JP2007223974A

JP2007223974A - ポリ（ａｄｐ−リボース）グリコヒドロラーゼ分解耐性のポリ（エテノａｄｐ−リボース）

Info

Publication number: JP2007223974A
Application number: JP2006048854A
Authority: JP
Inventors: Mitsuko Masutani; 美都子益谷; Masayasu Shirato; 雅康白土; Masatoshi Watanabe; 昌俊渡邉; Hitoshi Nakagama; 斉中釜
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2007-09-06

Abstract

【課題】がんの化学療法や放射線療法の増感剤として有効な、細胞内で安定なポリ（ＡＤＰ−リボース）誘導体、特異性が高く強力なＰａｒｇの阻害剤、及びその製造方法を提供する。また、このようなポリ（ＡＤＰ−リボース）誘導体を含む、核酸保護剤、抗がん剤の増感剤、Ｐａｒｇ阻害剤及び生化学試薬を提供する。
【解決手段】ポリ(ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼによる分解耐性を有するポリ（エテノＡＤＰ−リボース)。
【選択図】図１

Description

本発明は、新規のポリ（ＡＤＰ−リボース）誘導体、その製造方法及びそれを用いる薬剤等に関する。

ポリＡＤＰ−リボシル化反応は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（Ｐａｒｐ）により、ＮＡＤを基質として自己やヒストンなどの様々な核タンパク質に対してポリ（ＡＤＰ−リボース）鎖を付加する反応である。この反応は、ＤＮＡ損傷修復、転写制御、クロマチン高次構造の変換制御、細胞死の誘導、細胞の分化や癌化など様々な細胞内の機能に関与していることが示唆されている。

ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ（Ｐａｒｇ）は、核及び細胞質に局在し、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を特異的に分解する酵素であり、細胞内でのポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解に重要な分子である。Ｐａｒｇはポリ（ＡＤＰ−リボース）のリボース・リボース結合を切断し、ＡＤＰ−リボースを生成する。ポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解酵素として、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）も知られている。ＰＤＥはホスホジエステル結合を切断し、ホスホリボシル−ＡＭＰおよびＡＭＰを生成する。

ポリＡＤＰ−リボシル化反応は、細胞内ではＰａｒｐによる合成と、Ｐａｒｇによる分解とによって調節される。アルキル化剤処理やガンマ線照射等によるＤＮＡ損傷後、細胞内では、ＰａｒｐによるポリＡＤＰ−リボシル化反応が亢進する。Ｐａｒｇ欠損細胞ではポリ（ＡＤＰ−リボース）が蓄積し、早期のアポトーシスが認められる。

従って、細胞内で安定なポリ（ＡＤＰ−リボース）誘導体やＰａｒｇ阻害剤はがんの化学療法や放射線療法の増感剤として有効であると考えられるが、特異性が高く強力なＰａｒｇの阻害剤は非常に少ない現状である。

また、ポリ（ＡＤＰ−リボース）は核酸と構造の類似性が高く遺伝情報をコードしていないため、細胞内や細胞外で分解されにくい誘導体があれば、細胞や個体への遺伝子導入の際の保護剤としての利用が期待できる。

しかし、これまで、細胞内や細胞外で分解されにくいポリ（ＡＤＰ−リボース）の誘導体の報告はない。Oeiらは、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を合成したが、これはＰａｒｇで分解されると報告した（非特許文献１：Oei et al., FEBS Letters, 1996, 397, 17-21）。Jacobsonらは、リボシルアデノシンやモノＡＤＰ−リボースのアデノシン残基をほぼ１００％の効率でエテノ化してエテノアデノシン残基に変換できることを報告したが、ポリ（ＡＤＰ−リボース）のエテノ化については言及していない（非特許文献２：Jacobson et al., Methods in Enzymology, 1984, 106:483-494；非特許文献３:Sims et al., Analtycal Biochemistry, 1980, 106:296-306）
Oei et al., FEBS Letters, 1996, 397:17-21 Jacobson et al., Methods in Enzymology, 1984, 106:483-494 Sims et al., Analytical Biochemistry, 1980, 106: 296-306 Shimokawa et al., J. Biochem., 1999, 126:748-755 Ikejima et al., J. Biol. Chem., 1987, 262:17641-17650

