DE69318474T2

DE69318474T2 - Neue (Estradiol-Derivat)-Chlorambucil-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Präparate

Info

Publication number: DE69318474T2
Application number: DE69318474T
Authority: DE
Inventors: Kiro Asano; Tadahiro Matsudaira; Satoshi Mitsuhashi; Tsuyoshi Saito; Fumio Tamura
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1992-06-11
Filing date: 1993-06-09
Publication date: 1998-10-15
Anticipated expiration: 2013-06-10
Also published as: FI932641A; EP0573977A2; US5576309A; EP0573977B1; FI932641A0; JP2520074B2; CA2097137A1; US5354745A; ATE166060T1; EP0573977A3; KR940005662A; AU649180B2; ZA933993B; AU4011693A; US5578589A; IL105901A0; JPH05339285A; DE69318474D1; KR970001532B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Konjugat, umfassend ein Reaktionsprodukt eines Estradiolderivats mit Chlorambucil, ein Verfahren zu dessen Herstellung und ein Arzneimittel, umfassend das Konjugat.
Es gibt viele herkömmliche Antitumormittel, die inherente starke Antitumorwirkungen haben, aber diese inherenten Wirkungen tatsächlich nicht ausreichend entfalten. Der Hauptgrund ist, daß die Menge, die verabreicht werden kann, auf Grund ihrer Nebenwirkungen begrenzt ist. Einer der Versuche, das vorstehende Problem zu lösen, ist, das Antitumormittel an einen Träger mit spezifischer Affinität für Tumorgewebe zu binden, und dadurch ein Konjugat eines Antitumormittels und eines Trägers zu bilden. Der Versuch beabsichtigte, das Antitumormittel spezifisch an Tumorgewebe zu akkumulieren und die Antitumorwirkung wirkungsvoll zu zeigen, während die Nebenwirkungen vermindert werden.
Auf der Grundlage des vorstehenden Gedankens wurde bereits ein Estradiol-Chlorambucil-Konjugat und ein im wesentlichen das Konjugat enthaltendes Antitumormittel in USP 4,261,910 und USP 4,332,797 vorgeschlagen. Das Antitumormittel kann spezifisch in Tumorgewebe akkumulieren und dort eine starke Antitumorwirkung zeigen. Ferner ist sein Einfluß auf normale Zellen äußerst gering.
Kürzlich berichteten H. Kosano et al., daß das vorstehende Estradiol-Chlorambucil- Konjugat die Estrogenwirkung, das Wachstum von MCF-7 (menschliche Brustkarzinomzelle, deren Wachstum wird durch Estrogen gefördert) zu fördern, irreversibel oder über einen äußerst langen Zeitraum hemmt (Hiroshi Kosano et al., Cancer Research 52 (1992), 1187 - 1191). Als Erklärung dafür wurde vorgeschlagen, daß der Rückgang der Estrogenrezeptoren einen Verlust der Estrogenempfindlichkeit der Zelle verursacht, gefolgt von Hemmung der Sekretion des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF) α und daraus folgender Hemmung des Zellwachstums. Ebenso wurde vorgeschlagen, daß die Struktur des Konjugats notwendig ist, damit das Konjugat die vorstehenden Wirkungen auf die Estrogenrezeptoren zeigt und die Sekretion von TGF-α hemmt. Das heißt, es wird nicht vorgeschlagen, daß die vorstehenden Wirkungen durch im Verlauf des Konjugatabbaus freigesetztes Chlorambucil verursacht werden.
Ferner offenbart USP 4,921,849 eine Injektion, die hergestellt wird, indem das vorstehende Estradiol-Chlorambucil-Konjugat in einem Ester einer iodinierten Mohnölfettsäure gelöst wird. Die Injektion ermöglicht es dem Konjugat, für eine lange Zeit an Tumorgewebe zu bleiben und seine vollen pharmakologischen Wirkungen zu zeigen. Ferner offenbart USP 4,885,290 einen Immunregulator, der als Wirkstoff das vorstehende Konjugat enthält, das selektiv Immunreaktionen unterdrückt, die spezifisch durch ein Isoantigen hervorgerufen werden. Demzufolge zeigt das Estradiol-Chlorambucil-Konjugat selektive physiologische Aktivitäten, wie selektive Antitumorwirkung, selektive immunsuppressive Wirkung und ähnliches.
Wenn jedoch ein Antitumormittel über lange Zeit verabreicht wird, akkumulieren in der Tat selbst schwache Nebenwirkungen, die bei kurzzeitiger Verabreichung kein Problem darstellen, und werden zu ernsthaften Problemen. Insbesondere fehlt es einem Krebspatienten an Lebenskraft und deshalb verstärkt sich eine solche Akkumulierung schwacher Nebenwirkungen. Eines der Probleme mit dem Konjugat ist eine nachteilige Wirkung durch eine geringe Menge an im Körper freigesetztem Estrogen aus dem Estradiol-Chlorambucil-Konjugat. Beispielsweise akkumuliert bei Langzeitverabreichung des Konjugats die geringe Menge an freigesetztem Estrogen und kann Nebenwirkungen verursachen, wie Gynäkomastie, Mastose, Brustwarzenschmerzen, Genitalblutungen und ähnliches. Diese estrogenen Aktivitäten können selbst bei den Injektionen, dem Immunregulator oder ähnlichem, das das vorstehende Konjugat enthält, ein Problem sein.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß ein äußerst nützliches, verbessertes neues Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat mit keiner oder verminderter estrogener Aktivität erhalten werden kann, indem ein oder mehr bestimmte Substituenten in ein oder mehr Estradiolringe eingeführt werden, während die selektiven physiologischen Aktivitäten des herkömmlichen Estradiol-Chlorambucil-Konjugats erhalten bleiben, das heißt die selektive Antitumorwirkung und die selektive immunsuppressive Wirkung.
Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Estradiolderivat- Chlorambucil-Konjugat bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Herstellungsverfahren für das Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfidung ist es, ein Arzneimittel, umfassend das Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat, bereitzustellen.
Weitere Aufgaben und Wirkungen der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung offensichtlich.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat der Formel (I)
bereitgestellt, in der R¹ ein Alkyl- oder Alkoxylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist; R² ein Acyl-, Dansyl- oder Alkylrest ist; R³ und R&sup5; unabhängig voneinander H, eine Oxogruppe, OH oder ein Acyloxyrest sind; m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist; und die Konfiguration jedes der Substituenten R³ und R&sup5; und die Konfiguration des Sauerstoffatoms in der 17-Position der Estradiolderivat-Einheit unabhängig voneinander die β-Konfiguration oder die α-Konfiguration sind; mit der Maßgabe, daß R³ und R&sup5; nicht gleichzeitig H sind, wenn n 0 ist, und wenigstens eines von R³ und R&sup5; eine von H oder OH verschiedene Gruppe ist; und ferner daß die Reste R¹ gleich oder verschieden sind, wenn n 2 oder 3 ist.
Ferner werden gemäß der vorliegenden Erfindung ein Herstellungsverfallren für das vorstehende Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat und ein Arzneimittel, umfassend das Estradiolderivat-Chlorambucil, bereitgestellt.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung auch noch ein weiteres Zwischenprodukt des vorstehenden Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugats bereitgestellt, nämlich eine Verbindung der Formel (IIa)
in der R¹ ein Alkyl- oder Alkoxylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist; R²¹ ein Acyl- oder Dansylrest ist; R³ und R&sup5; unabhängig voneinander H, eine Oxogruppe, OH oder ein Acyloxyrest sind; m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist; X ein Halogenatom, OH oder ein Salz davon ist; und die Konfiguration jedes der Substituenten R³ und R&sup5; und die Konfiguration des Sauerstoffatoms in der 17-Position der Estradiolderivat-Einheit unabhängig voneinander die β-Konfiguration oder die α-Konfiguration sind; mit der Maßgabe, daß R³ und R&sup5; nicht gleichzeitig H sind, wenn n 0 ist, und wenigstens eines von R³ und R&sup5; eine von H oder OH verschiedene Gruppe ist; und ferner daß die Reste R¹ gleich oder verschieden sind, wenn n 2 oder 3 ist.
Das Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat der vorliegenden Erfindung (nachstehend als das vorliegende Konjugat bezeichnet) enthält eine Estradiolderivat-Einheit, gekennzeichnet durch die folgende chemische Struktur:
Zusätzlich zu OR² in der 3-Position am Ring A des Estradiols hat die Estradiolderivat- Einheit ein oder mehr Substituenten in der 1-, 2- und/oder 4-Position von Ring A oder in einer oder mehr Positionen an den Ringen B und/oder D. Die estrogene Wirkung kann eliminiert oder vermindert werden durch wenigstens einen Substituenten bei R¹ (einer oder mehr) am Ring A, R³ (von H verschieden) am Ring B oder R (von H verschieden) am Ring D, aber vorzugsweise ein oder mehr Reste R¹ in der 1-, 2-und/oder 4-Position am Ring A. R¹ in der 1-, 2- und/oder 4-Position am Ring A kann ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein Alkoxylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein. R¹ ist vorzugsweise in der 1- und/oder 4-Position vorhanden. Ferner kann die Estradiolderivat-Einheit eine Oxogruppe, OH oder Acyloxyrest an einem der Ringe B und D tragen, oder 2 jeweils gleiche oder verschiedene Substituenten an 2 verschiedenen Ringen aus den Ringen B und D. In diesem Fall wird eine Oxogruppe oder ein Acyloxyrest bevorzugt. Der Acyloxyrest ist vorzugsweise ein Acyloxyrest mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, beispielsweise ein Benzoyloxy-, Acetoxy-, Propanoyloxy-, Butanoyloxy- oder Pentanoyloxygruppe.
Der Substituent an der 3-Position der Estradiolderivat-Einheit im vorliegenden Konjugat weist eine Struktur auf, in der H von OH in der 3-Position des Estradiols durch einen Acylrest, eine Dansylgruppe (5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonyl) oder einen Alkylrest substituiert ist. R² als Acylrest ist vorzugsweise ein Acylrest mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Benzoyl-, Acetyl-, Palmitoyl-, Stearoyl- oder Linolenoylgruppe. Ferner ist R² als Alkyl rest vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohienstoffatomen, insbesondere eine Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe. Ferner kann die Konfiguration der OH-Gruppe in der 17-Position der Estradiolderivat-Einheit in der β-Konfiguration, der α-Konfiguration oder einem Gemisch daraus sein, aber die β-Konfiguration wird bevorzugt. Die Konfiguration jedes der Substituenten R³ und R&sup5; kann auch die β-Konfiguration, die α-Konfiguration oder ein Gemisch daraus sein.
Das vorliegende Konjugat kann beispielsweise durch folgendes Verfahren hergestellt werden:
Wenn ein Estradiolderivat mit OH in der 3-Position am Ring A des Estradiols und in der 17-Position am Ring D des Estradiols (das bedeutet ein Estradiolderivat mit R¹ in der 1-, 2- oder 4-Position am Ring A und/oder mit von H verschiedenem R³ und/oder R&sup5; am Ring B und/oder D: nachstehend einfach als ein "3,17-OH-Estradiolderivat" bezeichnet) verwendet wird und das H von OH in der 3-Hydroxylgruppe durch eine Acyl- oder Dansylgruppe R² ersetzt wird, wird das 3,17-OH-Estradiolderivat zuerst in einem organischen Lösungsmittel gelöst, und anschließend mit einem Alkalimetall oder einem Alkalimetallhydroxid umgesetzt, um ein Salz zu bilden. Dann wird das Salz mit einem Säurechlorid oder Säureanhydrid entsprechend der gewünschten Säure- oder Dansylgruppe umgesetzt. In einer anderen Ausführungsform wird zuerst ein Alkalimetallhydroxid in einem Aceton-Wasser-Gemisch gelöst, und anschließend wird das 3,17-OH-Estradiolderivat dazugegeben Daraufhin wird das entstandene Salz mit einem Säurechlorid oder Säureanhydrid entsprechend der gewünschten Acyl- oder Dansylgruppe umgesetzt. Wenn R² eine Dansylgruppe ist, wird Dansylchlorid (5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid) als Säurechlorid verwendet.
Wenn das H der 3-Hydroxylgruppe im 3,17-OH-Estradiolderivat durch eine Alkylgruppe R² substituiert wird, ist es möglich, ein übliches Alkylveretherungsverfahren anzuwenden. Beispielsweise werden ein Dialkylsulfat, wie Dimethylsulfat, und eine verdünnte Alkalilösung mit dem 3,17-OH-Estradiolderivat umgesetzt.
Demgemäß wird ein Estradiolderivat erhalten, das die OR²-Gruppe in der 3-Position am Ring A trägt, d.h. eine Verbindung (nachstehend als "3-OR²-Estradiolderivat" bezeichnet) der Formel (III)
in der R¹, R², R³, R&sup5; und n die gleiche Bedeutung wie vorstehend haben.
Ein Kupplungsmittel kann verwendet werden, um das 3-OR²-Estradiolderivat und Chlorambucil zu kuppeln. Das Kupplungsmittel kann ein hydroxyliertes oder halogeniertes Carbonsäurederivat der Formel (IV) sein
X(CH&sub2;)mCOY (IV)
in der X für Halogen (beispielsweise Chlor oder Brom) oder OH steht; Y für ein Halogen, das gleich oder verschieden von X ist (beispielsweise Chlor oder Brom), OH oder ein Salz davon steht; und m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist. Als Beispiele für solche Carbonsäurederivate können Monochloressigsäure, Monobromessigsäure, β-Monochlorpropionsäure, β-Monobrompropionsäure, Monochloracetylchlorid und Monobromacetylbromid erwähnt werden.
Es ist möglich, das 3-OR²-Estradiolderivat und das Kupplungsmittel umzusetzen, um die 17-Hydroxylgruppe zu verestern und die Verbindung der Formel (II) zu erhalten
in der R¹, R², R³, R&sup5;, m, n und X die gleiche Bedeutung wie vorstehend haben. Die entstandene Verbindung wird nachstehend als "Verbindung (II)" bezeichnet. Die Umsetzung kann bei -10 bis +30 ºC in einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Aceton oder Tetrahydrofuran, durchgeführt werden.
Daraufhin wird die Verbindung (II) mit Chlorambucil umgesetzt. Die Carbonsäureeinheit von Chlorambucil kann ein Salz mit einem Metall (beispielsweise Natrium, Kalium, Silber oder Calcium), ein Säurehalogenid oder ein Säureanhydrid sein, und ferner können die Chlorambucilderivate ein Hydrochlorid davon sein. Die Umsetzung kann in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, beispielsweise Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Benzol, Aceton, Toluol, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform oder Tetrahydrofuran. Gegebenenfalls kann eine wässerige Alkalilösung zugegeben werden. Die Umsetzung kann 0,1 bis 90 Stunden, vorzugsweise 0,5 bis 75 Stunden, bei -30 bis +150 ºC, vorzugsweise 0 bis 100 ºC, durchgeführt werden. Das Reaktionsprodukt kann durch ein geeignetes Verfahren gereinigt werden, um das vorliegende Konjugat zu erhalten. Extraktion, Chromatographie, Kristallisation, Umfällen usw. können zur Reinigung eingesetzt werden.
Die Reihenfolge der vorstehenden Umsetzungsschritte kann, falls angemessen, verändert werden. Beispiele für die Veränderungen sind wie folgt:
(1) Das Chlorambucil und das Kupplungsmittel werden zuerst umgesetzt, und dann wird das 3-OR²-Estradiolderivat daran gekuppelt.
(2) Nach dem Kuppeln von Chlorambucil und 3,17-OH-Estradiolderivat über das Kupplungsmittel kann das H der 3-Hydroxylgruppe der Estradiolderivat-Einheit substituiert werden.
(3) Wenn ein oder mehr Acyloxyreste am Ring B und/oder D eingeführt werden, werden ein oder mehr Hydroxylgruppen in die gewünschte Position(en) am Ring B und/oder D eingeführt, und anschließend wird deren Veresterung durchgeführt.
Die Struktur des so erhaltenen vorliegenden Konjugats kann durch IR(Infrarot)spektrum, UV(Ultraviolett)spektrum, NMR (kernmagnetische Resonanz), Elementaranalyse, Massenspektrum usw. bestätigt werden.
Die Toxizität und pharmakologischen Aktivitäten des vorliegenden Konjugats sind wie folgt:

(1) Toxizität

Jeder der 18 Typen der vorliegenden Konjugate wurde Wistar-Ratten in einer Menge von 5000 mg/kg oral verabreicht. Über einen Zeitraum von einer Woche wurde kein Todesfall beobachtet. Deshalb ist das vorliegende Konjugat äußerst sicher. Siehe Beispiel 3.

(2) Estrogenwirkungen (Messung des Uterusgewichts)

Die Estrogenwirkungen der 18 vorliegenden Konjugate wurden untersucht. Keine oder nur geringe Estrogenwirkung wurde beobachtet. Siehe Beispiel 4.

(3) Selektive Antitumorwirkung

In den folgenden Experimenten (a) bis (f) zeigte das vorliegende Konjugat eine selektive Antitumorwirkung, die der der Vergleichssubstanz (Estradiol-Chlorambucil-Konjugat) vergleichbar oder überlegen war.

(a) Selektive Wachstumshemmwirkung bei transformierten Mäusezellen

Das vorliegende Konjugat verminderte die Überlebensrate von transformierten Mäusezellen (3T3SV-40), wohingegen es die Überlebensrate normaler Mäusezellen (3T3) nicht beeinflußte. Siehe Beispiel 5(1).

(b) Selektive Wachstumshemmwirkung bei menschlichen Krebszellen

Das vorliegende Konjugat verminderte die Überlebensrate von verschiedenen Typen menschlicher Krebszellen [menschliche Nierenkrebszellen (RC), menschliche Prostatakarzinomzellen (PC-3), menschliche Zervixkarzinomzellen (He-La)], wohingegen es die Überlebensrate normaler menschlicher Zellen (FLOW4000) nicht beeinflußte. Siehe Beispiel 5(2).

(c) Wirkung auf die Sekretion von transformierendem Wachstumsfaktor (TOF) α aus menschlichen Brustkarzinomzellen (MCF-7)

Das vorliegende Konjugat verhinderte die durch Estradiol angeregte Sekretion von TGF-α. Dies zeigt, daß das vorliegende Konjugat das Abtöten von Krebszellen bewirkt, wohingegen die Sekretion des transformierenden Krebswachstumsfaktors verhindert wird. Siehe Beispiel 6.

(d) Antitumorwirkung (intraperitoneale und orale Verabreichung)

Das vorliegende Konjugat zeigte an krebserkrankten weiblichen BDF&sub1; Mäusen, in die P388-Zellen intraperitoneal verpflanzt waren, lebensverlängernde Wirkung (makrobiotische Wirkung). Siehe Beispiel 7.

(e) Antitumorwirkung (intraarterielle Verabreichung der Injektion)

Das vorliegende Konjugat zeigte makrobiotische Wirkung an Rattentumor Walker 256. Siehe Beispiel 8.

(f) Selektive Akkumulation in Tumorgewebe, das in die Leber verpflanzt ist, und Estrogenwirkung durch intraarterielle Verabreichung in die Leber

Die Konzentration des vorliegenden Konjugats war im in die Leber verpflanzten Tumorgewebe höher als die Konzentration im normalen Lebergewebe. Das vorliegende Konjugat vergrößerte den Uterus nicht. Siehe Beispiel 9.

(4) Selektive immunsuppressive Wirkung

In den folgenden Experimenten (a) bis (d) zeigte das vorliegende Konjugat eine selektive immunsuppressive Wirkung, die der der Vergleichssubstanz (Estradiol-Chlorambucil-Konjugat) vergleichbar war.

(a) Heteroantigenstimulierende Reaktion

Das vorliegende Konjugat beeinflußte die Blastogenesereaktion der Lymphozyten auf Phythämagglutinin (PHA) nicht beträchtlich. Siehe Beispiel 10(1).

(b) Isoantigenstimulierende Reaktion

Das vorliegende Konjugat hemmte die gemischte-Lymphozytenkultur-Reaktion (MLC). Siehe Beispiel 10(2).

(c) Aktivität, um in einem Mäuse-Knochenmarkstransplantations-Modell die Graft versus host reaction (GVHR) zu hemmen

Das vorliegende Konjugat erhöhte die Überlebenstage der Mäuse nach der Transplantation. Siehe Beispiel 11.

