EcoRI와 XhoI를 포함했다. PCR 확대 PARG DNA 단편은 EcoRI와 XhoI로 소화되고, 다음으로 표준이 되는 분자 생물학 공정을 이용해서 pGEX-PARG를 생성하기 위해, pGEX-4T1 플라스미드(plasmid)(파마시아)에 있는 동일한 자리로 결찰되었다. pGEX-PARG는, 아미노 말단에 글루타티온-S-트란스페라제가 있는 재조합형 단백질을 발현시키기 위해 E.Coli 계통(strain)의 BL21로 변형되었고, 카르복시 말단에 PARG가 있는 프레임에 융합되었다. 우리는 제조업인 파마시아에 따라 글루타티온-세파덱스 4B 비드(bead)를 이용하여 재조합형 단백질을 발현하고 정제하기 위한 표준 공정을 따랐다.

3) PARG 반응

30㎕의 반응물이 제조되었다. 이것은 0.3ng(200,000cpm)의³²P-폴리(ADP-리보오스), PARG 억제제, 및 약 0.1ng/ml의 PARG를 포함했다. IC₅₀을 측정하기 위해, 일반적인 실험은 0.2, 2, 6, 20, 60μM의 최종 농도인 화합물 투여량으로 구성되었다. 각각의 투여량은 2번 시험되었다. PARG 억제제 원액은 100% DMSO로 제조되었다. 이러한 반응에서 DMSO의 최종 농도는 7% 미만이었다. PARG 효소는 반응을 시작시키기 위해 마지막으로 첨가되었다. 반응은 37℃에서 10분 동안 수행되었고, 다음으로 3%(w/v) 소듐 도데실 황산염 2㎕를 첨가함으로써 종료되었다.

4) 가수분해되는³²P-ADP-리보오스의 TLC 분리

전체적으로 종료된 반응 혼합물은, 각각의 샘플 사이의 공간은 2cm로 하고 바닥에서 약 3cm의 높이로, 20cm ×20cm의 PEI-F 셀룰로오스 종이(독일, Darmstadt사)에 조심스럽게 떨어뜨린다. PEI-F 종이는, 2cm의 깊이에서 0.3M의 LiCI/0.9M의 아세트산으로 미리 평형이 이루어진 TLC 탱크에서, 현상액(developer)이 종이의 전면에 도달할 때까지 1시간 동안 현상된다. PEI-F 종이를 공기 중에서 말려서 플라스틱 랩으로 덮고 3시간 동안 코닥 X-OMAT 필름에 노출시킨다.

5) PARG 활성 정량

필름이 현상되어 PEI-F 셀룰로오스 종이에 폴리(ADP-리보오스)와 ADP-리보오스의 위치를 정하기 위한 주형으로 사용되었다. 상부 지점은 ADP-리보오스를 포함했고 하부 지점은 폴리(ADP-리보오스)를 포함했다. 일반적으로, 10-20%의 폴리(ADP-리보오스)는 ADP-리보오스로 가수분해되었다. 이에 상응하는 지점이 절단되고 신틸레이션 카운팅에 의해 방사성이 측정되었다. PARG 활성은 ADP-리보오스로변환된 폴리(ADP-리보오스)의 백분율, 즉 상부와 하부 지점의 결합된 총 개수로 나누어진 상부 지점의 개수로 표현된다. 일반적인 투여량 반응 곡선은, 본 발명에 따른 PARG 억제제를 이용해서 도 1에 설명되어 있다.

실시예 36- 과산화수소의 세포파괴(cytotoxicity) 효력 검정

과산화수소 세포파괴 모델은, 세포의 죽음을 방지하기 위한 PARG 억제제의 효율을 측정하기 위해 사용되었다. 폴리(ADP-리보오스) 전환(turn over)은, Schraustatter 등(Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83, 4908-4912, 1986)에 따라 P338D1 세포에서 과산화수소 처리에 의해 발생하는 세포의 죽음을 조정하는 메카니즘으로 나타났다.