本発明は、がんの化学療法や放射線療法の増感剤として有効な、細胞内で安定なポリ（ＡＤＰ−リボース）誘導体、特異性が高く強力なＰａｒｇの阻害剤、及びその製造方法を提供することを目的とする。

また、このようなポリ（ＡＤＰ−リボース）誘導体を含む、核酸保護剤、抗がん剤の増感剤、Ｐａｒｇ阻害剤及び生化学試薬を提供することも目的とする。

本発明者らは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）をクロロアセトアルデヒドと反応させ、大部分又は実質的にすべてのアデノシン残基をエテノ化してエテノアデノシン残基に変換することにより、細胞におけるＰａｒｇによる分解耐性かつＰａｒｇ阻害活性を有するポリ（エテノＡＤＰ−リボース）が得られることを見出した。

本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、Ｐａｒｇ又は細胞抽出液と反応させても分解されない。一方、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）と反応させた場合は、ほぼ完全に分解され、ホスホリボシル−エテノＡＭＰを生じることも見出した。

本発明は、
〔１〕ポリ(ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼによる分解耐性を有するポリ（エテノＡＤＰ−リボース)；
〔２〕ポリ（ＡＤＰ−リボース）を、加温条件下でエテノ化剤と反応させ、大部分又は実質的にすべてのアデノシン残基をエテノ化する工程を含む、ポリ(ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼによる分解耐性を有するポリ（エテノＡＤＰ−リボース)の製造方法；
〔３〕前記〔１〕記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含む抗がん剤の増感剤；
〔４〕前記〔１〕記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含む核酸保護剤；
〔５〕前記〔１〕記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含むポリ(ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ阻害剤；
〔６〕前記〔１〕記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含む生化学試薬、
を提供する。

本発明によれば、Ｐａｒｇによる分解耐性であって、細胞内及び細胞外で安定なポリ（エテノＡＤＰ−リボース）及びその製造方法が提供される。

本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、Ｐａｒｇによる分解耐性であり、Ｐａｒｇ活性を競合的に阻害すると考えられるので、Ｐａｒｇ阻害剤としてはもちろん、ＤＮＡ損傷を惹起させる抗がん剤については、Ｐａｒｇ阻害活性により増感剤としても使用することができる。

また、本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、核酸と類似性の高い構造であるため、細胞や個体への遺伝子導入の際に単独あるいはポリ（ＡＤＰ−リボース）と共に核酸の保護剤として用いることができる。

さらに、本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、マイクロインジェクションなどにより細胞内に導入することにより、ポリ（ＡＤＰ−リボース）の細胞機能を調べる生化学的試薬としても用いることができる。ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）誘導体は蛍光を有するため、試薬として用いる場合、顕微鏡観察が容易であることも利点である。

本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）のアデノシン残基を高い効率でエテノ化することにより製造することができる。本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を製造するためのエテノ化反応は、大部分ないしすべてのアデノシン残基がエテノ化される条件を選択して行なえばよく、特定の方法又は反応条件に限らない。このような条件の決定は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を種々の反応条件でエテノ化させ、そのアデノシン残基のエテノ化効率をＨＰＬＣ−質量分析法などによって確認することにより行なうことができる。

一般的には、エテノ化反応は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を酢酸アンモニウムのような酸性領域の緩衝剤及びクロロアセトアルデヒドのようなエテノ化剤の存在下で加熱して行なうことができる。ポリ（ＡＤＰ−リボース）は、公知の方法によって合成してもよいが、例えばAlexis Biochemicalsから入手可能のもののような市販のものを使用してもよい。反応温度は、２５℃〜９０℃、好ましくは４０℃〜８０℃、より好ましくは５０℃〜７０℃、特に６０℃前後とすることができる。反応時間は反応温度などの他の条件に応じて適宜選択することができるが、例えば１時間〜１５時間、特に２時間〜１０時間とすることができる。具体的には、例えば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）に終濃度０．２Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）及び終濃度０．１Ｍのクロロアセトアルデヒドを加え、加熱して反応させる。上記のような反応条件で５０〜７０℃で反応させる場合は、反応時間は３時間〜６時間程度が好ましい。