(d) Beziehung zu TGF-β in der MLC-Reaktion

Das vorliegende Konjugat zeigte eine kombinierte Wirkung mit der immunsuppressiven Substanz (TGF-β). Die hemmende Wirkung des vorliegenden Konjugats wurde durch die Anti- TGF-β-Antikörper neutralisiert. Deshalb wird angenommen, daß der Mechanismus der hemmenden Wirkung des vorliegenden Konjugats mit TGF-β in der MLC-Reaktion in Beziehung steht. Siehe Beispiel 12.
Das vorliegende Konjugat hat selektive physiologische Aktivitäten, wie vorstehend aufgezeigt, das heißt, eine selektive Antitumor- oder immunsuppressive Wirkung, und ist deshalb als Arzneimittel nützlich, insbesondere als Antitumormittel oder Immunsuppressivum. Als Antitumormittel ist es wirksam gegen Karzinome in beispielsweise der Brust, Ovarium, Uterus, Magen, Rektum, Kolon, Niere, hämatopoetischem System, Leber oder Harnorganen, oder weiteren festen Tumoren.
Wenn das vorliegende Konjugat als Antitumormittel verwendet wird, können verschiedene Arzneimittel, die zur Verabreichung auf verschiedenen Wegen geeignet sind, mit beliebigen herkömmlichen Verfahren zubereitet werden. Als Beispiele für die Zubereitungen können orale Mittel, wie Kapseln, Sirupe, Pillen oder Tabletten, Injektionen, Externa und Suppositorien erwähnt werden. Als Beispiele für Externa kann ein festes Mittel erwähnt werden, das eine übliche Grundlage, wie weiße Vaseline, und einen Penetrationsverstärker, wie N,N-Diethanollauramid, enthält.
Das vorliegende Konjugat als Antitumormittel hat ein charakteristisches Merkmal darin, daß die Kreuztoleranz mit existierenden Medikamenten nur gering ist.
Das Arzneimittel kann das vorliegende Konjugat in einer Menge von vorzugsweise 0,01 bis 75 Gew.%, stärker bevorzugt 0,05 bis 25 Gew.% enthalten. Das vorliegende Konjugat kann oral, transdermal, intramuskulär, intravenös, intraarteriell, intrarektal usw. verabreicht werden. Die Dosierung hängt von der Verabreichungsform und dem Ausmaß der Behandlung ab, ist aber im allgemeinen wie folgt: für einen Erwachsenen beträgt die Dosierung bei oraler Verabreichung 0,1 bis 50 mg/kg pro Tag, während die Dosierung bei parenteraler Verabreichung 0,01 bis 20 mg/kg pro Tag beträgt.
Wenn das vorliegende Konjugat in einer Injektion zur intraarteriellen Verabreichung enthalten ist, wird bevorzugt, das vorliegende Konjugat in einem Ester einer iodinierten Mohnölfettsäure zu lösen. Die Konzentration des vorliegenden Konjugats in der intraarteriellen Injektion beträgt vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.%, stärker bevorzugt 1 bis 5 Gew.%. Als Ester der iodinierten Mohnölfettsäure wird ein Niederalkylester mit einem Iodinierungsgrad von 30 bis 40 Gew.% bevorzugt. Stärker bevorzugt wird Lipiodol (Handelsname der Lipiodol Ultra-fluide) (Iodinierungsgrad 38,8 Gew.%; Ethylester). Die Dosierung der intraarteriellen Injektion beträgt vorzugsweise 0,01 bis 20 mg/kg, stärker bevorzugt 0,1 bis 10 mg/kg. Die intraarterielle Injektion ist wirksam gegen Karzinome in der Leber, Brust, gynäkologischen Organen, gastromtestinalen Organen und urogenitalen Organen. Die intraarterielle Injektion akkumuliert spezifisch in Tumorgewebe und verbleibt dort lange Zeit. Ferner ermöglicht die Verwendung eines Esters einer iodinierten Mohnölfettsäure die Durchführung einer Diagnose oder medizinischen Behandlung, während die Tumorzellen durch Röntgenstrahlen, CT (Computertomographie), Ultraschallwellen usw. beobachtet werden.
Das vorliegende Konjugat ist als Immunsuppressivum bei der Organtransplantation wirksam, beispielsweise bei der Prävention und Behandlung von Abstoßungsreaktionen bei der Transplantation von Niere, Leber, Herz, Haut, Knochenmark oder ähnlichem, und ferner bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, wie verschiedene Arten von Nierenerkrankungen, Schilddrüsenerkrankungen, chronischem Gelenksrheumatismus, aplastischer Anämie, systemischem Lupus erythematodes, Myasthenia gravis, Lebererkrankungen, Polyarthritis und Dermatomyositis. Deshalb kann das vorliegende Konjugat als Präventions- oder Behandlungsmittel für die Abstoßung bei Organtransplantation und als Wirkstoff bei Autoimmunkrankheiten verwendet werden.
Wenn das vorliegende Konjugat als Immunsuppressivum verwendet wird, können verschiedene Arzneimittel, die zur Verabreichung auf verschiedenen Wegen geeignet sind, mit herkömmlichen Verfahren zubereitet werden. Als Beispiele für die Zubereitung können orale Mittel, wie Tabletten, Granulate, Dispersionen oder Kapseln, Suppositorien, Injektionen oder Externa erwähnt werden. Die Verabreichungswege und Dosierungen sind die gleichen wie bei den vorstehend erwähnten Antitumormitteln.
Wie vorstehend trägt die Estradiolderivat-Einheit im vorliegenden Konjugat einen oder mehr Substituenten zusätzlich zum 3-Substituenten, der auch in der herkömmlich bekannten Estradiolderivat-Einheit vorhanden ist. Auf Grund einer solchen Struktur ist es möglich, die Estrogenwirkung des herkömmlich bekannten Konjugats auszuschalten oder stark abzuschwächen, während die selektiven physiologischen Aktivitäten des herkömmlichen Estradiol-Chlorambucil-Konjugats beibehalten werden, nämlich die selektive Antitumorwirkung und die selektive immunsuppressive Wirkung. Deshalb ist die Nützlichkeit als Antitumormittel oder Immunsuppressivum erheblich erhöht.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun weiter veranschaulicht durch die folgenden Beispiele, ist aber keinesfalls darauf begrenzt.
In den folgenden Beispielen wurden die physikalischen Eigenschaften der Verbindung mit den folgenden Verfahren gemessen:

(1) Dünnschichtchromatographie (Kieselgel):

Kieselgeldünnschichtplatte LK6DF (Schichtdicke = 250 um; Whatman Co.)

(2) Elementaranalyse:

Yanaco CHN-CORDER MT-3 (Yanagimoto Co.)

(3) Massenspektrum:

Massenspektrometer JMS-DX303 (JOEL)

(4) NMR (CDCl&sub3;):

JNM-GSX-500 (JOEL)

(5) Fluorometrische Analyse:

Shimadzu Spectrophotofluorometer RF-540 (Shimadzu Co.)

Beispiel 1

[1] Herstellung von 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 3-benzoat, 17β-monobromacetat

Aceton (200 ml) und 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol (7,2 g) wurden in einen 4-Halskolben (500 ml) gegeben, bewegt, um es zu lösen, und anschließend wurde 1N NaOH (0,028 Mol als NaOH) dazu gegeben. Eine Lösung von Benzoylchlorid (4,2 g) in Aceton (20 ml) wurde unter Eiskühlung zur Lösung getropft. Eine viskose Substanz wurde ausgefällt. Die viskose Substanz wurde mit Chloroform (200 ml + 100 ml) extrahiert, und die organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen, dann mit Magnesiumsulfat behandelt und unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch eine hellgelbe viskose Substanz (9,9 g) erhalten wurde. Die νC=O-Absorption wurde durch ein IR-Spektrum der Substanz bestätigt. Das Produkt wurde durch Dünnschichtchromatographie entwickelt (Kieselgel; Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexanlethylacetat (5/2; Vol./Vol.)), daraufhin war der Rf des Produkts 0,27 und das Verschwinden des Rohmaterialfiecks (Rf = 0,18) wurde bestätigt.
Dann wurden das entstandene 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol,3-benzoat (9,9 g), trockenes Tetrahydrofuran (250 ml) und Pyridin (2,4 g) in einen 4-Halskolben (500 ml) gegeben, der mit einem Calciumchloridrohr versehen war, anschließend wurde eine Lösung von Bromacetylbromid (10 g) in trockenem Tetrahydrofuran (80 ml) bei -5 ºC bis -3 ºC zugetropft. Anschließend wurde das Gemisch 1 Stunde bei 0 ºC bewegt. Nachdem das Verschwinden des Rohmaterials durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurde das ausgefallene Pyridin HBr-Salz abfiltriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt [Entwicklungslösungsmittel: Chloroform/n-Hexan (2/1; Vol./Vol.)], wodurch die Titelverbindung (9,3 g) erhalten wurde. Die physikalisch-chemischen Daten waren wie folgt:
Rf: 0,70 [Cyclohexanlethylacetat (5/2; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub1;O&sub4;Br:
Berechnet (%): C: 65,77, H: 6,06, Br: 15,64
Gefunden (%): C: 66,0, H: 6,1, Br: 15,9
EI-MS: m/z 510 (Molekülionenpeak)
Die in Tabelle 1 gezeigten Zwischenprodukte wurden durch ein ähnliches Verfahren hergestellt. Tabelle 1

[2] Herstellung von 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 3-(5-dimethylaminonaphthalinsulfonat), 17-monobromacetat

Aceton (100 ml) und 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol (9 g) wurden in einen 4-Halskolben (2000 ml) gegeben und zum Lösen bewegt. NaOH (1N; 32,5 ml) wurde zugegeben, und dann wurde eine Lösung von 5-Dimethylaminonaphthalinsulfonylchlorid (Dansylchlorid: DNS-Cl) (9,2 g) in trockenem Aceton (200 ml) bei 10 bis 15 ºC dazugetropft. Das Gemisch wurde 3 Stunden bewegt. Nachdem das Ende der Umsetzung durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel; Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexanlethylacetat (5/2, Vol./Vol.)) bestätigt worden war, wurde das Aceton unter vermindertem Druck entfernt, und anschließend wurde der Rückstand mit Chloroform extrahiert (200 ml x 3). Die Chloroformphasen wurden gesammelt, über Magnesiumsulfat getrocknet und dann weiter unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch eine gelbe viskose Substanz (31,3 g) erhalten wurde. Säulenchromatographie an Kieselgel [Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)] wurde durchgeführt, wodurch 1-Methyl-estra- 1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 3-(5-dimethylaminonaphthalinsulfonat) (12 g) erhalten wurde.
Rf: 0,15 [Cyclohexan/Ethylacetat (5/2: Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub7;NO&sub4;S:
Berechnet (%): C: 71,64, H: 7,18, N: 2,70
Gefunden (%): C: 71,5, H: 7,2, N: 2,6
EI-MS: m/z 519 (Molekülionenpeak)
Fluorometrische Analyse:
Anregung: 356 nm
Emission: 520 nm
Dann wurden das entstandene 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 3-(5-dimethylaminonaphthalinsulfonat) (12 g), trockenes Tetrahydrofuran (200 ml) und Pyridin (5 g) in einen 4-Halskolben (500 ml), der mit einem Calciumchloridrohr versehen war, gegeben und bei -5 ºC bis -3 ºC bewegt. Zu der Lösung wurde eine Lösung von Bromacetylbromid (7,6 g) in trockenem Tetrahydrofuran (40 ml) zugetropft. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 0 ºC bewegt und weiter über Nacht bei Zimmertemperatur bewegt. Nachdem das Verschwinden des Rohmaterials durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurde das ausgefallene Pyridin HBr-Salz abfiltriert, und dann wurde das Filtrat mit Magnesiumsulfat behandelt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wodurch ein gelb-weißer Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel [Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)] gereinigt, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
Rf: 0,62 [Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub3;&sub3;H&sub3;&sub8;NO&sub5;SBr:
Berechnet (%): C: 61,87, H: 5,98, Br: 12,47, N: 2,19
Gefunden (%): C: 61,7, H: 5,8, Br: 13,0, N: 2,2
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ
2,90 ppm (s, CH&sub3;, DNS-N(CH&sub3;)&sub2;)
2,14 ppm (s, CH&sub3;, Ar-CH&sub3;)
0,70 ppm (s, CH&sub3;, E&sub2;-18CH&sub3;)
EI-MS: 639 (Molekülionenpeak)
Fluorometrische Analyse:
Anregung: 355 nm
Emission: 525 nm
Flammenreaktion: Halogenfärbung
In gleicher Weise wie vorstehend erwähnt wurden die in Tabelle 2 gezeigten Zwischenprodukte hergestellt. Tabelle 2
(1) Mobilität mittels Kieselgeldünnschichtchromatographie Kieselgel LK6DF (Whatman Co.)
Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexanlethylacetat (5/2; Vol./Vol.)
(2) Mobilität mittels Kieselgeldünnschichtchromatographie Kieselgel LK6DF
Entwicklungslösungsmittel: Chloroformlethylacetat (50/1; Vol./Vol.)
(3) Molekülionenpeak im Massenspektrum (EI)

