JPH05339285A - 新規なエストラジオール誘導体−クロラムブチル結合体、その製造方法、及び医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数である
が、但し、ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時
に水素原子になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５
が水素原子と水酸基だけからなることはないものとし、
そしてｎが２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１が同一又
は異なっていてもよいものとする）の新規なエストラジ
オール誘導体−クロラムブチル結合体、その製造方法、
及び医薬製剤。 【効果】 従来の結合体が有する選択的生理活性作用を
維持しながら、エストロゲン作用を消滅ないし極微弱に
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なエストラジオー
ル誘導体−クロラムブチル結合体に関する。詳しくは、
エストラジオール誘導体とクロラムブチルとを化学的に
結合してなる結合体、その製造方法、及びその結合体を
含有する医薬製剤に係わる。

【０００２】

【従来の技術】従来の抗腫瘍剤の中には、強力な抗腫瘍
作用を有するものであっても、その薬効を十分に発揮し
ていないものが多い。その主たる理由は、副作用のため
に投与量が制限されることにある。解決手段の一つとし
て、腫瘍部位に対して特異的親和性を有する担体物質に
抗腫瘍剤を結合させ、抗腫瘍剤−担体結合体を形成する
方法がある。こうして、抗腫瘍剤を腫瘍部位に特異的に
集積させ、副作用を抑制しながら抗腫瘍作用を効果的に
発揮させようとするものである。この考え方に基づい
て、既にエストラジオール−クロラムブチル結合体及び
それを主成分とする抗腫瘍剤が提案されている（特公昭
５８−１０３９７号公報）。この抗腫瘍剤は、腫瘍部位
に特異的に集積し、強い抗腫瘍効果を発揮する。しかも
正常細胞に対する影響は、極めて少ない。最近、このエ
ストラジオール−クロラムブチル結合体は、不可逆的あ
るいは非常に長期間にわたってＭＣＦ−７（エストロゲ
ンにより増殖が促進されるヒト由来乳癌細胞）のエスト
ロゲンによる増殖促進作用を抑制するということが報告
された（Hiroshi Kosano et al.,CANCER RESEARCH 52,
1187-1191,1992) 。これは、エストロゲンレセプターの
減少がエストロゲン感受性を消失させ、トランスフォー
ミング成長因子（Transforming growth factor；ＴＧ
Ｆ）−αの分泌を抑制し、細胞の増殖を抑制するためと
考えられている。また、エストロゲンレセプターに対す
る作用及びＴＧＦ−αの分泌を抑制する作用にはこの結
合体の構造が必要であり、結合体の分解生成物であるク
ロラムブチルによって引き起こされるものではないと考
えられている。更に、このエストラジオール−クロラム
ブチル結合体をヨード化ケシ油脂肪酸エステルに溶解し
て調製した注射剤（特開昭６４−２６５９５号公報）も
提供されている。この注射剤によると、前記結合体が腫
瘍部位に長時間滞留することが可能で、薬効が十分に発
揮される。また、この結合体が同種抗原特異的免疫反応
を選択的に抑制するという、ユニークな免疫抑制剤とな
ることも見出されている（特開昭６３−１２２６２５号
公報）。このように、前記のエストラジオール−クロラ
ムブチル結合体は、選択的な抗腫瘍作用、免疫抑制作用
等の、選択的生理活性作用を有する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、抗腫瘍
剤は長期投与されるため、短期投与では問題にならない
ほどの微弱な副作用であっても、それらが集積されて無
視できない問題になることがある。特に癌患者の体力は
衰えているので、微弱な副作用の集積が強調されること
になる。前記結合体における、こうした問題の一つは、
このエストラジオール−クロラムブチル結合体から体内
で遊離する微量のエストロゲンによる作用である。例え
ば、前記結合体の長期投与により、微量の遊離エストロ
ゲンが集積し、女性化乳房、乳房腫脹、乳頭痛、性器出
血等の副作用を起こすことがある。前記の結合体注射剤
や免疫抑制剤等においても、こうしたエストロゲン作用
が問題となる。本発明者は、この課題を解決すべく鋭意
研究した結果、エストラジオール環に特定の置換基を導
入することにより、前記のエストラジオール−クロラム
ブチル結合体が有する選択的生理活性作用、即ち、選択
的な抗腫瘍作用及び免疫抑制作用等を維持しながら、前
記のエストロゲン作用を消滅ないし軽減した、有用性の
極めて高い、改良された新規なエストラジオール誘導体
−クロラムブチル結合体を見出した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、一般
式（Ｉ）：

【化４】 のエストラジオール誘導体−クロラムブチル結合体に関
する。また、本発明は、そのエストラジオール誘導体−
クロラムブチル結合体の製造方法、及びそのエストラジ
オール誘導体−クロラムブチル結合体を含有する医薬製
剤にも関する。

【０００５】本発明のエストラジオール誘導体−クロラ
ムブチル結合体（以下、本結合体と称する）の構成成分
であるエストラジオール誘導体部分の化学構造上の特徴
は次のとおりである。即ち、エストラジオールのＡ環の
３位置換基ＯＲ² の他に、エストラジオールのＡ環の１
位、２位若しくは４位、又はＢ環、Ｃ環若しくはＤ環の
いずれかの位置に１個以上の置換基が存在する。Ａ環の
基Ｒ¹ 、Ｂ環の基Ｒ³ （水素原子以外）、Ｃ環の基Ｒ⁴
（水素原子以外）及びＤ環の基Ｒ⁵ （水素原子以外）の
いずれの置換基が存在してもエストロゲン作用の消失な
いし低下効果が現れるが、Ａ環の１位、２位及び／又は
４位に基Ｒ¹ が存在するのが好ましい。Ａ環の１位、２
位及び／又は４位に置換基Ｒ¹ が存在する場合、その置
換基Ｒ¹ は炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４
のアルコキシ基である。置換基Ｒ¹ は、好ましくは１位
及び／又は４位に存在する。Ｂ環、Ｃ環及び／又はＤ環
に置換基が存在する場合は、ケトン基、水酸基又はアシ
ルオキシ基のいずれか１個がいずれか１個の環に存在す
るか、又は、同じか又は異なる２個又は３個の基が異な
る環にそれぞれ１個ずつ存在する。ケトン基又はアシル
オキシ基が好ましい。アシルオキシ基は好ましくは炭素
数２〜７のアシルオキシ基、例えば、ベンゾイルオキシ
基、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイル
オキシ基、又はペンタノイルオキシ基である。

【０００６】本結合体のエストラジオール誘導体部分の
３位置換基は、エストラジオールの３位水酸基の水素原
子をアシル基又はアルキル基で置換した構造に相当す
る。アシル基としての基Ｒ² は、好ましくは炭素数２〜
１８のアシルオキシ基、例えば、ベンゾイル基、ダンシ
ル基（５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル基）、
アセチル基、パルミトイル基、ステアリル基及びリノレ
イル基等である。また、アルキル基としての基Ｒ² は、
好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、より好ましく
は、メチル基、エチル基又はプロピル基である。また、
エストラジオール誘導体部分の１７位配座は、β配座、
α配座又はその混合物であってもよいが、β配座が好ま
しい。

【０００７】本結合体は、例えば以下の方法によって調
製することができる。本結合体を構成するエストラジオ
ール誘導体部分の骨格をなし、エストラジオールのＡ環
の３位及びＤ環の１７位がそれぞれ水酸基であるエスト
ラジオール誘導体（即ち、Ａ環の１位、２位若しくは４
位に置換基Ｒ¹ が存在し、及び／又はＢ環、Ｃ環及び／
又はＤ環のいずれかの位置にそれぞれ水素原子以外の置
換基Ｒ³ 、Ｒ⁴ 及び／又はＲ⁵ が存在するエストラジオ
ール誘導体（以下、単に３，１７−ＯＨエストラジオー
ル誘導体と称する）の３位水酸基の水素原子をアシル基
Ｒ² で置換してエステルとする場合は、３，１７−ＯＨ
エストラジオール誘導体を有機溶媒に溶解した後にアル
カリ金属と反応させて塩とし、次に、目的のアシル基に
対応する酸クロライド又は酸無水物を反応させる。他の
方法として、アセトンと水の混合溶媒にアルカリ金属を
溶解し、３，１７−ＯＨエストラジオール誘導体を加
え、目的のアシル基に対応する酸クロライド又は酸無水
物を反応させる。アシル基がダンシル基である場合は、
酸クロライドとしてダンシルクロライド〔５−（ジメチ
ルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルクロライド〕を
用いる。３，１７−ＯＨエストラジオール誘導体の３位
水酸基の水素原子をアルキル基Ｒ² で置換してアルキル
エーテルとする場合は、通常のアルキルエーテル化法を
応用することができる。例えば、ジメチル硫酸等のジア
ルキル硫酸と稀アルカリとを、エストラジオール誘導体
に反応させる。こうして、Ａ環の３位がＯＲ² 基で置換
された一般式（III)：

【化５】 のエストラジオール誘導体（以下、３−ＯＲ² エストラ
ジオール誘導体と称する）が得られる。

【０００８】３−ＯＲ² エストラジオール誘導体とクロ
ラムブチルとの結合は、導入結合剤を用いて行うことが
できる。導入結合剤は、一般式（IV）：

【化６】 Ｘ（ＣＨ₂ ) _m ＣＯＹ （IV） 〔式中、Ｘはハロゲン原子（例えば、塩素原子又は臭素
原子）であるか又は水酸基であり、ＹはＸと同じか又は
異なるハロゲン原子（例えば、塩素原子又は臭素原子）
であるか又は水酸基若しくはその塩であり、ｍは１〜３
の整数である〕のヒドロキシル化カルボン酸誘導体もし
くはハロゲン化カルボン酸誘導体、例えば、モノクロロ
酢酸、モノブロモ酢酸、β−モノクロロプロピオン酸、
β−モノブロモプロピオン酸、モノクロロアセチルクロ
ライド、モノブロモアセチルブロマイドである。３−Ｏ
Ｒ² エストラジオール誘導体と前記導入結合剤とを反応
させて、１７位水酸基をエステル化し、一般式（II）：

【化７】 の化合物〔以下、化合物（II）と称する〕を得ることが
できる。この反応は、ジメチルスルホキシド、ジメチル
ホルムアミド、ピリジン、アセトン、テトラヒドロフラ
ン等の有機溶媒中で、−１０〜＋３０℃で行うことがで
きる。

【０００９】次に、この化合物（II）とクロラムブチル
とを反応させる。クロラムブチルのカルボン酸は金属
（例えば、ナトリウム、カリウム、銀又はカルシウム）
塩、又は酸ハライドあるいは酸無水物であってもよく、
更にその塩酸塩であってもよい。反応は、ジメチルスル
ホキシド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ベンゼ
ン、アセトン、トルエン、四塩化炭素、クロロホルム、
テトラヒドロフラン等の有機溶媒中で行うことができ
る。必要に応じて、アルカリ水溶液を加える。反応は、
−３０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１００℃で、０．
１〜９０時間、好ましくは０．５〜７５時間行うことが
できる。反応生成物を常法により精製して、本結合体を
得ることができる。精製法としては、抽出、クロマトグ
ラフィー、結晶化、再沈殿等を利用することができる。

【００１０】前記の反応の順序は適宜変更することがで
き、それらの変更例を挙げれば以下のとおりである。 （１）クロラムブチルと導入結合剤とを先に結合させ、
次に３−ＯＲ² エストラジオール誘導体を結合させる。 （２）クロラムブチルと３，１７−ＯＨエストラジオー
ル誘導体とを導入結合剤を介して結合した後に、エスト
ラジオール誘導体部分の３位水酸基の水素原子を置換し
てもよい。 （３）Ｂ環、Ｃ環及び／又はＤ環にアシルオキシ基を導
入する場合、先ずＢ環、Ｃ環及び／又はＤ環の相当する
部位に水酸基を導入してからエステル化してもよい。 こうして得られる本結合体の構造は、赤外線吸収スペク
トル、紫外線吸収スペクトル、核磁気共鳴吸収スペクト
ル、元素分析、質量スペクトル等により確認することが
できる。

【００１１】本結合体の毒性及び薬理作用は次のとおり
である。 （１）毒性：本結合体の代表例として１９種の結合体
を、Ｗｉｓｔａｒ系ラットに５０００mg／kgの量で経口
投与して１週間観察したが、死亡例はなかった。即ち、
本結合体は、極めて安全な化合物である（後記実施例３
参照）。 （２）エストロゲン作用（子宮重量法）：本結合体の代
表例として１９種の結合体についてエストロゲン作用を
調べたが、エストロゲン作用は全く認められないか、あ
るいは極めて微小の作用しか認められなかった（後記実
施例４参照）。