なお、Oeiらが用いたポリ（ＡＤＰ−リボース）のクロロアセトアルデヒドによるエテノ化反応の条件は、終濃度２０％（３．０５Ｍ）クロロアセトアルデヒド−５０ mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）−５０ mMβ−メルカプトエタノール中で室温で１６時間反応させるというものであったが、ＡＤＰ−リボース残基のエテノ化の効率が低いためＰａｒｇ分解耐性でなかったと考えられる。

本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の鎖長は特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、細胞への透過性の点からは、１００残基以下の短鎖型のものが好ましい。細胞への透過性を最大にするためには、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）のＡＤＰ−リボース残基数は、好ましくは２〜１００個、さらに好ましくは５〜３０個、特に好ましくは１０〜２５個程度である。一方、安定性の点からは、１００残基を超える長鎖型のもの、例えば１０１〜１０００残基、好ましくは１００〜３００残基程度が望ましいと考えられる。

本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、高い効率でエテノ化されており、大部分又は実質的にすべてのＡＤＰ−リボース残基がエテノ化されている。そのため、本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、Ｐａｒｇによる分解耐性（又はＰａｒｇ阻害活性）を有し、核酸保護作用等を有するという従来予期されなかった優れた効果を奏することができる。具体的には、全ＡＤＰ−リボース残基のうち、好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上がエテノ化されている。

上述のとおり、本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は（Ｐａｒｇ）による分解耐性であり、Ｐａｒｇ活性を競合的に阻害すると考えられるので、Ｐａｒｇ阻害剤として使用することができ、また、Ｐａｒｇ阻害活性によってＤＮＡ損傷を惹起させる抗がん剤の増感剤として使用することができる。

抗がん剤の増感剤として使用する場合、細胞内への透過性が高い方が好ましく、上記のような短鎖型のものが好ましいと考えられる。

細胞内への透過性を上げるためには、公知の方法、例えば本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）をカチオン性リポソーム内へ封入する等の方法を用いることができる。がん細胞への親和性が高いリポソームを用いれば、腫瘍特異性を上昇させることも可能である。このように細胞内への導入試薬を用いる場合は、安定性の点から長鎖型のものが好ましい。

また、同様に、本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、細胞や個体への遺伝子導入の際の核酸の保護剤として用いることができる。

ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を核酸保護剤又は抗がん剤の増感剤等として個体へ投与する場合は、あらかじめ一般的な毒性試験を行い、有効かつ安全な投与量を決定することができる。ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は水溶性であり、遺伝子導入試薬のＤＮＡやＲＮＡ及びその誘導体と同様の剤型、投与経路、剤型中の含有物質を用いることが可能である。

本発明のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は、生化学的試薬としても使用することができる。ポリ（ＡＤＰ−リボース）はＰａｒｐによるポリＡＤＰ−リボシル化反応の産物であり、この分子自体が細胞内で種々の細胞機能に関与することが考えられる。従って、ポリ（ＡＤＰ−リボース）の細胞機能を研究するため等の目的で、本発明のＰａｒｇによる分解に耐性のポリ（ＡＤＰ−リボース）を生化学的試薬としてそのままで又は溶液等の組成物として用いることができる。この場合、本発明の試薬をマイクロインジェクション等により細胞内に導入し、細胞に対する影響を調べる。影響の検出又は測定は、公知の方法で適宜行なうことができる。ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は蛍光を有することが知られているため、顕微鏡観察が容易であるので有利である。

１．ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の製造
（１）ポリ（ＡＤＰ−リボース）のエテノ化
ポリ（ＡＤＰ−リボース）は、Shimokawa らの方法（非特許文献４）で合成した鎖長約２０残基をピークとする鎖長約１００残基までのものを用いた。

ポリ（ＡＤＰ−リボース）１００μgに、終濃度０．２Ｍの酢酸アンモニウム及び０．１Ｍのクロロアセトアルデヒドを加えて１mlとし、６０℃で４時間加温して、エテノ化反応を行った。反応液に、２５％アンモニア水を終濃度０．８％となるように添加し、３Ｍ酢酸ナトリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、反応液の約３倍量のエタノールを加え、零下８０℃で１５分間冷却してポリ（ＡＤＰ−リボース）のエタノール沈殿を行った。

１７，０００ｇで１５分間遠心後、上清を除き、７０％エタノール５００μLを添加し、リンスした。その後、同様に遠心し、再び上清を除き、再度、７０％エタノールによるリンス操作を行い、風乾した。その後、超純水５０μLに沈殿を溶解した。