[3] Herstellung von Estra-1,3,5(10)-trien-3,16α,17β-triol, 3-benzoat, 17-monobromacetat

Ein birnenförmiger Kolben (300 ml) wurde mit Estriol (5 g), Aceton (45 ml), destilliertem Wasser (150 ml) und 1N NaOH (20,6 ml) befüllt. Das Gemisch wurde zum Lösen bewegt. Die Lösung wurde auf 0 ºC abgekühlt, dann wurde eine Lösung von Benzoylchlorid (2,68 g) in Aceton (35 ml) während 1 Stunde zugetropft. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei der gleichen Temperatur und 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur bewegt, und anschließend über Nacht stehen gelassen. Die ausgefallenen Kristalle wurde abfiltriert. Die Kristalle wurden mit Ethanol (200 ml) gewaschen und anschließend in Chloroform (700 ml) gelöst. Das Einengen und Kristallisieren wurde wiederholt, wodurch weiße Kristalle (Estradiol-3-benzoat) (6,2 g) erhalten wurden.
Ein birnenförmiger Kolben (300 ml) wurde mit dem enstandenen Estradiol-3-benzoat (5,6 g), Pyridin (1,3 g) und trockenem Tetrahydrofuran (160 ml) befüllt, und das Gemisch wurde unter Kühlen bei 0 ºC bewegt. Eine Lösung von Bromacetylbromid (3,5 g) in trockenem Tetrahydrofuran (35 ml) wurde während 1 Stunde zum Gemisch zugetropft. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Gemisch weitere 1,5 Stunden bewegt und anschließend über Nacht in einem Kühlschrank (etwa 5 ºC) stehen gelassen. Das ausgefallene Pyridin HBr-Salz wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde eingeengt, wodurch eine ölige Substanz (8,4 g) erhalten wurde. Durch Dünnschichtchromatographie [Kieselgel: Cyclohexanlethylacetat (5/1; Vol./Vol.)] wurden 3 Bestandteile bestätigt. Mittels Kieselgelchromatographie (Entwicklungslösungsmittel = das gleiche wie bei der vorstehenden Dünnschichtchromatographie) wurden Verbindungen mit einem Rf von 0,71, einem Rf von 0,75 bzw. einem Rf von 0,87 in einer Menge von 1 g, 2,3 g bzw. 1 g erhalten. Die Titelverbindung war eine Verbindung mit einem Rf von 0,71.
Rf: 0,71 [Cyclohexan/Ethylacetat (5/1; Vol./Vol.)]
EI-MS: m/z 512 (Molekülionenpeak)

[4] Herstellung von Estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol-6-on, 3-benzoat, 17-monobromacetat

Estradiol (50 g), Pyridin (90 g) und trockenes Tetrahydrofuran (400 ml) wurden in einen 4-Halskolben (1 Liter) gegeben. Anschließend wurde Essigsäureanhydrid (94 g) dazugegeben, und das Gemisch wurde 6 Stunden unter Rühren refluxiert. Das Pyridin in der Lösung wurde auf etwa 1/3 des Volumens eingeengt. Anschließend wurden Ethylacetat (400 ml) und destilliertes Wasser (300 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde zwecks Extraktion geschüttelt. Die organische Phase wurde zweimal mit gleichen Volumina destillierten Wassers gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, und anschließend unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch weiße Kristalle (Estradiol-3,17β-diacetat; 64,1 g) erhalten wurden.
Das entstandene Estradiol-3,17β-diacetat (64 g), Essigsäure (740 ml) und destilliertes Wasser (160 ml) wurden in einen birnenförmigen Kolben (1 Liter) gegeben, und anschließend wurde auf einem Bad mit 30 bis 40 ºC portionsweise Chromtrioxid (53,8 g) dazugegeben Nach 3 Stunden wurde weiter Chromtrioxid (6 g) zugegeben, und dann wurde das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde in destilliertem Wasser (3 Liter) dispergiert und mit Ethylacetat (1 Liter x 3) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wässerigen Natriumhydrogencarbonatlösung (1 Liter x 6) und destilliertem Wasser (1 Liter x 2) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch eine gelbe ölige Substanz erhalten wurde. Die Substanz wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)] gereinigt, wodurch weiße Kristalle (13,1 g) erhalten wurden. Durch NMR- und IR-Spektrum wurde bestätigt, daß die Substanz Estradiol-3,17β-diol-6-on, 3,17β-diacetat war.
Das entstandene Estradiol-3,17β-diol-6-on, 3,17β-diacetat (12 g) und Methanol (350 ml) wurden in einen birnenförmigen Kolben (1 Liter) gegeben. Eine Lösung von Kaliumhydroxid (53 g) in Methanol (530 ml) wurde unter Kühlen zur Lösung gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Zimmertemperatur bewegt. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck auf etwa die Hälfte seines Volumens eingeengt, mit 2N HCl auf etwa pH 4 eingestellt und dann mit Ethylacetat (400 ml × 3) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit destilliertem Wasser (500 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch hellgelbe Kristalle (8,74 g) erhalten wurden. Durch NMR- und IR-Spektrum wurde bestätigt, daß die Verbindung Estradiol-3,17β-diol-6-on war.
Das entstandene Estradiol-3,17β-diol-6-on (2 g) wurde in Aceton (50 ml) gelöst und in einen birnenförmigen Kolben (200 ml) gegeben. Dann wurde eine NaOH-Lösung (309 mg) in Wasser (100 ml) und ferner eine Lösung von Benzoylchlorid (1,04 g) in Ethylether (10 ml) dazugegeben, und das Gemisch wurde heftig bewegt, woraufhin schnell eine weiße Substanz ausfiel. Die weiße Substanz wurde mit einem G4-Filter abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch weiße Kristalle (2,6 g) erhalten wurden. Die Kristalle (2 g) und Triethylamin (2 g) wurden in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) gelöst. Die Lösung wurde in einen Erlenmeyerkolben (100 ml) gegeben und anschließend unter Kühlen mit Eiswasser bewegt. Danach wurde eine Lösung von Bromacetylbromid (4 g) in Tetrahydrofuran (20 ml) zur Lösung zugetropft, und das Gemisch konnte 2 Stunden unter Kühlen und Rühren reagieren und wurde anschließend über Nacht in einem Kühlschrank (etwa 5 ºC) stehen gelassen. Der entstandene Niederschlag wurde mit einem G4-Filter abfiltriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch eine viskose Verbindung (3,4 g) erhalten wurde. Die viskose Verbindung wurde durch Kieselgelchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/3; Vol./Vol.)] gereinigt. Fraktionen, die bei Dünnschichtchromatographie [Kieselgel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/3; Vol./Vol.)] einen einzigen Fleck (Rf = 0,63) zeigten, wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde unter Verwendung einer geringen Menge Ethylacetat und Ethylether bei -20 ºC kristallisiert, wodurch weiße Kristalle der Titelverbindung (1,7 g) erhalten wurden.
Rf: 0,63 [Cyclohexan/Ethylacetat (5/3; Vol./Vol.)]
EI-MS: m/z 510 (Molekülionenpeak)

Beispiel 2: Konjugatherstellung

[1] Herstellung von 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol,3-benzoat,17-[[4-[4-[bis(2- chlorethyl)amino]phenyl]-1-oxobutoxy]acetat] [= vorliegendes Konjugat (I)]

Chlorambucil (7,2 g), Dimethylformamid (100 ml) und 1N NaOH (26,0 ml) wurden in einen birnenförmigen Kolben (500 ml) gegeben. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck bei 50 ºC mit einem Rotationsverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Dann wurde der Rückstand wieder in trockenem Dimethylformamid (200 ml) gelöst. Eine Lösung des in Beispiel 1 [1] erhaltenen Zwischenprodukts (9,3 g) in trockenem Dimethylformamid (100 ml) wurde dazugegeben Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Zimmertemperatur bewegt. Nachdem das Verschwinden des Rohmaterialflecks durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel) bestätigt worden war, wurde das Dimethylformamid unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Chloroform (200 ml) gelöst und einmal mit 200 ml verdünnter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat behandelt und unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch eine hellbraune ölige Substanz erhalten wurde. Der Rückstand wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt, wodurch eine farblose ölige Substanz (8,8 g) erhalten wurde, die mittels Dünnschichtchromatographie einen einzigen Fleck zeigte.
Eine Lösung der farblosen öligen Substanz (8,8 g) in Ethylacetat (20 ml) wurde portionsweise zu Isopropylakohol (1,3 Liter) gegeben, der auf einem Wasserbad bei 50 ºC bewegt wurde. Das Gemisch wurde nach und nach unter Bewegen auf 0 ºC abgekühlt und dann über Nacht in einem Kühlschrank bei -18 ºC stehen gelassen. Der entstandene weiße Kristall wurde bei tiefer Temperatur abfiltriert und mit kaltem n-Hexan (-20 ºC) gewaschen. Der Kristall wurde 1 Stunde bei 0 ºC unter vermindertem Druck getrocknet und weiter 4 Stunden bei Zimmertemperatur, wodurch weiße Kristalle (5,2 g) des vorliegenden Konjugats (I) erhalten wurden.
Rf: 0,66 [Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub4;&sub2;H&sub4;&sub9;Cl&sub2;NO&sub6;:
Berechnet (%): C: 68,65, H: 6,72, Cl: 9,65, N: 1,91
Gefunden (%): C: 68,8, H: 6,7, Cl: 9,7, N: 1,9
EI-MS: m/z 733 (Molekülionenpeak)
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ
4,56 ppm (s, CH&sub2;, COCR&sub2;O)
3,71-3,60 ppm (m, CH&sub2;, N(CH&sub2;CH&sub2;Cl)&sub2;)
2,23 ppm (s, CH&sub3;, Ar-CH&sub3;)
0,80 ppm (s, CH&sub3;, 18-CH&sub3;)
Flammenreaktion: Halogenfärbung
In gleicher Weise wie vorstehend erwähnt, wurden die in der folgenden Tabelle 3 gezeigten vorliegenden Konjugate (II) bis (XI) hergestellt. Tabelle 3
(1) Mobilität mittels Kieselgeldünnschichtchromatographie Kieselgel LK6DF (Whatman Co.)
Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)
(2) Molekülionenpeak im Massenspektrum (EI)

[2] Herstelllung von 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 3-(5-dimethylaminonaphthalinsulfonat), 17-[[4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]-1-oxobutoxy]acetat] [= vorliegendes Konjugat (XII)]

