CN109125337B - 赶黄草化合物在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开中药赶黄草的提取物在制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用，其通过诱导自噬发挥作用，并公开了提取物中的四种关键化合物。赶黄草提取物及其化合物在体内体外实验中表现出抗动脉粥样硬化氧化应激损伤作用，对引起阿尔兹海默病的β‑淀粉样蛋白纤维的形成和Tao蛋白的表达具有抑制作用，具有用于治疗动脉粥样硬化和减轻阿尔兹海默病的潜在应用。

Description

赶黄草化合物在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用
技术领域
本发明涉及赶黄草及其化合物在疾病治疗或缓解方面的应用，具体涉及其在制备治疗动脉粥样硬化和减轻阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的药物中的应用。
背景技术
赶黄草为虎耳草科扯根菜属多年生草本植物，是一种传统中药材，古籍记载其具有清热解毒、退黄化湿、活血散瘀、利水消肿的功效。图1展示了赶黄草植株的地上部分，包括花、叶和茎(1A)，以及晒干的叶(1B)。现代研究通过对赶黄草有效成分分离鉴定，表明其含有的黄酮类、有机酸类化合物与其抗氧化和抗病毒作用有关。虽然赶黄草在保肝护肝的民间验方中有一定应用，但其作用机理以及在治疗其他疾病方面的应用潜力还有待挖掘。
自噬是一种重要的生理机制，其通过自噬溶酶体泡的形成降解细胞内非必需的或者损伤的细胞器或胞内物质，有证据表明，自噬在某些疾病的发展中扮演重要角色。自噬-溶酶体通路(ALP)和泛素-蛋白酶体系统是公认的修复或去除动脉粥样硬化及神经退行性变疾病中异常蛋白的重要途径(Ohsumi Y.Nature reviews Molecular cellbiology.2001,2(3):211；Martinet W等.Circulation research. 2009,104(3):304-17；Menzies FM等.Nature Reviews Neuroscience. 2015；16(6):345)。因此，发现新的自噬激活剂，在治疗这些疾病方面具有重要意义。
动脉粥样硬化是一种难治性疾病，其导致的心血管疾病死亡率极高。其特征是血管壁的脂蛋白沉积及炎症细胞浸润的慢性炎症。血管内皮细胞损伤被认为是诱导炎症细胞趋化浸润及促炎因子释放的重要始动因素，最终导致血管壁不可逆性结构功能改变，从而导致动脉粥样硬化的病理过程。其中，主要由血管内皮细胞和平滑肌细胞在氧化应激诱导下产生的活性氧簇(ROS)，是导致血管损伤的最重要因素(Harrison D等.AmericanJournal of Cardiology. 2003；91(3):7-11)。
氧化应激是动脉粥样硬化过程中的重要病理生理因素。近年来，有报道指出NOD样受体家族3(NLRP3)炎症小体参与氧化还原损伤的炎症机制中(De Nardo D等.Trends inimmunology.2011；32(8):373-9；Liu W等，Inflammation Research.2014；63(1):33-43)。最近文献显示，ROS激活NLRP3，NLRP3活化 caspase-1从而剪切pro-IL-1β为其活化形式IL-1β，并通过caspase-1诱导的 Gasdermin D形成的细胞膜孔道释放到胞外(He W-t等.Cellresearch. 2015；25(12):1285)。
研究显示，IL-1β参与动脉粥样硬化的发展过程。最近一项大型随机双盲临床前实验显示，一种单克隆抗体型IL-1β抑制剂——卡那单抗(canakinumab)，可以成功的降低心血管事件的发生率。这是第一个证明抑制IL-1β可以降低心血管疾病发病率的临床实验，表明IL-1β有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。
阿尔茨海默病是一种以记忆认知功能障碍为主的渐进性神经退行性疾病。细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常聚集和Tau蛋白的过度磷酸化是阿尔茨海默病的主要病理特征(Blennow K等.Lancet.2006；368(9533):387-403)。Aβ是淀粉样前体蛋白(APP)依次经β-分解酶和γ-分解酶水解而形成，过量的Aβ自聚集成大小不同的聚合体，形成淀粉样斑块，进而产生神经毒性，影响轴突功能，最终导致认知和记忆功能的丧失(Palop JJ等.Natureneuroscience. 2010；13(7):812-8)。而在细胞内，Tau蛋白的过度磷酸化形成神经纤维缠结 (Neurofibrillary tangles，NFTs)，干扰神经细胞功能，导致神经元丢失(Gong CX 等.Current medicinal chemistry.2008；15(23):2321-8)；此外，研究表明Tau基因的突变导致神经退行性病变和痴呆(Taniguchi S等.The Journal of biologicalchemistry.2005；280(9):7614-23)。因此，以Aβ，APP以及Tau为靶点，发现和鉴定新的化合物，是治疗神经退行性疾病的良好策略(Kung MP等.Brain research. 2004；1025(1-2):98-105)。
本申请的发明人在研究工作中发现，赶黄草植株提取物，特别是四种化合物Pinocembrin dihydrochalcone-7-O-[3”-O-galloyl-4”,6”-HHDP]-glucoside(TA，图7)、Pinocembrin-7-O-[3”-O-galloyl-4”,6”-HHDP]-glucoside(PG，图8)、 Pinocembrindihydrochalcone-7-O-[4”,6”-HHDP]-glucoside(TB，图9)、 Pinocembrin-7-O-[4”,6”-HHDP]-glucoside(PG1，图10)，在抗氧化、自噬诱导及清除Aβ、Tau蛋白聚合物中具有一定的功效，具有治疗动脉粥样硬化和减轻阿尔兹海默病的潜力。
发明内容
本发明提供中草药赶黄草及其化合物在制备药物方面的一种用途，即将其用于制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物，该药物对于所述动脉粥样硬化和神经退行性疾病的治疗作用是通过诱导自噬发挥作用的。