得られたサンプルを１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に希釈し、ＵＶ吸収スペクトラムを測定した（図２）。定量は、エテノアデノシンのモル吸光係数（波長２７５nm）６，０００（非特許文献２）を用いてＡＤＰ−リボース残基のモル濃度として算出した。収量は６５μgであり、収率は約６０％であった。

（２）^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の製造
Shimokawaらの方法（非特許文献４）に従って調製した^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）５．５μgに、終濃度０．２Ｍの酢酸アンモニウム及び０．１Ｍのクロロアセトアルデヒドを加えて１mLとし、６０℃で４時間加温して、エテノ化反応を行った。前記（１）に記載したのと同様に、ポリ（ＡＤＰ−リボース）のエタノール沈殿を行った。

その後、前記（１）と同様にリンスした沈殿を超純水５０μLに溶解した。

チェレンコフ法により放射能を測定し、^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）の比活性値より、収量を算出した。収量は２．７μg、収率は約４７％であった。

２．ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の特性
（１）^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）のＰａｒｇ及びＰＤＥによる分解の分析
前記（２）と同様に調製したチェレンコフ法による放射能２，０００cpm相当分の^３２Ｐ−ポリ（エテノ化ＡＤＰ−リボース）を、Shimokawaらの方法（非特許文献４）で調製したグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ融合型Ｐａｒｇ約１５ng、終濃度２０ mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ、１０ mMβ−メルカプトエタノールを含む反応液に添加し、２０μLに調整後、２５℃で２時間保温し、Ｐａｒｇによる分解反応を行った。

ＰＤＥによる分解を調べるためには、上記と同様に、２，０００cpm相当の^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）、１０ mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ mMＭｇＣｌ_２及びIkejimaらの方法（非特許文献５）でブルーＳｅｐｈａｒｏｓｅを用いて活性画分を調製した蛇毒ＰＤＥ０．００４ユニットを含む反応液を用意し、２５℃で２時間保温した。

１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析
Ｐａｒｇ及びＰＤＥによる反応液の１０μLを、２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。無処理の^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）と共に、コントロールとして、無処理の^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）、及びＰａｒｇ又はＰＤＥにより同様に分解反応を行った^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）を泳動した。

結果を図３に示す。無処理の^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）（「ＰＡＤＰＲ」の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）は、ＡＤＰ−リボース残基数３から約２０までの鎖長のラダーパターンを示す。^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）をＰａｒｇ又はＰＤＥ（それぞれ同「Ｐａｒｇ」及び「ＰＤＥ」）で分解すると、各々泳動度の早い分解産物にほぼ完全に分解されている。

一方、本発明の^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）（「ＰεＡＤＰＲ」）は、無処理のもの（同「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）は無処理の^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）と同様のＡＤＰ−リボース残基数３から約２０までのラダーパターンを示す。Ｐａｒｇで分解しても、そのラダーパターンに変化はなく、Ｐａｒｇでは分解されなかった（同「Ｐａｒｇ」）。ＰＤＥで分解した場合は、^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）の場合と同様にほとんどが泳動度の早い分解産物に分解されていた（同「ＰＤＥ」）。

２）薄層クロマトグラフィによる解析
^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）及びコントロールとして^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）のそれぞれについて、Ｐａｒｇ又はＰＤＥによる反応液の２μLをポリエチレンイミンセルロースＴＬＣプレートにスポットし、３Ｍ酢酸、０．１Ｍ塩化リチウム、３Ｍ尿素を含む展開溶媒を用いて展開した。その後、プレートを風乾し、バイオイメージングアナライザー（Fuji フィルム、ＢＡＳ２５００）により放射能を検出した。

その結果を図４に示す。無処理の^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）（「ＰεＡＤＰＲ」の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）では、^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）（「ＰＡＤＰＲ」の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と同様に放射能はほぼ原点にのみ検出された。

^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）をＰａｒｇで分解すると放射能のスポットは、標準物質で確認したＡＤＰ−リボースとＡＭＰのＲｆ値に主に検出された（「ＰＡＤＰＲ」の「Ｐａｒｇ」）。ＡＭＰが生ずるのは、用いたポリ（ＡＤＰ−リボース）から、調製時のアルカリ処理によりタンパク質結合末端側のリボースリン酸残基が加水分解により脱離しているためと考えられる。これに対し、^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）をＰａｒｇで分解した場合は、無処理の場合と同様にほぼ原点にのみ放射能が検出された（「ＰεＡＤＰＲ」の「Ｐａｒｇ」）。