【００１２】（３）選択的抗腫瘍作用：以下の試験
（Ａ）〜（Ｆ）において、本結合体は、比較物質（エス
トラジオール−クロラムブチル結合体）と同等か、又は
より優れた選択的抗腫瘍作用を示した。 （Ａ）選択的増殖抑制作用：本結合体は、マウス正常細
胞（３Ｔ３）の生存率に関して悪影響が少ないのに対
し、マウス悪性細胞（３Ｔ３ＳＶ−４０）の生存率を大
いに低下させた〔後記実施例５（１）参照〕。 （Ｂ）選択的増殖抑制作用：本結合体は、ヒト正常細胞
（ＦＬＯＷ４０００）の生存率に関して悪影響が少ない
のに対し、各種のヒト癌細胞〔ヒト腎癌（ＲＣ）細胞、
ヒト前立腺癌（ＰＣ−３）細胞、又はヒト子宮頸癌（Ｈ
ｅＬａ）細胞〕の生存率を大いに低下させた〔後記実施
例５（２）参照〕。 （Ｃ）ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）の増殖因子（ＴＧ
Ｆ）−α分泌抑制作用：本結合体は、エストラジオール
によって誘導されるＴＧＦ−αの分泌を抑制した。本結
合体が、癌増殖因子を抑制しながら癌細胞を殺す作用を
有することを示した（後記実施例６参照）。 （Ｄ）抗腫瘍効果（腹腔内投与及び経口投与）：本結合
体は、Ｐ３８８細胞を腹腔内に移植された担癌ＢＤＦ₁
雌マウスに対して、延命効果を示した（後記実施例７参
照）。 （Ｅ）抗腫瘍効果（注射剤の動脈内投与）：本結合体
は、ラット腫瘍Ｗａｌｋｅｒ２５６に対して、延命効果
を示した（後記実施例８参照）。 （Ｆ）肝動脈内投与による選択性とエストロゲン作用：
本結合体の肝内癌組織内濃度は、正常肝組織内濃度より
も高かった。本結合体による子宮肥大作用はなかった
（後記実施例９参照）。

【００１３】（４）選択的免疫抑制作用：以下の試験
（Ａ）〜（Ｄ）において、本結合体は、比較物質（エス
トラジオール−クロラムブチル結合体）と同様の選択的
免疫抑制効果を示した。 （Ａ）異種抗原刺激反応：本結合体は、フィトヘマグル
チニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＰＨ
Ａ）に対するリンパ球の幼若化反応に大きな影響を与え
なかった〔後記実施例１０（１）参照〕。 （Ｂ）同種抗原刺激反応：本結合体は、リンパ球混合培
養（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒ
ｅ；ＭＬＣ）反応を抑制した〔後記実施例１０（２）参
照〕。 （Ｃ）マウス骨髄移植モデルにおけるＧＶＨＲ（ｇｒａ
ｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）抑
制作用：本結合体は、移植後マウスの生存日数を延長し
た（後記実施例１１参照）。 （Ｄ）ＭＬＣ反応抑制作用におけるＴＧＦ−β産生の関
与：本結合体と免疫抑制物質（ＴＧＦ−β）とは併用効
果があり、本結合体の抑制効果は抗ＴＧＦ−β抗体との
併用で中和された。従って、本結合体のＭＬＣ反応抑制
作用にはＴＧＦ−β産生の関与が考えられる。本結合体
は、ＴＧＦ−βを分泌し、移植による拒絶反応を抑制す
ると考えられた（後記実施例１２参照）。

【００１４】以上のように、本結合体は、選択的生理活
性作用、即ち、選択的抗腫瘍作用及び選択的免疫抑制作
用を有するので、抗腫瘍剤並びに免疫抑制剤として有用
である。抗腫瘍剤としては、乳癌、卵巣癌、子宮癌、胃
癌、直腸癌、結腸癌、腎癌、造血器癌、肝癌、泌尿器
癌、その他の固形癌等に有効である。本結合体を抗腫瘍
剤として使用する場合には、任意慣用の方法で、各種経
路の投与用に調製することができる。製剤例としては、
カプセル、シロップ、丸薬、錠剤等の経口剤、注射剤、
外用剤、座剤を挙げることができる。外用剤の例として
は、白色ワセリン等の通常の基剤にラウリン酸ジエタノ
ールアミド等の経皮浸透助剤を含有する固形剤等をあげ
ることができる。本結合体を抗腫瘍剤として用いた場合
には、既応薬に対して交叉耐性が少ないという特徴があ
る。

【００１５】製剤中には、本結合体を好ましくは０．０
１〜７５重量％、より好ましくは０．０５〜２５重量％
の量で含有させることができる。本結合体は、経口、経
皮、筋肉内、静脈内、動脈内、直腸内等の経路によって
投与することができる。投与量は、投与方式及び治療の
程度によって異なるが、大略次のとおりである。成人に
対し、経口投与量は１日当たり０．１〜５０mg／kg、非
経口投与量は１日当たり０．０１〜２０mg／kgである。

【００１６】本結合体を、動脈内投与用注射剤（即ち、
動注剤）に含有させて用いる場合には、ヨード化ケシ油
脂肪酸エステルに本結合体を溶解するのが好ましい。動
注剤中の本結合体の濃度は、好ましくは０．１〜１０重
量％、より好ましくは１〜５重量％である。ヨード化ケ
シ油脂肪酸エステルとしては、ヨード化３０〜４０重量
％の低級アルキルエステルが好ましく、リピオドール
〔リピオドールウルトラフルイド（Ｌｉｐｉｏｄｏｌ
Ｕｌｔｒａ−ｆｌｕｉｄｅ）の商品名〕（ヨード化３
８．８重量％、エチルエステル）が特に好ましい。この
動注剤の投与量は、好ましくは０．０１〜２０mg／kg、
より好ましくは０．１〜１０mg／kgである。この動注剤
は、肝癌、乳癌、婦人科癌、消化器癌及び泌尿器癌に有
効である。この動注剤は、癌組織に特異的に集まり、持
続性が高い。また、ヨードでラベルしたヨード化ケシ油
脂肪酸エステルを用いると、Ｘ線、ＣＴ（コンピュータ
ー断層装置）又は超音波等により腫瘍細胞を観察しなが
ら診断又は治療を行うことができる。

【００１７】本結合体は、免疫調節作用及び／又は免疫
抑制作用を有する免疫調節剤あるいは免疫抑制剤とし
て、臓器等の移植、例えば腎臓、肝臓、心臓、皮膚、骨
髄等の移植分野における拒絶反応の防止及び治療、更に
は、各種腎疾患、甲状腺疾患、慢性関節リウマチ、自己
免疫性溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、重症筋無
力症、肝疾患、多発性動脈炎、皮膚筋炎等の自己免疫疾
患の治療に有効である。従って、臓器移植分野における
拒絶反応の防止剤、その治療剤、及び自己免疫疾患治療
剤として使用することができる。本結合体を、免疫抑制
剤として使用する場合には、任意慣用の方法で、各種経
路の投与用に調製することができる。製剤例としては、
錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル等の経口剤、座剤、注射
剤、外用剤である。投与経路及び投与量は、前記抗腫瘍
剤の場合と同じである。

【００１８】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例において、化合物の物性値は次の方法
により測定した。 （１）薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）：Ｗｈａ
ｔｍａｎ社製シリカゲル薄層プレートＬＫ６ＤＦ（２５
０μｍ層厚） （２）元素分析：柳本Ｃ・Ｈ・ＮコーダーＭＴ−３型
〔（株）柳本製作所〕 （３）質量スペクトル：Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅ
ｔｅｒ ＪＭＳ−ＤＸ３０３〔日本電子（株）〕 （４）ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：ＪＮＭ−ＧＳＸ−５００
〔日本電子（株）〕 （５）蛍光分析：島津分光蛍光光度計ＲＦ−５４０〔島
津製作所（株）〕

【００１９】実施例１ 〔１〕１−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−ト
リエン−３，１７β−ジオール，３−ベンゾエート，１
７−モノブロモアセテートの合成 １−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン
−３，１７β−ジオール（７．２ｇ）とアセトン（２０
０ml）を四つ口フラスコ（５００ml）に入れ、攪拌して
溶解し、１Ｎ−ＮａＯＨ（ＮａＯＨとして０．０２８モ
ル）を加えた。この系にベンゾイルクロライド（４．２
ｇ）のアセトン（２０ml）溶液を氷冷下で滴下した。粘
性物が析出したため、クロロホルムで抽出（２００ml＋
１００ml）し、有機層を水洗した後で硫酸マグネシウム
で処理し、減圧乾燥して、薄黄色粘性物（９．９ｇ）を
得た。ＩＲスペクトルによりν_C=O の吸収を確認した。
薄層クロマトグラフィー〔シリカゲル；展開溶媒＝シク
ロヘキサン／酢酸エチル（５／２容量）〕で展開したと
ころ、生成物はＲｆ＝０．２７を示し、原料化合物スポ
ット（Ｒｆ＝０．１８）の消失が認められた。

【００２０】次いで、得られた１−メチル−エストラ−
１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオー
ル，３−ベンゾエート（９．９ｇ）と乾燥テトラヒドロ
フラン（２５０ml）とピリジン（２．４ｇ）とを、塩化
カルシウム管付四つ口フラスコ（５００ml）に入れ、−
５℃〜−３℃で、ブロモアセチルブロマイド（１０ｇ）
の乾燥テトラヒドロフラン（８０ml）溶液を滴下した。
０℃で１時間攪拌し、薄層クロマトグラフィーで原料の
消失を確認した後、析出したピリジン−ＨＢｒ塩を濾別
し、減圧乾燥した。残渣をシリカゲルを用いたクロマト
グラフィー〔展開溶媒＝クロロホルム／ｎ−ヘキサン
（２／１容量）〕により精製し、１−メチル−エストラ
−１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオー
ル，３−ベンゾエート，１７−モノブロモアセテート
（９．３ｇ）を得た。理化学的データ以下のとおりであ
る。 Ｒｆ：０．７０〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ₂₈Ｈ₃₁Ｏ₄ Ｂｒ 理論値（％） Ｃ：６５．７７，Ｈ：６．０６，Ｂｒ：
１５．６４ 実測値（％） Ｃ：６６．０， Ｈ：６．１， Ｂｒ：
１５．９ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１０（親ピーク）

【００２１】同様の方法で、表１に記載の各反応中間体
を合成した。

【表１】

【００２２】〔２〕１−メチル−エストラ−１，３，５
（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール，３−（５
−ジメチルアミノナフタレンスルホネート），１７−モ
ノブロモアセテートの合成 １−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン
−３，１７β−ジオール（９ｇ）とアセトン（１００m
l）を四つ口フラスコ（２０００ml）に入れ、攪拌して
溶解し、１Ｎ−ＮａＯＨ（３２．５ml）を加えた後、５
−ジメチルアミノナフタレンスルホニルクロライド（ダ
ンシルクロライド：ＤＮＳ−Ｃｌ）（９．２ｇ）の乾燥
アセトン溶液（２００ml）を１０〜１５℃で滴下した。
３時間攪拌した後、薄層クロマトグラフィー〔シリカゲ
ル；展開溶媒＝シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２容
量）〕で反応終了を確認し、減圧下でアセトンを除去し
た後、クロロホルム（２００ml×３）で抽出した。クロ
ロホルム層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥し、更に減
圧乾燥して黄色粘性物（３１．３ｇ）を得た。シリカゲ
ルを用いたカラムクロマトグラフィー〔シクロヘキサン
／酢酸エチル（５／２容量）〕を行い、１−メチル−エ
ストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−
ジオール，３−（５−ジメチルアミノナフタレンスルホ
ネート）（１２ｇ）を得た。 Ｒｆ：０．１５〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ₃₁Ｈ₃₇ＮＯ₄ Ｓ 理論値（％） Ｃ：７１．６４，Ｈ：７．１８，Ｎ：
２．７０ 実測値（％） Ｃ：７１．５， Ｈ：７．２， Ｎ：
２．６ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１９（親ピーク） 蛍光分析：Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝３５６ｎｍ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝ ５２０ｎｍ