技术方案如下：
本发明的目的之一在于赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用。
优选地，赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用，所述赶黄草提取物包括如下化合物中的至少一种：
化合物(Ⅰ)TA，其结构式为
Figure BDA0001738938690000041
化合物(Ⅱ)PG，其结构式为
Figure BDA0001738938690000042
化合物(Ⅲ)TB，其结构式为
Figure BDA0001738938690000051
化合物(Ⅳ)PG1，其结构式为
Figure BDA0001738938690000052
优选地，赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用，动脉粥样硬化涉及血管包括冠状动脉、主动脉、外周动脉和脑动脉。
优选地，赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用，所述赶黄草提取物对动脉粥样硬化的治疗作用包括减轻动脉粥样硬化中氧化应激损伤和抑制损伤后炎症因子的表达。
优选地，赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用，所述炎症因子包括IL-1β。
优选地，赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用，所述赶黄草提取物对阿尔兹海默病的治疗作用包括降低β-淀粉样蛋白和Tau蛋白的表达。
本发明的目的之二在于提供一种用于治疗动脉粥样硬化或减轻阿尔茨海默病的药物或组合物，其关键在于，包含作为活性成分的如下化合物中的至少一种：
化合物(Ⅰ)，
化合物(Ⅱ)，
化合物(Ⅲ)，
化合物(Ⅳ)。
优选地，所述药物或组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
优选地，所述药物或组合物为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或注射剂。
附图说明
图1为赶黄草植株形貌图：(A)地上部分花、叶及茎和(B)晒干的叶；
图2为免疫印迹法检测赶黄草的花、叶及茎提取物在HeLa细胞中诱导自噬： (A)蛋白条带和(B)量化的蛋白条带统计学分析结果柱状图；
图3展示免疫荧光法检测赶黄草的花、叶及茎提取物在GFP-LC3稳转的 U87细胞中诱导自噬：(A)免疫荧光照片和(B)柱状图显示GFP-LC3绿色荧光颗粒阳性细胞的比率；
图4为CMC联合UHPLC-TOF-MS鉴定分离赶黄草中新活性成分的流程图；
图5为赶黄草的叶提取物的CMC样品的总离子色谱图；
图6为(A)赶黄草中化合物C1,C2,C3及C4的质谱图和(B)通过CMC 联合UHPLC-TOF-MS鉴定分离的赶黄草中四个化合物(TA,PG,TB and PG1)的色谱停留时间、精确质量以及分子量；
图7为化合物TA的化学结构、分子式(HHDP＝hexahydroxydiphenoyl)及分子量；
图8为化合物PG的化学结构、分子式及分子量；
图9为化合物TB的化学结构、分子式(HHDP＝hexahydroxydiphenoyl)及分子量；
图10为化合物PG1的化学结构、分子式及分子量；
图11免疫印迹法检测四种赶黄草化合物在GFP-LC3稳转的U87细胞中诱导自噬：(A)免疫荧光照片和(B)柱状图显示GFP-LC3绿色荧光颗粒阳性细胞的比率；
图12免疫印迹法检测TA、PG、TB和PG1处理过的HUVEC细胞的自噬蛋白LC3-I/II表达情况：(A)蛋白条带和(B)量化的蛋白条带统计学分析结果柱状图；
图13免疫印迹法研究溶酶体抑制剂对四种赶黄草化合物处理的HUVEC细胞的自噬蛋白LC3-I/II表达情况的影响：(A)蛋白条带和(B)量化的蛋白条带统计学分析结果柱状图；
图14免疫印迹法研究四种赶黄草化合物处理的Atg7野生型和基因敲除型 MEF细胞中的自噬蛋白LC3-I/II表达情况：(A)蛋白条带和(B)量化的蛋白条带统计学分析结果柱状图；
图15四种赶黄草化合物预处理对H2O2诱导HUVEC细胞凋亡情况的影响： (A)细胞流式图和(B)细胞凋亡率柱状图；
图16(A)四种赶黄草化合物在H2O2诱导的HUVEC细胞线粒体膜电位 (MMP)降低中的保护作用；(B)柱状图示正常MMP的HUVEC细胞的比例；
图17(A)免疫印迹法表明在HUVEC细胞中CC(AMPK抑制剂)可以抵消TA诱导的AMPK磷酸化及自噬的发生；(B)柱状图示各组p-AMPK条带相对于β-actin的表达强度分析；
图18(A)在HUVEC细胞中CC(AMPK抑制剂)可以抵消TA诱导的自噬颗粒形成，(B)柱状图示GFP-LC3自噬颗粒阳性细胞比率；
图19在有无CC(AMPK抑制剂)的情况下，TA对H2O2诱导的HUVEC 细胞氧化应激损伤影响：(A)细胞形貌和(B)柱状图示各组处理方式下H2O2诱导的HUVECs的细胞活性变化；
图20免疫细胞化学染色显示TA可以逆转H2O2诱导的HUVEC细胞线粒体膜电位的降低，而CC可抑制TA的这种保护作用；
图21(A)免疫印迹法检测Atg7siRNA抑制HUVEC细胞Atg7基因后的蛋白表达情况；(B)Atg7基因敲除后，TA对HUVEC细胞的抗氧化应激损伤的作用明显降低；
图22TA减轻oxLDL诱导的HUVEC细胞死亡；
图23TA减轻ApoE-KO小鼠主动脉管壁的氧化应激水平；
图24免疫组化染色显示，TA减轻ApoE-KO小鼠主动脉管壁的IL-1β表达水平；
图25免疫印迹法显示，TA减轻ApoE-KO小鼠主动脉管壁的NLRP3和IL-1 β(前体型和活化型IL-1β)表达水平：(A)蛋白条带，(B)柱状图示前体型 IL-1β表达的量化分析结果；
图26ThT荧光测定显示TA对Aβ(1-42)纤维的抑制效应；
图27(A)斑点免疫印迹分析显示TA对Aβ(1-42)纤维的清除效应；(B) 量化的斑点免疫印迹分析结果；
图28TA减轻Aβ(1-42)纤维诱导的PC12细胞存活率降低；
图29(A)TA降低带标记的APP质粒转染的PC12细胞中过表达的APP； (B)柱状图示APP表达的量化统计结果；
图30(A)带绿色荧光蛋白的Tau质粒转染至PC12细胞，TA减少绿色荧光蛋白的表达；(B)柱状图示Tau绿色荧光蛋白表达的量化统计结果；