종양과 같이 쥐과의 대식세포(murine macrophage)로부터 얻어지는 P388D1 세포(ATCC, #CCL-46)는, 10%의 말 혈청(horse serum), 2mM의 L-글루타민이 있는 둘베코의 수정된 이글 매질(dulbeco's modified eagle medium)(DMEM)에서 보존되었다. 세포파괴 효력검정은 96-웰 플레이트에서 시작되었다. 각각의 웰에서, 190㎕의 세포가 2×10/ml의 농도로 시딩되었다(seeded). 세포 죽음의 50% 감소를 이루는데 필요한 화합물의 농도인 EC₅₀을 측정하기 위해, 투여량 반응 실험이 행해졌다. 여러 가지 농도의 PARG 억제제가 세포에 첨가되었다. 일반적인 실험은 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μM의 최종 농도를 갖는 투여량으로 이루어졌다. 각각의 데이터 점은 4번 평균되었다. 15분을 배양한 후에, 5㎕의 금방 제조된 과산화수소를 2mM의최종 농도로 세포에 첨가했다. 화합물이 없는 웰들은 배경 측정(background determination)을 위해 과산화수소에 노출시키지 않았다. 세포는 4시간 동안 37℃의 배양기로 보내어졌다. 배양이 끝나면, 죽은 세포로부터 방출되는 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)(LDH)의 수준을 측정하기 위해 세포 매질(cell media)로부터 25㎕의 상층액(supernatant)을 채취했다. 우리는 시그마사로부터 조절된 LDH 효력 검정을 사용했고, 제조에 따른 실험적 공정을 따랐다. 340nM에서 NADH 흡수성의 감소 속도를 모니터함으로써 LDH 활성을 측정했다. 배경의 LDH 활성을 뺐다. 과산화수소 처리에 의한 전체 세포 죽음을 계산하기 위해 약물 처리하지 않은 그룹이 사용되었다. PARG 억제제의 보호 효과는 세포 생존의 비율로 표현되었다. EC₅₀는 투여량 반응 곡선으로부터 측정되었다. 예를 들어, PARG 억제제에 대한 투여량 반응 곡선이 도 1에 도시되어 있다.

본 발명은 이와 같이 설명되고, 이와 동일한 것은 여러 방법으로 변화될 수 있음이 분명할 것이다. 이러한 변화는 본 발명의 사상과 범위에서 벗어나는 것으로 간주되지 않고, 이러한 모든 변화는 다음 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (38)

1. PARG 억제제(PARG inhibitor) 또는 약학적으로 수용가능한 염(pharmaceutically acceptable salt), 수화물(hydrate), 에스테르(ester), 용매화합물(solvate), 프로드러그(prodrug), 대사산물(metabolite), 또는 이들의 입체이성질체(stereoisomer), 및 약학적으로 수용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는 약학적 조성물(pharmaceutical composition)로서,

   상기 PARG 억제제는 세포 손상이나 세포 죽음으로부터 발생하는 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 존재하는, 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 세포 손상 또는 죽음은 괴사(necrosis), 세포자멸사(apoptosis) 또는 이들의 결합에 의한 것인, 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 질병 또는 이상은 급성 통증(acute pain), 관절염(arthritis), 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 악액질(cachexia), 심장 혈관 장애(cardiovascular disorders), 만성적인 통증(chronic pain), 퇴행성 질병(degenerative diseases), 당뇨병(diabetes), 세포의 수명이나 증식 능력(proliferative capacity)과 관련된 질병이나 장애, 세포의 노화(cellular senescence)에 의해 유발되거나 악화된 질병이나 질환 이상, 두부 외상(head trauma), 면역성 노화(immune senescence), 염증성 내장 장애(inflammatory boweldisorders), 국소 빈혈(ischemia), 황반 변성(macular degeneration), 근이영양증(muscular dystrophy), 국소빈혈과 재관류 손상(reperfusion injury)으로부터 발생하는 신경 조직 손상(neural tissue damage), 신경학적인 장애와 신경변성 질병(neurodegenerative diseases), 신경세포의 조절에 의한 조직(neuronal mediated tissue) 손상 또는 질병, 신경장애성 통증(neuropathic pain), 신경성 손상(nervous insult), 골 관절염(osteoarthritis), 말초 신경 손상(peripheral nerve injury), 신장 기능 부전(renal failure), 망막의 국소 빈혈(retinal ischemia), 패혈증성 쇼크(septic shock), 피부 노화, 및 혈관 뇌졸중(vascular stroke)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 PARG 억제제는 글루코스 유도체, 리그닌 글리코시드(lignin glycoside); 가수분해되는 타닌(tannin); 에데노시드 유도체; 아크리딘 유도체(acridine derivatives); 틸로론 유사체(tilorone analog); 다우노마이신(daunomycin); 엘립티신(ellipticine) 및 프로플라빈(proflavine)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
5. 제 3항에 있어서, 상기 PARG 억제제는 화학식 I의 화합물로서,

