CS242856B2

CS242856B2 - Method of chlorambucile production

Info

Publication number: CS242856B2
Application number: CS795566A
Authority: CS
Inventors: Kiro Asano; Humio Tamura; Hiromitsu Tanaka; Satoru Enomoto
Original assignee: Kureha Chemical Ind Co Ltd
Priority date: 1978-08-14
Filing date: 1979-08-14
Publication date: 1986-05-15
Also published as: CS556679A2; UA6043A1; YU198179A; JPS5810393B2; BE878186A; JPS5527121A; YU41345B; SU1001860A3; GEP19960478B; HU180002B

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových protirakovinových derivátů 4^£p-/bi.s-^2~chh.oi:ethyl^amino/fenyimrnáselné ^kyseliny /tzv. c^hlormbbuilu/. Zvl^áště se tento v^yn^ález tý^ká derivátů získaných tak, že ee chlorambuučl v přítomnosSi vazebného činidla chemicky váže s estradiolem nebo jeho deriváty a to přes hydroxyskupinu v poloze 17.

Je dobře známo, že většina prstiaaksvinilých drog působí na rakovinné buňky stejně jako na buňky normbání a že tedy tyto látky bij vážné vedleiší účinky. Je proto těžké podávat takové látky dostatečně dlouho, aby byly zničeny veškeré rakovinné buňky.

Autooi se snnřili překonat tyto nedootatky známých prstirakovinných drog a vyvinout novou drogu, která by měla vysoký terapeutický účinek. Výsledkem je získán:! nových prstirrasvinných derivátů esteradiolu, které se slektivně váží na některé rakovinné buňky a které mm j nízké veddejší účinky.

Způsob výroby derivátů chlorabbbtilt obecného vzorce I

/I/ v němž R znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu, jako je li

-С-СН₃, spočívá podle vynálezu v tom, že a estrad^l nebo acylovaný e^1^rr^i.s;L se vážou přes hydroxyskupinu v poloze 17 působením vazebného činidla bromaacey ^romHu načež se produkt popřípadě acyluje. Výše uvedené deriváty ίhlsrrmbbtίlt obecného vzorce I jsou nové sloučeniny.

Deeiváty ίhlsiabbbtίlt podle vynálezu jsou konjugáty a estradlo^ nebo jeho derivátů s vazebným činidLam. Deeiváty ίhlsirbbbtίlt podle vynálezu mm j specifickou afinitu k rakovinným buňkám a mm j tedy speeífický účinek proto, že selektivně napaadj rakovinné buňky.

Spplίfiίké rakovinné buňky mři recepto^ pro steroidní hormony, zvláště pro deriváty estradlo^, které jsou sobčáásí derivátů podle vynálezu.

Tyto recepto^ mohou být cUem pro deriváty ίhlsrrmbbtίlt podle vynálezu. Deeiváty chlorrbbbtίlu podle vynálezu tudíž napsaní rakovinné buňky, které maj receptory pro estradio! a jeho deriváty.

Tyto druhy rakoviny zahrnuj rakovinu prsu, prostaty, zhoubný nádor jater, štítné žlázy a dělohy. Produkty podle vynálezu jsou zvláště účinné při léčení rakoviny prsu, dělohy a prostaty.

□odváty chlorrbbbtίlu podle vynálezu jsou selektivně distrbtsováuy k rakovinným buňkám v organismu a tak napaadj rakovinné buňky bez veddeeších'účinků.

Zvláštním rysem vynálezu je to, že vazba estradio^ nebo jeho derivátů a ίhloraibbtίlu se děje bez ztráty aktivních center estrad iloIu nebo jeho derivátů a bez ztráty prstirrasviuných vlastnossí crlsirbbbtίlt.

Je výhodné přivést hydroxyskupinu estradio^ v poloze 3 na acvloxysktpiuu, jako ji

0 0

II *

-O-C-CH₃, -O-C-C2H5 a -o-c-C₃ll₇.

Tato acyloxyskupina se v organismu snadno převádí na hydroxylovou skupinu, která je v tele potřebná k vazbě na receptory v buňkách.

ChlorambucCl a estradiol nebo jeho deriváty mohou být vázány vhodnými postupy. V jednom z těchto postupů například se nejprve estradiol nebo jeho derivát uvede v reakci s vazebným činidlem a takto získaný moOčfikovaný estradiol nebo jeho acylovaný d^e^rÍváb se vystaví působení chlorambbuClu.

V jnném takovém postupu se moodfikovaný chloraiumbučl nechá reagovat s estradic^m nebo acylovaným estradic^m.

V prvním případě se vazebné činidlo nechá reagovat s neaativní posicí estradiolu nebo acylovaného estradiolu a tak se získá ester obecného vzorce X-/CH₉/_n -COOB, v němž B představuje radikál estradiolu nebo acylovaného estradiol, vzniklý odstraněním 17-hydroxylové skupiny a x znamená atom halogenu. Pak se halogen tohoto esteru nechá reagovat chloramUucirem za vzniku derivátu chlorambtiuclu podle vynálezu.

Tyto reakce jsou nyní blíže popsány.

Vazebné činidlo /Uromaccrylbromid/ reaguje s hydroxylovou skupinou v poloze 17 estradiolu nebo 3-acylovaného estradiolu v rozpouštědlech, jako je chlorid uhličitý, chloroform, tetrahydrofuran, iimerhylsulfoxii /DMSO/, dimethyfoormamid /DMF/, pyridin a aceton.

Reakční produkt pak reaguje s chlor a^ucHem v rozpouštědlech, jako je ϋ^^^ειΗ^χϋ, dimethylformamid, pyridin, toluen uHičitý, chloroform nebo tetrahydrofuran. CCloramruuCl může být pouužt ve foímě kyseliny nebo sodné soli /např. stříbrné soli nebo soli s altalCtýým kovem/.

Teplot^{y p}ro JcaMou reakci se volí v rozsahu -30 °C a^ž 100 °C, nejlépe mezi -10 °C a ⁸0 °C. Reakční do^by ^bývvj^j'v ^0,5 a^ž 7^{4 h}odin. Reakční ^pro^dukt se čistí vadnými čisticími postupy.