Chlorambucil (3,9 g), Dimethylformamid (100 ml) und 1N NaOH (14,1 ml) wurden in einen birnenförmigen Kolben (500 ml) gegeben. Das Gemisch wurde mit einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck bei 50 ºC auf etwa 1/3 Volumen eingeengt. Eine Lösung des in Beispiel 1 [2] hergestellten Zwischenprodukts (6,5 g) in trockenem Dimethylformamid (150 ml) wurde dazugegeben. Das Gemisch konnte 24 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren, und das Verschwinden des Rohmaterials wurde durch Dünnschichtchromatographie bestätigt. Dann wurde das Dimethylformamid unter vermindertem Druck entfernt. Ethylacetat (150 ml) wurde zum Rückstand gegeben. Das Gemisch wurde mit kaltem Wasser (100 ml x 2) gewaschen. Die Ethylacetatphase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wodurch eine gelb-braune ölige Substanz erhalten wurde. Die Substanz wurde durch Kieselgelchromatographie [Entwicklungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/1; Vol./Vol.)] gereinigt, und eine Verbindung (6,2 g), die bei Dünnschichtchromatographie einen einzigen Fleck zeigte, wurde erhalten. Das gereinigte Produkt wurde aus Isopropylalkohol/n-Hexan kristallisiert, wodurch das vorliegende Konjugat (XII) (5,1 g) erhalten wurde.
Rf: 0,52 [Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub4;&sub7;H&sub5;&sub6;Cl&sub2;N&sub2;O&sub7;S:
Berechnet (%): C: 63,96, H: 6,26, Cl: 8,23, N: 3,24
Gefunden (%): C: 64,0, H: 6,3, Cl: 8,2, N: 3,2
EI-MS: m/z 862 (Molekülionenpeak)
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ
4,59 ppm (s, CH&sub2;, COCH&sub2;O)
3,70 - 3,59 ppm (m, CH&sub2;, N(CH&sub2;CH&sub2;Cl)&sub2;)
2,90 ppm (s, CH&sub3;, DNS-N(CH&sub3;)&sub2;)
2,14 ppm (s, CH&sub3;, Ar-CH&sub3;)
0,70 ppm (s, CH&sub3;, E&sub2;-18CH&sub3;)
Flammenreaktion: Halogenfärbung
In gleicher Weise wie vorstehend erwähnt wurden die in der folgenden Tabelle 4 gezeigten vorliegenden Konjugate (XIII) bis (XVI) hergestellt. Tabelle 4
(1) Mobilität mittels Kieselgeldünnschichtchromatographie Kieselgel LK6DF (Whatman Co.)
Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)
(2) Mobilität mittels Kieselgeldünnschichtchromatographie Kieselgel LK6DF
Entwicklungslösungsmittel: Chloroform/Ethylacetat (50/1; Vol./Vol.)
(3) Molekülionenpeak im Massenspektrum (EI)

[3] Herstellung von 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 3-palmitat, 17-[[4-[4-[bis(2- chlorethyl)amino]phenyl]-1-oxobutoxy]acetat] [= vorliegendes Konjugat (XIV)]

Pyridin (1,1 g) und 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol (2 g) wurden in trockenem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und unter Kühlen auf einem Eis-Salz-Bad bewegt. Eine Lösung von Bromacetylbromid (2,8 g) in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) wurde dazugetropft. Nach der Zugabe konnte das Gemisch über Nacht in einem Kühlschrank (etwa 5 ºC) reagieren. Das entstandene Pyridin HBr-Salz wurde abfiltriert, und das Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Ethanol gewaschen, wodurch 1-Methylestra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol-3,17-dibromacetat (3,1 g) erhalten wurde. Die entstandene Verbindung wurde in Aceton (200 ml) gelöst und auf 0 ºC gekühlt. Destilliertes Wasser wurde portionsweise dazugegeben, um die Bedingung unmittelbar vor dem Ausfällen einzustellen. Dann wurde 1 N NaHCO&sub3; (0,45 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten bewegt. Das Aceton wurde unter vermindertem Druck entfernt, woraufhin weiße Kristalle ausgefällt wurden. Dünnschichtchromatographie zeigte, daß der Rohmaterialfleck geringfügig verblieb. Die Kristalle wurden abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Das Produkt wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/1; Vol./Vol.)) gereinigt, wodurch weiße Kristalle (2,5 g) erhalten wurden. Durch NMR und Elementaranalyse wurde bestätigt, daß die entstandene Verbindung 1-Methyl-estra- 1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 17-monobromacetat war.
Dann wurde ein Natriumsalz von Chlorambucil (1 g) in trockenem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst. Eine Lösung des vorstehend erwähnten 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 17-monobromacetats (1,2 g) in trockenem Tetrahydrofuran (10 ml) wurde dazugegeben, während bewegt wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten auf 40 ºC erhitzt und konnte dann weitere 24 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren. Nachdem das Verschwinden des Rohmaterials durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurde das entstandene Salz abfiltriert, und das Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck entfernt, wodurch eine viskose Substanz (2,0 g) erhalten wurde. Das Produkt wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)] gereinigt, wodurch 1-Methyl-estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 17-[[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]-1-oxoacetat] (1,5 g) erhalten wurde.
Die entstandene Verbindung (1,0 g) und trockenes Pyridin (0,25 g) wurden in trockenem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und auf 0 ºC abgekühlt, während bewegt wurde. Eine Lösung von Palmitoylchlorid (0,87 g) in trockenem Tetrahydrofuran (10 ml) wurde dazugetropft. Nach der Zugabe wurde das Gemisch 3 Stunden bei 30 ºC bewegt und konnte dann über Nacht bei Zimmertemperatur reagieren. Nachdem das Verschwinden des Rohmaterials durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurde Tetrahydrofuran unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde wieder in Ethylacetat (50 ml) gelöst, mit Wasser (25 ml x 2) gewaschen, dann wurde die Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und weiter unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Chloroform/Ethylacatat (50/1; Vol./Vol.)] gereinigt, wodurch 1,1 g des vorliegenden Konjugats (XIV) erhalten wurden.
Rf: 0,63 [Chloroform/Ethylacetat (50/1; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub5;&sub1;H&sub7;&sub5;O&sub6;Cl&sub2;:
Berechnet (%): C: 70,48, H: 8,70, Cl: 8,16, N: 1,61
Gefunden (%): C: 70,2, H: 8,8, Cl: 8,2, N: 1,6
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ
4,57 ppm (s, CH&sub2;, COCH&sub2;O)
3,77-3,53 ppm (m, CH&sub2;, N(CH&sub2;CH&sub2;Cl)&sub2;)
2,17 ppm (s, CH&sub3;, Ar-CH&sub3;)
1,5 - 1,2 ppm (m, CR&sub2;, (CH&sub2;)&sub1;&sub4;)
0,83 ppm (s, CH&sub3;, 18-CH&sub3;)
EI-MS: m/z 867 (Molekülionenpeak)
Flammenreaktion: Halogenfärbung
In gleicher Weise wie vorstehend wurden die in Tabelle 4 aufgeführten vorliegenden Konjugate (XIII), (XV) und (XVI) hergestellt.

[4] Herstellung von Estra-1,3,5(10)-trien-3,16α,17β-triol, 3-benzoat, 16α-acetat, 17-[[4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]-1-oxobutoxy]acetat] [= vorliegendes Konjugat (XVII)]

Die in Beispiel 1 [3] hergestellte Zwischenverbindung (1 g) und ein Kaliumsalz von Chlorambucil (0,65 g) wurden in Dimethylformamid (80 ml) gelöst und 24 Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt, während bewegt wurde. Die Reaktionslösung wurde auf 1/3 Volumen eingeengt, und Ethylacetat (250 ml) wurde zur eingeengten Lösung gegeben. Das Gemisch wurde mit kaltem Wasser (150 ml x 3) gewaschen, und die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und weiter unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch eine ölige Substanz (1,9 g) erhalten wurde. Der Rückstand wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)] gereinigt, und das Produkt wurde aus Isopropanol kristallisiert, wodurch eine weiße kristalline Vorstufe (0,6 g), Estra-1,3,5(10)-trien-3,16α, 17β-triol, 3-benzoat, 17-[[4-[4-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl]-1-oxobutoxy]acetat] [Vorstufe des vorliegenden Konjugats (XVII)], erhalten wurde.
Rf: 0,75 [Cyclohexanlethylacetat (5/2; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub4;&sub1;H&sub4;&sub7;Cl&sub2;NO&sub7;:
Berechnet (%): C: 66,85, H: 6,39, Cl: 9,65, N: 1,90
Gefunden (%): C: 67,0, H: 6,5, Cl: 9,7, N: 1,9
EI-MS: m/z 735 (Molekülionenpeak)
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ
4,56 ppm (s, CH&sub2;, COCH&sub2;O)
3,70-3,60 ppm (m, CH&sub2;, N(CH&sub2;CH&sub2;Cl)&sub2;)
0,81 ppm (s, CH&sub3;, 18-CH&sub3;)
Flammenreaktion: Halogenfärbung
Die Vorstufe (400 mg), trockenes Tetrahydrofuran (15 ml), trockenes Pyridin (1,5 ml) und Essigsäureanhydrid (1,5 ml) wurden in einen birnenförmigen Kolben (50 ml) gegeben. Dann wurde ein Kondensationsrohr mit Calciumchloridrohr am Kolben befestigt. Daraufhin wurde das Gemisch erhitzt und 6 Stunden bei 60 ºC bewegt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck getrocknet und der Rückstand wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat(5/2; Vol./Vol.)] gereinigt. Die entstandene ölige Substanz (0,6 g) wurde aus Ethylacetat und Isopropanol kristallisiert, wodurch weiße Kristalle des vorliegenden Konjugats (XVII) (0,32 g) erhalten wurden.
Rf: 0,45 [Cyclohexan/Ethylacetat (5/2; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub4;&sub3;H&sub4;&sub9;Cl&sub2;NO&sub9;:
Berechnet (%): C: 64,99, H: 8,94, Cl: 8,94, N: 1,76
Gefunden (%): C: 65,1, H: 9,1, Cl: 8,8, N: 1,8
EI-MS: m/z 793 (Molekülionenpeak)
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ
4,60 ppm (s, CH&sub2;, COCH&sub2;O)
3,71-3,60 ppm (m, CH&sub2;, N(CH&sub2;CH&sub2;Cl)&sub2;)
2,0 ppm (s, CH&sub3;, COCH&sub3;)
0,83 ppm (s, CH&sub3;, 18-CH&sub3;)
Flammenreaktion: Halogenfärbung

[5] Herstellung von Estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol-6-on,3-benzoat, 17-[[4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]-1-oxobutoxy]acetat] [= vorliegendes Konjugat (XVIII)]