   (I)

   R₁- R₅가 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면

   R₁, R₂, R₃, R₄, R₅는 각각 수소 원자 또는 X를 나타내고,

   X는 수산기와 C₁-C₈알콕시기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹에 의해 각각 치환된 페닐(phenyl)을 갖고 있는 카르보닐(carbonyl)을 나타내는, 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, X는 갈로일(galloyl), 4-하이드록시-3-메톡시벤조일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시벤조일, 3,4,5-트리메톡시벤조일, 4-하이드록시-3-메톡시신나모일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시신나모일, 3,4,5-트리메톡시신나모일, 3,4,5-트리하이드록시벤질카르보닐 또는 3,4,5-트리하이드록시펜에틸카르보닐인, 약학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 1,2,3,4,6-펜타-o-갈로일-d-글루코피라노스, 1,2,3,4,6-펜타-o-(3,5-디메톡시-4-하이드록시신나모일)-d-글루코피라노스, 또는 1,2,3,4,6-펜타-o-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-d-글루코피라노스인, 약학적 조성물.
8. 제 3항에 있어서, 상기 PARG 억제제는 가수분해되는 타닌인, 약학적 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 가수분해되는 타닌은 갈로타닌(gallotannins)과 엘라기타닌(ellagitannins)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
10. 제 3항에 있어서, 상기 PARG 억제제는 리그닌 글리코시드인, 약학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 리그닌 글리코시드는,

    (i) 타닌과 다당류가 결합되고,

    (ii) 분자량은 500 내지 140,000이며,

    (iii) 타닌과 다당류의 결합비는 분자비로서 1:1 내지 20:1이고,

    (iv) 상기 다당류는 60 내지 70%의 우론산(uronic acid)과 30 내지 40%의 중성당(neutral sugar)으로 이루어진 특성을 갖는, 약학적 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 리그닌 글리코시드는 다음의 구조를 포함하는 약학적 조성물.
13. 제 3항에 있어서, 상기 PARG 억제제는 화학식 II의 화합물을 포함하는데,

    (II)

    R₁은 수소 원자, 화학식 III으로 표시된 그룹,

    (III)

    또는 X를 나타내는데, 여기서 X는 화학식 IV의 화합물이고,

    (IV)

    여기서 Z는 C₁-C₈알킬(alkyl), 또는 C₂-C₈알켄일(alkenyl) 결합으로서,

    R₇- R₁₁이 동시에 4개나 5개의 수소 원자가 아니고, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 각각 수소 원자 또는 X를 나타내며, X는 위에서 설명된 바와 같이 동일한 것을 나타내고,

    R₁, R₂, 및 R₃이 동시에 수소 원자를 나타내지 않으며,

    또한 R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면,

    R₇, R₈, R₉, R₁₀, 및 R₁₁은 수소, 수산기, 또는 C₁-C₈알콕시로부터 독립적으로 선택되는, 약학적 조성물.
14. 제 13항에 있어서, X는 갈로일(galloyl), 4-하이드록시-3-메톡시벤조일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시벤조일, 3,4,5-트리메톡시벤조일, 4-하이드록시-3-메톡시신나모일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시신나모일, 3,4,5-트리메톡시신나모일, 3,4,5-트리하이드록시벤질카르보닐 또는 3,4,5-트리하이드록시펜에틸카르보닐인, 약학적 조성물.
15. PARG 억제제 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 PARG 억제제는 자유 라디칼에 의해 유발된 세포 에너지 소모를 억제하거나 감소시키는데 효과적인 양으로 존재하는, 약학적 조성물.
16. 화학식 I의 화합물,

    (I)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 화학식 I의 화합물은,

    괴사 또는 세포자멸사로 인한 세포 손상 또는 세포 죽음으로부터 발생하는 조직 손상, 신경 세포의 조절에 의한 조직 손상 또는 질병, 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 혈관 뇌졸중, 심장 혈관 장애, 황반 변성, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 악액질, 골격 근육의 퇴행성 질병, 당뇨병, 머리 외상, 염증성 내장 장애, 근이영양증, 골 관절염, 골다공증, 신경장애 통증, 신경 손상, 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 및 피부 노화를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질병이나 이상을 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 존재하는데,