V druhém postupu se vazebné činidlo nechá reagovat s karboxylovou skupinou chlorambiudu a tak se získá sloučenina obecného vzorce АСОО/СНн/пСОХ, v němž A znamená zbytek chlorambucilu, z něhož byla odstraněna COOH skupina v poloze 1.

Atom halogenu /X/ této sloučeniny se pak nechá reagovat s hydroxylovou skupinou v poloze 17 estradiol nebo 3-acylovaného estradiol za vzniku derivátů chlorambLuciu podle vynálezu.

Roozpoutědla, která se pro tyto reakce pouuívaaí jsou stejná, aE jde o reakci chlorambucčlu nebo estradiol nebo acylovaného estradiol.

Reakční teploty a reakční doby se volí ve stejném rozsahu.

3-Hydroxyskupina estradiol vázaného v popsaném konjugátu podle vynálezu může být acylována před nebo po vazbě na chlooamruud v příOcmnoosi vazebného činidla. Tyto reakce jsou v dalším textu blíže popsány.

Hydroxylová skupina v poloze 3 lstoadiolu reaguje s hydroxidem alkalckkého kovu v rozpouštědle jako je např. TH/, čímž je převedena na ONa nebo OK skupinu a pak se tento mmezprodukt vystaví daltí reakci s acylchlordeem, nap^kl-ad s benzoolchlorddem, acetylchlordeem nebo řropionylchlO)rdeem.

Produktem je 3-acylovaný estradMl. Pak se vazebným čini^de^m, např. bromacetylboomidem působí na d-hydroxyskupinu tohoto acylovaného estradiolu ve vhodném rozpouštědle /DMSO, DMF, pyridin, toluen, chlorid uhličitý, chloroform nebo THF/.

Reakční teplota každého stupně se volí z teplot mezi -30 °c a 100 °C, s výhodou mezi

-10 °C a 80 °C. Reakční doby se pohybují v rozmezí 0,5 až 74 hodin. Výsledný produkt se Čistí vhodnými postupy a tak se získá derivát chlorambucilu podle vynálezu.

Některé postupy výroby derivátů chlorambucilu budou popsány příklady, které jsou uvedeny jako ilustrace a podmínky reakcí mohou být zvoleny podle vlastního uvážení.

Deriváty chlorambucilu podle vynálezu mají obecný vzorec I, jsou to tedy konjugáty chlorambucilu a estradiolu nebo acylovaného estradiolu. Tato skutečnost je potvrzena IČ spektrem, UF spektrem, NMR spektrem, chromatografií na tenké vrstvě, hmotovým spektrem, elementární analysou a teplotami tání produktů.

Podle testů akutní toxicity, podle vazby látek na estrogen-sensitivní buňky, podle protirakovinného účinku je zřejmé, že deriváty chlorambucilu podle vynálezu vykazují pozoruhodně nízkou toxicitu, velmi vysokou afinitu к estrogen-sensitivním buňkám a vysokou protirakovinnou účinnost.

Deriváty chlorambucilu podle vynálezu jsou zvláště účinné při působení na rakovinné tkáně a buňky, které jsou citlivé na estradiol a tedy mohou být používány pro léčení rakoviny prsu, prostaty, jater, štítné žlázy a dělohy.

Tyto látky jsou také účinné při léčení rakoviny zažívacího ústrojí, rakoviny konečníku, hrtanu, jícnu, plic, kůže a leukosarkomu a mají pozoruhodně nízkou toxicitu ve srovnání se známými protirakovinnými drogami včetně chlorambucilu samotného.

Deriváty chlorambucilu podle vynálezu nemají specifické sexuální funkce estradiolu, třebaže jsou deriváty estradiolu. V tomto stádiu není znám důvod této skutečnosti. Uvažuje se o tom, že tyto účinky jsou podporovány jistými neznámými mechanismy vedle léčebného účinku založeného na běžné koncepci receptoru.

Mají-li být derivát chlorambucilu podle vynálezu použity v lékařství, přípravky pro podávání drogy mohou být vyráběny konvenčními postupy, běžnými u protirakovinných drog.

Deriváty chlorambucilu podle vynálezu mohou být formulovány v požadované formě jako injekce, pro perorální aplikaci, jako čípxy nebo masti. Pokud jsou formulovány v pevné formě /jedná se o perorální přípravky: tablety, pilulky, granule, prášky, kapsle/, je možno přidat к droze pojidlo, ředidlo, plnidlo, mazadlo, olej, povrchově aktivní látku nebo desintegrátor.

Pokud jsou formulovány v kapalné formě pro perorální aplikaci, může jít o vodné suspense, olejové suspense, roztoky, sirupy a dvoufázové směsi, které je před upotřebením třeba zatřepat. Jsou-li formulovány jako čípky, je možno použít podkladu hydrofobního nebo hydrofilního spolu se stabilizátorem, desintegrátorem a barvivém.

Jsou-li formulovány jako injekce, mohou být přidány vodný roztok, rozpouštědlo, živina, stabilizátor a povrchově aktivní látka. Je-li to žádoucí, pak pro udržení nebo zvýšení terapeutického účinku je možno přidat bázi, kyselinu nebo sůl.

Množství aktivní látky obsažené v přípravku tvoří obecně 0,001 % až 90 % hmot., s výhodou 0,01 až 60 % hmot, přípravku.

Přípravky derivátů chlorambucilu podle vynálezu mohou být podávány perorálně, perkutánní absorpcí, svalovou, intraperitoneální, subkutání, nitrožilní nebo intrarektální injekcí nebo topicky.

Dávka derivátu chlorambucilu podle vynálezu se volí v rozmezí od 0,01 do 50 mg/kg/den pro dospělou osobu při perorální aplikaci a od 0,001 do 20 mg/kg/den pro dospělého u nitrožilní injekce.