【００２３】次に、得られた１−メチル−エストラ−
１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオー
ル，３−（５−ジメチルアミノナフタレンスルホネー
ト）（１２ｇ）と乾燥テトラヒドロフラン（２００ml）
とピリジン（５ｇ）とを塩化カルシウム管付四つ口フラ
スコ（５００ml）に入れ、−５℃〜−３℃で攪拌した。
この系にブロモアセチルブロマイド（７．６ｇ）の乾燥
テトラヒドロフラン溶液（４０ml）を滴下した。０℃で
１時間攪拌し、室温で１晩攪拌した。薄層クロマトグラ
フィーで原料の消失を確認し、析出したピリジン−ＨＢ
ｒ塩を濾別した後、濾液を硫酸マグネシウムによって処
理した。減圧下で溶媒を除去し、黄白色の固体を得た。
シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー〔シクロヘ
キサン／酢酸エチル（５／２容量）〕で精製して１−メ
チル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，
１７β−ジオール，３−（５−ジメチルアミノナフタレ
ンスルホネート），１７−モノブロモアセテートを得
た。 Ｒｆ：０．６２〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ₃₃Ｈ₃₈ＮＯ₅ ＳＢｒ 理論値（％） Ｃ：６１．８７，Ｈ：５．９８， Ｂｒ：１２．４７，Ｎ：２．１９ 実測値（％） Ｃ：６１．７，Ｈ：５．８， Ｂｒ：１３．０，Ｎ：２．２¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ ２．９０ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，ＤＮＳ−Ｎ（Ｃ
Ｈ₃ ）₂ ），２．１４ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，Ａｒ−Ｃ
Ｈ₃ ），０．７０ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，Ｅ₂ −１８Ｃ
Ｈ₃ ） ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６３９（親ピーク） 蛍光分析：Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝３５５ｎｍ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝ ５２５ｎｍ 炎色反応：ハロゲン呈色

【００２４】前記と同様にして、以下の表２に記載の反
応中間体を合成した。

【表２】

【００２５】〔３〕エストラ−１，３，５（１０）−ト
リエン−３，１６α，１７β−トリオール，３−ベンゾ
エート，１７−モノブロモアセテートの合成 ナス型フラスコ（３００ml）に、エストリオール（５
ｇ）、アセトン（４５ml）、蒸留水（１５０ml）及び１
Ｎ−ＮａＯＨ（２０．６ml）を加え、攪拌して溶解し
た。０℃に冷却し、ベンゾイルクロライド（２．６８
ｇ）のアセトン（３５ml）溶液を１時間かけて滴下し
た。同じ温度で１時間、室温で１．５時間攪拌した後、
一晩放置した。生成した結晶を濾別し、エタノール（２
００ml）で結晶を洗浄した後、クロロホルム（７００m
l）に溶解させた。濃縮及び結晶化を繰り返し、白色結
晶（エストリオール−３−ベンゾエート）（６．２ｇ）
を得た。

【００２６】ナス型フラスコ（３００ml）に、前記で得
られたエストリオール−３−ベンゾエート（５．６
ｇ）、ピリジン（１．３ｇ）及び乾燥テトラヒドロフラ
ン（１６０ml）を加え、冷却（０℃）下で攪拌した。こ
の系にブロモアセチルブロマイド（３．５ｇ）の乾燥テ
トラヒドロフラン溶液（３５ml）を１時間かけて滴下し
た。添加終了後、更に１．５時間攪拌した後、冷蔵庫
（約５℃）内で１晩放置した。析出したピリジン塩酸塩
を濾別し、濾液を濃縮して油状物質（８．４ｇ）を得
た。薄層クロマトグラフィー〔シリカゲル：シクロヘキ
サン／酢酸エチル（５／１容量）〕により、３つの成分
が確認された。シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶
媒は前記薄層クロマトグラフィーの場合と同じ）によ
り、Ｒｆ＝０．７１、Ｒｆ＝０．７５、及びＲｆ＝０．
８７を示す化合物がそれぞれ１ｇ、２．３ｇ、及び１ｇ
の量で得られた。エストラ−１，３，５（１０）−トリ
エン−３，１６α，１７β−トリオール，３−ベンゾエ
ート，１７−モノブロモアセテートはＲｆ＝０．７１を
示す化合物であった。 Ｒｆ：０．７１〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／１
容量）〕 ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１２（親ピーク）

【００２７】〔４〕エストラ−１，３，５（１０）−ト
リエン−３，１７β−ジオール−６−オン，３−ベンゾ
エート，１７−モノブロモアセテートの合成 エストラジオール（５０ｇ）とピリジン（９０ｇ）と乾
燥テトラヒドロフラン（４００ml）を４つ口フラスコ
（１リットル）に入れ、無水酢酸（９４ｇ）を加え、６
時間攪拌下に還流した。この溶液のピリジンを約１／３
量まで濃縮し、そこへ酢酸エチル（４００ml）及び蒸留
水（３００ml）を加えた後、振とう抽出し、有機層を同
容量の蒸留水で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウ
ムにより乾燥した後、減圧乾固して白色結晶（エストラ
ジオール−３，１７β−ジアセテート；６４．１ｇ）を
得た。こうして得られたエストラジオール−３，１７β
−ジアセテート（６４ｇ）、酢酸（７４０ml）及び蒸留
水（１６０ml）をナス型フラスコ（１リットル）に入
れ、三酸化クロム（５３．８ｇ）を３０〜４０℃の浴上
で少量ずつ添加し、３時間後に更に三酸化クロム（６
ｇ）を追加し、室温で一晩攪拌した。反応液を蒸留水
（３リットル）に分散し、酢酸エチル（１リットル×
３）で抽出した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１
リットル×６）及び蒸留水（１リットル×２）で洗浄
し、有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥した後、減圧
乾固して黄色油状物質を得た。シリカゲルによるカラム
クロマトグラフィー〔展開溶媒：シクロヘキサン／酢酸
エチル（５／２容量）〕を行い、白色結晶（１３．１
ｇ）を得た。この化合物は、ＮＭＲ及びＩＲスペクトル
により、エストラジオール−３，１７β−ジオール−６
−オン，３，１７β−ジアセテートであることを確認し
た。こうして得られたエストラジオール−３，１７β−
ジオール−６−オン，３，１７β−ジアセテート（１２
ｇ）とメタノール（３５０ml）をナス型フラスコ（１リ
ットル）に入れ、水酸化カリウム（５３ｇ）のメタノー
ル（５３０ml）溶液を冷却しながら添加し、室温で２時
間攪拌した。減圧下で約半量まで濃縮し、２Ｎ−ＨＣｌ
でpH４程度にまで調整した後、酢酸エチル（４００ml×
３）で抽出し、有機層を蒸留水（５００ml）で洗浄した
後、硫酸マグネシウムによって乾燥し、減圧乾固して薄
黄色結晶（８．７４ｇ）を得た。この化合物は、ＮＭＲ
及びＩＲスペクトルにより、エストラジオール−３，１
７β−ジオール−６−オンであることを確認した。

【００２８】得られたエストラジオール−３，１７β−
ジオール−６−オン（２ｇ）をアセトン（５０ml）に溶
解し、ナス型フラスコ（２００ml）に入れ、ＮａＯＨ
（３０９mg）の水（１００ml）溶液を加えた。更に、ベ
ンゾイルクロライド（１．０４ｇ）のエチルエーテル
（１０ml）溶液を加え、厳しく攪拌すると白色物質がす
みやかに析出した。Ｇ−４フィルターで濾別した後、結
晶をよく水洗し、減圧乾固して白色結晶（２．６ｇ）を
得た。この化合物（２ｇ）とトリエチルアミン（２ｇ）
を乾燥テトラヒドロフラン（２０ml）に溶解し、三角フ
ラスコ（１００ml）に入れ、氷水で冷却下に攪拌した。
次いで、この系にブロモアセチルブロマイド（４ｇ）の
テトラヒドロフラン（２０ml）溶液を滴下し、冷却下で
攪拌下に２時間反応させ、冷蔵庫（約５℃）内で１晩静
置した。生成した沈殿をＧ−４フィルターで濾別し、濾
液を減圧乾固して粘性化合物（３．４ｇ）を得た。シリ
カゲルクロマトグラフィーによる精製を行った〔展開溶
媒：シクロヘキサン／酢酸エチル（５／３容量）〕。薄
層クロマトグラフィー〔シリカゲル：シクロヘキサン／
酢酸エチル（５／３容量）〕により、１スポット（Ｒｆ
＝０．６３）を示す画分を集め、減圧乾固し、微量の酢
酸エチルとエチルエーテルを用いて−２０℃で晶析し、
白色結晶のエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−
３，１７β−ジオール−６−オン，３−ベンゾエート，
１７−モノブロモアセテート（１．７ｇ）を得た。 Ｒｆ：０．６３〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／３
容量）〕 ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１０（親ピーク）

【００２９】実施例２：結合体の合成 〔１〕１−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−ト
リエン−３，１７β−ジオール，３−ベンゾエート，１
７−〔〔４−〔４−〔ビス（２−クロロエチル）アミ
ノ〕フェニル〕−１−オキソブトキシ〕アセテート〕
〔＝本結合体（Ｉ）〕の合成 クロラムブチル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）（７．２
ｇ）、ジメチルホルムアミド（１００ml）及び１Ｎ−Ｎ
ａＯＨ（２６．０ml）をナス型フラスコ（５００ml）に
入れ、５０℃でロータリーエバポレーターを用い、減圧
下で溶媒を除去し、減圧乾燥した。再度、乾燥ジメチル
ホルムアミド２００mlで溶解させた系に、実施例１
〔１〕で得た合成中間体（９．３ｇ）の乾燥ジメチルホ
ルムアミド溶液（１００ml）を加え、室温で２４時間攪
拌した。薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）で原料
スポットの消失を確認した後、ジメチルホルムアミドを
減圧下で除去した。残渣をクロロホルム（２００ml）で
溶解し、希食塩水２００mlで１回洗浄し、有機層を硫酸
マグネシウムで処理した後、減圧乾燥し、薄褐色の油状
物質を得た。更にこの残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフィー〔展開溶媒：シクロヘキサン／酢酸エチル
（５／１容量）〕で精製し、薄層クロマトグラフィーで
１スポットを示す無色油状物質（８．８ｇ）を得た。

【００３０】次いで、５０℃の湯浴上でイソプロピルア
ルコール（１．３リットル）を攪拌している系に、この
無色油状物質（８．８ｇ）の酢酸エチル（２０ml）溶液
を徐々に加え、攪拌下で徐々に０℃まで冷却し、−１８
℃の冷凍庫で一晩静置した。生成した白色結晶を低温下
で濾別し、冷ｎ−ヘキサン（−２０℃）で洗浄した。こ
の結晶を０℃で１時間、室温で更に４時間減圧乾燥し、
白色結晶の標記結合体（Ｉ）５．２ｇを得た。 Ｒｆ：０．６６〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ₄₂Ｈ₄₉Ｃｌ₂ ＮＯ₆ 理論値（％） Ｃ：６８．６５，Ｈ：６．７２， Ｃｌ：９．６５，Ｎ：１．９１ 実測値（％） Ｃ：６８．８， Ｈ：６．７， Ｃｌ：９．７， Ｎ：１．９ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７３３（親ピーク）¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ ４．５６ppm （Ｓ，ＣＨ₂ ，ＣＯＣＨ₂ Ｏ），３．７１
〜３．６０ppm （ｍ，ＣＨ₂ ，Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｃｌ）
₂ ，２．２３ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，Ａｒ−ＣＨ₃ ），０．
８０ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，１８−ＣＨ₃ ） 炎色反応：ハロゲン呈色

【００３１】前記と同様にして、以下の表３に記載の本
結合体（II）〜（XI）を得た。

【表３】

【００３２】〔２〕１−メチル−エストラ−１，３，５
（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール，３−（５
−ジメチルアミノナフタレンスルホネート），１７−
〔〔４−〔４−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕フ
ェニル〕−１−オキソブトキシ〕アセテート〕〔＝本結
合体（XII)〕の合成 クロラムブチル（３．９ｇ）とジメチルホルムアミド
（１００ml）と１Ｎ−ＮａＯＨ（１４．１ml）をナス型
フラスコ（５００ml）に入れ、５０℃でロータリーエバ
ポレーターを用いて約１／３量まで減圧下で濃縮し、実
施例１〔２〕で得た合成中間体（６．５ｇ）の乾燥ジメ
チルホルムアミド（１５０ml）溶液を加えた。室温で２
４時間反応させ、薄層クロマトグラフィーで原料の消失
を確認した後、ジメチルホルムアミドを減圧下で除去し
た。残渣に酢酸エチル（１５０ml）を加え、冷水（１０
０×２ml）で洗浄し、酢酸エチル層を硫酸マグネシウム
で処理し、溶媒を減圧下で除去し、黄褐色油状物質を得
た。この物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
〔展開溶媒＝シクロヘキサン／酢酸エチル（５／１容
量）〕で精製し、薄層クロマトグラフィーで１スポット
を示す化合物（６．２ｇ）を得た。イソプロピルアルコ
ール／ｎ−ヘキサンで結晶化し、標記の本結合体（XII)
５．１ｇを得た。 Ｒｆ：０．５２〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ₄₇Ｈ₅₆Ｃｌ₂ Ｎ₂ Ｏ₇ Ｓ 理論値（％） Ｃ：６３．９６，Ｈ：６．２６， Ｃｌ：８．２３，Ｎ：３．２４ 実測値（％） Ｃ：６４．０，Ｈ：６．３， Ｃｌ：８．２，Ｎ：３．２ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ８６２（親ピーク）¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ ４．５９ppm （Ｓ，ＣＨ₂ ，ＣＯＣＨ₂ Ｏ），３．７０
〜３．５９ppm （ｍ，ＣＨ₂ ，Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｃｌ）
₂ ，２．９０ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，ＤＮＳ−Ｎ（ＣＨ₃ ）
₂ ），２．１４ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，Ａｒ−ＣＨ₃ ），
０．７０ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，Ｅ₂ −１８ＣＨ₃ ） 炎色反応：ハロゲン呈色