In Beispiel 1[4] hergestelltes Estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol-6-on, 3-benzoat, 17-monobromacetat (500 mg) und ein Kaliumsalz von Chlorambucil (340 mg) wurden zu trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) gegeben und 2 Stunden bei 40 ºC bewegt. Dann konnte das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur reagieren. Das entstandene Kaliumsalz wurde mit einem 64-Filter abfiltriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde durch Kieselgelchromatographie [Entwicklungslösungsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat (50/15; Vol./Vol.)] gereinigt. Die Fraktionen, die bei Dünnschichtchromatographie mit dem gleichen Entwicklungslösungsmittel wie vorstehend einen einzigen Fleck mit Rf = 0,24 zeigten, wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und aus n-Hexan kristallisiert, wodurch das vorliegende Konjugat (XVIII) als weiße Kristalle (370 mg) erhalten wurde.
Rf: 0,24 [Cyclohexan/Ethylacetat (50/15; Vol./Vol.)]
Elementaranalyse für C&sub4;&sub1;H&sub4;&sub5;Cl&sub2;NO&sub7;:
Berechnet (%): C: 67,03,H: 6,13,Cl: 9,67,N: 1,91
Gefunden (%): C: 66,9, H: 6,4, Cl: 10,0, N: 1,9
EI-MS: m/z 733 (Molekülionenpeak)
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ
4,57 ppm (s, CH&sub2;, COCH&sub2;O)
3,70-3,59 ppm (m, CH&sub2;, N(CH&sub2;CH&sub2;Cl)&sub2;)
0,80 ppm (s, CH&sub3;, 18-CH&sub3;)
Flammenreaktion: Halogenfarbung

Beispiel 3: Toxizität

Eine Suspension des vorliegenden Konjugats (I) in einer 0,5%igen wässerigen Methylcelluloselösung wurde Wistar-Ratten (männlich; 5 Wochen alt; mittleres Gewicht = 130 g; jede Gruppe bestand aus 10 Ratten) unter Verwendung eines metallischen Magentubus in einer Menge von 5000 mg/kg einmal oral verabreicht. Die Ratten wurden nach der Verabreichung 7 Tage beobachtet, aber kein Todesfall wurde beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden ebenso für die vorliegenden Konjugate (II) bis (XVIII) erhalten.

Beispiel 4: Estrogenwirkung (Messung des Uterusgewichts)

Die Testsubstanzen wurden Wistar/slc-Ratten (weiblich; 3,5 Wochen alt) an 3 aufeinanderfolgenden Tagen (nämlich 50 mg/kg/Tag, 100 mg/kg/Tag bzw. 200 mg/kg/Tag) subkutan verabreicht. Die Hormonaktivität der vorliegenden Konjugate wurde mit der einer Vergleichssubstanz verglichen, indem die Uterusgewichte am 4. Tag gemessen wurden. Es sollte angemerkt werden, daß das vorstehende Verfahren von Koyama (Yoshihiko Koyama, Folia Endocrinologica Japonica, 37(8) (1961), 826) als ausgezeichnetes Verfahren beschrieben wurde.
Aus der Beziehung zwischen dem "Uterusgewicht/Körpergewicht"-Verhältnis am 4. Tag und der Menge der verabreichten Substanz wurden die Mengen der zu verabreichenden Substanzen berechnet, die das "Uterusgewicht/Körpergewicht"-Verhältnis auf das doppelte des Verhältnisses der Kontrollgruppen erhöhen. Wenn die vorliegenden Konjugate subkutan verabreicht wurden, wurde Sesamöl als Lösungsmittel verwendet. Ferner wurde Estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol, 3-benzoat, 17-[[4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]-1-oxobutoxy)acetat] (nachstehend als Vergleichssubstanz I bezeichnet) als Vergleichssubstanz für das Konjugat verwendet. Die Vergleichssubstanz I entspricht der Verbindung der Formel (I), in der alle R¹, R³ und R&sup5; Wasserstoffatome sind (was kein vorliegendes Konjugat ist). Ferner wurde auch Estradiol-17β für den Vergleichstest verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
Die Hormonaktivität wurde für die Vergleichssubstanz I in einem Maße von etwa 1/10 der von Estradiol-17β beobachtet. Andererseits wurde beobachtet, daß die vorliegenden Konjugate, die einen Substituenten R¹ in der 2-Position an Ring A des Estradiols und keinen Substituenten an den Ringen B, C und D tragen, abgeschwächte Hormonaktivität in einem Maße von 1/100 bis 1/500 der von Vergleichssubstanz I zeigten. Für das vorliegende Konjugat mit einem Substituenten in der 1- oder 4-Position an Ring A oder mit mehrfachen Substituenten wurde in den vorstehenden Experimenten keine Hormonaktivität beobachtet. Ferner war die Hormonaktivität des vorliegenden Konjugats, das keinen Substituenten R¹ an Ring A, aber Substituenten an Ring B oder D trigt, das heißt das vorliegende Konjugat (XVII) und (XVIII), äußerst niedrig, d. h. etwa 1/20 bis 1/5 der von Vergleichssubstanz I.

Beispiel 5: Selektive Antitumorwirkung

(1) Selektive Wachstumshemmungswirkung bei transformierten Mäusezellen (normale Mäusezellen und transformierte Zellen)

Normale Mäusezellen 3T3 und transformierte Zellen 3T3SV-40 in der logarithmischen Wachstumsphase wurden mit 0,25% Trypsin behandelt. Die Zellen wurden in Medium (MEM) mit 2 × 10&sup4; Zellen/ml dispergiert. Die Zelldispersionen wurden in Reagensgläser (Ikemoto Rika) in einer Menge von 1 ml/Glas eingebracht. Die Reagensgläser wurden mit Baumwolle gestopft und stationär in einem Kohlendioxidgasinkubator (95% Luft und 5% Kohlendioxidgas; konstante Temperatur von 37 ºC; Luftfeuchtigkeit von 95%) in einem Winkel von 5º von der Horizontalen kultiviert.
Nachdem 1 Tag nach dem Beginn der Züchtung der Zellen vergangen war, wurde das Medium entfernt, und frisches Medium (pH 7,4) wurde zugefügt. Dann wurde jede Testsubstanz, gelöst in Dimethylsulfoxid (10 ug/ml oder 50 ug/ml), zugefügt. Die Konzentration von Dimethylsulfoxid bezüglich des Mediums betrug 1%. Zu einem Kontrollreagensglas wurde lediglich Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach der Zugabe der Testsubstanzen wurden die Proben 5 Tage inkubiert. Die lebenden Zellen wurden gezählt, indem in einem Burker-Turk-Hämozytometer die nicht durch Trypanblau gefärbten Zellen gezählt wurden. Ein Mittelwert aus 3 Proben wurde für jede Konzentration der Testsubstanzen erhalten. Auf Grundlage der Kontrolle wurde die Überlebensrate (%) berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt. Es wurde beobachtet, daß die vorliegenden Konjugate die gleiche Aktivität, das Wachstum der transformierten Zellen selektiv zu hemmen, beibehielten wie die Vergleichssubstanz I. Tabelle 6

(2) Selektive Wachstumshemmungwirkung bei menschlichen Krebszellen (normale menschliche Zellen und Krebszellen)

Die Wachstumshemmungswirkung (Überlebensrate) der vorliegenden Konjugate wurde für normale menschliche Zellen (FLOW4000) und verschiedene Arten menschlicher Krebszellen [menschliche Nierenkrebszellen (RC), menschliche Prostatakarzinomzellen (PC-3) und menschliche Zervixkarzinomzellen (He-La)] bewertet.
Zellen, die in einem Kulturkolben gezüchtet wurden und in der logarithmischen Wachstumsphase waren, wurden mit 0,25% Trypsin behandelt. Die Zellen wurden in Medium mit 2 × 10&sup4; Zellen/ml dispergiert. Die Zelldispersionen wurden in Reagensgläser (Ikemoto Rika) in einer Menge von 1 ml/Glas eingebracht. Die Reagensgläser wurden mit Baumwolle gestopft und stationär in einem Kohlendioxidgasinkubator (95% Luft und 5% Kohlendioxidgas; konstante Temperatur von 37 ºC; Luftfeuchtigkeit von 95%) in einem Winkel von 5º von der Horizontalen kultiviert. Jede Testsubstanz wurde in Dimethylsulfoxid gelöst und zu den Kultursystemen zugegeben. Die Dimethylsulfoxidkonzentration war 1% bezüglich des Mediums.
Nachdem 1 Tag nach dem Beginn der Züchtung der Zellen vergangen war, wurde das Medium entfernt, und frisches Medium, das die Testsubstanzen enthielt und den in Tabelle 7 aufgeführten pH-Wert hatte, wurde zugefügt. Zu einem Kontrollreagensglas wurde lediglich Dimethylsulfoxid gegeben. Die Proben wurden nach der Zugabe der Testsubstanzen 5 Tage ihkubiert. Die Ergebnisse wurden wie in Beispiel 3(1) bewertet. Die Überlebensraten (%) der vorliegenden Konjugate für die vorstehenden Zellen ist in Tabelle 7 gezeigt. Es wurde beobachtet, daß die vorliegenden Konjugate die gleiche Aktivität, das Wachstum menschlicher Krebszellen selektiv zu hemmen, beibehielten wie die Vergleichssubstanz I. Tabelle 7

Beispiel 6: Wirkung auf die Sekretion von transformierendem Wachstumsfaktor aus menschlichen Brustkarzinomzellen

Die Wirkung des vorliegenden Konjugats (I) auf die Sekretion von transformierendem Wachstumsfaktor (TGF-α) aus einer menschlichen Brustkarzinomzelle MCF-7 wurde untersucht.
MCF-7 wurde 7 Tage in einem MEM-Medium kultiviert, das 5% DCC-NBS (mit dextranbeschichteter Aktivkohle behandeltes Serum von neugeborenen Rindern) und Estradiol (10&supmin;&sup8; M) enthielt und kein Phenolrot enthielt. Das Medium wurde an den 2. und 4. Tagen gewechselt. Am 7. Tag, nachdem die Kultivierung begonnen hatte, wurde das Medium entfernt, und ein Experimentalmedium, das 5% DCC-NBS, Estradiol (10&supmin;&sup8; M) und eine Lösung der Testsubstanz in Dimethylsulfoxid enthielt, wurde zugegeben. Am 4. Tage, nachdem die Testsubstanz zugegeben worden war, wurde das Testmedium herausgenommen und zentrifugiert (10 Minuten bei 3500 min&supmin;¹). Die überstehende Lösung wurde unter Verwendung einer SpectraPor 3-Membran (Rückhaltevermögen MG 3500, Fisher Scientific) 3 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach dem Ende der Dialyse wurde das Dialysat lyophilisiert, wodurch ein Pulver erhalten wurde. Anschließend wurde das Pulver in 1/10 Volumen PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), die 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, gelöst.
In Übereinstimmung mit Inagaki et al. (H. Inagaki et al., J. Immunol. Method. 128 (1990), 27 - 37) wurde das TGF-α unter Verwendung von Kaninchenantikörper und monoklonalem Antikörper von Mäusen (ATG-25) durch ein Sandwichenzym-verknüpftes immunabsorbierendes Verfahren (EIA) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
n = 3, Durchschnitt ± Standardabweichung
Es wurde beobachtet, daß das vorliegende Konjugat (1) in der gleichen Weise wie die Vergleichssubstanz I bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup6;M vollständig die durch 10&supmin;&sup8;M Estradiol ("E&sub2;" in der Tabelle) induzierte Produktion und Sekretion von TGF-α hemmte, aber eine äquimolare Konzentration von Chlorambucil beeinflußte die Produktion und Sekretion von TGF-α nicht.