Deriváty chlorambucilu podle vynálezu mají následující charakteristiky:

1. Potud rakovina vznikla v tkáni obsahuje receptory, produkt selektivně napadá rakovinné buňky této tkáně a ničí je. Je tedy účinný v malých dávkách.

2. má nižší vedlejší účinky ve srovnání s účinky po podávání samotného chlorambucclc. Může být proto podáván po dlouhou UoUc a rakovinné buňky tedy mohou být úplně zničeny.

3. Eslradiol nebo acylovaný estradiol·, který je poučit jako nosič v chlorambucioovm konjugátu, má jednoduchou strukturu a jeho fyziologická účinnost je zcela známa. Je tedy možno beze strachu konjugát poouivat.

4. Rovněž struktura a účinnost protiaakovinné složky konjugátu jsou známy. Produkt tedy je možno beze strachu podávat.

5. Je možno studovat recepto^ rakovinných buněk a podle toho vybrat odpooídující stero- idní hormon nebo jeho dee-řvát a pouuit pak UerivSt chloiambuuilu od tohoto nosiče. Léčivo pro různé typy rakovin je tedy možno volit podle vhodné nosičové složky. ·

6. Chloaambuuilový derivát může být podáván běžným způsobem: perorálně, injekčne a jako čípek.

Produkty podle vynálezu mm aí jedinečné vlastnosti, které výborně přispívaa! rozvoj lékařství a pommáhaí člověku. Tyto deriváty chlorkmbuuilu mohou být také pousity jako stabilizátory pro vysokomoOeetCární polymery, zvláště pro polyolefiny.

Vynález bude objasněn na některých případech, které jsou určeny pouze pro aci a neznamenal omezení rozsahu vynálezu.

Příklad 1

Přeprava 3-hydui)oy-l1beUre^r4--pPb^us^s’2-chlorrthy^^jaIninoO^frnyl/^uutya^ylox^y] acetoxy-1,3,⁵/10/-estratreenu.

1. Příprava 3-hydroxy-17bura-Uromaacrooyyl,3,5/1O/-rstirerrenc:

1, 3,5/10/^51^1^0^3, ^beta-dio! /1/ g/ se iozpuslí v bezvodém tetrahydrofuranu /THF, 400 ml/ a k roztoku se přidá 8,8 g pyridinu. K tomuto roztoku se pomalu přikape při tejiotě -5 °C až -7 °C iozeo^{k b}aomar!c^ryl^uromi^uu /^22,5 ^g/ v chlorid uhiič^ém /74 ^g/.

Směs se ponechá stát přes noc, pak se od^Hruj vzniklá sraženina a filtrát se zahuusí k suchu, Odparek se aoipuctí v etheru a krystklZjacr z etheru poskytne 3,17buta-Uil/boomacrtoxy/-:!, 3,5 / WO/e^ta^im.

Dva gramy taho^ ^pro^duktu se rozpustí v mmthanolu /9^/0 ml/ a roz^ se o^^c^l^la^J^í,na ^-5 °C. K tomuto roztoku se pommlu přidá roztok uhličiaanu draselného /0,24 g/ ve vodě /20 m^/. Po 30 minutách se směs zředí 1 i.ei^rm vody a vyloučená sraženina se od^Hruj a vysuší.

Elemeetární analysa a IČ spektrum potvrzuje, že produktem je 3-hydroxy-l7beta-bromacetoxy-1,3,5/ 10//-es sra arien .

2. Příprava ^hydroxy-Wlrn^-/^4-^- ^sf^ch^rethyl/m^o ^пу^Ы^г^сху/acetox^ -1,3,5/10/-rstrjtiiets /Konjugát chlorammucils a estradiolu/.

Stříbrná sůl 4-^p Uil/2-ihⁱoireh^/i/jm^mno/^frn^t/lm^mselt^v ^seli^ /²00 mg/ se pom^cc^í ml DMSO převede na bílý kolo^ní roztok, k němuž se pak přidá 190,8 mg 3-hydroxy-17Uetk-Uromarcroxy-1, 3Λ/ΙΟ/θ^^γ^^.

Tato směs se nechá míchat 64 hodin ve tmě, přičemž sraženina změní barvu na žlutozelenou. Přidá se malá množsSví acetonu a sraženina se odstraní fittrací přes filtr G4. Meeztím sraženina působením denního světla ztmavne do ierně zelené barvy, filtrát ale zůstává bezbarvý a iirý.

Za sn^ížené^ho tkku se na vocfoí lázni při ⁸0 °C o^dpaří DMSO a ^po přisní 100 ml vo^dyse vyloučí produkt ve tvaru bílých krystalů. Po hodině /odstranění DMSO/ se krystaly odsaj na GJřiltr^u a pečlivě promyjí destilovanou vodou. Produkt se suší ve vakuu v exsikátoru, výtěžek 330,5 g.

Čištění produktu:

330,5 mg surových krystalů se rozpustí ve směsi 50 objemových dílů cyklohexanu a 10 objemových dílů octanu ethyl-natého.

Roztok se pomalu fitrruje přes sloupec g siliač^gel^u a postupná separace poskytne 188,2 mg /62,86 8/ čistého produktu.

Elemeenární analýza:

nalezeno	: 66 ₍	,0	% C, 7,0	% H, 2,3	% N,	11,0	% Cl;
vypočteno: 66,	,22	: % C, 6,98	% H, 2,27	% N,	11,52	% Cl
Teplota	tání:	měkne při 25	°C.
IČ spek^um /cm^-	1/:
3 420, 2	920,	2	840, 1 750,	. 1 74(0, 1	612,	1 582,	1 516,
1 450, 1	380,	1	350, 1 280,	1 250, 1	210,	1 175,	1 142,
1 070, 1	000,		960, 917,	867,	810,	800,	740,
655
klad	2

3-ben2oyloxy-l7beta-1,3,5/10/-estratrěenu ^př^íprava

4- ^p-£bis/^2-c^Ullrtt^Uyl/amio⁰7.ⁱtnyl but^yr^ylox^y acetoxy1,3,5/10/-Esttаarieo-3,17bbetadiol /10 g/ se rozpuusí ve 100 ml THF a přidá se 10 ml roztoku obsaauřící 1,47 g hydroxidu sodného ve vodě. Směs se míchá 30 minut při teplotě mís tne! ti a pa^k se odpárá do sucta ve va^kuu /te^plota pou^^ vodní l^ázně je ⁸⁰ °C/.