^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）をＰＤＥで分解した場合は、ホスホリボシル−ＡＭＰの標準物質のＲｆ値にスポットが検出された（「ＰＡＤＰＲ」の「ＰＤＥ」）。^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）をＰＤＥで処理した場合は、ホスホリボシル−ＡＭＰのＲｆ値よりやや大きい移動度の分解産物にほとんど分解されていた（「ＰεＡＤＰＲ」の「ＰＤＥ」）。この分解産物はホスホリボシル−エテノＡＭＰ（図５、「ＰＲ−εＡＭＰ」）であることが予想された。

３）細胞粗抽出液によるポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の分解
細胞としては、ＨｅＬａ細胞株を直径１０cmプレート２枚に培養したもの、及びラットＰａｒｇ発現カセットを有するバキュロウイルス（Baculovirus）を感染させて３日後の昆虫細胞Ｓｆ９（１０cmプレート０．１枚分）を使用した。

これらの細胞をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、それぞれ細胞溶解液（２０ mMリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、１０mMβ−メルカプトエタノール、２ mMＥＤＴＡを含む抽出用液）を加え、細胞を懸濁させた。ＨｅＬａ細胞については３００μL、Ｓｆ９細胞については１００μLを用いた。４℃で保温しながら３０分間ブレンダーミキサーで混合し、１７，０００ｇで１５分遠心し、上清を細胞粗抽出液とした。この細胞粗抽出液を用いて以下の反応を行った。

^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）５．４ ng(チェレンコフ法による放射能２０ cpm相当、２ μL)、及び^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）５．４ ng (チェレンコフ法による放射能２０ cpm相当、２ μL)を、それぞれＨｅＬａ細胞粗抽出液又はラットＰａｒｇ発現Ｓｆ９細胞粗抽出液２ μLと混合し、２５℃で２時間保温後、１％ＳＤＳを反応液の１／１０量添加して反応を終了させた。各反応液の２μLをポリエチレンイミンセルロースＴＬＣプレートにスポットし、３Ｍ酢酸、０．１Ｍ塩化リチウム、３Ｍ尿素を含む展開溶媒を用いて展開した。その後、プレートを風乾し、ＢＡＳ２５００により放射能を検出した。

結果を図６に示す。ＨｅＬａ細胞粗抽出液及びラットＰａｒｇ発現Ｓｆ９細胞粗抽出液のいずれについても、コントロールの^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）のＡＤＰ−リボースへの分解は認められたが（「HeLa cell extract」及び「Sf9 cell extract」の「ＰＡＤＰＲ」）、^３２Ｐ−ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）は分解されなかった（「HeLa cell extract」及び「Sf9 cell extract」の「ＰεＡＤＰＲ」）。

（２）ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の構造の分析
１）ＨＰＬＣ分析
ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）２μgを、Ikejimaらの方法（非特許文献５）によりブルーＳｅｐｈａｒｏｓｅで活性画分を調製した蛇毒ＰＤＥ０．０１２ユニットを含む反応液に加え、終濃度１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０mMＭｇＣｌ_２、容量３０μLとなるように調整し、２５℃で一晩反応させた。超純水１００μLを添加後、１５Ｎ過塩素酸カリウム３μLを添加し、氷上で２０分間保温し、３ＭＫＯＨ／０．７Ｍ glycine-glycine（ｐＨ７．４）を加えて中和し、１７，０００ｘｇ、４°Ｃで５分間遠心し、酸処理可溶性画分である上清を回収し、下記の条件でＨＰＬＣを行い、波長２５４nmでモニタリングを行った。