    R₁- R₅이 수소 원자를 동시에 나타내지 않는다면,

    R₁, R₂, R₃, R₄, R₅는 각각 수소 원자 또는 A를 나타내고,

    A는 수산기와 C₁-C₈알콕시기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹에 의해 치환된 페닐을 갖고 있는 카르보닐을 나타내는, 약학적 조성물.
17. 제 16항에 있어서, A는 갈로일, 4-하이드록시-3-메톡시벤조일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시벤조일, 3,4,5-트리메톡시벤조일, 4-하이드록시-3-메톡시신나모일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시신나모일, 3,4,5-트리메톡시신나모일, 3,4,5-트리하이드록시벤질카르보닐 또는 3,4,5-트리하이드록시펜에틸카르보닐인, 약학적 조성물.
18. 제 16항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 1,2,3,4,6-펜타-o-갈로일-d-글루코피라노스, 1,2,3,4,6-펜타-o-(3,5-디메톡시-4-하이드록시신나모일)-d-글루코피라노스, 또는 1,2,3,4,6-펜타-o-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-d-글루코피라노스인, 약학적 조성물.
19. 화학식 I의 화합물,

    (I)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 화학식 I의 화합물은 자유 라디칼에 의해 유발된 세포 에너지 소모를억제하거나 감소시키는데 효과적인 양으로 존재하고,

    R₁- R₅이 수소 원자를 동시에 나타내지 않는다면,

    R₁, R₂, R₃, R₄, R₅는 각각 수소 원자 또는 A를 나타내고,

    A는 수산기와 C₁-C₈알콕시기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹에 의해 치환된 페닐을 갖고 있는 카르보닐을 나타내는, 약학적 조성물.
20. 리그닌 글리코시드 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 리그닌 글리코시드는,

    괴사 또는 세포자멸사로 인한 세포 손상 또는 세포 죽음으로부터 발생하는 조직 손상, 신경 세포의 조절에 의한 조직 손상 또는 질병, 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 혈관 뇌졸중, 심장 혈관 장애, 황반 변성, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 악액질, 골격의 퇴행성 질병, 당뇨병, 머리 외상, 염증성 내장 장애, 근이영양증, 골 관절염, 골다공증, 신경장애 통증, 신경 손상, 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 및 피부 노화를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질병이나 이상을 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 존재하는데,

    상기 리그닌 글리코시드는,

    (i) 타닌과 다당류가 결합되고,

    (ii) 분자량은 500 내지 140,000이며,

    (iii) 타닌과 다당류의 결합비는 분자비로서 1:1 내지 20:1이고,

    (iv) 상기 다당류는 60 내지 70%의 우론산과 30 내지 40%의 중성당으로 이루어진 특성을 갖는, 약학적 조성물.
21. 제 20항에 있어서, 상기 리그닌 글리코시드는 다음의 구조를 포함하는, 약학적 조성물.
22. 리그닌 글리코시드 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 리그닌 글리코시드는, 자유 라디칼에 의해 유발된 세포 에너지 소모를 억제하거나 감소시키는데 효과적인 양으로 존재하고,

    상기 리그닌 글리코시드는,

    (i) 타닌과 다당류가 결합되고,

    (ii) 분자량은 500 내지 140,000이며,

    (iii) 타닌과 다당류의 결합비는 분자비로서 1:1 내지 20:1이고,

    (iv) 상기 다당류는 60 내지 70%의 우론산과 30 내지 40%의 중성당으로 이루어진 특성을 갖는, 약학적 조성물.
23. 화학식 II의 화합물,

    (II)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 화학식 II의 화합물은,

    괴사 또는 세포자멸사로 인한 세포 손상 또는 세포 죽음으로부터 발생하는 조직 손상, 신경 세포의 조절에 의한 조직 손상 또는 질병, 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 혈관뇌졸중, 심장 혈관 장애, 황반 변성, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 악액질, 골격 근육의 퇴행성 질병, 당뇨병, 머리 외상, 염증성 내장 장애, 근이영양증, 골 관절염, 골다공증, 신경장애 통증, 신경 손상, 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 및 피부 노화를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질병이나 이상을 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 존재하는데,

    R₁은 수소 원자, 화학식 III으로 표시된 그룹,

    (III)

    또는 A를 나타내는데,

    A는 화학식 IV의 화합물이고,

    (IV)

    여기서 Z는 C₁-C₈알킬, 또는 C₂-C₈알켄일 결합으로서,

    R₇- R₁₁이 동시에 4개나 5개의 수소 원자가 아니고, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 독립적으로 수소 원자 또는 A를 나타내며, A는 위에서 설명된 바와 같이 동일한 것을 나타내고,