图31(A)带绿色荧光蛋白的P301L-Tau质粒转染至PC12细胞，TA减少绿色荧光蛋白的表达；(B)柱状图示P301L-Tau绿色荧光蛋白的量化统计结果。
中英文缩写对照：
Aβ＝β-淀粉样蛋白；ApoE KO＝ApoE基因敲除型；APP＝淀粉样前体蛋白； CMC＝细胞膜相色谱；ECL＝增强化学发光显影剂；HRP＝辣根过氧化物酶； HUVEC＝人脐静脉内皮细胞；IL-1β＝白介素1β；MEF＝小鼠胚胎成纤维细胞； MMP＝线粒体膜电位；NLRP3＝NOD样受体家族3；oxLDL＝氧化低密度脂蛋白； PCP-flower＝赶黄草花；PCP-leaf＝赶黄草叶；PCP-stem＝赶黄草茎；PVDF＝聚偏氟乙烯；ROS＝活性氧；RSV＝白藜芦醇；siRNA＝小干扰RNA；Th-T＝硫代磺色素；UHPLC-TOF-MS＝超高效液相色谱-飞行时间质谱；WT＝野生型。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1：赶黄草总提取物诱导自噬
1.1免疫印迹法检测Hela细胞中自噬相关蛋白的表达
向培养的Hela细胞中分别加入15-30μg/mL药物孵育过夜：赶黄草花提取物、赶黄草叶提取物、赶黄草茎提取物，以雷帕霉素(Rapa)作为自噬阳性对照。药物处理后，以70μl/孔的量向各孔中加入RIPA裂解液(Cell Signaling Technologies Inc.Beverly，MA，USA)裂解HeLa细胞，Bradford试剂(Bio-Rad， Hercules，CA，USA)测量蛋白浓度。在SDS-PAGE电泳胶每个孔加入等量蛋白，在300mA电流下电泳2小时，将SDS-PAGE胶上蛋白转到PVDF膜上。PVDF 膜用5％的脱脂奶粉封闭60分钟，TBST(1X)洗涤三次。随后，将此PVDF膜与一抗在4℃摇床孵育过夜或室温下孵育2小时。然后TBST(1X)洗涤三次，然后 HRP标记的二抗孵育60分钟。TBST(1X)洗涤PVDF膜三次，ECL免疫印迹检测液(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)曝光显影蛋白条带。
1.2转染及建立GFP-LC3稳转的U87细胞系
通过LipofectamineTM 2000试剂(Invitrogen，Shanghai，China)将GFP-LC3 质粒转染U87细胞。通过流式细胞仪(Becton Dickinson，US)分选表达GFP-LC3 的U87细胞。300mg/mL的G418(GDJ958，Sangon Biotech Co.Ltd，Shanghai， China)筛选获得稳定转染成功的细胞系。
1.3 GFP-LC3绿色荧光颗粒测定
向培养的GFP-LC3稳转的U87细胞内添加赶黄草花提取物、赶黄草叶提取物或赶黄草茎提取物进行处理，形成的GFP-LC3绿色荧光颗粒依据文献中的方法进行量化(KlionskyDJ等.Autophagy.2016；12(1):1-222)。简言之，GFP-LC3稳转的U87细胞种植在6孔板的盖玻片上，药物处理后，4％多聚甲醛室温固定细胞20分钟，PBS洗涤两次。FluorSaveTM封片液(Calbiochem，San Diego，CA， USA)封闭空气中晾干的玻片。荧光显微镜分析系统(AppliedPrecision DeltaVision Elite，Applied Precision，Inc，USA)观察和计量GFP-LC3绿色荧光颗粒形成的阳性细胞数。GFP-LC3绿色荧光颗粒阳性细胞数除以总细胞数，得到阳性细胞比率。随机选取三个视野的150个细胞进行计数。
1.4结果与分析
免疫印迹法分析上述赶黄草总提取物在HeLa细胞中的诱导自噬作用。见图 2A和2B，赶黄草的花和叶提取物(15和30μg/mL)可以明显诱导自噬标志蛋白LC3-II的表达，并且诱导自噬效果比茎提取物更强。通过免疫细胞化学方法，在GFP-LC3稳转U87细胞系观察赶黄草提取物诱导自噬的效果。如图3A 和3B示，15-60g/mL的赶黄草花和叶提取物能促进GFP-LC3II绿色荧光颗粒形成(图3A中明亮区域)，且其促进效果表现出浓度依赖性，诱导自噬发生，并显示出比茎的提取物更强的效果。
1.5细胞膜相色谱(CMC)联合UHPLC-TOF-MS技术鉴定赶黄草中的活性成分
实验流程图解：如图4所示，首先，在HeLa细胞、GFP-LC3稳转U87细胞及HUVEC细胞中，通过免疫印迹法和免疫荧光法观察胞浆LC3-I向膜结合的 LC3-II转化的自噬过程。通过不同极性的溶剂溶解赶黄草各部分的总提物来提高萃取效率。HUVEC细胞与上述提取物共同孵育6小时后，PBS洗掉赶黄草中无细胞膜亲和力的成分，而保留其与细胞膜具有亲和力的赶黄草成分，进行细胞膜相色谱分析。上述细胞通过柠檬素结合超声破碎，未经过赶黄草药物处理的细胞作为对照组。最后，通过UHPLC-TOF-MS分析鉴定各组的组分。未知化合物通过MRI进一步分析。在体内体外试验中，进一步验证上述鉴定分离的自噬活性化合物的生物学活性。
细胞膜相色谱法(CMC)：HUVEC细胞与100μg/mL的赶黄草酒精总提物 (TEE)共同孵育4小时。取1mL的上层液置于15mL的离心管中。PBS洗涤上述细胞5次。PBS洗涤液作为对照组，来明确那些赶黄草中对细胞膜无亲和力的化合物。培养皿中的细胞通过柠檬素缓冲液(3mL，pH 4.0)37℃破裂。超声辅助更有利于细胞悬液中的细胞破裂。然后上述破裂的HUVEC细胞溶液在 2500rpm离心5分钟，液氮吹干。100μL甲醇重悬离心底层存留物后，0.22μ m直径微孔膜过滤，进一步行UHPLC-TOF-MS分析鉴定(Feng L等.Journal of ChromatographyB.2012；881:55-62)。
仪器及色谱条件：使用Agilent Technologies 1290系列的超高效液相色谱(UHPLC)联合Agilent Technologies 6230飞行时间质谱(MS)以及阴离子模式的喷射离子流。通过Agilent Zorbax Eclipse Plus C-18 50mm×2.1mm柱子 (颗粒直径:1.8μm)，以0.35mL/min速率分离提取物。柱子温度设置为40℃，分析样品量为1μL。流动相A:0.1％甲酸水溶剂，流动相B(ACN)，以梯度洗脱方式进行：0–8min，5％–70％(B)；8–11min，70％–100％(B)，11–14min, 100％(B)；14–18min，5％(B)。扫描模式以2.0频谱/秒从m/z 100到3200Da设置，通过UHPLC-TOF-MS数据系统获取。Agilent MassHunter Workstation softwareB.01.03软件进行数据分析。