【００３３】前記と同様にして、以下の表４に記載の本
結合体（XIII）〜（XVI)を得た。

【表４】

【００３４】〔３〕１−メチル−エストラ−１，３，５
（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール，３−パル
ミテート，１７−〔〔４−〔４−〔ビス（２−クロロエ
チル）アミノ〕フェニル〕−１−オキソブトキシ〕アセ
テート〕〔＝本結合体（XIV)〕の合成 １−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン
−３，１７β−ジオール（２ｇ）とピリジン（１．１
ｇ）を乾燥テトラヒドロフラン（５０ml）に溶解し、氷
−食塩浴での冷却下で攪拌した。この系に、ブロモアセ
チルブロマイド（２．８ｇ）の乾燥テトラヒドロフラン
（２０ml）溶液を滴下し、滴下終了後、冷蔵庫（約５
℃）内で１晩反応させた。生成されたピリジン−ＨＢｒ
塩を濾別し、テトラヒドロフランを減圧下で除去した。
残渣をエタノールで洗浄し、１−メチル−エストラ−
１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオー
ル，３，１７−ジブロモアセテート（３．１ｇ）を得
た。この化合物をアセトン（２００ml）に溶解し、０℃
に冷却した。蒸留水をこの系に徐々に加え、沈澱が析出
する直前の状態とした。この系に１Ｎ−ＮａＨＣＯ
₃ （０．４５ml）を加え、３０分間攪拌した。減圧下で
アセトンを除去すると白色結晶が析出した。薄層クロマ
トグラフィーのチェックでは、原料スポットが若干残っ
た状態であった。この結晶を濾別して水洗し、減圧下で
乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔展開
溶媒＝シクロヘキサン／酢酸エチル（５／１容量）〕で
精製し、白色結晶（２．５ｇ）を得た。ＮＭＲ及び元素
分析より、この化合物は、１−メチル−エストラ−１，
３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール，１
７−モノブロモアセテートであることを確認した。

【００３５】次いで、クロラムブチルのナトリウム塩
（１ｇ）を乾燥テトラヒドロフラン（５０ml）に分散
し、攪拌しながら、前記の１−メチル−エストラ−１，
３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール，１
７−モノブロモアセテート（１．２ｇ）の乾燥テトラヒ
ドロフラン（１０ml）溶液を加え、４０℃で３０分間加
温した。室温で更に２４時間反応させた。薄層クロマト
グラフィーで原料の消失を確認した後、生成塩を濾別
し、テトラヒドロフランを減圧下で除去し、粘性状物質
（２．０ｇ）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー〔展開溶媒＝シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕により精製し、１−メチル−エストラ−１，
３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール，１
７−〔〔４−〔４−〔ビス（２−クロロエチル）アミ
ノ〕フェニル〕−１−オキソブトキシ〕アセテート
（１．５ｇ）を得た。

【００３６】こうして得られた前記化合物（１．０ｇ）
と乾燥ピリジン（０．２５ｇ）を乾燥テトラヒドロフラ
ン（５０ml）に溶解し、攪拌下で０℃に冷却した。この
系に、パルミチン酸クロライド（０．８７ｇ）の乾燥テ
トラヒドロフラン（１０ml）溶液を滴下した。添加終了
後、３０℃で３時間攪拌し、室温で１晩反応させた。薄
層クロマトグラフィーで原料の消失を確認し、テトラヒ
ドロフランを減圧下で除去した。酢酸エチル（５０ml）
に再溶解し、水（２５ml×２）で洗浄した後、酢酸エチ
ル層を無水硫酸ナトリウムで処理し、更に減圧乾燥し
た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔展開溶媒＝
クロロホルム／酢酸エチル（５０／１容量）〕で精製
し、標記の本結合体（XIV)１．１ｇを得た。 Ｒｆ：０．６３〔クロロホルム／酢酸エチル（５０／１
容量）〕 元素分析：Ｃ₅₁Ｈ₇₅Ｏ₆ Ｃｌ₂ 理論値（％） Ｃ：７０．４８，Ｈ：８．７０， Ｃｌ：８．１６，Ｎ：１．６１ 実測値（％） Ｃ：７０．２，Ｈ：８．８， Ｃｌ：８．２，Ｎ：１．６¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ ４．５７ppm （Ｓ，ＣＨ₂ ，ＣＯＣＨ₂ Ｏ），３．７７
〜３．５３ppm （ｍ，ＣＨ₂ ，Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｃｌ）
₂ ），２．１７ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，Ａｒ−ＣＨ₃ ），
１．５〜１．２ppm （ｍ，ＣＨ₂ ，（ＣＨ₂ ）₁₄），
０．８３ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，１８ＣＨ₃ ） ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ８６７（親ピーク） 炎色反応：ハロゲン呈色 前記と同様にして、前記の表４に記載の本結合体（XII
I）、（XV）及び（XVI)を得た。

【００３７】〔４〕エストラ−１，３，５（１０）−ト
リエン−３，１６α，１７β−トリオール，３−ベンゾ
エート，１６α−アセテート，１７−〔〔４−〔４−
〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕フェニル〕−１−
オキソブトキシ〕アセテート〔＝本結合体（XVII）〕の
合成 実施例１〔３〕で得た中間体化合物（１ｇ）とクロラム
ブチルのカリウム塩（０．６５ｇ）をジメチルホルムア
ミド（８０ml）に溶解させ、室温で２４時間攪拌反応さ
せた。反応溶液を１／３量まで濃縮し、この濃縮液に酢
酸エチル（２５０ml）を加え、冷水（１５０ml×３）で
洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、更に減圧
乾燥してオイル状物質（１．９ｇ）を得た。シリカゲル
カラムクロマトグラフィー〔展開溶媒＝シクロヘキサン
／酢酸エチル（５／２容量）〕で精製し、イソプロパノ
ールにより晶析して白色結晶の前駆物質・エストラ−
１，３，５（１０）−トリエン−３，１６α，１７β−
トリオール，３−ベンゾエート，１７−〔〔４−〔４−
〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕フェニル〕−１−
オキソブトキシ〕アセテート〔＝本結合体（XVII）の前
駆物質〕０．６ｇを得た。 Ｒｆ：０．７５〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ₄₁Ｈ₄₇Ｃｌ₂ ＮＯ₇ 理論値（％） Ｃ：６６．８５，Ｈ：６．３９； Ｃｌ：９．６５，Ｎ：１．９０ 実測値（％） Ｃ：６７．０，Ｈ：６．５， Ｃｌ：９．７，Ｎ：１．９ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７３５（親ピーク）¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ ４．５６ppm （Ｓ，ＣＨ₂ ，ＣＯＣＨ₂ Ｏ），３．７０
〜３．６０ppm （ｍ，ＣＨ₂ ，Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｃｌ）
₂ ），０．８１ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，１８−ＣＨ₃ ） 炎色反応：ハロゲン呈色

【００３８】前駆物質（４００mg）、乾燥テトラヒドロ
フラン（１５ml）、乾燥ピリジン（１．５ml）及び無水
酢酸（１．５ml）をナス型フラスコ（５０ml）に入れ、
塩化カルシウム管付の冷却管をつけて、６０℃で６時間
加熱攪拌し、室温で一晩放置した。反応液を減圧乾固
し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔展開
溶媒＝シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２容量）〕で
精製した。得られた油状物質（０．６ｇ）を酢酸エチル
とイソプロパノールにより晶析し、白色結晶の標記本結
合体（XVIII)０．３２ｇを得た。 Ｒｆ：０．４５〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ₄₃Ｈ₄₉Ｃｌ₂ ＮＯ₉ 理論値（％） Ｃ：６４．９９，Ｈ：８．９４， Ｃｌ：８．９４，Ｎ：１．７６ 実測値（％） Ｃ：６５．１，Ｈ：９．１， Ｃｌ：８．８，Ｎ：１．８ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７９３（親ピーク）¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ ４．６０ppm （Ｓ，ＣＨ₂ ，ＣＯＣＨ₂ Ｏ），３．７１
〜３．６０ppm （ｍ，ＣＨ₂ ，Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｃｌ）
₂ ），２．０ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，ＣＯＣＨ₃ ），０．８
３ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，１８−ＣＨ₃ ） 炎色反応：ハロゲン呈色

【００３９】〔５〕エストラ−１，３，５（１０）−ト
リエン−３，１７β−ジオール−６−オン，３−ベンゾ
エート，１７−〔〔４−〔４−〔ビス（２−クロロエチ
ル）アミノ〕フェニル〕−１−オキソブトキシ〕アセテ
ート〔＝本結合体（XVIII)〕の合成 前記実施例１〔４〕で得たエストラ−１，３，５（１
０）−トリエン−３，１７β−ジオール−６−オン，３
−ベンゾエート，１７−モノブロモアセテート（５００
mg）と、クロラムブチルのカリウム塩（３４０mg）に乾
燥テトラヒドロフラン（２０ml）を加え、４０℃で２時
間攪拌した。１晩室温で反応させ、生成されたカリウム
塩をＧ−４フィルターで濾別した後、濾液を減圧乾固し
た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー〔展開溶媒＝
シクロヘキサン／酢酸エチル（５０／１５容量）〕で精
製し、同じ溶媒の薄層クロマトグラフィーでＲｆ＝０．
２４の単一スポットを示す画分を集め、減圧濃縮し、ｎ
−ヘキサンにより晶析し、白色結晶の標記本結合体（XI
X)３７０mgを得た。 Ｒｆ：０．２４〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５０／
１５容量）〕 元素分析：Ｃ₄₁Ｈ₄₅Ｃｌ₂ ＮＯ₇ 理論値（％） Ｃ：６７．０３，Ｈ：６．１３； Ｃｌ：９．６７，Ｎ：１．９１ 実測値（％） Ｃ：６６．９，Ｈ：６．４； Ｃｌ：１０．０，Ｎ：１．９ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７３３（親ピーク）¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ ４．５７ppm （Ｓ，ＣＨ₂ ，ＣＯＣＨ₂ Ｏ），３．７０
〜３．５９ppm （ｍ，ＣＨ₂ ，Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｃｌ）
₂ ），０．８０ppm （Ｓ，ＣＨ₃ ，１８−ＣＨ₃ ） 炎色反応：ハロゲン呈色

【００４０】実施例３：毒性 生後５週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラット（平均体重１３０
ｇ）の各群（１０匹）に、０．５％メチルセルロース水
溶液中の本結合体（Ｉ）の懸濁液を５０００mg／kgの割
合で、金属製胃ゾンデを用いて一回強制経口投与し、投
与してから７日後まで観察したが、死亡例は認められな
かった。本結合体（II）〜（XIX)についても同様の結果
を得た。

【００４１】実施例４：エストロゲン作用（子宮重量
法） Ｗｉｓｔａｒ／ｓｌｃの３．５週齢雌性ラットに各被検
試料を３日間連続して皮下投与（５０mg／kg／日、１０
０mg／kg／日又は２００mg／kg／日の量で各々３回）
し、４日目の子宮重量を計測することにより、本結合体
のホルモン作用を比較物質と比較検討した。なお、この
試験法は、小山により最も優れた方法であると紹介され
ている（小山良彦，日本内分泌学会誌，３７（８）：８
２６，１９６１）。４日目の「子宮重量／体重」比と投
与量との関係より、対照群の「子宮重量／体重」比を２
倍とする各被検試料の投与量を算出した。なお、本結合
体を皮下投与する際には、ゴマ油を溶媒とした。また、
結合体比較物質としては、エストラ−１，３，５（１
０）−トリエン−３，１７β−ジオール，３−ベンゾエ
ート，１７−〔〔４−〔４−〔ビス（２−クロロエチ
ル）アミノ〕フェニル〕−１−オキソブトキシ〕アセテ
ート〔以下、比較物質Ｉとする〕を用いた。この比較物
質Ｉは、本結合体を表す前記一般式（Ｉ）において、Ｒ
¹ 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ がすべて水素原子である場合（本
結合体とならない）に相当する。更に、エストラジオー
ル−１７βも比較用として用いた。結果を表５に示し
た。