    R₁, R₂, 및 R₃이 동시에 수소 원자를 나타내지 않으며,

    또한 R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면,

    R₇, R₈, R₉, R₁₀, 및 R₁₁은 수소, 수산기, 또는 C₁-C₈알콕시로부터 독립적으로 선택되는, 약학적 조성물.
24. 제 23항에 있어서, 상기 A는 갈로일, 4-하이드록시-3-메톡시벤조일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시벤조일, 3,4,5-트리메톡시벤조일, 4-하이드록시-3-메톡시신나모일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시신나모일, 3,4,5-트리메톡시신나모일, 3,4,5-트리하이드록시벤질카르보닐 또는 3,4,5-트리하이드록시펜에틸카르보닐인, 약학적 조성물.
25. 화학식 II의 화합물,

    (II)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 화학식 II의 화합물은, 자유 라디칼에 의해 유발된 세포 에너지 소모를 억제하거나 감소시키는데 효과적인 양으로 존재하고,

    R₁은 수소 원자, 화학식 III으로 표시된 그룹,

    (III)

    또는 A를 나타내는데,

    A는 화학식 IV의 화합물이고,

    (IV)

    여기서 Z는 C₁-C₈알킬, 또는 C₂-C₈알켄일 결합으로서,

    R₇- R₁₁이 동시에 4개나 5개의 수소 원자가 아니고, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 독립적으로 수소 원자 또는 A를 나타내며, A는 위에서 설명된 바와 같이 동일한 것을 나타내고,

    R₁, R₂, 및 R₃이 동시에 수소 원자를 나타내지 않으며,

    또한 R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면,

    R₇, R₈, R₉, R₁₀, 및 R₁₁은 수소, 수산기, 또는 C₁-C₈알콕시로부터 독립적으로 선택되는, 약학적 조성물.
26. PARG 억제제 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모를 억제하거나 감소시키는 방법.
27. PARG 억제제 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 죽음 또는 세포 손상을 억제하거나 예방하는 방법.
28. 괴사 또는 세포자멸사로 인한 세포 손상 또는 세포 죽음으로부터 발생하는 조직 손상, 신경 세포의 조절에 의한 조직 손상 또는 질병, 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 혈관 뇌졸중, 심장 혈관 장애, 황반 변성, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 악액질, 골격 근육의 퇴행성 질병, 당뇨병, 머리 외상, 염증성 내장 장애, 근이영양증, 골 관절염, 골다공증, 신경장애성 통증, 신경 손상, 말초 신경 손상, 종양 세포의 방사선민감, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 및 피부 노화를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질병이나 이상을 치료 또는 예방하고,

    화학식 I의 화합물,

    (I)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로서,

    R₁- R₅가 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면

    R₁, R₂, R₃, R₄, R₅는 각각 수소 원자 또는 A를 나타내고,

    A는 수산기와 C₁-C₈알콕시기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기(substituent)에 의해 치환되는 페닐을 갖고 있는 카르보닐을 나타내는, 치료 또는 예방 방법.
29. 제 28항에 있어서, A는 갈로일, 4-하이드록시-3-메톡시벤조일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시벤조일, 3,4,5-트리메톡시벤조일, 4-하이드록시-3-메톡시신나모일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시신나모일, 3,4,5-트리메톡시신나모일, 3,4,5-트리하이드록시벤질카르보닐 또는 3,4,5-트리하이드록시펜에틸카르보닐인,치료 또는 예방 방법.
30. 제 28항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-D-글루코피라노스, 1,2,3,4,6-펜타-O-(3,5-디메톡시-4-하이드록시신나모일)-D-글루코피라노스, 또는 1,2,3,4,6-펜타-O-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-D-글루코피라노스인, 치료 또는 예방 방법.
31. 화학식 I의 화합물,

    (I)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모를 억제하거나 감소시키는 방법으로서,

    R₁- R₅가 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면

    R₁, R₂, R₃, R₄, R₅는 각각 수소 원자 또는 A를 나타내고,

    A는 수산기와 C₁-C₈알콕시기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹으로부터 치환되는 페닐을 갖고 있는 카르보닐을 나타내는, 치료 또는 예방 방법.
32. 괴사 또는 세포자멸사로 인한 세포 손상 또는 세포 죽음으로부터 발생하는 조직 손상, 신경 세포의 조절에 의한 조직 손상 또는 질병, 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 혈관 뇌졸중, 심장 혈관 장애, 황반 변성, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 악액질, 골격 근육의 퇴행성 질병, 당뇨병, 머리 외상, 염증성 내장 장애, 근이영양증, 골 관절염, 골다공증, 신경장애성 통증, 신경 손상, 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 및 피부 노화를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질병이나 이상을 치료 또는 예방하고,