Mparek se rozpuusí v bezvodlém THF a k tomuto roztoku se pomalu přikape roztok 5,5 g benozljchUoridu v 50 ml etheru. Po 16 hodinách reakce při teplotě místnoosi se vznóklý chlorid sodný oddělí běžným způsobem, filtrát se ve vakuu odpaří k suchu a nezreagovaný ben2!OljchUorid se odstraní přidáním 200 ml vodného roztoku hydroxidu sodného /0,1 N/.

Po 15 minutách mícháni při teplotě místnoosi se bílé krystaly odděH pomocí fiiru G3, promni se ěestiOovanlu vodou a suší ve vakuu v exsikátoru.

Produkt se analysuje cUromatolrafií v tenké vrstvě silkaagelu /vyvíjecí soustava; 50 dílů octanu ethylnatého a 30 dílů cyklohexanu/, hlavní skvrna se nachází u Rp = 0,34.

Surový krystalický produkt se překrystaluje z octanu ethylantého, iímš se získá 8,6 g bílých krystalů.

Elemeenární analýza a IČ spektrum potvrdí, že produktem je l-benzooloxy-^beta-hydroxy-1,3,5/10/ estratrien.

Veškerý produkt se rozpustí v THF /7 g/ a přidá se pyi^d^ /2 g/ a roztok se ochladí na -5 °C, K tomuto roztoku se pomalu přidá 30% roztok bromaactylbromidu v chloridu uhličiéém /15,5 ^g/ z^dě^ tttruhydli/uαotem /50 ^mj/. ^po stonaném p^clávání se směs míc^ ^při ^-5 °C po dobu 2 hodin a pak se míchá další 4 hodiny v ledové lázni.

Po 16 hodinách stání v lednňci se odfiltruje na fil^u G4 bílá sraženina, která se vysuší ^vak^{uu p}ři t^^tě lá^zně 30 °C. Dále se smenina míc^há s ²⁰⁰ ml etteru a^ž se z^^ ^5,3 g bílých krystalů.

Elementární analýza:

nalezeno: 64,3 % C, 5,8 % H, 15,7 % Br; vypočteno: 64,23 % C, 5,78 % H, 15,8 % Br. Teplota tání: ¹⁴⁵ az ¹⁴⁶ °C.

Při analýze produktu chromatografií v tenké vrstvě sLlia^gel^u a při použití směsného vyvíjecího systému /50 objemových dílů octanu ethylnatého a 30 objemových dílů cyklohexanu/ se produkt jeví jako jediná skvrna u R^, 0,77.

IČ spektrum prokazuje nepřítomnoos! hydroxyskupiny a tak je prokázáno, že produktem je 3-ben zooloxy-1 7beta-bromaacnoxy- 1 ,3,ř/10 //-es bratrien.

^IČ spket.rum /cm ¹/:

2	920,	1	735 ,	1	728 ,	1	595 ,	1	579,	L 490
1	448,	1	412,	1	382 ,	1	286 ,	1	280,	1 260
1	210,	1	200,	1	170,	1	145 ,	1	09 5,	1 075
1	019 ,	1	004 ,		897,		7 80,		700,	680

3-bentouloxy-l7beta-bru>mafceouχl 1,3,5/100-62^^^6^ /182,2 mg/ mmA Reakce se prostříbrný a k fil5 ml

DMSO se smísí _ _ . . . . .

a stříbrná sůl Κ^θΙ^^- 4-£р-[^s/2-ch^uontt^-y^f/am^tuoJft-^ll^mm^ásnlté /М^⁵vádí při teplotě místnooti ve tmě po dobu 3 dnů, pak se odfiltruje bromid trátu se přidá 400 ml vody.

Vznňklá bílá sraženina se o^c^e^ěí оопОг^!::ugací, sraženina se rozpustí v 50 ml acetonu a nerozpustný ma^eřU se o^c^děí ii.tta^cí přes filtr G4. Filtrát se zahussí ve vakuu k suchu a tak se získá 165 mg olejovt-tého produktu.

Analýza produktu íhrumafourafίí v tenké vrstvě tilifarnls při p<oišití smeéi octanu ethy^^ého a cyklohnxats /10:50 objemových dílů/ vykazuje příuomnouti hlavní složky u Rr=0,44.

r

Protože ve smměi zůstal ^zre^ovaný výchozí mfent<^l, produkt se čistí chroma Doradí na silíaagel: ve smměi rozpouštědel /octan ethylnatý a íyklohnxft v poměru 10:50 objemových dílů/.

^přeČišt^ěný ^pro^dukt ^je ^při ²⁰ °C ^bí^lá kr^taHctá ^tka. Bylo ^tvrzeno, ^že pro^ktem je 3—^bmntou^——ox^——17beta— ^4-|-p-^pbib/2²c^ílour^nty^l/aminoJ 13,5/¹^°^/-estratrien.

ELe^^ent^i^r^^í analýza':

nalezeno: 68,5 % c, 6,60 % H, 1,99 % N, 9,79 % Cl; vypočteno:68,33 % c, 6,53 % H, 1,94 % N, 9,86 % Cl. Teplota tání: 110 až 111 °C.

IČ spektrum /cm’¹/:

2	920,	2	860,	1	755 ,	1	735 ,	1	612,	1	582
1	516,	1	491,	1	450,	1	420,	1	380,	1	355
1	260,	1	224,	1	210,	1	174,	1	145,	1	079
1	022,	1	005,		960,		915,		890,		800

740, 705.·

Příklad 3

Příprava

-1,3,5/10/-estratreens

3-^pr(u^pi(uny^l(uxy-l ⁷be ta-/^l-^^£p-^£^^bs_/ ^/2 -íh^LurпЪЬ^-1/г^-^^- acetox^y1,3,5/1O/-EEtrafrtnt-3,1⁷bbnt-člfol/ÍO g/ se tuzřustí ve 100 ml uranu a přidá se 10 ml vodného roztoku obsahujícího 1,47 g hydroxidu sodného. Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Reakční směs se zahuutí ve vakuu k suchu, k odstranění vody se ^použije vodní ^lázeň ⁸0 °C te^plá.