Beispiel 7: Antitumorwirkung (intraperitoneale und orale Verabreichung)

Eine Zellsuspension, die hergestellt wurde, indem die Anzahl P388-Zellen auf 1 × 10&supmin;&sup6; Zellen/0,05 ml Hanks' Lösung eingestellt wurde, wurde intraperitoneal in eine Maus (weiblich; BDF&sub1;; 7,5 Wochen alt) verpflanzt. Eine Gruppe für jeden Test bestand aus 6 Mäusen, und eine Kontrollgruppe bestand aus 10 Mäusen.
Die Vergleichssubstanz I wurde in einer physiologischen Kochsalziösung, die 0,5% Methylcellulose enthielt, dispergiert. 50 mg/kg oder 100 mg/kg der Dispersion wurden intraperitoneal an den 1., 4., und 7. Tagen nach der vorstehendenverpflanzung des Tumors verabreicht. Ferner wurden die vorliegenden Konjugate in gleicher Weise in einer Menge (Molverhältnis) verabreicht, die 50 mg/kg oder 100 mg/kg Vergleichssubstanz I entsprach. Beim Verabreichen der vorliegenden Konjugate wurde eine Dispersion in einer pyhsiologischen Kochsalzlösung, die 0,5% Methylcellulose enthielt, verwendet, falls es möglich war, eine solche Dispersion herzustellen. Beim Verabreichen der vorliegenden Konjugate (XIII), (XIV), (XV) und (XVI), die bei Zimmertemperatur halbfest sind, wurden die Konjugate in Sesamöl gelöst, um ihre Konzentration so einzustellen, daß die Menge der Verabreichung von 10 mg/kg und 20 mg/kg Vergleichssubstanz I, die in Sesamöl gelöst oder dispergiert war, entsprach. Diese Präparate wurden den Mäusen, die den P388-Tumor trugen, an 8 aufeinanderfolgenden Tagen oral verabreicht. Aus der Zahl der Todesfälle in jeder Gruppe wurde die mittlere Überlebenszeit (MST) bestimmt und als "T" bezeichnet. In gleicher Weise wurde die MST der Kontrollgruppe (Gruppe, der lediglich physiologische Kochsalzlösung oder Sesamöl verabreicht wurde) bestimmt und als "C" bezeichnet. Aus "T" und "C" wurde T/C×100 (%) berechnet. Die Prüfung auf Überleben wurde am 45. Tag nach dem Beginn der Verabreichung der zu testenden Substanzen eingestellt.
Die Ergebnisse der intraperitonealen Verabreichung der Testsubstanzen an die Mäuse, die P388 intraperitoneal verpflanzt hatten, sind in Tabelle 9 gezeigt, und die der oralen Verabreichung in Tabelle 10. Es wurde bei beiden Verabreichungen beobachtet, daß die vorliegenden Konjugate eine lebensverlängernde (makrobiotische) Wirkung zeigen, die der der Vergleichssubstanz I vergleichbar oder überlegen ist. Ferner wurde bei den vorliegenden Konjugaten (XVII) und (XVIII) eine lebensverlängernde Wirkung beobachtet, die der der Vergleichssubstanz I überlegen war. Tabelle 9 Tabelle 10
Beispiel 8: Antitumorwirkung (intraarterielle Verabreichung einer Injektion) Walker-256 Karzinosarkom (feste Form, etwa 3 mm × 3 mm × 3 mm) wurde hergestellt und subkutan mit einer Verpflanzungsnadel in den linken Oberarm und den linken Oberschenkel von Wistar-Ratten (6 Wochen alt, weiblich; 5 Ratten je Gruppe) verpflanzt. Am 8. oder 9. Tag nach der Verpflanzung wurden die Testsubstanzen (0,1 ml/Körper) über einen Katheter in der rechten Femoralarterle injiziert. Die Testsubstanzen wurden in Lipiodol (6,5 g) gelöst oder dispergiert, um Injektionszubereitungen zu bilden.
Die mittlere Überlebenszeit (MST) und die Lebensverlängerungsrate (T/C) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 7 berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Adriamycm war in Lipiodol unlöslich und schwer für lange Zeit im Tumorgewebe zu behalten, und zeigte demzufolge die Wirkung nicht ausreichend. Das vorliegende Konjugat (I) wurde ebenso ausreichend wie die Vergleichssubstanz 1 gelöst, und zeigte eine anhaltende und ausreichende Wirkung. Tabelle 11

Beispiel 9: Selektive Akkumulation in Tumorgewebe, das in die Leber verpflanzt ist, und Estrogenwirkung durch intraarterielle Verabreichung in die Leber

Das gleiche Walker 256 Karzinosarkom (fester Tumor) wie das in Beispiel 8 verwendete wurde in die Leber von Wistar-Ratten verpflanzt, und die in Tabellen 12 und 13 aufgeführten Reagentien A bis E (0,05 ml/Körper) wurden in die Leberarterie injiziert. Am 7. Tag nach der Injektion wurde eine Blutprobe von jeder Ratte gesammelt, und die Mengen an GOT (Glutamin-Oxalessigsäure-Transaminase) und GPT (Glutamin-Brenztraubensäure-Transaminase) wurden bestimmt. Ferner wurden die Lebern aus den Ratten herausgeschnitten, und die Konzentrationen der Reagentien im Tumor- und normalen Gewebe im Lebergwebe wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 12 und 13 gezeigt. Tabelle 12
Mittelwert ± Standardabweichung Tabelle 13
(1) A: Injektion, hergestellt durch Auflösen von 10 mg Adria mycin in 0,5 ml Urografin, Zugehen von 1,5 ml Lipiodol und Emulgieren durch Ultraschallwellen.
B: Injektion, hergestellt durch Auflösen von 10 mg vorliegendem Konjugat (I) in 2 ml Lipiodol.
C: Injektion, hergestellt durch Auflösen von Vergleichssubstanz I (10 mg) in 2 ml Lipiodol.
D: Injektion, hergestellt durch Auflösen von 10 mg vorliegendem Konjugat (I) in 2 ml Sesamöl.
E: Injektion, hergestellt durch Auflösen von Vergleichssubstanz I (10 mg) in 2 ml Sesamöl.
(2) Konzentration der Testsubstanz in Tumorgewebe im Lebergewebe (ug/g nasses Gewebe)
(3) Konzentration der Testsubstanz in normalem Lebergewebe (ug/g nasses Gewebe)
(4) Verhältnis des Uterusgewichts der Gruppe, der das Medikament verabreicht wurde, zu dem der Kontrollgruppe, der lediglich Lipiodol intraarteriell injiziert wurde, d.h. das Uterusgewicht der Kontrollgruppe ist 1.
(5) Nicht detektiert
(6) Werte sind Mittelwert ± Standardabweichung
Wenn das vorliegende Konjugat (I) in Form der Lipiodol-Injektion [Zubereitung (B)] verabreicht wurde, war dessen Konzentration im Tumorgewebe höher als im normalen Lebergewebe. Das Ergebnis war ähnlich dem Ergebnis, das bei der Lipiodol-Injektion der Vergleichssubstanz I [Zubereitung (C)) beobachtet wurde. Wenn die Adriamycin-Injektion [Zubereitung (A)) verwendet wurde, wurde kein verbleibendes Reagens gefunden. Wenn die Sesamöl-Injektionen [Zubereitungen (D) und (E)] verwendet wurden, wurde kein Unterschied zwischen den Konzentrationen der Testsubstanzen im normalen Lebergewebe und denen im Tumorgewebe beobachtet. Hinsichtlich des Einflußes auf Uterusgewichte wurde eine geringe uterotrophe Wirkung der Vergleichssubstanz I beobachtet, wohingegen keine uterotrophe Wirkung des vorliegenden Konjugats beobachtet wurde.

Beispiel 10: Immunsuppressive Wirkung

(1) Heteroantigenstimulierende Reaktion [Wirkung des vorliegenden Konjugats (I) auf die Mitogenreaktion]

Das vorliegende Beispiel untersucht die Wirkung des vorliegenden Konjugats (I) auf die Blastogenesereaktion von Lymphozyten, die für Heteroantigen-Stimulierung verantwortlich sind (gemessen über die Aufnahme von ³H-Thymidin in die Zellen), das heißt, die Immunreaktion, die für Bakterien oder ähnliches verantwortlich ist. Als Mitogen wurde Phythämagglutinin (PHA) verwendet, da es die stärkste Reaktion auf menschliche Lymphozyten (insbesondere T-Zellen) zeigt.
Peripheres venöses Blut wurde von einer gesunden männlichen Person in ein Vakuumblutsammelrohr gesammelt und zentrifugiert (2000 min&supmin;¹, Raumtemperatur, 20 Minuten). Das Serum wurde weiter zentrifugiert (3500 min&supmin;¹, 4 ºC, 20 Minuten) und die entstandene überstehende Lösung wurde zu einem Medium (RPMI 1640) gegeben, sodaß die Konzentration der überstehenden Lösung 20% betrug. Der durch Entfernen des vorstehenden Serums erhaltene Rückstand wurde mit der gleichen Menge des gleichen Mediums wie vorstehend verdünnt, und das Gemisch wurde vorsichtig über einen Lymphoprep gelegt. Das Ganze wurde zentrifugiert (1500 min&supmin;¹, 20 ºC, 30 Minuten). Die Monozytenschicht wurde entfernt und zwei- oder dreimal mit dem Medium gewaschen, und dann wurde die Zellkonzentration auf 5 × 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.
Die entstandene Flüssigkeit mit flötierenden Zellen wurde auf eine U-Bodenmikroplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 200 ul/Vertiefung gegeben. Das vorliegende Konjugat (I) bzw. Vergleichssubstanz I wurden in Dimethylsulfoxid gelöst und zur flüssigkeit mit fiötierenden Zellen in einer Menge von 0,5% bezogen auf die Konzentration von Dimethylsulfoxid zugegeben. Bei der Kontrollgruppe wurde nur Dimethylsulfoxid zugegeben. Der Test wurde für jede Gruppe dreifach durchgeführt. Zu jeder Vertiefung wurde PHA in einer Menge von 10 ug/ml zugegeben. Nach 2 Tagen Inkubation in einem Kohlendioxidgasinkubator wurde ³H-Thymidin in einer Menge von 1 uCi/Vertiefung zugegeben. Nach Kultivieren für weitere 18 Stunden wurden die Zellen auf einem Glasfilter mit einem Zellernter geerntet. Die Radioaktivität wurde mit einem flüssigkeitenszintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt. Das vorliegende Konjugat (I) und die Vergleichssubstanz 1 beeinträchtigten die Blastogenesereaktion der Lymphozyten, die für die Heteroantigen-Stimulierung verantwortlich sind, nicht stark.