装置：ＨＰＬＣ分析装置（ＳＣＬ−１０ＡＶＰ、島津製作所）
カラム：ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−５（径４６×２５０mm、野村化学）
溶離液：Ａ液０．１ＭＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４（Ｗａｋｏ）
Ｂ液５０mM ＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４−５０％ＣＨ_３ＣＮ（Ｗａｋｏ）
０分、Ａ：Ｂ＝９８：２→１００分、Ａ：Ｂ＝０：１００のリニアグラジエント
流速：０．５mL／min
検出：ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ、島津製作所）
結果を図７に示す。図７に示すように、ホスホリボシル−エテノＡＭＰ（図５）の標準物質と同一の保持時間２０分に主要なピークが検出された。ＨＰＬＣでのホスホリボシル−ＡＭＰの保持時間は１４〜１６分であるが、これに相当するピークは認められなかった。従って、殆どのアデノシン残基がエテノ化されていたと考えられる。

２）ＬＣ−ＭＳ分析
前記１）で得られた保持時間２０分の主要な溶出画分を分取し、真空遠心濃縮装置で濃縮後、分子量３，０００の限外濾過膜（ＹＭ−３、ミリポア社）で濾過し、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。

ＬＣ装置はＳｅｒｉｅｓ１１００、Ａｇｉｌｅｎｔ、カラムはＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−５を用い、溶離液はＡ液０．１ＭＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４、Ｂ液５０mMＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４−５０％ＣＨ_３ＣＮとし、流速０．３mL／min、Ｂ液２％から５０％まで５０分のリニアグラジエントにより分析した。ＵＶ２６０nmの検出も同時に行った。ＭＳ装置（ＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ、Ｗａｔｅｒｓ）はｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）法によりイオン化を行い、検出を行った。

図５に示すホスホリボシル−エテノＡＭＰの標準物質は、分子量５８３であり、保持時間２３分に分子イオンピークｍ／ｚ＝５８４（ＥＳ＋）及びｍ／ｚ＝５８２（ＥＳ−）のピークが認められる。上記のＨＰＬＣで分取したポリ（エテノＡＤＰ−リボース）のＰＤＥでの分解産物の主要画分（保持時間１７．５−２０．４分）をＬＣ−ＭＳ分析したところ、図７に示すように、ホスホリボシル−エテノＡＭＰの標準物質と同様に保持時間２３分に分子イオンピークｍ／ｚ＝５８４（ＥＳ＋）及びｍ／ｚ＝５８２（ＥＳ−）のピークが認められた。

（３）ポリ（エテノ化ＡＤＰ−リボース）によるＰａｒｇの阻害
^３２Ｐ−ポリ（ＡＤＰ−リボース）を基質として終濃度２μMとなるように用い、２０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ、１０mMβ−メルカプトエタノール、及び０、０．５、２．５、５、２５、５０、７５及び１００μMのエテノ化ポリ（ＡＤＰ−リボース）を含む反応液を調製した。前記のShimokawaらの方法（非特許文献４）で調製したグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ融合型Ｐａｒｇ約７．５ngを添加し全量２０μLとして、２５℃で３０分間反応させた。反応液に１％ＳＤＳ２μLを添加し、反応を終了させ、２μLをポリエチレンイミンセルロースＴＬＣプレートにスポットし、３Ｍ酢酸、０．１Ｍ塩化リチウム、３Ｍ尿素を含む展開溶媒を用いて約４０分展開後、風乾しＢＡＳ２５００により放射能を検出しＰａｒｇの分解産物ＡＤＰ−リボース量を測定し、阻害効果を算出した。

その結果を図８に示す。ポリ（エテノ化ＡＤＰ−リボース）はＰａｒｇを用量依存性に阻害し、５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）値は約８μMであった。

（４）ポリ（エテノ化ＡＤＰ−リボース）の核酸保護効果
１）ＤＮＡの保護
一本鎖２１mer ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ、ヒトＰＡＲＰ−１ｃＤＮＡ由来配列：５’−^３２Ｐ−ＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＧＧ−３’；図９、パネル（Ａ））の５’末端を、^３２Ｐ−ガンマ−ＡＴＰを用いてリン酸化し、^３２Ｐの標識体を得た。終濃度４０％(V/V)のウシ胎児血清（ＦＣＳ）にポリ（エテノＡＤＰ−リボース）０ ng、１０ ng、１００ ng、５００ ng、１ μg、５ μg及び終濃度２０ mM Tris-HCl (ｐＨ７．５)を添加して反応液量を２５μLとし、３７℃で２時間インキュベーションを行い、反応液に１０％ＳＤＳ２.7μLを添加し、反応を終了させた。