Odparek se rozpussí v bezvodého tetrahydrofuranu h k roztoku se pomalu přidá roztok sbsshutící 3,4 g prspistylcUlsriís v 50 ml bezvodého tetrahydrofsthts. Po 16 hodinách za laboratorní teploty se oddeěí sraženina chloridu sodného h filtrát se ve vakuu k suchu. Kryssalizací odparku z ethanolu se získá 9 g bílých krystalů.

zahnusí

Bylo zjištěno, ie produktem je 3-^pro^pPostУosχyl,3,5/10/-estthtrěen-17beth~sl ní analysa h IČ spektrum/.

/elementár7 g tohoto produktu se rozpust v 70 ml bezvodého tetrahydrofuranu ^ri-dinu. Směs se ochlad na ^-5 °C a ^k tomuto roz^t^o^ku se ^pomalu přikape bromidu v chloridu u^li^čittm /-7,3 g/ zředěný 50 ml tetrahydrofuranu.

a přidají

30% rozto^k ^omaac^yse 3 g ^po s^končeném pidává^ se směs ааШ 2 ^hodiny ^při ^-5 °C a ^pa^k

Po skončení reakce se na vo^dní láíinw ^při 30

1^{6 h}odin v ..ednki. vznj-klá sraženina sSífltrsjě, filtrát se zahustí ve °C a ^k odpadu se ^přid^á etter /²°0 mlA s ^kterým se vakuu k suchu ^pro^duJ^it míc^há

Tak se získá 6 g bílých krystalů. Zahuštěním fittáátu se získá další stalů /3,5 g/. Produkt se překrystaluje ze směěi etheru a ethanolu.

podíl bílých kryElemeenámí analýza: nalezeno: 61,5 % C, 6,5 % vypočteno: 61,43 % C, 6,45 %

H, 17,9

H, 17,78 % Br;

% Br.

V IČ spektru nebyla nalezena struktura 3-prspistyl-sxy--7běth-btsmahcěosχ-l, 3,5/10/-021.^trienu .

absorpce hydroxylové skupiny a produktu tedy přísluší g tohoto produktu a 0,91 g máselné se disperguj či rozpust ncosi po dobu 3 dnů ve tmě.

stříbrná soJ-i ^seHny ⁴-^-£p^p-2bs/2-c^hlsrět^Uylhamino^3fet^ylJv 50 ml DMSO a reakce se nechá probíhat při teplotě místPo skončení reakce se bromid stříbrný oddfltruje a fiir^át se zředí vodou /4 litry/. Ceetrifsghcí se oddeěí sraženina, která se tszpustí v 50 ml acetonu a nerozpustný mea-Geřá! se z tohoto roztoku oddělí fixací přes filtr G4. Filtrát se ve vakuu s<ípplh:í k suchu a tak se získá 1,3 g olejov^ého produktu.

Produkt se cUromahosgafuje na tilihagěls ve směěi octanu ethylnatého a cyklohexanu /10:⁵0 o^emový^ íí^1ů/. Nečištěný ^pro^dukt je ^při ²0 °C v-s^ozní olej.

Elemeenární analýza;

nalezeno: 67,1 % C, 7,0 % H, 2,1 % N, 1 1 ,0 % Cl;

vypočteno: 66,0 % C, 6,99 % H, 2,08 % N, 10,56 % cl.

IČ spektrum /cm ¹/:

2	916 ,	2	840,	1 750,	1 740,	1 6 10,	1 512,	1 488,	1 · 141,
1	415,	1	379 ,	1 361 ,	1 270,	1 210,	1 200,	1 170,	1 140,
1	06 8,	1	00 4 ,	956 ,	931 ,	885 ,	817,	793,	735 с^г-1

má s^trs^ktsrs a-propwi-^^y.c^y^y17beěth^/4£ppjbist2-c^cul>stěh^uУ/Je tedy potvrzeno, ie produkt a^inoj ^f en^tyl^jbst^yt^y .oxyj ace to^x^^-1, ³,5/ 1 O/-estratrienu .

Příklad 4 úprava 3-acětsx^y-^beta-: ⁴/10/^^^^16^.

^-£bis/ Wanim^ ^^l^uty^oxy^ -acetoxy¹,³>59

3-Aceeox^y-l7betř-bromařeeoxχy1,3,5/10/-estrřtrSenu /1 g/, při^pravený ^postu^pem podle pří^aclu 2 a sti^íbrná sůl ^kyselin^{y 4}-<^p-[bit/²-chlore^rh^jl/rιmin<^ieny^j^ máseln^t /0^,9 ^g/ se smísí v 50 ml DMSO.

Reakce pro^bíhá 3 ^dny ^při ²⁵ °c ve ^t^m^ě. ^Po skonaní reakce se očl^ltruje vyloučený br^omid stříbrný a k fitráátu se 4 1 vody. Vznnklá sraženina se izoluje ceenrifugacc, rozpuštěním v 50 ml acetonu a fi trací G4 se produkt o^c^é^Ii' od nerozpustných příměsí.

Odppaení rozpouštědla ve vakuu poskytne 1,2 g olejovitého produktu, který se chromatograiuje-na tiliřagslu ve sm^ě^i octanu ethylnatého a cyklohexanu /v poměru 10:50 objemových dílů/. Přečištěný produkt je při 20 °C viskozní olej.

»

Elemmenární analýza:

nalezeno: 66,0 % C, 6,9 % vypočteno: 65,64 % C, 6,84 %

Cl;

Cl.