结论：图5显示赶黄草叶乙酸乙酯提取物(EF)的CMC样品的总离子色谱图。图5中S3色谱图显示赶黄草EF提取物具有几个主要的峰，但是与赶黄草处理过的HUVEC细胞裂解液相比较后，发现C1、C2、C3和C4化合物成分。并且此四个化合物在未经过赶黄草处理的对照组(S2)及细胞PBS冲洗液(S1) 中未发现。这些数据显示赶黄草中的化学成分C1、C2、C3和C4是与HUVEC 细胞相互作用的化合物(图5)。
本实验通过UHPLC-TOF-MS技术进一步鉴定赶黄草中C1、C2、C3和C4 成分，如图6。UHPLC-TOF-MS以2.0频谱/秒从m/z 100到3200Da扫描模式分析CMC分离的赶黄草成分。该四个化合物的峰在100-3200Da的质量范围内。通过比对精确质量(MS)、文献报道的赶黄草已知分子式(Guo W等.Journal of separation science.2015；38(16):2789-96)以及“天然化合物字典”(Dictionary of Natural Products.最后访问：2016年11月5.网址: http://dnp.chemnetbase.com/faces/chemical/ChemicalSearch.xhtml)，最终该四个化合物被鉴定如下：
C1:Pinocembrin-7-O-[4”,6”-hexahydroxydiphenoyl]-glucoside＝PG1(图10)；
C2:Pinocembrin dihydrochalcone-7-O-[4”,6”-hexahydroxydiphenoyl]-glucoside ＝Thonningianin B＝TB(图9)；
C3:Pinocembrin-7-O-[3”-O-galloyl-4”,6”-hexahydroxydiphenoyl]-glucoside ＝PG(图8)；
C4:Pinocembrin
dihydrochalcone-7-O-[3”-O-galloyl-4”,6”-hexahydroxydiphenoyl]-glucoside
＝Thonningianin A＝TA(图7)
本发明第一次阐述赶黄草的花、叶和茎的总提取物可以诱导自噬，该结论通过免疫印迹和GFP-LC3稳转免疫荧光方法证明。
实施例2：化合物TA、PG、TB、PG1诱导自噬
2.1 GFP-LC3绿色荧光颗粒测定
如实施例1中的方法转染及建立GFP-LC3稳转的U87细胞系，药物处理后，检测GFP-LC3绿色荧光颗粒。
2.2免疫印迹法
如实施例1中描述的方法，使用4-8μM化合物TA、PG、TB、PG1处理 HUVEC细胞，以不加药物组作为空白对照，并以雷帕霉素(Rapa)作为阳性对照。经药物处理后，采用前述方法裂解各组HUVEC细胞，SDS-PAGE蛋白电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，使用抗体孵育后，使用ECL免疫印迹检测液 (Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)曝光显影蛋白条带。
结果分析：通过GFP-LC3稳转的U87细胞的免疫荧光技术分析上述四个化合物的自噬活性。如图11A所示，TA，PG，TB和PG1可以在2μM到16μ M的浓度范围内诱导GFP-LC3绿色荧光颗粒的形成，该诱导作用表现出剂量依赖性。柱状图定量分析GFP-LC3颗粒形成阳性细胞比率(图11B)。
免疫印迹结果进一步确认TA，PG，TB和PG1能够在HUVEC细胞中剂量依赖性的增强LC3-II蛋白表达(图12A)。如图12B所示，TA和TB比PG 和PG1更强地诱导LC3-I向LC3-II转化，说明具有更强的自噬诱导活性。结合图7-10，在U87细胞和HUVEC细胞中，仅含有黄酮及查耳酮苷的化合物才具有自噬诱导活性。比较上述四种化合物的结构可知，含有查耳酮苷的化合物(TA 和TB)比含黄酮结构的化合物(PG和PG1)具有更强的自噬活性，并且具有糖基的黄酮(PG)和查耳酮苷(TA)比不具有糖基的黄酮(PG1)和查耳酮苷 (TB)具有更强的自噬活性。方框内结构代表黄酮(flavonone)或查耳酮 (chalcone)，圆框内结构代表糖基。
2.3 TA，PG，TB和PG1诱导细胞自噬流是Atg7依赖性的
2.3.1 TA，PG，TB和PG1通过增加自噬泡的形成而诱导自噬流的发生
如实施例1中描述的方法，单独使用8μM化合物TA、PG、TB、PG1，或同时加入E64d+pepstatin A(溶酶体酶抑制剂)处理HUVEC细胞，以不加药物组作为空白对照，并以雷帕霉素(Rapa)作为阳性对照。经药物处理后，采用前述方法裂解各组HUVEC细胞，SDS-PAGE蛋白电泳，将蛋白转移到PVDF 膜上，使用抗体孵育后，使用ECL免疫印迹检测液(Invitrogen，Paisley， Scotland，UK)曝光显影蛋白条带。
由于自噬蛋白LC3II的表达升高可以是继发于自噬流诱导的增强，或者是由于自噬泡与溶酶体融合障碍导致自噬泡聚积而引起(Mizushima N等. Autophagy.2007；3(6):542-5；Tanida I等.Autophagy.2005；1(2):84-91)。为了区分上述两种可能性，本实验通过E64d+pepstatin A(溶酶体酶抑制剂)来进行鉴别。如图13A和13B所示，在E64d+pepstatinA处理的情况下，四种赶黄草化合物TA、TB、PG、PG1依旧可以明显的增加自噬蛋白LC3II的表达。此结果显示上述四个化合物是通过增加自噬泡的形成而诱导自噬流的发生。
2.3.2 TA，PG，TB和PG1诱导细胞自噬流是Atg7依赖性的
为进一步探明赶黄草分离活性化合物的分子机制，本实验利用Atg7野生型 (Atg7+/+)和Atg7基因敲除型(Atg7-/-)MEFs细胞，来研究TA，PG，TB 和PG1(各8μM)诱导自噬的途径。其中，Atg7是自噬诱导的关键因子，对自噬泡的形成具有重要的作用(Juhász G等.Genes&development. 2007；21(23):3061-6)。本试验显示，前述四个化合物可以诱导Atg7野生型MEFs 细胞自噬发生，但是不能诱导Atg7基因敲除型MEFs细胞的自噬发生(图14A 和14B)。该结果说明，化合物TA，PG，TB和PG1诱导自噬是Atg7依赖性的。