【００４２】

【表５】 比較物質Ｉにはエストラジオール−１７βの１／１０程
度のホルモン作用が観察された。一方、本結合体のホル
モン作用では、エストラジオールのＡ環上２位に置換基
Ｒ¹ を担持し、Ｂ環、Ｃ環及びＤ環に置換基を担持しな
い本結合体で、比較物質Ｉよりも１／１００〜１／５０
０程度に弱まったことが確認された。また、Ａ環上１位
又は４位に置換基を有するか、複数置換基を有する本結
合体では、ホルモン作用は、本実験系において検出され
なかった。更に、Ａ環に置換基Ｒ¹ を担持せず、Ｂ環、
Ｃ環又はＤ環に置換基を担持する本結合体、即ち、本結
合体（XVII）及び（XVIII)のホルモン作用は、極めて低
く、比較物質Ｉの約１／２０〜１／５に低下しているこ
とが観察された。

【００４３】実施例５：選択的増殖抑制作用 （１）選択的増殖抑制作用（マウス正常細胞と悪性細
胞） 対数増殖期にあるマウス３Ｔ３正常細胞及び悪性細胞３
Ｔ３ＳＶ−４０を０．２５％トリプシンで処理し、細胞
を２×１０⁴ 個／mlの割合で培養液に分散させた後、そ
の細胞分散液を円型短試〔池本理化〕に１本あたり１ml
の量で植込み、綿栓後、水平より５°の傾斜で炭酸ガス
培養器（９５％空気、５％炭酸ガス、３７℃恒温、９５
％湿度）で静置培養した。被検試料をジメチルスルホキ
シドに溶解して培養後に添加した。その際、ジメチルス
ルホキシドの濃度は培養液に対して１％となるようにし
た。

【００４４】細胞の植込から１日経過後に培養液を除去
し、pH７．４の新鮮な培養液を加え、更にジメチルスル
ホキシドに溶解した各被検試料１０μｇ／ml又は５０μ
ｇ／mlを加えた。コントロールとしてはジメチルスルホ
キシドのみを加えた。被検試料を添加してから５日間培
養を行い、生細胞の計測を、トリパンブルーに不染な細
胞のビュルケルチュルク血球計算盤により行った。１被
検試料の濃度につき３検体の平均値を求めた。コントロ
ールとの比較より生存率（％）を求めた。結果を表６及
び表７に示す。本結合体は比較物質Ｉと同様な悪性細胞
への選択的な増殖抑制作用を維持していることが認めら
れた。

【００４５】

【表６】

【表７】

【００４６】（２）選択的増殖抑制作用（ヒト正常細胞
と癌細胞） ヒト正常細胞（ＦＬＯＷ４０００）と各種ヒト癌細胞
〔ヒト腎癌（ＲＣ）細胞、ヒト前立腺癌（ＰＣ−３）細
胞、ヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞〕に対する本結合体
の増殖抑制作用（生存率）を検討した。培養フラスコに
て継代培養している対数増殖期にある細胞を０．２５％
トリプシンで処理し、細胞（２×１０⁴ 個／ml）をそれ
ぞれの培養液に分散させた後、円型短試〔池本理化〕に
１本あたり１mlの割合で植込み、綿栓後、水平より５°
の傾斜で炭酸ガス培養器（９５％空気、５％炭酸ガス、
３７℃恒温、９５％湿度）で静置培養した。被検試料を
ジメチルスルホキシドに溶解して培養後に添加した。そ
の際、ジメチルスルホキシドの濃度は培養液に対して１
％となるようにした。細胞の植込から１日経過後に培養
液を除去し、それぞれ以下の表８及び表９に示したpHに
調製した新鮮な培養液（被検試料を含む）を加えた。コ
ントロールとしてはジメチルスルホキシドのみを加えた
系を用いた。被検試料添加後５日間培養を行い、評価は
実施例３（１）と同様な条件で行った。表８及び表９に
各細胞に対する本結合体の増殖抑制作用（生存率）を示
した。本結合体は、ヒト癌細胞に対し、比較物質Ｉと同
程度の選択的な増殖抑制作用を維持していることが認め
られた。

【００４７】

【表８】

【表９】

【００４８】実施例６：ヒト乳癌細胞の増殖因子分泌抑
制作用 ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７の増殖因子（ＴＧＦ−α）分泌
に及ぼす本結合体（Ｉ）の作用を検討した。ＭＣＦ−７
を、５％ＤＣＣ−ＮＢＳ（デキストランコート活性炭処
理牛新生児血清）とエストラジオール（１０^-8Ｍ）を含
むフェノールレッド不含のＭＥＭ培地で７日間培養し
た。培養液の交換は２日目及び４日目に行った。培養開
始後７日目に培養液を除去し、５％ＤＣＣ−ＮＢＳとエ
ストラジオール（１０^-8Ｍ）と被検試料のジメチルスル
ホキシド溶液とを添加した培養液を加えた。被検試料を
添加してから４日目に培養液を採取し、遠心分離（３５
００rpm で１０分間）した。更に、上澄液を蒸留水でＳ
ｐｅｃｔｒａＰｏｒ３ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＷ３５０
０ ｃｕｔ ｏｆｆ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ）を用い、３日間透析した。透析終了後、凍結乾燥
を行って得た粉末を、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含む１／１０量のＰＢＳ（リン酸緩衝液）に溶解し
た。

【００４９】ＴＧＦ−αの測定は稲垣らの報告と同様
に、ウサギ抗体とマウスモノクローナル抗体（ＡＴＧ−
２Ｓ）を用い、サンドイッチＥＩＡ法により行った（Ｉ
ｎａｇａｋｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．１２８：２７−３７，１９９０）。
結果を表１０に示す。

【表１０】 本結合体（Ｉ）は比較物質Ｉと同様に、１０^-8Ｍのエス
トラジオール（表中では「Ｅ₂ 」で示す）によって誘導
されるＴＧＦ−α産生分泌を１０^-6Ｍで完全に抑制する
ことが観察されたが、等モルのクロラムブチルでは、Ｔ
ＧＦ−α産生分泌への影響は認められなかった。

【００５０】実施例７：抗腫瘍効果（腹腔内投与及び経
口投与） Ｐ３８８細胞を１×１０⁶ 個／０．０５mlハンクス液と
なるように調整して用意した細胞懸濁液を、ＢＤＦ₁ の
７．５週齢雌マウスの各群（１群６匹；コントロール群
１０匹）の腹腔内へ移植した。一方、比較物質Ｉを０．
５％メチルセルロース含有生理食塩水に分散し、その分
散液５０mg／kg又は１００mg／kgを、腫瘍移植後１日
目、４日目及び７日目に腹腔内投与した。また、本結合
体も比較物質Ｉの５０mg／kg又は１００mg／kgに相当す
る量（モル比）で同様に投与した。なお、ここで本結合
体では、０．５％メチルセルロース含有生理食塩水分散
剤を調製可能なものについてはその分散剤を用い、室温
において半固体の本結合体（XIII）、（XIV)、（XV）及
び（XVI)についてはゴマ油に溶解し、ゴマ油に溶解分散
された比較物質Ｉの投与量１０mg／kg、２０mg／kgと等
モルの投与量となるよう調製し、Ｐ３８８担癌マウスに
８日間連続で経口投与を行った。各群の死亡例数より、
中間生存日数（ｍｅｄｉａｎｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍ
ｅ；ＭＳＴ）を求め、これを「Ｔ」とした。同様にコン
トロール群（生理食塩水又はゴマ油のみを投与した群）
のＭＳＴを求め、これを「Ｃ」とした。これより Ｔ／Ｃ×１００（％） を求めた。生存確認は被検試料の投与開始より、４５日
目を限度とした。Ｐ３８８腹腔内移植マウスに対する被
検試料の腹腔内投与法による試験結果を表１１に、ま
た、被検試料の経口投与法による試験結果を表１２に示
す。いずれの試験においても、本結合体は比較物質Ｉと
同等以上の延命効果を示すことが認められた。また、本
結合体（XVII）及び（XVIII)にはいずれも比較物質Ｉ以
上の延命効果が認められた。

【００５１】

【表１１】

【表１２】

【００５２】実施例８：抗腫瘍効果（注射剤の動脈内投
与） Ｗａｌｋｅｒ２５６ｃａｒｃｉｎｏｓａｒｃｏｍａ（固
型；約３mm×３mm×３mm）を調製し、１群５匹のＷｉｓ
ｔａｒラット（６週齢；雌）の左上腕部及び左大腿部皮
下に移植針を用いて移植した。移植後８〜９日目に右大
腿動脈よりカテーテルを用いて被検試料を注入（０．１
ml／ｂｏｄｙ）した。被検試料はリピオドール（６．５
ｇ）に溶解又は分散した注射剤として用いた。前記実施
例７と同様に中間生存日（ＭＳＴ）を算出し、延命率
（Ｔ／Ｃ）を求めた。結果を表１３に示した。アドリア
マイシンはリピオドールに不溶であり、癌組織への長時
間滞留が困難であり、効果が不十分であった。本結合体
（Ｉ）の場合は、比較物質Ｉと同様によく溶解され、し
かも持続性があり、その効果も十分現れた。

【表１３】

【００５３】実施例９：肝動脈内投与による選択性とエ
ストロゲン作用 Ｗｉｓｔａｒラットの肝臓に、前記実施例８と同様のＷ
ａｌｋｅｒ２５６ｃａｒｃｉｎｏｓａｒｃｏｍａ（固型
癌）を移植し、肝動脈より表１４に記載の各薬剤Ａ〜Ｅ
（０．０５ml／ｂｏｄｙ）を注入した。注入後７日目に
ラットの血液を採取し、ＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏ
ｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）と
ＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎ
ｓａｍｉｎａｓｅ）を測定した。更に、ラットより肝臓
を摘出し、肝組織内の癌組織と正常肝組織内の薬剤濃度
を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。結果
を表１４及び表１５に示す。

【００５４】

【表１４】

【表１５】 本結合体（Ｉ）のリピオドール注射液〔薬剤（Ｂ）〕の
癌組織内濃度は正常肝組織内濃度よりも高値で、比較物
質Ｉのリピオドール注射液〔薬剤（Ｃ）〕と同様な結果
を得た。アドリアマイシンの注射液〔薬剤（Ａ）〕では
滞留がみられなかった。ゴマ油注射剤〔薬剤（Ｄ）及び
（Ｅ）〕は、正常肝組織及び癌組織内活性物質の濃度に
差がみられなかった。子宮重量に与える影響では、比較
物質Ｉで若干の子宮肥大作用が認められたが、本結合体
では子宮肥大作用はみられなかった。

【００５５】実施例１０：免疫調節作用 （１）異種抗原刺激反応〔本結合体（Ｉ）のマイトジェ
ン反応に対する作用〕 異種抗原刺激に対するリンパ球の幼若化反応（ ³Ｈ−ｔ
ｈｙｍｉｄｉｎｅの細胞内への取り込みを指標として測
定）、即ち、細菌等に対する免疫反応に及ぼす本結合体
（Ｉ）の影響について調べた。なお、マイトジェンとし
てはヒトリンパ球（特にＴ細胞）に最も強い反応を示す
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いた。男性健常人
より末梢静脈血を真空採血管に採取し、遠心（２０００
rpm ；常温；２０分間）した。血漿を更に遠心（３５０
０rpm ；4 ℃；２０分間）して、培養液（ＲＰＭＩ１６
４０）に２０％となるように添加した。血清を取り去っ
た残留物に前記と同じ培養液を同量加えて希釈した後、
リンホプレップに静かに重層した。これを遠心処理（１
５００rpm ；２０℃；３０分間）した後、単核細胞層を
取り出し、培養液で２〜３回洗浄し、細胞数を５×１０
⁵ ｃｅｌｌ／mlに調整した。

【００５６】こうして得た細胞浮遊液を９６穴Ｕ字底マ
イクロプレートに２００μｌ／ウエルずつ分注した。本
結合体（Ｉ）及び比較物質Ｉをジメチルスルホキシドに
溶解した後、ジメチルスルホキシド濃度として０．５％
となるように各細胞浮遊液に加えた。コントロールとし
てはジメチルスルホキシドのみを添加し、各群トリプリ
ケットで行った。ＰＨＡは１０μｇ／mlとなるように各
ウエルに添加した。炭酸ガス培養器内で２日間培養した
後、 ³Ｈ−チミジンを１μＣｉ／ウエルずつ添加し、更
に１８時間培養した後、セルハーベスターにて細胞をガ
ラスフィルター上に集め、放射能活性を液体シンチレー
ションカウンターを用いて測定した。結果を表１６に示
す。本結合体（Ｉ）は比較物質Ｉと同様に、異種抗原刺
激に対するリンパ球の幼若反応には大きな影響を与えな
かった。