V IČ spektru nebyla nalezena 3-acetoxy-17be tanu

IČ spektrum /cm V:

absorpce hydroxylové

-(4-£ρ -[bis-/ 2-chlorethyJ/aminc⁰ fenylj ^butyr^ylox^y^ skupiny, produkt tedy má strukturu f acetoxy-1,3,5/10/-estrařrie-

2 915,	2	840,	1 750,	1	740,	1	610,	1 512
1 488,	1	442 ,	1 415,	1	378,	1	360,	1 2 70
1 210,	1	200,	1 170,	1	140,	1	06 8,	1 005
956 ,		931 i	885 ,		817,		793,	735
P ř í k 1 a	d	5

³-Асе toxy-Wbe ta^romm aeeoxy-3^{3,5 5 1}00e e ^atr ^eenu ^/1 ^g/ a so^fná sůl ^kyseiin^y 4 ^/2-chloreth^ylřím^/o^[fsnnyl^mmáteln^é /⁰,8 ^g/ se smísí s ⁵⁰ ml ^trah^ro^ranu. Reakce ^probí^{há p}ři ⁶0 °C ^po do^bu 24 hodin.

Po skončení reakce se vyloučená sraženina ocdfltruje a filrrát se zahuusí ve vakuu k suchu. Od^parek se rozdělí a přečistí chrommaooraaií na sloupci siliaagelu při poouití směsi rozpouštědel /octan ethylnatý a cyklohexaa/. Přečištěný produkt /0,09 gl má strukturu 3-acetox^y-17beta- ^-£ρ-^£bⁱs/²-chlot·eth^ylrami/^{0] f}en^y l^bu^^lox^ acetoxy-1,3,5/110-eetratrienu.

Příklad 6 ^Př^íprava 3-acetoxy-¹⁷beta- (4-—p- ^bis^-chlorethy^-aamin^oj feny^but^yloxyj -acetox^y-1,3,5/10/-estrrtrSenu

Stří^brn^á sůl c^hloram^biiu^clu to je 4-{p-|-bi s/²~c^hloreth^y lamino] ^fenyljm^áseln^é k^yseiⁱn^y/200 mg/ se přidá k 10 ml DMSO za vzniku bílého koloidního roztoku. K tomuto roztoku se pak přidá 190,8 mg 3-h^ydrox^y-17^bbea-^bromaaceoo^yj-,3,5/1O/-estratreenu a směs se míchá při teplotě místnoosi ve tmě po dobu 64 hodin.

Po této době se barva sraženiny stane žlutozelená. Přidá se malé mnoossví acetonu a sraženina se odffltruje na fitrru G4, filrrát, který je bezbarvý a čirý, se zbaví DMSO deeti-lací ve vakuu ^při ^poo^uití ⁸⁰ °C vochí Ш/х.

Po přidání 100 ml vody k odparku se vyloučí bílé krystaly. Po jedné hodině se DMSO oddestiluje. Bílé krystaly se oddělí filtrací na G4 a pak se promyjí destiovvanou vodou. Sušení se provádí ve vakuu v exsikátoru. Výtěžek surové látky je 330,5 mg.

330,5 mg tohoto produktu se rozpustí ve směni octanu ethylnatého a cyklohexanu /v poměru 10:50 objemových dílů/, roztok se pommlu nechá protékat sloupcem siMkc-elu /40 g/.' Postupně se oddělí produkt: 188,2 mg /62,86 % čistého produktu.

Elementární analýza:

nalezeno: 66,0 % C, 7,0 % H, 2,3 % N, 11,0 % Cl;

vypočteno: 66,22 % C, 6,98 % H, 2,27 % N, 11,52 % Cl.

Teplota tání: měkne při 2⁵ °C.

Bylo zjištěno, ze ^produktem je 3-^hydroxy-17bett- (⁴-_lp-[bi s/2-chlonehhyl/am^tno] fenylj)butyryloxyy tcetoxy-1,3^/lOZ-estratrienu.

mg tohoto produktu se rozpuutí v 1 ml bezvodého pyridinu a 1 ml anhy-ridu kyseliny octové, tmět se nechá stát v lednici 16 hodin. Po skončení reakce se tmět zahustí a vytuší ve vakuu při ^te^plot^^{t l}^^ázn^{ě 30} °C.

K od^parku se přidá destilovaná voda a tmět se nechá stát 1 hodinu, aby te vylouščl olejovitý produkt jako bílá koloidní pěna. Zbytek pyridinu a kyseliny octové se odstraní deetilovanou vodou a produkt se vodou vymyje do neeurrait-. Oleeovitý produkt te izoluje a tuší v ^s^kát-oru ve vakuu, výtěžek: 45 mg.

Produkt se analyzuje chromatoorafií v tenké vrstvě na silifarelu směsí octanu ethylnatého a cyklohexanu v poměru 30:50 objemových dílů: ukáže te, že produkt vykazuje jedinou skvrnu u R_F 0,78.

Pro přečištění produktu byla chroaatooratin na silifarelu provedena při poLlSití smmti octanu ethylnatého a cyklohexanu v poměru 10:50 /objemové díly/. Přečištěný produkt tvoří ^při ²0 °C v^Lskozní olej .

Elemmenámí analýza:

nalezeno: 66,0 % C, 6,5 % H, 2,0 % N, 10,9 % Cl;

vypočteno: 65,64 % C, 6,84 % H, 2,13 % N, 10,79 % Cl.

V IČ spektru nebyla nalezena absorpce hydroxylové skupiny a produktu tedy odpovídá struktura 3-a^ťetoxy-17bett- (4-^p- ⁱbis/2-chlornthy^/faain0 ⁱnnyУ^ljbst^yr^yll)x^yj acetoxy-¹, ^3,5/:LO/-nstrft.rnens.

IČ spektrum /cm”¹/:

915 ,	2	840,	1	750,	1	740,	1	610,	1	512
488,	1	4 42 ,	1	415,	1	378,	1	360,	1	2 70
210,	1	200,	1	170,	1	140,	1	068,	1	005

Příklad 7

Příprava 3-propilnyloxy-17beta-1,3,5/10 /-es trat^enu.