2.4 TA，PG，TB和PG1预处理可以降低H2O2诱导的HUVEC细胞凋亡和恢复下降的线粒体膜电位
2.4.1细胞凋亡分析
将HUVEC细胞接种到60-mm培养皿中培养12小时，根据试验设计，各组使用TA，PG，TB或PG1(各8μM)预处理2小时或不进行处理，然后使用H2O2 (600μM)共孵育24小时。胰酶消化收集上述细胞，离心，PBS洗涤2次。使用流式细胞仪(FACS Calibur flow cytometer，BDBiosciences，CA)，通过FITC标记的Annexin V和Propidium Iodide(PI)双染试剂检测凋亡变化。具体地，含上述双染试剂的缓冲液与细胞作用30分钟进行染色。流式细胞仪FITC荧光发射值设置为515-545nm，PI结合DNA复合体的荧光发射值设置为564-606nm，其激发值皆为488nm。按照使用手册，Annexin V阳性合并PI阴性HUVEC细胞代表凋亡早期，而Annexin V阳性合并PI阳性代表凋亡晚期。
2.4.2线粒体膜电位(MMP)检测
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。Rhodamine 123 (Rho-123)是一种亲脂性阳离子荧光染料，可以被线粒体选择性摄取并以膜电位依赖性方式分布于线粒体，即被摄取的Rho-123的量与细胞MMPΔΨm呈正相关。因此，本试验使用Rho-123(Invitrogen，Carlsbad，CA)检测细胞MMP的变化。HUVEC细胞接种到6孔板12小时后，根据试验设计，部分组细胞使用 TA(8μM)预处理2小时，然后H2O2(600μM)共孵育24小时。然后，将胰酶消化上述细胞，PBS洗涤2遍，1μM含Rho-123的工作液重悬细胞，37℃共孵育 30分钟后，PBS洗掉细胞外Rho-123。通过流式细胞仪测量每组样品中10,000 个细胞中MMPΔΨm相对值。Rho-123荧光强度测量的激发值和发射值分别设置为488nm和525-530nm。细胞内MMP的水平以Rho-123荧光发射强度均值来表示。
2.4.3结果与分析
为进一步验证TA，PG，TB和PG1的保护作用，本试验通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测其在H2O2诱导的HUVEC细胞凋亡中的作用。如图 15A和15B所示，H2O2(600μM)诱导细胞凋亡率从约3％升高到约34％，而TA， PG，TB或PG1(各8μM)预处理2小时后，细胞凋亡率下降至10.6％，表明化合物TA，PG，TB或PG1可以明显的减弱H2O2(600μM)诱导的细胞凋亡。上述结果初步显示，化合物TA，PG，TB和PG1具有抗HUVEC细胞氧化应激损伤的作用。
如图16A和图16B，H2O2(600μM)处理诱导HUVEC细胞中MMP正常细胞比例从DMSO对照组的约91.7％降至约68.0％，而TA，PG，TB或PG1(各 8μM)预处理2小时可以逆转MMP的降低，使正常MMP细胞的比例最高升至 85.6％。上述结果显示，化合物TA，PG，TB或PG1可能通过维持线粒体稳定性来发挥抗H2O2诱导的氧化应激损伤。
2.5 TA通过AMPK依赖信号通路诱导自噬及保护H2O2介导的细胞氧化应激损伤
2.5.1Compound C对TA诱导HUVEC细胞自噬作用的影响
AMPK信号通路能够促进自噬，Compound C(CC)是一种AMPK抑制剂。向培养的HUVEC细胞中加入药物TA、TA+CC、CC进行处理，TA浓度为8μ M，CC浓度为0.5μM，以不加药物的空白组作为对照。药物处理后，采用如实施例1中所述免疫印迹法，检测药物处理对HUVEC细胞中p-AMPKα1、 AMPK、LC3I、LC3II蛋白的表达。
2.5.2 Compound C对TA诱导GFP-LC3稳转的U87细胞自噬作用的影响
如实施例1中的方法转染及建立GFP-LC3稳转的U87细胞系，药物处理后，检测GFP-LC3绿色荧光颗粒。
2.5.3 Compound C对TA抗H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤作用的影响
细胞毒性试验：DMSO溶解药物，于-40℃保存待用。MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)法用于测量细胞活性 (Riss TL等.Cellviability assays.2016)。细胞接种于96孔板12小时后，添加化合物孵育细胞48小时。各组添加化合物分别为：TA，CC，H2O2，TA+H2O2， TA+CC+H2O2，TA浓度为8μM，CC浓度为0.5μM，H2O2浓度为600μM，以不加化合物组作为空白对照。每个孔中加入10μL的5μg/mL MTT，共同孵育 4小时。然后DMSO溶解所形成的紫色结晶。分光光度计在570nm处测量上述混合溶液的比色值。细胞活性通过以下公式计算比率：％细胞活性＝(处理组细胞OD值/DMSO对照组细胞OD值)×100。三组独立试验数据进行统计学分析。
线粒体膜电位检测(JC-1染色)：在MMP较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在MMP较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测MMP的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。HUVEC细胞接种于μ-Slide 8-孔玻璃底板(#80826，ibidi， Germany)中，每孔8，000个细胞。按照实验设计，各组细胞使用或不使用既定浓度的TA或CC预处理2小时后，与400μM H2O2共孵育24小时，弃掉培养基，加入含10μg/mL JC-1的PBS 1mL，37℃孵育10分钟。使用63×倍油浸物镜的共聚焦显微镜(Leica TCSSP8，Germany)观测细胞MMP的红色和绿色荧光变化。荧光观测条件为，红色荧光激发488/发射530nm，绿色荧光激发550/ 发射600nm。计算红色/绿色荧光的比率来评估量化细胞MMP的变化。
2.5.4 Atg7 siRNA对TA抗H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤作用的影响