【００５７】（２）同種抗原刺激反応〔本結合体（Ｉ）
のリンパ球混合培養（ＭＬＣ）に対する作用） 臓器移植の際の免疫反応のモデルで、いわゆる同種抗原
刺激反応であるリンパ球混合培養における本結合体
（Ｉ）の作用について検討した。男性健常人（２名）よ
りそれぞれＰＨＡ反応の場合と同様にして単核細胞を
得、一方ヒトより得られた細胞に１５Ｇｙの放射線処理
を行った。培養液にて洗浄した後、細胞数を５×１０⁵
ｃｅｌｌ／mlに調整し、両細胞をそれぞれ１００μｌず
つ合計２００μｌとなるようにマイクロプレートの各ウ
エルに分注した。本結合体（Ｉ）及び比較物質Ｉを、Ｐ
ＨＡ反応の場合と同様にジメチルスルホキシドに溶解し
て培養系に加えた。６日間培養した後、 ³Ｈ−チミジン
（１μＣｉ／ml）を添加し、更に１８時間培養し、セル
ハーベスターにてガラスフィルター上に細胞を集め、そ
の放射能活性を液体シンチレーションカウンターにて測
定した。結果を表１６に示す。本結合体（Ｉ）は、比較
物質Ｉと同様にＭＬＣ反応を抑制することが認められ
た。

【００５８】

【表１６】

【００５９】実施例１１：マウス骨髄移植モデルにおけ
るＧＶＨＲ抑制作用 ８週令の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス及び雄性Ｂ６Ｃ３Ｆ₁
マウスを用いて、骨髄移植モデルにおける本結合体のＧ
ＶＨＲ（ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）抑制作用について検討した。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマ
ウスの脾臓から、金属メッシュを用いて脾細胞を、１０
％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に集めた。また同じ
マウスの大腿骨よりシリンジを用いて骨髄細胞を洗い出
し、ＲＰＭＩ１６４０培養液に集めた。両細胞の浮遊液
を２〜３回洗浄した後、それぞれを８×１０⁶ ｃｅｌｌ
／mlに調整し、これらを１：１の割合で混合し、予め９
Ｇｙの放射線処理を行ったＢ６Ｃ３Ｆ₁ マウスの尾静脈
より、前記混合液０．５mlを注入した。移植前日より、
当日を除き、移植後３０日まで、本結合体（Ｉ）又は比
較物質Ｉを２mg／kg（０．５％メチルセルロース生理食
塩水分散剤）の量で連日経口的に投与した。コントロー
ル群には０．５％メチルセルロース生理食塩水のみを投
与した。マウスの生存について観察した。結果を表１７
に示す。

【００６０】

【表１７】 コントロールでは、生存日数中間値が８日と少なく、Ｇ
ＶＨＤ発症と考えられる早期死亡が認められた。一方、
本結合体（Ｉ）では、マウス骨髄移植モデル系におい
て、比較物質Ｉと同様に明らかな生存率の延長がみられ
た。

【００６１】実施例１２：ＭＬＣ反応抑制作用における
ＴＧＦ−β産生への関与 本結合体（Ｉ）のＭＬＣ反応の選択的抑制作用の機序を
解明するために、実施例１０（２）と同様な条件下で、
ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と抗ＴＧＦ−β
抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＲＰＭＩ１６４０に
溶解したものを添加し、本結合体（Ｉ）のＭＬＣ反応の
抑制作用に与える影響を検討した。結果を表１８に示
す。

【００６２】

【表１８】 免疫抑制物質（ＴＧＦ−β）の抑制と同程度に本結合体
のＭＬＣ反応の抑制とＴＧＦ−βとの併用効果が認めら
れた。抗ＴＧＦ−β抗体はＭＬＣ反応へ影響を与えず、
本結合体との併用で、本結合体（Ｉ）の単独で認められ
たＭＬＣ反応の抑制作用をほぼ中和した。これらの傾向
は比較物質Ｉと同様であった。従って、本結合体（Ｉ）
のＭＬＣ反応の抑制作用は、ＴＧＦ−β産生と深く関与
しているものと考えられる。

【００６３】製剤例１：錠剤 本結合体（Ｉ） ３０部 マンニット ３５部 ソルビット ２５部 カルボキシメチルセルロース ５部 ステアリン酸マグネシウム ５部 タルク ４０部 上記成分をよく混和し、混和物を圧縮して直径１０mmの
錠剤とした。

【００６４】製剤例２：注射剤 本結合体（Ｉ）１００mgを、２５℃のリピオドール
（６．５ｇ）に加え、１５分間攪拌し、本結合体（Ｉ）
の注射剤としての溶液を得た。これを滅菌したバイアル
ビンに入れた。

【００６５】製剤例３：カプセル剤 製剤例１で得た混和物を０号カプセルに封入してカプセ
ル剤とした。

【００６６】製剤例４：外用薬 本結合体（Ｉ）１ｇとゴマ油（１０ｇ）、白色ワセリン
（９０ｇ）及びラウリン酸ジエタノールアミド（経皮浸
透助剤；１０ｇ）を湯浴上で加温溶融して混合した。混
合物を室温に冷却して外用剤を得た。

【００６７】製剤例５：座薬 本結合体（Ｉ）１００mgとゴマ油（５ｇ）及びウイテプ
ゾール（９０ｇ）を湯浴上で加温溶融して混合した。溶
融混合物を１．３３ｇずつプラスチック製座剤コンテナ
に充填し、室温に冷却して座剤とした。

【００６８】

【発明の効果】本発明の新規結合体を構成するエストラ
ジオール誘導体部分には、従来公知のエストラジオール
誘導体部分においても存在したＡ環の３位置換基に加え
て、更に置換基を担持する。こうした構造により、従来
のエストラジオール−クロラムブチル結合体が有する選
択的生理活性作用、即ち、選択的抗腫瘍作用及び選択的
免疫抑制作用をそのまま維持しながら、従来公知の結合
体の欠点であったエストロゲン作用を消滅ないし極微弱
にすることが可能になり、抗腫瘍剤及び免疫抑制剤とし
ての有用性を著しく高めた。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１２月２１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【化１】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数である
が、但し、ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時
に水素原子になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５
が水素原子と水酸基だけからなることはないものとし、
そしてｎが２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１が同一又
は異なっていてもよいものとする）のエストラジオール
誘導体−クロラムブチル結合体。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項６

【補正方法】変更

【補正内容】

【化２】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数であり、
Ｘはハロゲン原子、水酸基又はその塩であるが、但し、
ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時に水素原子
になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が水素原子
と水酸基だけからなることはないものとし、そしてｎが
２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１が同一又は異なって
いてもよいものとする）の化合物。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項８

【補正方法】変更

【補正内容】

【化３】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数である
が、但し、ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時
に水素原子になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５
が水素原子と水酸基だけからなることはないものとし、
そしてｎが２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１が同一又
は異なっていてもよいものとする）の化合物。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、一般
式（Ｉ）：

【化４】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数である
が、但し、ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時
に水素原子になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５
が水素原子と水酸基だけからなることはないものとし、
そしてｎが２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１が同一又
は異なっていてもよいものとする）のエストラジオール
誘導体−クロラムブチル結合体に関する。また、本発明
は、そのエストラジオール誘導体−クロラムブチル結合
体の製造方法、及びそのエストラジオール誘導体−クロ
ラムブチル結合体を含有する医薬製剤にも関する。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】本発明のエストラジオール誘導体−クロラ
ムブチル結合体（以下、本結合体と称する）の構成成分
であるエストラジオール誘導体部分の化学構造上の特徴
は次のとおりである。即ち、エストラジオールのＡ環の
３位置換基ＯＲ^２の他に、エストラジオールのＡ環の１
位、２位若しくは４位、又はＢ環、Ｃ環若しくはＤ環の
いずれかの位置に１個以上の置換基が存在する。Ａ環の
基Ｒ^１、Ｂ環の基Ｒ^３（水素原子以外）、Ｃ環の基Ｒ^４
（水素原子以外）及びＤ環の基Ｒ^５（水素原子以外）の
いずれの置換基が存在してもエストロゲン作用の消失な
いし低下効果が現れるが、Ａ環の１位、２位及び／又は
４位に基Ｒ^１が存在するのが好ましい。Ａ環の１位、２
位及び／又は４位に置換基Ｒ^１が存在する場合、その置
換基Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４
のアルコキシ基である。置換基Ｒ^１は、好ましくは１位
及び／又は４位に存在する。Ｂ環、Ｃ環及び／又はＤ環
に置換基が存在する場合は、オキソ基、水酸基又はアシ
ルオキシ基のいずれか１個がいずれか１個の環に存在す
るか、又は、同じか又は異なる２個又は３個の基が異な
る環にそれぞれ１個ずつ存在する。オキソ基又はアシル
オキシ基が好ましい。アシルオキシ基は好ましくは炭素
数２〜７のアシルオキシ基、例えば、ベンゾイルオキシ
基、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイル
オキシ基、又はペンタノイルオキシ基である。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００６】本結合体のエストラジオール誘導体部分の
３位置換基は、エストラジオールの３位水酸基の水素原
子をアシル基、ダンシル基（５−ジメチルアミノナフタ
レンスルホニル基）又はアルキル基で置換した構造に相
当する。アシル基としての基Ｒ^２は、好ましくは炭素数
２〜１８のアシル基、例えば、ベンゾイル基、アセチル
基、パルミトイル基、ステアロイル基及びリノレノイル
基等である。また、アルキル基としての基Ｒ^２は、好ま
しくは炭素数１〜４のアルキル基、より好ましくは、メ
チル基、エチル基又はプロピル基である。また、エスト
ラジオール誘導体部分の１７位配座は、β配座、α配座
又はその混合物であってもよいが、β配座が好ましい。
置換基Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_５の立体配座も、β配座、α配
座又はその混合物であることができる。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】本結合体は、例えば以下の方法によって調
製することができる。本結合体を構成するエストラジオ
ール誘導体部分の骨格をなし、エストラジオールのＡ環
の３位及びＤ環の１７位がそれぞれ水酸基であるエスト
ラジオール誘導体（即ち、Ａ環の１位、２位若しくは４
位に置換基Ｒ^１が存在し、及び／又はＢ環、Ｃ環及び／
又はＤ環のいずれかの位置にそれぞれ水素原子以外の置
換基Ｒ^３、Ｒ^４及び／又はＲ^５が存在するエストラジオ
ール誘導体（以下、単に３，１７−ＯＨエストラジオー
ル誘導体と称する）の３位水酸基の水素原子をアシル基
又はダンシル基Ｒ^２で置換してエステルとする場合は、
３，１７−ＯＨエストラジオール誘導体を有機溶媒に溶
解した後にアルカリ金属と反応させて塩とし、次に、目
的のアシル基又はダンシル基に対応する酸クロライド又
は酸無水物を反応させる。他の方法として、アセトンと
水の混合溶媒にアルカリ金属を溶解し、３，１７−ＯＨ
エストラジオール誘導体を加え、目的のアシル基又はダ
ンシル基に対応する酸クロライド又は酸無水物を反応さ
せる。置換基がダンシル基である場合は、酸クロライド
としてダンシルクロライド〔５−（ジメチルアミノ）−
１−ナフタレンスルホニルクロライド〕を用いる。３，
１７−ＯＨエストラジオール誘導体の３位水酸基の水素
原子をアルキル基Ｒ^２で置換してアルキルエーテルとす
る場合は、通常のアルキルエーテル化法を応用すること
ができる。例えば、ジメチル硫酸等のジアルキル硫酸と
稀アルカリとを、エストラジオール誘導体に反応させ
る。こうして、Ａ環の３位がＯＲ^２基で置換された一般
式（ＩＩＩ）：

【化５】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数である
が、但し、ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時
に水素原子になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５
が水素原子と水酸基だけからなることはないものとし、
そしてｎが２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１は同一又
は異なっていてもよいものとする）のエストラジオール
誘導体（以下、３−ＯＲ^２エストラジオール誘導体と称
する）が得られる。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】３−ＯＲ^２エストラジオール誘導体とクロ
ラムブチルとの結合は、導入結合剤を用いて行うことが
できる。導入結合剤は、一般式（ＩＶ）：

【化６】 Ｘ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＹ （ＩＶ） 〔式中、Ｘはハロゲン原子（例えば、塩素原子又は臭素
原子）であるか又は水酸基であり、ＹはＸと同じか又は
異なるハロゲン原子（例えば、塩素原子又は臭素原子）
であるか又は水酸基若しくはその塩であり、ｍは１〜３
の整数である〕のヒドロキシル化カルボン酸誘導体もし
くはハロゲン化カルボン酸誘導体、例えば、モノクロロ
酢酸、モノブロモ酢酸、β−モノクロロプロピオン酸、
β−モノブロモプロピオン酸、モノクロロアセチルクロ
ライド、モノブロモアセチルブロマイドである。３−Ｏ
Ｒ^２エストラジオール誘導体と前記導入結合剤とを反応
させて、１７位水酸基をエステル化し、一般式（Ｉ
Ｉ）：