«-{p-[bi^s/2 -chořethyiam™!!^ ^п^-^ but^^-:!^^-) a^(^too^xyЭ-Ну^ох^^- 17beta- (4-.^p-Qis/2-c^tlornth^-lfaainO ⁱeny]^ but-r-lDx— 3,5/^0//50 mg/ se rlZFUStí v 1 ml pyridinu a 1,5 ml tnhydridu kyse^ny propanové. Roz tok se nechá stát v lednici jeden den, pak 30 ^oc.

K odparku te přidá destUvvaná voda a jovitý kolu-dní produkt. Pp-idin a kyselin, dukt se promyje vodou do ienSrrfit-. Vodná v exs^kátoru: výtěžek činí 40 mg oleje.

se ve vakuu odpadlí k tuchu, teplota lázně činí tmět te nechá 2 hodiny stát, aby se vylouučl oleoctová te odstraní pomocí restilované vody, proiá'ze se lddrtí a olejovitá fáze se suší ve vakuu

Produkt te ctroaafoorafsjn na si Utapeli: ve sm^s^i. octanu ntt-lnttétl a cyklotnxtnu v poměru 10:50 /obňemové díly/. Přečištěný produkt je olejovitá látka. V IČ spektru se nenachází tlatorpce u 3 600 t^ž 3 200 cm ¹.

To potvrzuje^ že produktem je 3-propionyloxy-17beta- ^4-^p-£bis/2-chlorethyl/aminójfenyl} butyryloxyj acetoxy-1,3,5/10/-estratrien.

Příklad 8

Příprava 3-benzolpxy-17beta- (4-{p-Qbis/2-chlorethyl/amino] fenyl} butyryloxy) acetoxy-1,3,5/10/-estratrienu.

3-hydroxy-l7beta- (4-£p-[bis/2-chlorethy 1/amino] feny^ butyryloxy) acetoxy-1,3,5/ 10/-estratrien /50 mg/ se rozpustí v 1 ml bezvodého pyridinu a benzoové. Směs se nechá stát jeden den v lednici, pak se ve lázně činí 30 °C/.

smísí se s 2 g anhydridu kyseliny vakuu zahustí к suchu /teplota minut stát, aby se vyloučil olejovitý koloidní produkt. Pyridin a kyselina benzoová se odstraní destilovanou vodou a

Odparek se smíchá s destilovanou vodou a směs se nechá produkt se exsikátoru promyje vodou do neutrality. Vodná fáze se oddělí a olejovitá fáze se vysuší ve vakuu. Výtěžek:

mg oleje.

se chromatografuje

Produkt poměru 10:50 /objemové díly/.

na silikagelu ve směsi octanu ethylnatého a cyklohexanu Přečištěný produkt je viskózní olejovitá látka.

V IČ spektru nebyla nalezena absorpce mezi 3 600 a 3 200 cm ¹. Tak je potvrzeno, že produktu přísluší struktura 3-benzoyloxy-17beta- (4-^p-Qbis/2-chlorethy 1/aminó] feny^ butyrylox$ acetoxy-1,3,5/10/-estratrienu.

Test 1

Akutní toxicity a protirakovinné aktivity /in vivo/ derivátů chlorambucilu podle vynálezu .

1. Akutní toxicity /LD_5q/

Pro měření LD^q byly použity skupiny vždy 8 ICF-JC1 myších samiček ve věku 5 týdnů, které byly umístěny v průhledné kleci. Každá droga byla rozpuštěna v olivovém oleji a aplikována v jediné dávce intraperitoneální injekcí, subkutánní injekcí a perorálně.

Hodnoty byly odečteny při použití Litchfield-Wilcoxonovy grafické metody z výsledků po 7 dnech. Bylo zjištěno, že chlorambucil má LD^₀ 20 mg/kg při intraperitoneální aplikaci 80 mg/kg při perorální aplikaci a 26 mg/kg při subkutánní aplikaci.

^LD50 ^pro ^tku č. 2 /viz tabulka 1/ je větší než 3 000 mg/kg při intraperitoneální, větší než 6 000 mg/kg při perorální a větší než 3 000 mg/kg při subkutánní aplikaci.

2. Protirakovinný test in vivo.

Kousky rakovinných buněk z lidského prsu, které mají receptory steroidních hormonů, byly podkožně implantovány do podpaží myší, /BALB/C-nu/nu, 5 týdnů staré/, aby vyvolaly vznik nádorů. Po 24 hodinách po implantaci bylo započato s aplikací aktivních látek v olejové dispersi roztoku: aplikace byla provedena subkutánně nebo perorálně a každý druhý den, celkem lOx.

25. den po implantaci byly nádory vyoperovány. Účinnost inhibice růstu nádoru byla vždy počítána ze srovnání celkové váhy nádorů z 10 myší, kterým byla podávána aktivní látka /А/ s celkovou váhou nádorů 10 kontrolních myší /В/.

Účinnost inhibice /%/ = /1 - ^/ x 100

В

U subkutánně i perorálně chlorambucilem /15 mg/kg/ ošetřených myší aktivita byla asi až 70%, zatímco při podávání derivátů chlorambbcčlu podle vynálezu byla nalezena účinnost větší než 90%. Při podávání derivátů chlorambncilc podle vynálezu všechny myši zůstaly naživu .

PPi autopsii byly nalezeny vážné poruchy sleziny, uteru a štítné žlázy u myší, jimž byl podáván ^Ιθ^Ι)^ 1, ale u těch, které byly ošetřeny deriváty chloramnicdc podle vynálezu, nebyly nalezeny žádné změny na těchto orgánech.