反応液をポリエチレンイミンセルロースＴＬＣプレートにスポットし、一次元ＴＬＣに展開した。また、１６％ポリアクリルアミド-７Mウレアゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、分解抑制効果があるかどうか調べた。

一次元ＴＬＣ及び１６％ＰＡＧＥの結果を図９（それぞれパネル（Ｂ）及び（Ｃ））に示す。ＦＣＳ中ではｓｓＤＮＡは大部分分解されるが、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の添加量に依存して、分解が抑制された。

２）ＲＮＡの保護
二本鎖ｓｉＲＮＡ２２mer（ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰ−２２、緑色蛍光タンパク質用（Qiagen社：５’−ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ−３’ 及び３’−ＧＣＣＧＵＵＣＧＡＣＵＧＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧ−５’；図１０、パネル（Ａ））の５’末端を、それぞれ^３２Ｐ−ガンマ−ＡＴＰを用いてリン酸化し、^３２Ｐの標識体を得た。前記と同じ終濃度４０％(V/V)のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の混合液にポリ（エテノＡＤＰ−リボース）０ ng、１０ ng、１００ ng、５００ ng、１ μg、５ μg及び終濃度２０ mM Tris-HCl (ｐＨ７．５)を添加して反応液量を25μlとし、３７℃で２時間インキュベーションを行い、反応液に１０％ＳＤＳ２.7μLを添加し、反応を終了させた。

反応液をポリエチレンイミンセルロースＴＬＣプレートにスポットし、一次元ＴＬＣに展開した。また、１６％ポリアクリルアミド-7Mウレアゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、分解抑制効果があるかどうか調べた。

一次元ＴＬＣ及び１６％ＰＡＧＥの結果を図１０（それぞれパネル（Ｂ）及び（Ｃ））に示す。ＦＣＳ中ではｓｉＲＮＡは大部分分解されるが、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の添加量に依存して、分解が抑制された。

図１は、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の構造（部分）を示す図である。図２は、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）のＵＶスペクトラムを示す図である。図３は、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）のＰａｒｇ及びＰＤＥによる分解後のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。「ＰεＡＤＰＲ」＝ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）、「ＰＡＤＰＲ」＝ポリ（ＡＤＰ−リボース）を表す。図４は、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）のＰａｒｇ及びＰＤＥによる分解後の薄層クロマトグラフを示す図である。図５は、ホスホリボシル−エテノＡＭＰ（ＰＲ−εＡＭＰ）の構造を示す図である。図６は、ＨｅＬａ細胞（「HeLa cell extract」）及びＳｆ９細胞（「Sf9 cell extract」）粗抽出液によるポリ（エテノＡＤＰ−リボース）の分解を示す図である。図７は、ＬＣ−ＭＳによるポリ（エテノＡＤＰ−リボース）のＰＤＥによる分解産物の分析を示す図である。パネル（Ａ）(左図)は、ＰＲ−εＡＭＰの結果、パネル（Ｂ）(右図)は、ＰＲ−εＡＭＰの結果をそれぞれ表す。図８は、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）によるＰａｒｇの阻害効果を示す図である。図９は、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）による血清中でのＤＮＡの保護効果を示す図である。パネル（Ａ）（上図）は使用した一本鎖ＤＮＡの配列、パネル（Ｂ）（左図）はＴＬＣの結果、パネル（Ｃ）（右図）はポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をそれぞれ表す。図１０は、ポリ（エテノＡＤＰ−リボース）による血清中でのＲＮＡの保護効果を示す図である。パネル（Ａ）（上図）は使用した二本鎖ＲＮＡの配列、パネル（Ｂ）（左図）はＴＬＣの結果、パネル（Ｃ）（右図）はポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をそれぞれ表す。

Claims

ポリ(ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼによる分解耐性を有するポリ（エテノＡＤＰ−リボース)。
ポリ(ＡＤＰ−リボース)を、加温条件下でエテノ化剤と反応させ、大部分又は実質的にすべてのアデノシン残基をエテノ化する工程を含む、ポリ(ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼによる分解耐性を有するポリ（エテノＡＤＰ−リボース)の製造方法。
請求項１記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含む抗がん剤の増感剤。
請求項１記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含む核酸保護剤。
請求項１記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含むポリ(ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ阻害剤。
請求項１記載のポリ（エテノＡＤＰ−リボース）を含む生化学試薬。