Atg7 RNA干扰技术：由Ambion(Invitrogen，Scotland，UK)公司按照基因序列5’-GGAGUCACAGCUCUUCCUU-3’合成人Atg7siRNA，以及对照组 siRNA。LipofectamineTM 2000(Invitrogen)推荐用于转染短链寡聚RNA。按照使用说明，脂质体转染过夜接种的HUVEC细胞4小时，转染成功的细胞孵育48 小时后用于进一步试验研究。
Atg7是一种自噬关键基因，本实验通过免疫印迹法检测Atg7siRNA对 HUVEC细胞中Atg7的表达作用的影响。
2.5.5结果与分析
如图17A和17B示，CC明显的降低TA诱导的p-AMPK表达，继而显著的抵消TA诱导的LC3I向LC3II转化。本试验结果显示，在HUVEC细胞中， TA诱导的自噬发生是AMPK依赖性的。
免疫荧光试验结果显示，在GFP-LC3稳转的U87细胞中，CC同样抑制TA 诱导的自噬发生。如图18A和18B示，CC(1.25μM)明显降低TA(8μM)诱导的GFP-LC3绿色荧光颗粒(明亮区域)形成。本试验说明在GFP-LC3稳转U87 细胞中，TA诱导的自噬是AMPK依赖性的。
TA可以减轻H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤。如图19A和19B示，在MTT法检测细胞活性试验中，TA(8μM)可以显著的降低H2O2诱导的 HUVEC细胞氧化应激性死亡，并且TA的这种保护作用可以被CC所抵消。该实验结果显示，抑制自噬可以抵消TA在HUVEC细胞中的抗H2O2诱导氧化应激损伤的作用，从另一方面说，TA诱导的自噬可能在其抗H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤中发挥重要的作用。
从机制研究出发，本试验发现TA复转H2O2诱导的细胞MMP降低是AMPK 活化依赖性的。如图20示，H2O2(400μM)导致HUVEC细胞MMP明显降低，表现为减弱的红色荧光和增强的绿色荧光。而TA(8μM)可以有效的复转H2O2诱导的MMP下降，表现为增强的红色荧光(Red，第三行图片)和减弱的绿色荧光(Green，第二行图片)。若CC(0.5μM)预处理1小时，将几乎阻断TA对 HUVEC细胞MMP的复转作用。上述试验结果显示，TA诱导的自噬或AMPK 活化，通过复转MMP的下降参与抗H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤过程。
并且，本试验发现敲除自噬关键基因Atg7亦可以抑制TA在HUVEC细胞中的抗氧化应激作用。如图21A和21B，免疫印迹法显示Atg7siRNA转染显著的抑制了HUVEC细胞中Atg 7的表达。然后再检测Atg 7敲除后，TA对于H2O2诱导的氧化应激损伤导致的细胞活性变化。柱状图结果显示，与H2O2+TA组相比，Atg 7siRNA显著降低了TA(8μM)对H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤的保护作用。本试验结果显示，TA诱导的自噬在保护H2O2诱导的HUVEC 细胞氧化应激损伤中发挥重要作用。
2.6 TA减轻oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤
目前已经证实，氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)是导致内皮损伤的一个重要危险因素，特别是其所介导的氧化应激与脂质渗入相互作用，促进动脉粥样硬化的发展。如2.5.3部分所述的细胞活力检测方法，本实验研究TA对oxLDL 诱导的HUVEC细胞损伤作用的影响。各组细胞添加的化合物分别为：oxLDL， TA，oxLDL+TA，其中oxLDL浓度为50μg/mL，TA浓度为8μM，以不添加化合物的空白组作为对照。
如图22示，TA可以明显降低oxLDL诱导的HUVEC细胞死亡，提高细胞活性，从而显示出其在高脂血症氧化应激中的潜在的保护作用。
小结：化合物TA、TB、PG、PG1能够诱导自噬，其对于H2O2诱导的HUVEC 细胞凋亡和线粒体膜电位下降具有明显的保护作用，从而表现出显著的抗血管细胞氧化应激损伤的作用。
作为一种AMPK抑制剂，CC在免疫印迹和GFP-LC3稳转免疫荧光试验中可以抵消TA诱导的自噬，从而说明TA诱导的自噬是AMPK依赖性的。
由此，通过CC和siRNA Atg7阻断TA诱导的自噬，TA对于H2O2诱导 HUVEC细胞氧化应激损伤的保护作用以及线粒体膜电位的恢复作用发生极大的降低。此试验结果第一次证明TA诱导的自噬在抗氧化应激损伤中发挥重要作用。
实施例3：TA可以降低ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠模型(ApoE-KO mice)主动脉血管氧化应激水平
建立2月龄ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠(ApoE-KO)模型，C57BL/6J 野生型小鼠作为对照组，各组给予或不给予腹腔注射TA(0.1mg/kg每天)一个月疗程，来评估TA在ApoE-KO基因敲除小鼠早期主动脉动脉粥样硬化过程中的作用。
3.1主动脉血管ROS测定
使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA) 来测定细胞内ROS含量。ApoE-KO小鼠和C57BL/6J小鼠的主动脉血管细胞通过Nylonsieve mesh联合胰酶法收集。向上述细胞中加入10μM DCFH-DA，在 37℃共同孵育30分钟，然后用无血清培养基洗涤三遍。细胞内酯酶水解 DCFH-DA成DCFH，使其可以穿过细胞膜，无荧光的DCFH被细胞内的ROS 氧化变成具有荧光的DCF。通过分光光度计或流式细胞仪测定细胞内DCF的荧光数值，激发波长488nm，发射波长525-530nm。细胞内ROS的水平通过此荧光强度平均值来表示。
3.2免疫组织化学法(IHC)研究主动脉组织IL-1β的表达
主动脉血管使用methyl Carnoy固定，石蜡包埋，4μm切片，Periodic Acid–Schiff(PAS)法染色。IL-1β抗体免疫学染色石蜡切片，微波法进行抗原修复。二抗免疫学染色后，二氨基联苯胺处理为棕色，苏木精复染。
Figure BDA0001738938690000211
AT2 (Leica Biosystems，Wetzlar，Germany)观测切片。