(2) Isoantigenstimulierende Reaktion [Wirkung des vorliegenden Konjugats (I) auf gemischte Lymphozytehkultur (MLC)]

Die Aktivität des vorliegenden Konjugats (I) in einer gemischten Lymphozytenkultur, eine sogenannte isoantigenstimulierende Reaktion, wurde als Modell der Immunreaktion bei der Organverpflanzung untersucht.
Von jeweils 2 gesunden männlichen Personen wurden Monozyten in der gleichen Weise wie bei den vorstehenden PHA-Reaktionen erhalten. Die von einer der beiden Personen erhaltenen Zellen wurden mit 15 Gy Strahlung behandelt. Nachdem die Zellen mit Kulturmedium gewaschen worden waren, wurde die Zellenanzahl auf 5 × 10&sup5; Zellen/ml eingestellt. Jeweils 100 ul der beiden Zelltypen wurde in jeweils die gleiche Vertiefung einer Mikroplatte gegossen, d. h. 200 ul insgesamt. In gleicher Weise wie bei den vorstehenden PHA-Reaktionen wurden das vorliegende Konjugat (I) bzw. die Vergleichssubstanz 1 in Dimethylsulfoxid gelöst und zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 6 Tagen Inkubation wurde ³H-Thymidin (1 uCi/ml) zugegeben. Nach Inkubation für weitere 18 Stunden wurden die Zellen auf einem Glasfilter mit einem Zellernter geerntet. Die Radioaktivität wurde mit einem Flüssigkeitenszintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt. Es wurde beobachtet, daß das vorliegende Konjugat (I) die MLC-Reaktion in gleicher Weise wie die Vergleichssubstanz I hemmte. Tabelle 14
* Prozentsatz der Aufnahme von ³H-Thymidin in Lymphozyten: relativer Prozentsatz, wenn der Wert für die Kontrolle 100 beträgt.

Beispiel 11: GVHR-Hemmwirkung im Knochenmarkstransplantationsmodell an Mäusen

Das vorliegende Beispiel untersuchte die GVHR(graft versus host reaction)-Hemmwirkung des vorliegenden Konjugats in einem Knochenmarkstransplantationsmodell, wobei 8 Wochen alte männliche C3H/He-Mäuse und männliche B6C3F1-Mäuse eingesetzt wurden.
Aus den Milzen der C3H/He-Mäuse wurden mit einem Metalisieb Milzzellen erhalten und zu RPMI 1640 gegeben, das 10% FBS (fötales Rinderserum) enthielt. Aus dem Femur der gleichen Mäuse wurden mit einer Spritze Knochenmarkszellen herausgewaschen und zu einem RPMI 1640-Medium gegeben. Nachdem die frei schwebenden Zellen jeweils zwei- oder dreimal gewaschen worden waren, wurde die Zellkonzentration auf 8 × 10&sup6; Zellen/ml eingestellt. Diese wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, und dann wurde 0,5 ml des Gemischs den B6C3F1- Mäusen in die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse waren mit 9 Gy Strahlung vorbehandelt worden. Beginnend mit dem Tag vor der vorstehenden Transplantation, ausgenommen den Tag der Transplantation, bis zum 30. Tag nach der Transplantation wurde das vorliegende Konjugat (I) oder die Vergleichssubstanz I jeden Tag in einer Menge von 2 mg/kg in Form einer Dispersion in physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Methylcellulose oral verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde lediglich 0,5% Methylcellulose in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht. Das Überleben der Mäuse wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt. Tabelle 15
(1): mg/kg/Tag.
(2): Tage
Im Kontrolltest betrug der Mittelwert der Überlebenstage gerade einmal 8 Tage. Man nimmt an, daß die frühen Todesfälle durch das Auftreten von GVHD (graft versus host disease) verursacht werden. Andererseits wurde beim vorliegenden Konjugat (I), wie bei der Vergleichssubstanz I, eine klare Verbesserung der Überlebensrate im Mäuseknochenmarkstransplantationsmodell beobachtet.

Beispiel 12: Beziehung zu TGF-β bei der Hemmwirkung in MLC-Reaktionen

Um den Mechanismus der selektiven Hemmaktivität des vorliegenden Konjugats (1) in der MLC-Reaktion aufzuklären, wurde eine Lösung hergestellt, indem TGF-β (R&D Systems) und Anti-TGF-β-Antikörper (R&D Systems) in RPMI 1640 gelöst wurden, und wurde unter den gleichen experimentellen Bedingungen wie in Beispiel 10(2) zugegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt. Tabelle 16
(1) Prozentsatz der Aufnahme von ³H-Thymidin in Lymphozyten: Kontrolle = 100. n = 3, Mittelwert ± Standardabweichung
(2) "Konjugate" bezeichnet das vorliegende Konjugat oder die Vergleichssubstanz.
Es wurde beobachtet, daß das vorliegende Konjugat die MLC-Reaktion in vergleichbarer Weise hemmte, wie mit der immunsuppressiven Substanz (TGF-β) beobachtet, und ferner mit dem TGF-β eine kombinierte Wirkung zeigte. Der Anti-TGF-β-Antikörper beeinträchtigte die MLC-Reaktion nicht. Die Kombination aus dem vorliegenden Konjugat (I) und dem Anti- TGF-β-Antikörper neutralisierte im wesentlichen die Hemmwirkung der MLC-Reaktion, die durch die alleinige Verwendung des vorliegenden Konjugats (I) erhalten wurde. Das vorstehende Verhalten des vorliegenden Konjugats ist ähnlich dem von Vergleichssubstanz I. Deshalb wird angenommen, daß der Mechanismus der Hemmwirkung der vorliegenden Konjugate mit TGF-β in der MLC-Reaktion in Beziehung steht.

Zubereitungsbeispiel 1: Tablette

Vorliegendes Konjugat (I) 30 Teile
Mannit 35 Teile
Sorbit 25 Teile
Carboxymethylcellulose 5 Teile
Magnesiumstearat 5 Teile
Talkum 40 Teile
Die vorstehenden Bestandteile wurden gründlich gemischt, und das Gemisch wurde gepresst, um Tabletten mit einem Durchmesser von 10 mm zu formen.

Zubereitungsbeispiel 2: Injektion

Das vorliegende Konjugat (I) (100 mg) wurde bei 25 ºC zu Lipiodol (6,5 g) gegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt, wodurch eine Lösung als ein Injektionsmedium des vorliegenden Konjugats (I) erhalten wurde. Die Lösung wurde in sterilisierte Glasampullen gefüllt.

Zubereitungsbeispiel 3: Kapsel

Das in Zubereitungsbeispiel 1 hergestellte Gemisch wurde eingefüllt und versiegelt in einer Nr. 0 Kapsel, wodurch eine Kapsel erhalten wurde.

Zubereitungsbeispiel 4: Externum

Das vorliegende Konjugat (I) (1 g), Sesamöl (10 g), weiße Vaseline (90 g) und N,N-Diethanollauramid (Durchdringungsförderer: 10 g) wurden in einem Wasserbad erhitzt, um zu schmelzen, und gemischt. Das Gemisch wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt, wodurch ein Externum erhalten wurde.

Zubereitungsbeispiel 5: Suppositorium

Das vorliegende Konjugat (I) (100 mg), Sesamöl (5 g) und Witepsol (90 g) wurden in einem Wasserbad erhitzt, um zu schmelzen, und gemischt. 1,33 g des geschmolzenen Gemischs wurden in einen Kunststoffsuppositoriumsbehälter gefüllt und auf Zimmertemperatur abgekühlt, wodurch ein Suppositorium erhalten wurde.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezug auf spezifische Beispiele beschrieben wurde, werden verschiedene Änderungen und Modifikationen, die für Fachleute offensichtlich sind, als innerhalb des Geistes, Umfangs und Konzepts der Erfindung betrachtet.

Claims

1. Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat der Formel (I):

in der R¹ ein Alkyl- oder Alkoxylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist; R² ein Acyl-, Dansyl- oder Alkylrest ist; R³ und R&sup5; unabhängig voneinander H, eine Oxogruppe, OH oder ein Acyloxyrest sind; m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist; und die Konfiguration jedes der Substituenten R³ und R&sup5; und die Konfiguration des Sauerstoffatoms in der 17-Position der Estradiolderivat-Einheit unabhangig voneinander die β-Konfiguration oder die α-Konfiguration sind; mit der Maßgabe, daß R³ und R&sup5; nicht gleichzeitig H sind, wenn n 0 ist, und wenigstens eines von R³ und R&sup5; eine von H oder OH verschiedene Gruppe ist; und ferner daß die Reste R¹ gleich oder verschieden sind, wenn n 2 oder 3 ist.

2. Konjugat nach Anspruch 1, in dem das Sauerstoffatom in der 17-Position des Estradiolderivats in der β-Konfiguration ist.

3. Konjugat nach Anspruch 1, in dem R² eine Benzoyl-, Acetyl-, Palmitoyl-, Stearoyl- oder Linolenoylgruppe oder ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.

4. Konjugat nach Anspruch 1, in dem R³ oder R&sup5; ein Acyloxyrest, gewählt aus der Gruppe Benzoyloxy-, Acetoxy-, Propanoyloxy-, Butanoyloxy- und Pentanoyloxygruppe, ist.

5. Verbindung der Formel (IIa):

in der R¹ ein Alkyl- oder Alkoxylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist; R ein Acyloder Dansylrest ist; R³ und R&sup5; unabhängig voneinander H, eine Oxogruppe, OH oder ein Acyloxyrest sind; m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist; X ein Halogenatom, OH oder ein Salz davon ist; und die Konfiguration jedes der Substituenten R³ und R&sup5; und die Konfiguration des Sauerstoffatoms in der 17-Position der Estradiolderivat-Einheit unabhingig voneinander die β-Konfiguration oder die α-Konfiguration sind; mit der Maßgabe, daß R³ und R&sup5; nicht gleichzeitig H sind, wenn n 0 ist, und wenigstens eines von R³ und R&sup5; eine von H oder OH verschiedene Gruppe ist; und ferner daß die Reste R¹ gleich oder verschieden sind, wenn n 2 oder 3 ist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, in der das Sauerstoffatom in der 17-Position des Estradiolderivats in der β-Konfiguration ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugats der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, gekennzeichnet durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (II):

in der R¹, R², R³, R&sup5;, mund n die gleichen Bedeutungen haben wie in Anspruch 1 definiert, und X ein Halogenatom, OH oder ein Salz davon ist; mit einem Salz, Säurehalogenid oder Säureanhydrid von Chlorambucil.

8. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

9. Verwendung eines Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugats der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Antitumormittel.

10. Mittel nach Anspruch 8, in der das Konjugat in einer Menge enthalten ist, die wirksam ist, um einen Tumor zu behandeln.

11. Verwendung eines Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugats der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Immunsuppressivum.

12. Mittel nach Anspruch 8, in der das Konjugat in einer Menge enthalten ist, die wirksam ist, um eine Immunantwort eines Patienten zu unterdrücken.

13. Mittel nach Anspruch 8 in Form einer Injektion, einer Kapsel, einer Tablette, eines Suppositoriums oder zur äußeren Anwendung.

14. Injizierbares Mittel nach Anspruch 13, umfassend das Estradiolderivat-Chlorambucil-Konjugat nach Anspruch 1 gelöst in einem Ester einer iodinierten Mohnölfettsäure.