【化７】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数であり、
Ｘはハロゲン原子、水酸基又はその塩であるが、但し、
ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時に水素原子
になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が水素原子
と水酸基だけからなることはないものとし、そしてｎが
２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１が同一又は異なって
いてもよいものとする）の化合物〔以下、化合物（Ｉ
Ｉ）と称する〕を得ることができる。この反応は、ジメ
チルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、
アセトン、テトラヒドロフラン等の有機溶媒中で、−１
０〜＋３０℃で行うことができる。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】本結合体の毒性及び薬理作用は次のとおり
である。 （１）毒性：本結合体の代表例として１８種の結合体
を、Ｗｉｓｔａｒ系ラットに５０００ｍｇ／ｋｇの量で
経口投与して１週間観察したが、死亡例はなかった。即
ち、本結合体は、極めて安全な化合物である（後記実施
例３参照）。 （２）エストロゲン作用（子宮重量法）：本結合体の代
表例として１８種の結合体についてエストロゲン作用を
調べたが、エストロゲン作用は全く認められないか、あ
るいは極めて微小の作用しか認められなかった（後記実
施例４参照）。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】本結合体は、免疫抑制剤として、臓器等の
移植、例えば腎臓、肝臓、心臓、皮膚、骨髄等の移植分
野における拒絶反応の防止及び治療、更には、各種腎疾
患、甲状腺疾患、慢性関節リウマチ、自己免疫性溶血性
貧血、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、肝疾
患、多発性動脈炎、皮膚筋炎等の自己免疫疾患の治療に
有効である。従って、臓器移植分野における拒絶反応の
防止剤、その治療剤、及び自己免疫疾患治療剤として使
用することができる。本結合体を、免疫抑制剤として使
用する場合には、任意慣用の方法で、各種経路の投与用
に調製することができる。製剤例としては、錠剤、顆粒
剤、散剤、カプセル等の経口剤、座剤、注射剤、外用剤
である。投与経路及び投与量は、前記抗腫瘍剤の場合と
同じである。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】次いで、得られた１−メチル−エストラ−
１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオー
ル，３−ベンゾエート（９．９ｇ）と乾燥テトラヒドロ
フラン（２５０ｍｌ）とピリジン（２．４ｇ）とを、塩
化カルシウム管付四つ口フラスコ（５００ｍｌ）に入
れ、−５℃〜−３℃で、ブロモアセチルブロマイド（１
０ｇ）の乾燥テトラヒドロフラン（８０ｍｌ）溶液を滴
下した。０℃で１時間攪拌し、薄層クロマトグラフィー
で原料の消失を確認した後、析出したピリジン−ＨＢｒ
塩を濾別し、減圧乾燥した。残渣をシリカゲルを用いた
クロマトグラフィー〔展開溶媒＝クロロホルム／ｎ−ヘ
キサン（２／１容量）〕により精製し、標記の化合物
（９．３ｇ）を得た。理化学的データは以下のとおりで
ある。 Ｒｆ：０．７０〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ_２８Ｈ_３１Ｏ_４Ｂｒ 理論値（％） Ｃ：６５．７７，Ｈ：６．０６，Ｂｒ：
１５．６４ 実測値（％） Ｃ：６６．０， Ｈ：６．１， Ｂｒ：
１５．９ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１０（親ピーク）

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】次に、得られた１−メチル−エストラ−
１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオー
ル，３−（５−ジメチルアミノナフタレンスルホネー
ト）（１２ｇ）と乾燥テトラヒドロフラン（２００ｍ
ｌ）とピリジン（５ｇ）とを塩化カルシウム管付四つ口
フラスコ（５００ｍｌ）に入れ、−５℃〜−３℃で攪拌
した。この系にブロモアセチルブロマイド（７．６ｇ）
の乾燥テトラヒドロフラン溶液（４０ｍｌ）を滴下し
た。０℃で１時間攪拌し、室温で１晩攪拌した。薄層ク
ロマトグラフィーで原料の消失を確認し、析出したピリ
ジン−ＨＢｒ塩を濾別した後、濾液を硫酸マグネシウム
によって処理した。減圧下で溶媒を除去し、黄白色の固
体を得た。シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー
〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２容量）〕で精製
して標記の化合物を得た。 Ｒｆ：０．６２〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ_３３Ｈ_３８ＮＯ_５ＳＢｒ 理論値（％） Ｃ：６１．８７，Ｈ：５．９８， Ｂｒ：１２．４７，Ｎ：２．１９ 実測値（％） Ｃ：６１．７，Ｈ：５．８， Ｂｒ：１３．０，Ｎ：２．２^１ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ ２．９０ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_３，ＤＮＳ−Ｎ（Ｃ
Ｈ_３）_２），２．１４ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_３，Ａｒ−ＣＨ
_３），０．７０ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_３，Ｅ_２−１８Ｃ
Ｈ_３） ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６３９（親ピーク） 蛍光分析：Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝３５５ｎｍ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝ ５２５ｎｍ 炎色反応：ハロゲン呈色

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】ナス型フラスコ（３００ｍｌ）に、前記で
得られたエストリオール−３−ベンゾエート（５．６
ｇ）、ピリジン（１．３ｇ）及び乾燥テトラヒドロフラ
ン（１６０ｍｌ）を加え、冷却（０℃）下で攪拌した。
この系にブロモアセチルブロマイド（３．５ｇ）の乾燥
テトラヒドロフラン溶液（３５ｍｌ）を１時間かけて滴
下した。添加終了後、更に１．５時間攪拌した後、冷蔵
庫（約５℃）内で１晩放置した。析出したピリジン塩酸
塩を濾別し、濾液を濃縮して油状物質（８．４ｇ）を得
た。薄層クロマトグラフィー〔シリカゲル：シクロヘキ
サン／酢酸エチル（５／１容量）〕により、３つの成分
が確認された。シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶
媒は前記薄層クロマトグラフィーの場合と同じ）によ
り、Ｒｆ＝０．７１、Ｒｆ＝０．７５、及びＲｆ＝０．
８７を示す化合物がそれぞれ１ｇ、２．３ｇ、及び１ｇ
の量で得られた。標記の化合物はＲｆ＝０．７１を示す
化合物であった。 Ｒｆ：０．７１〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／１
容量）〕 ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１２（親ピーク）

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】得られたエストラジオール−３，１７β−
ジオール−６−オン（２ｇ）をアセトン（５０ｍｌ）に
溶解し、ナス型フラスコ（２００ｍｌ）に入れ、ＮａＯ
Ｈ（３０９ｍｇ）の水（１００ｍｌ）溶液を加えた。更
に、ベンゾイルクロライド（１．０４ｇ）のエチルエー
テル（１０ｍｌ）溶液を加え、厳しく攪拌すると白色物
質がすみやかに析出した。Ｇ−４フィルターで濾別した
後、結晶をよく水洗し、減圧乾固して白色結晶（２．６
ｇ）を得た。この化合物（２ｇ）とトリエチルアミン
（２ｇ）を乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解
し、三角フラスコ（１００ｍｌ）に入れ、氷水で冷却下
に攪拌した。次いで、この系にブロモアセチルブロマイ
ド（４ｇ）のテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）溶液を滴
下し、冷却下で攪拌下に２時間反応させ、冷蔵庫（約５
℃）内で１晩静置した。生成した沈殿をＧ−４フィルタ
ーで濾別し、濾液を減圧乾固して粘性化合物（３．４
ｇ）を得た。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製
を行った〔展開溶媒：シクロヘキサン／酢酸エチル（５
／３容量）〕。薄層クロマトグラフィー〔シリカゲル：
シクロヘキサン／酢酸エチル（５／３容量）〕により、
１スポット（Ｒｆ＝０．６３）を示す画分を集め、減圧
乾固し、微量の酢酸エチルとエチルエーテルを用いて−
２０℃で晶析し、白色結晶の標記の化合物（１．７ｇ）
を得た。 Ｒｆ：０．６３〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／３
容量）〕 ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１０（親ピーク）

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３８】前駆物質（４００ｍｇ）、乾燥テトラヒド
ロフラン（１５ｍｌ）、乾燥ピリジン（１．５ｍｌ）及
び無水酢酸（１．５ｍｌ）をナス型フラスコ（５０ｍ
ｌ）に入れ、塩化カルシウム管付の冷却管をつけて、６
０℃で６時間加熱攪拌し、室温で一晩放置した。反応液
を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー〔展開溶媒＝シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕で精製した。得られた油状物質（０．６ｇ）を
酢酸エチルとイソプロパノールにより晶析し、白色結晶
の標記本結合体（ＸＶＩＩ）０．３２ｇを得た。 Ｒｆ：０．４５〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／２
容量）〕 元素分析：Ｃ_４３Ｈ_４９Ｃｌ_２ＮＯ_９ 理論値（％） Ｃ：６４．９９，Ｈ：８．９４， Ｃｌ：８．９４，Ｎ：１．７６ 実測値（％） Ｃ：６５．１，Ｈ：９．１， Ｃｌ：８．８，Ｎ：１．８ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７９３（親ピーク）^１ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ ４．６０ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_２，ＣＯＣＨ_２Ｏ），３．７
１〜３．６０ｐｐｍ（ｍ，ＣＨ_２，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ
ｌ）_２），２．０ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_３，ＣＯＣＨ_３），
０．８３ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_３，１８−ＣＨ_３） 炎色反応：ハロゲン呈色

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３９】〔５〕エストラ−１，３，５（１０）−ト
リエン−３，１７β−ジオール−６−オン，３−ベンゾ
エート，１７−〔〔４−〔４−〔ビス（２−クロロエチ
ル）アミノ〕フェニル〕−１−オキソブトキシ〕アセテ
ート〔＝本結合体（ＸＶＩＩＩ）〕の合成 前記実施例１〔４〕で得たエストラ−１，３，５（１
０）−トリエン−３，１７β−ジオール−６−オン，３
−ベンゾエート，１７−モノブロモアセテート（５００
ｍｇ）と、クロラムブチルのカリウム塩（３４０ｍｇ）
に乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）を加え、４０℃
で２時間攪拌した。１晩室温で反応させ、生成されたカ
リウム塩をＧ−４フィルターで濾別した後、濾液を減圧
乾固した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー〔展開
溶媒＝シクロヘキサン／酢酸エチル（５０／１５容
量）〕で精製し、同じ溶媒の薄層クロマトグラフィーで
Ｒｆ＝０．２４の単一スポットを示す画分を集め、減圧
濃縮し、ｎ−ヘキサンにより晶析し、白色結晶の標記本
結合体（ＸＶＩＩＩ）３７０ｍｇを得た。 Ｒｆ：０．２４〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５０／
１５容量）〕 元素分析：Ｃ_４１Ｈ_４５Ｃｌ_２ＮＯ_７ 理論値（％） Ｃ：６７．０３，Ｈ：６．１３； Ｃｌ：９．６７，Ｎ：１．９１ 実測値（％） Ｃ：６６．９，Ｈ：６．４； Ｃｌ：１０．０，Ｎ：１．９ ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７３３（親ピーク）^１ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ ４．５７ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_２，ＣＯＣＨ_２Ｏ），３．７
０〜３．５９ｐｐｍ（ｍ，ＣＨ_２，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ
ｌ）_２），０．８０ｐｐｍ（Ｓ，ＣＨ_３，１８−Ｃ
Ｈ_３） 炎色反応：ハロゲン呈色

【手続補正１８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４０】実施例３：毒性 生後５週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラット（平均体重１３０
ｇ）の各群（１０匹）に、０．５％メチルセルロース水
溶液中の本結合体（Ｉ）の懸濁液を５０００ｍｇ／ｋｇ
の割合で、金属製胃ゾンデを用いて一回強制経口投与
し、投与してから７日後まで観察したが、死亡例は認め
られなかった。本結合体（ＩＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）につ
いても同様の結果を得た。

【手続補正１９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４９】ＴＧＦ−αの測定は稲垣らの報告と同様
に、ウサギ抗体とマウスモノクローナル抗体（ＡＴＧ−
２Ｓ）を用い、サンドイッチＥＩＡ法により行った（Ｉ
ｎａｇａｋｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ，Ｍｅｔｈｏｄ．１２８：２７−３７；１９９０）。
結果を表１０に示す。

【表１０】 ｎ＝３の平均±ＳＤ 本結合体（Ｉ）は比較物質Ｉと同様に、１０^−８Ｍのエ
ストラジオール（表中では「Ｅ_２」で示す）によって誘
導されるＴＧＦ−α産生分泌を１０^−６Ｍで完全に抑制
することが観察されたが、等モルのクロラムブチルで
は、ＴＧＦ−α産生分泌への影響は認められなかった。