3.3免疫印迹法研究ApoE-KO小鼠主动脉NLRP3和IL-1β的表达
ApoE-KO小鼠和C57BL/6J小鼠的主动脉血管细胞通过Nylon sieve mesh联合胰酶法收集。然后根据实施例1中所述的免疫印迹法，研究NLRP3和IL-1β (前体及活性型)在小鼠主动脉的表达情况。具体地，采用前述方法裂解各组 HUVEC细胞，SDS-PAGE蛋白电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，使用抗体孵育后，使用ECL免疫印迹检测液(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)曝光显影蛋白条带。
3.4结果与分析
如图23，DCFDA试验显示，ApoE-KO小鼠主动脉管壁ROS含量较C57BL/6J 小鼠明显升高，而TA治疗后可以极大的降低ApoE-KO小鼠主动脉ROS表达水平。本试验结果显示，TA在ApoE-KO基因敲除小鼠动脉粥样硬化过程中具有明显的抗氧化应激的作用。
细胞内ROS能够激活炎症小体形成，通过活化caspase-1促进炎症因子 IL-1β的表达释放，而IL-1β参与动脉粥样硬化的发展过程。现有研究显示，自噬参与动脉粥样硬化中炎症小体形成((Razani B等.Cell metabolism. 2012；15(4):534-44)，同时本实验上述结果表明TA能够降低ROS的水平，因此，本实验还研究了TA对小鼠主动脉中IL-1β表达的影响。如图24示，免疫组织化学法发现，ApoE-KO小鼠动脉壁增厚、大量炎性细胞浸润、IL-1β表达高(实际为深染棕褐色颗粒，图中显示为深染灰色，黑色椭圆点示细胞核)，TA(0.1 mg/kg每天，腹腔注射)可以降低ApoE-KO小鼠主动脉IL-1β的表达，动脉壁组织更接近正常，显示TA具有抗炎症的潜在功效。
本实验通过免疫印迹法，进一步研究ApoE-KO小鼠主动脉NLRP3和 IL-1β的表达情况。NLRP3是动脉粥样硬化病理过程中最重要的炎症小体 (Duewell P等.Nature.2010；464(7293):1357)。IL-1β具有两种形式，前体 pro-IL-1β及活性型cleaved-IL-1β。Cleaved-IL-1β是由包括NLRP3在内的炎症小体活化的caspase-1剪切活化，进而在动脉粥样硬化始动和发展过程中发挥重要影响(Agostini L等.Immunity.2004；20(3):319-25；Kirii H等.Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology.2003；23(4):656-60)。因此，研究TA对于ApoE-KO小鼠主动脉活化型IL-1β表达的作用具有重要的意义。如图25A和25B，TA可以明显的降低ApoE-KO小鼠主动脉壁cleaved-IL-1β的表达，并且同时降低NLRP3和前体型IL-1β的表达，进一步证实了TA抗模型小鼠动脉粥样硬化的作用。
小结：在ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠模型(ApoE-KO小鼠)体内实验中发现，TA可以降低主动脉血管氧化应激水平。并且，通过免疫印迹实验方法，发现TA降低ApoE KO小鼠主动脉壁NLRP3和IL-1β(前体和活化两种形式的IL-1β)的表达水平。
实施例4：TA对Aβ的抑制效应和对神经细胞的保护作用
4.1 Aβ(1-42)聚合体的制备
取1毫克Aβ(1-42)多肽粉末溶解于400μL的六氟异丙醇(HFIP)中，密封并涡旋混匀，用超声溶解至溶液澄清，再分装至1.5毫升eppendorff管(100μL/ 管)，然后用氮气温和吹干，得到附着于管壁的无色透明Aβ肽膜，置于-80℃冰箱保存备用。
4.2 TA对体外Aβ(1-42)纤维化的影响
Th-T是一种能够与淀粉样纤维的β片层结构特异性结合的荧光探针，因此成为测定Aβ纤维的经典方法。用10μL的DMSO和490μL的PBS(pH＝7.4) 溶解Aβ(1-42)肽膜，然后取20μL Aβ(1-42)溶液加入适量的TA及PBS共100 μL，Aβ(1-42)终浓度为20μM，置于37℃恒温孵育，空白对照组不加 Aβ(1-42)，模型对照组不加入TA。5天后，取10μL该溶液，加入20μM的Th-T 190μL，在波长440nm至490nm处检测其荧光值。
4.3斑点免疫印迹分析
斑点免疫印迹是检测和分析生物分子和蛋白质的常用技术。20μM的 Aβ(1-42)和TA在37℃共孵育5天，取其4μL均匀点到预先活化的PVDF膜上，然后用5％的脱脂牛奶封闭1h，加入Anti-Amyloid Fibril抗体 (mOC87)(1:1000，Abcam，Cambridge，MA)于4℃孵育过夜，次日用二抗孵育1 h，TBST清洗3次后，加入增强化学发光显影剂(ECL)，用凝胶成像设备(Amersham Imager 600，GE，USA)进行扫描，获得的图片用Image J测量每个点的光密度值进行统计学处理。
4.4细胞存活率检测
神经细胞株PC12细胞培养于含10％的马血清(Gibico，Grand Island，USA) 和5％的胎牛血清(FBS，PAN Biotech，Germany)的DMEM(Gibico，Grand Island，USA)中，放置于37℃细胞培养箱。PC12细胞被接种于96孔板，24h 后，将孵育过的Aβ(1-42)及TA加入96孔板中，37℃孵育48h，每孔加10μL MTT，继续孵育6h，然后吸掉培养基，加入DMSO 150μL，在摇床上均匀微弱震荡10分钟，于490nm处测定其吸光度，并计算细胞的存活率。
4.5结果与分析
如图26，20μM的Aβ(1-42)单独或与TA在37℃共孵育5天，Th-T荧光检测显示TA(4、8和16μM)显著抑制Aβ(1-42)纤维化。此外，进一步用斑点免疫印迹分析(Gong Y等.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica.2003；100(18):10417-22)发现，如图27A和27B所示， TA呈显著降低了Aβ(1-42)纤维化的量，且呈剂量依赖性。为评估TA的神经保护作用，用MTT检测了Aβ(1-42)诱导的PC12细胞的存活率，如图28，与空白对照组相比，加入Aβ(1-42)大幅降低了PC12细胞的存活率。然而与仅加入 Aβ(1-42)组比较，同时加入Aβ(1-42)和TA，显著提高了PC12细胞的存活率。