    리그닌 글리코시드 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로서,

    상기 리그닌 글리코시드는,

    (i) 타닌과 다당류가 결합되고,

    (ii) 분자량은 500 내지 140,000이며,

    (iii) 타닌과 다당류의 결합비는 분자비로서 1:1 내지 20:1이고,

    (iv) 상기 다당류는 60 내지 70%의 우론산과 30 내지 40%의 중성당으로 이루어진 특성을 갖는, 치료 또는 예방 방법.
33. 제 32항에 있어서, 상기 타닌 글리코시드는 다음의 구조를 포함하는, 치료또는 예방 방법.
34. 리그닌 글리코시드 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모를 억제 또는 감소시키는 방법으로서,

    상기 리그닌 글리코시드는,

    (i) 타닌과 다당류가 결합되고,

    (ii) 분자량은 500 내지 140,000이며,

    (iii) 타닌과 다당류의 결합비는 분자비로서 1:1 내지 20:1이고,

    (iv) 상기 다당류는 60 내지 70%의 우론산과 30 내지 40%의 중성당으로 이루어진 특성을 갖는, 치료 또는 예방 방법.
35. 괴사 또는 세포자멸사로 인한 세포 손상 또는 세포 죽음으로부터 발생하는조직 손상, 신경 세포의 조절에 의한 조직 손상 또는 질병, 국소 빈혈과 재관류 손상으로부터 발생하는 신경 조직 손상, 신경학적인 장애와 신경퇴행성 질병, 혈관 뇌졸중, 심장 혈관 장애, 황반 변성, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 악액질, 골격 근육의 퇴행성 질병, 당뇨병, 머리 외상, 염증성 내장 장애, 근이영양증, 골 관절염, 골다공증, 신경장애성 통증, 신경 손상, 말초 신경 손상, 신장 기능 부전, 망막 국소 빈혈, 패혈증성 쇼크, 및 피부 노화를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질병이나 이상을 치료 또는 예방하고,

    화학식 II의 화합물,

    (II)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로서,

    R₁, R₂, 및 R₃가 동시에 수소 원자를 나타내지 않고, 또한 R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면,

    R₁은 수소 원자, 화학식 III으로 표시되는 그룹,

    (III)

    또는 A를 나타내고,

    A는 수산기와 C₁-C₈알콕시기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹에 의해 각각 치환된 페닐을 갖고 있는 카르보닐을 나타내고,

    R₂, R₃, R₄, R₅및 R₆은 독립적으로 수소 원자 또는 A를 나타내고,

    A는 위에서 설명된 바와 같은 동일한 것을 나타내는, 치료 또는 예방 방법.
36. 제 35항에 있어서, A는 갈로일, 4-하이드록시-3-메톡시벤조일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시벤조일, 3,4,5-트리메톡시벤조일, 4-하이드록시-3-메톡시신나모일, 4-하이드록시-3,5-디메톡시신나모일, 3,4,5-트리메톡시신나모일, 3,4,5-트리하이드록시벤질카르보닐 또는 3,4,5-트리하이드록시펜에틸카르보닐인, 치료 또는 예방 방법.
37. 화학식 II의 화합물,

    (II)

    또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체의 치료 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 자유 라디칼에 의해 유발되는 세포 에너지 소모를 억제하거나 감소시키는 방법으로서,

    R₁, R₂, 및 R₃가 동시에 수소 원자를 나타내지 않고,

    또한 R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆이 동시에 수소 원자를 나타내지 않는다면,

    R₁은 수소 원자, 화학식 III으로 표시되는 그룹,

    (III)

    또는 A를 나타내고, A는 수산기와 C₁-C₈알콕시기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 다수의 그룹에 의해 치환된 페닐을 갖고 있는 카르보닐을 나타내고,

    R₂, R₃, R₄, R₅및 R₆은 독립적으로 수소 원자 또는 A를 나타내며,

    A는 위에서 설명된 바와 같은 동일한 것을 나타내는, 치료 또는 예방 방법.
38. PARG 억제제 또는 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 에스테르, 용매화합물, 프로드러그, 대사산물, 또는 이들의 입체이성질체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물로서,

    상기 PARG 억제제는 종양 세포를 방사선 민감화(radiosensitizing)시키는데 효과적인 양으로 존재하는, 약학적 조성물.