Tabulka 1

Vzorek č.	1
LD50 /mg/kg/ Peeorální aplikace	80
LD5₀ /mg/k// Subťctánní aplikace	26
Tabulka 2

LD50
2		3		4
6 000	3	000	3	000
2 000	2	000	2	000

Protirakovinná účinnost

Vzorek č. 1 2345

Protiratovinný test

Ppeorální aplikace

Dávka /mg/k//	10	15	10	15	10	15	10	15	15
Korefcient p^í^eitLÍ	8/10	7/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
Účinnost inhibice /%/	55	70	92	98	9 1	93	93	97	0
Subbutánní aplikace
Dávka /mg/k//	5	10	5	10	5	10	5	10	10
Korefcient přežití	9/10	7/10	10/10	10/ 10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
Účinnost inhibice /%/	53	71	90	98	93	95	92	94	0

Poznámky:

chlor ami^cc!

Vzorek	č.	1
Vzorek	č.	2
Vzorek	č.	3
Vzorek	č.	4
Vzorek	č.	5

3-benzorlrxy-17beta- (4-^S“^£bis/2-ihlorlthy^/rmino] fenylj ^ьи^гу1ох^у) acetox^y-1,3,5/lO/^stratreen ³-acetox^y-17beta- (4-^/p- [^bii/2-i!hlorlth^š/.rmirюj ^п^^Рш^г^оху^ acetoxy-1,3,5/ H/-e f^s^jratrkn

З-фггргту^х^^^эе^- ⁽⁴-(p-[^bis/2-i:hloleth^y/aamino] ^^l^bctyjštoxy) s^t^y-1,3,5/10/-estratrien olivový olej /kontrola/. .

Test 2:

Testy p^t^akov^né aativity byly prováděny jako v případě testů 1 s tím rozdíem, že každá aktivní látka byla aplikována prcze ve formě disperse v Polysolvátu 80 /emul/ažní činidlo/ a tr intr^^100^11^' injekcí, výsledky jsoc shrnuty v tétr tabulce:

Chlorambucil

Dávka /mg/kg/

Účinnost inhibice /%/

Test akutní toxicity /LD_5Q/

0,5

000

Test 3

V tomto testu se zjisřuje afinita 3-^hydroxy-17beta- ^4- {p-[b is/2-c^hloret^hyiaamⁱn( yloxy) acetoxy-1,3,5/10/-estratr^eenu ^k estrogen-sens^stivním buň^kám.

Es^sradiol značený tnUem /³И/ b/l in^ku^bován ^do ^dělo^{hy k}r^álí^ků a ^když ^došlo ^k navázání značeného estradiolu, b^yl do systému zaveden zkoumaný vzorek a byla měřena nmnosSví volného ³H-e^eSradiolu, ^který byl v^ytesněn ^přidaným esturadl^o^h^m.

Výsledky jsou shrnuty v grafu na obr. 1, v němž v ose x jsou vynášeny dávky zkoumaných drog ^v nM a v ose ^y minoví vázanko ^3H-^e^si:a^i.o^lu v %. Gra^f u^kazuje^{, s}e mn^UÍ ³H-estradiolu uvolněného estradioeem /křivka 1/ a konjugátem chlórambuučlu a estradiolu /křivka 2/ jsou srovnatelná a závislost na mnoossví přidané drogy je prakticky stejná v obou případech. Tato skutečnost ukazuje, že konjugát chlorammbcclu a estradiolu vykazuje vysokou aktivitu k receptoru estrogenů. Křivka 3 znázorňuje poměry pro samotný chlorammbuci.

Přípravky: ' díly hmot.

Formulace 1: aktivní látka získaná podle příkladu 350 maaót35 soobit25 karboxymmethyacelulóza5 stearát hořečnatý5 talek 40

JednoOtlvé složky se smísí, rozprášku u í a ko^mpri^mují do t^varu tablet o průměru 10 mm.

díly hmc)t.

Formulace 2: aktivní látka připravená ppode příkaadu 2 laktosa ester cukru a mastné kyseliny škrob voda /1% sodná sůl karbo^^íy^mbthyc^cel^lLÓz^//

100

500

100

JednnoH-vé složky se prohnětou a protlačí J.sem a takto vzniklé granulky se pak suší a prosáaají, aby se získala velikost 10 as 24 mesh pro přípravu grant^í pro perorální aalikaci.

Formulace 3: granule podle formulace 2 se plní do komerčně dostupných kapplí s obsahem

0.⁵ cm³.

Formulace 4: aktivní látka připravená podle případu 1 olivový olej * hmot. dílů hmot. dílů

Složky se zaařříí, smíchaií a s^t^eili^zui í pro injekční pouuřií.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU obecného vzorce I

1.Způsob výroby derivátů chlorambucilu

-e-c₃H₇, vyznaaučíií se tím, že chlorambbcíl a estradiol nebo acylovaný estradiol se vážou přes hydroxyskcpinc v poloze 17 působením bromaaceylbromidc načež se produkt popřípadě acylcje.
2. Způsob podle bodc 1, vyznaaující se tím, že bromaaceylbromid se nejprve cvede do reakce se 17-hydroxyskcpinoc estradiolc nebo acylovaného estradiolc v rozpouštědle a pak se takto modifikovaný estradiol nebo acylovaný e^t;ra^i.o]L nechá reagovat s karboxylovoc sk^incO ^οι^^Ιη v rozpouštědle.
3. Způsob podle bodc 1, vyznaččcjcí se tím, že se bromacceylbromid nejprve nechá reagovat s karboxylovoc skupinou ^ЗсгсшЬ!^^ v rozpouštědle a pak se takto moOifikovaaý chlorcmbbjil nechá reagovat se 17-hydroxyskupinou estradiol nebo acylovaného estradiolc v rozpouštědle.
4. Způsob podle bodc 1, vyznaCující se tím, že se derivát ihlorcmbucilc obecného vzorce I, v němž R znamená hydroxylovoc ski^pinc, acylcje působením anhydrit nebo halogenidc alifatické kyseliny obsaaujíií 1 až 4 chlíkové atomy nebo kyseliny benzoové v rozpouštědle.
5. Způsob podle bodc 1, vyznaCující se tím, že se chlorama^! převede na střenoc sůl nebo sůl d^Mckého kovc a ta se pak vystaví reakci s nebo modífídovaným estradioeem nebo acylovaným estradiolem v rozpouštědle.