4.6TA通过清除细胞中的APP过表达蛋白产生神经保护作用。
淀粉样前体蛋白(APP)经酶解形成Aβ，过量的Aβ自聚集成大小不同的聚合体，形成淀粉样斑块，进而产生神经毒性。因此，研究TA对细胞内APP 的表达具有重要意义。
4.6.1 APP质粒的转染
将PC12细胞接种到6孔板上，每孔细胞数量约为20万个，24h后，待细胞密度达到70％左右时，按照lipofectamineTM 2000(Invitrogen，USA)转染试剂的说明操作，将pCAX-FLAG-APP质粒(Addgene，Cambridge，USA)瞬时转染入细胞中，转染6h后，换新的培养基，加入不同浓度的TA进行干预处理，以白藜芦醇作为阳性对照。24小时后收集细胞裂解液。
4.6.2免疫印迹法分析
细胞裂解液在4℃高速离心15min，吸取上清液，按蛋白测定试剂盒 (Bio-Radprotein assay，USA)说明书测定每个样品的蛋白浓度。取50μg的蛋白样品，加入上样缓冲液于100℃煮10分钟，用10％的SDS-PAGE进行凝胶电泳，300mA恒流湿转法电转2h至PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)。用5％的脱脂奶粉震摇封闭1h，然后加入含5％的BSA的APP-flag((1:1000， Sigma-aldrich，USA)抗体，4℃孵育过夜。次日加入HRP标记的羊抗兔二抗(1:2000，CST，USA)，室温震摇孵育1h，TBST洗3次，每次5min。加入 ECL发光液显色，Bio-RadChemiDoc成像系统显影。最后应用Image J软件对条带进行定量分析。
4.6.3结果与分析
在证明了TA对Aβ(1-42)纤维化的抑制效应后，本实验对TA在PC12细胞中过表达的APP的清除效应进行了评估。如图29A和29B，免疫印迹法数据显示，TA(16μM)有显著降低过表达的APP的作用，与阳性对照白藜芦醇效果相同。
实施例5：TA对突变的Tau基因的抑制作用
5.1野生型和突变的Tau的转染
用Lipofectamine Plus LTX转染试剂(Invitrogen)将EGFP-tagged-Tau或EGFP -tagged-p301-Tau(Addgene，Cambridge，USA)质粒转染到PC12细胞，转染6 个小时后，用不同浓度的TA或白藜芦醇处理24小时。收集细胞裂解液用作 Western blot分析。
5.2免疫印迹法分析
细胞裂解液在4℃离心15分钟，取上清液，然后测定蛋白浓度。50μg 蛋白和5x上样缓冲液被加入到12％SDS-PAGE凝胶电泳。2h后，凝胶转移到 PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)。用EGFP抗体(1:1000，Sigma-aldrich， USA)在4℃恒温摇床孵育过夜，次日加入羊抗兔二抗(1:2000，CST，USA) 孵育1h。最后，用ECL显色，Bio-Rad ChemiDoc成像系统显影，Image J软件对条带进行定量分析。
5.3结果与分析
本实验研究了TA对PC12细胞中野生型和突变的Tau蛋白的清除效应。非转染细胞被用作阴性对照。实验结果表明，阳性对照化合物白藜芦醇可以清除野生型Tau，而TA对野生型Tau的清除没有显著影响(图30A和30B)。然而，如图31A和31B所示，在TA的作用下，突变的P301L-Tau蛋白被明显清除，白藜芦醇具有同样的效果。本实验结果证明，TA对阿尔兹海默病中突变的 P301L-Tau蛋白具有潜在的选择性清除作用。已有研究表明Tau基因的突变导致神经退行性病变(Taniguchi S等.The Journal of biological chemistry. 2005；280(9):7614-23)，因此，TA对突变的P301L-Tau蛋白的选择性清除作用，显示其具有减轻阿尔茨海默病的潜在功效。
小结：本发明通过硫代磺色素(Th-T)荧光检测和dot免疫印迹法验证了化合物TA作为Aβ(1-42)抑制剂，其抑制作用从4～16μM呈剂量依赖性。并且，本发明呈现，8μM和16μM的TA显著提高Aβ(1-42)诱导的PC-12细胞的存活率，暗示TA对AD有潜在的神经保护作用。另外，TA降低了PC-12细胞中过表达的APP，TA对Aβ前体蛋白的降低作用，进一步说明其对Aβ的抑制效应。本发明还首次呈现了TA对突变的Tau的抑制活性，在P301L-Tau转染的 PC12细胞，TA从4到16μM呈剂量依赖性的抑制效应。
有益效果：赶黄草提取物，尤其是分离得到的四种化合物TA、TB、PG、PG1，特别是TA，在动脉粥样硬化体内体外实验中具有显著的抗氧化应激损伤的药理活性，具有用于治疗动脉粥样硬化的潜在用途；
上述四种化合物，特别是TA，对Aβ的聚集有缓解作用，对突变的P301L-Tau 蛋白有选择性清除作用，表现出抑制Aβ的形成和抑制突变的Tao基因表达的药理活性，具有用于治疗阿尔兹海默病的潜力。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，所述赶黄草提取物包括如下化合物中的至少一种：
化合物(Ⅰ)TA，其结构式为
Figure FDA0002953579880000011
化合物(Ⅱ)PG，其结构式为
Figure FDA0002953579880000012
化合物(Ⅲ)TB，其结构式为
Figure FDA0002953579880000021
化合物(Ⅳ)PG1，其结构式为
Figure FDA0002953579880000022
2.根据权利要求1所述的赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其特征在于：动脉粥样硬化涉及血管包括冠状动脉、主动脉、外周动脉和脑动脉。
3.根据权利要求1所述的赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其特征在于：所述赶黄草提取物对动脉粥样硬化的治疗作用包括减轻动脉粥样硬化中氧化应激损伤和抑制损伤后炎症因子的表达。
4.根据权利要求3所述的赶黄草提取物在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其特征在于：所述炎症因子包括IL-1β。
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