【手続補正２０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５５】実施例１０：免疫抑制作用 （１）異種抗原刺激反応〔本結合体（Ｉ）のマイトジェ
ン反応に対する作用〕 異種抗原刺激に対するリンパ球の幼若化反応（^３Ｈ−ｔ
ｈｙｍｉｄｉｎｅの細胞内への取り込みを指標として測
定）、即ち、細菌等に対する免疫反応に及ぼす本結合体
（Ｉ）の影響について調べた。なお、マイトジェンとし
てはヒトリンパ球（特にＴ細胞）に最も強い反応を示す
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いた。男性健常人
より末梢静脈血を真空採血管に採取し、遠心（２０００
ｒｐｍ；常温；２０分間）した。血漿を更に遠心（３５
００ｒｐｍ；４℃；２０分間）して、培養液（ＲＰＭＩ
１６４０）に２０％となるように添加した。血清を取り
去った残留物に前記と同じ培養液を同量加えて希釈した
後、リンホプレップに静かに重層した。これを遠心処理
（１５００ｒｐｍ；２０℃；３０分間）した後、単核細
胞層を取り出し、培養液で２〜３回洗浄し、細胞数を５
×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整した。

【手続補正２１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６０】

【表１７】 コントロールでは、生存日数中間値が８日と少なく、Ｇ
ＶＨＤ（ｇｒａｆｔｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅ
ａｓｅ）発症と考えられる早期死亡が認められた。一
方、本結合体（Ｉ）では、マウス骨髄移植モデル系にお
いて、比較物質Ｉと同様に明らかな生存率の延長がみら
れた。

【手続補正２２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６２】

【表１８】 １）リンパ球への^３Ｈ−チミジンの取り込み百分率：コ
ントロールを１００とした。ｎ＝３，平均±ＳＤ ２）結合体類とは本結合体又は比較物質を示す。 免疫抑制物質（ＴＧＦ−β）の抑制と同程度に本結合体
のＭＬＣ反応の抑制とＴＧＦ−βとの併用効果が認めら
れた。抗ＴＧＦ−β抗体はＭＬＣ反応へ影響を与えず、
本結合体との併用で、本結合体（Ｉ）の単独で認められ
たＭＬＣ反応の抑制作用をほぼ中和した。これらの傾向
は比較物質Ｉと同様であった。従って、本結合体（Ｉ）
のＭＬＣ反応の抑制作用は、ＴＧＦ−β産生と深く関与
しているものと考えられる。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年４月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】本結合体は、例えば以下の方法によって調
製することができる。本結合体を構成するエストラジオ
ール誘導体部分の骨格をなし、エストラジオールのＡ環
の３位及びＤ環の１７位がそれぞれ水酸基であるエスト
ラジオール誘導体〔即ち、Ａ環の１位、２位若しくは４
位に置換基Ｒ^１が存在し、及び／又はＢ環、Ｃ環及び／
又はＤ環のいずれかの位置にそれぞれ水素原子以外の置
換基Ｒ^３、Ｒ^４及び／又はＲ^５が存在するエストラジオ
ール誘導体（以下、単に３，１７−ＯＨエストラジオー
ル誘導体と称する）〕の３位水酸基の水素原子をアシル
基又はダンシル基Ｒ^２で置換してエステルとする場合
は、３，１７−ＯＨエストラジオール誘導体を有機溶媒
に溶解した後にアルカリ金属又はその水酸化物と反応さ
せて塩とし、次に、目的のアシル基又はダンシル基に対
応する酸クロライド又は酸無水物を反応させる。他の方
法として、アセトンと水の混合溶媒にアルカリ金属の水
酸化物を溶解し、３，１７−ＯＨエストラジオール誘導
体を加え、目的のアシル基又はダンシル基に対応する酸
クロライド又は酸無水物を反応させる。置換基がダンシ
ル基である場合は、酸クロライドとしてダンシルクロラ
イド〔５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホ
ニルクロライド〕を用いる。３，１７−ＯＨエストラジ
オール誘導体の３位水酸基の水素原子をアルキル基Ｒ^２
で置換してアルキルエーテルとする場合は、通常のアル
キルエーテル化法を応用することができる。例えば、ジ
メチル硫酸等のジアルキル硫酸と稀アルカリとを、エス
トラジオール誘導体に反応させる。こうして、Ａ環の３
位がＯＲ^２基で置換された一般式（ＩＩＩ）：

【化５】 （式中、Ｒ^１は炭素数１〜４のアルキル基又はアルコキ
シ基であり、Ｒ^２はアシル基、ダンシル基又はアルキル
基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原
子、オキソ基、水酸基又はアシルオキシ基であり、ｍは
１〜３の整数であり、そしてｎは０〜３の整数である
が、但し、ｎが０の場合にはＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５が同時
に水素原子になることはなく、またＲ^３、Ｒ^４及びＲ^５
が水素原子と水酸基だけからなることはないものとし、
そしてｎが２又は３の場合にはそれらの基Ｒ^１は同一又
は異なっていてもよいものとする）のエストラジオール
誘導体（以下、３−ＯＲ^２エストラジオール誘導体と称
する）が得られる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１３】（４）選択的免疫抑制作用：以下の試験
（Ａ）〜（Ｄ）において、本結合体は、比較物質（エス
トラジオールークロラムブチル結合体）と同様の選択的
免疫抑制効果を示した。 （Ａ）異種抗原刺激反応：本結合体は、フィトヘマグル
チニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＰＨ
Ａ）に対するリンパ球の幼若化反応に大きな影響を与え
なかった〔後記実施例１０（１）参照〕。 （Ｂ）同種抗原刺激反応：本結合体は、リンパ球混合培
養（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒ
ｅ；ＭＬＣ）反応を抑制した〔後記実施例１０（２）参
照〕。 （Ｃ）マウス骨髄移植モデルにおけるＧＶＨＲ（ｇｒａ
ｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）抑
制作用：本結合体は、移植後マウスの生存日数を延長し
た（後記実施例１１参照）。 （Ｄ）ＭＬＣ反応抑制作用におけるＴＧＦ−β産生の関
与；本結合体と免疫抑制物質（ＴＧＦ−β）とは併用効
果があり、本結合体の抑制効果は抗ＴＧＦ−β抗体との
併用で中和された。従って、本結合体のＭＬＣ反応抑制
作用にはＴＧＦ−β産生の関与が考えられる（後記実施
例１２参照）。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１６】本結合体を、動脈内投与用注射剤（即ち、
動注剤）に含有させて用いる場合には、ヨード化ケシ油
脂肪酸エステルに本結合体を溶解するのが好ましい。動
注剤中の本結合体の濃度は、好ましくは０．１〜１０重
量％、より好ましくは１〜５重量％である。ヨード化ケ
シ油脂肪酸エステルとしては、ヨード化３０〜４０重量
％の低級アルキルエステルが好ましく、リピオドール
〔リピオドールウルトラフルイド（ＬｉＰｉｏｄｏｌ
Ｕｌｔｒａ−ｆｌｕｉｄｅ）の商品名〕（ヨード化３
８．８重量％、エチルエステル）が特に好ましい。この
動注剤の投与量は、好ましくは０．０１〜２０ｍｇ／ｋ
ｇ、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。こ
の動注剤は、肝癌、乳癌、婦人科癌、消化器癌及び泌尿
器癌に有効である。この動注剤は、癌組織に特異的に集
まり、持続性が高い。また、ヨード化ケシ油脂肪酸エス
テルを用いると、Ｘ線、ＣＴ（コンピューター断層装
置）又は超音波等により腫瘍細胞を観察しながら診断又
は治療を行うことができる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】ナス型フラスコ（３００ｍｌ）に、前記で
得られたエストリオールー３−ベンゾエート（５．６
ｇ）、ピリジン（１．３ｇ）及び乾燥テトラヒドロフラ
ン（１６０ｍｌ）を加え、冷却（０℃）下で攪拌した。
この系にブロモアセチルブロマイド（３．５ｇ）の乾燥
テトラヒドロフラン溶液（３５ｍｌ）を１時間かけて滴
下した。添加終了後、更に１．５時間攪拌した後、冷蔵
庫（約５℃）内で１晩放置した。析出したピリジンＨＢ
ｒ塩を濾別し、濾液を濃縮して油状物質（８．４ｇ）を
得た。薄層クロマトグラフィー〔シリカゲル：シクロヘ
キサン／酢酸エチル（５／１容量）〕により、３つの成
分が確認された。シリカゲルクロマトグラフィー（展開
溶媒は前記薄層クロマトグラフィーの場合と同じ）によ
り、Ｒｆ＝０．７１、Ｒｆ＝０．７５、及びＲｆ＝０．
８７を示す化合物がそれぞれ１ｇ、２．３ｇ、及び１ｇ
の量で得られた。標記の化合物はＲｆ＝０．７１を示す
化合物であった。 Ｒｆ：０．７１〔シクロヘキサン／酢酸エチル（５／１
容量）〕 ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１２（親ピーク）

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４３】実施例５：選択的増殖抑制作用 （１）選択的増殖抑制作用（マウス正常細胞と悪性細
胞） 対数増殖期にあるマウス３Ｔ３正常細胞及び悪性細胞３
Ｔ３ＳＶ−４０を０．２５％トリプシンで処理し、細胞
を２×１０^４個／ｍｌの割合で培養液に分散させた後、
その細胞分散液を円型短試〔池本理化〕に１本あたり１
ｍｌの量で植込み、綿栓後、水平より５°の傾斜で炭酸
ガス培養器（９５％空気、５％炭酸ガス、３７℃恒温、
９５％湿度）で静置培養した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４４】細胞の植込から１日経過後に培養液を除去
し、ｐＨ７．４の新鮮な培養液を加え、更にジメチルス
ルホキシドに溶解した各被検試料１０μｇ／ｍｌ又は５
０μｇ／ｍｌを加えた（その際、ジメチルスルホキシド
の濃度は培養液に対して１％となるようにした）。コン
トロールとしてはジメチルスルホキシドのみを加えた。
被検試料を添加してから５日間培養を行い、生細胞の計
測を、トリパンブルーに不染な細胞のビュルケルチュル
ク血球計算盤により行った。１被検試料の濃度につき３
検体の平均値を求めた。コントロールとの比較より生存
率（％）を求めた。結果を表６及び表７に示す。本結合
体は比較物質１と同様な悪性細胞への選択的な増殖抑制
作用を維持していることが認められた。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５５】実施例１０：免疫抑制作用 （１）異種抗原刺激反応〔本結合体（Ｉ）のマイトジェ
ン反応に対する作用〕 異種抗原刺激に対するリンパ球の幼若化反応（^３Ｈ＝ｔ
ｈｙｍｉｄｉｎｅの細胞内への取り込みを指標として測
定）、即ち、細菌等に対する免疫反応に及ぼす本結合体
（Ｉ）の影響について調べた。なお、マイトジェンとし
てはヒトリンパ球（特にＴ細胞）に最も強い反応を示す
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いた。男性健常人
より末梢静脈血を真空採血管に採取し、遠心（２０００
ｒｐｍ；常温；２０分間）した。血清を更に遠心（３５
００ｒｐｍ；４℃；２０分間）して、上清を培養液（Ｒ
ＰＭ１１６４０）に２０％となるように添加した。血清
を取り去った残留物に前記と同じ培養液を同量加えて希
釈した後、リンホプレップに静かに重層した。これを遠
心処理（１５００ｒｐｍ；２０℃；３０分間）した後、
単核細胞層を取り出し、培養液で２〜３回洗浄し、細胞
数を５×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整した。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５７】（２）同種抗原刺激反応〔本結合体（Ｉ）
のリンパ球混合培養（ＭＬＣ）に対する作用） 臓器移植の際の免疫反応のモデルで、いわゆる同種抗原
刺激反応であるリンパ球混合培養における本結合体
（Ｉ）の作用について検討した。男性健常人（２名）よ
りそれぞれＰＨＡ反応の場合と同様にして単核細胞を
得、一方のヒトより得られた細胞に１５Ｇｙの放射線処
理を行った。培養液にて洗浄した後、細胞数を５×１０
^５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、両細胞をそれぞれ１００μ
ｌずつ合計２００μｌとなるようにマイクロプレートの
各ウエルに分注した。本結合体（Ｉ）及び比較物質Ｉ
を、ＰＨＡ反応の場合と同様にジメチルスルホキシドに
溶解して培養系に加えた。６日間培養した後、^３Ｈ−チ
ミジン（１μＣｉ／ｍｌ）を添加し、更に１８時間培養
し、セルハーベスターにてガラスフィルター上に細胞を
集め、その放射能活性を液体シンチレーションカウンタ
ーにて測定した。結果を表１６に示す。本結合体（Ｉ）
は、比較物質Ｉと同様にＭＬＣ反応を抑制することが認
められた。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５９】実施例１１：マウス骨髄移植モデルにおけ
るＧＶＨＲ抑制作用 ８週令の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス及び雄性Ｂ６Ｃ３Ｆ_１
マウスを用いて、骨髄移植モデルにおける本結合体のＧ
ＶＨＲ（ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）抑制作用について検討した。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマ
ウスの脾臓から、金属メッシュを用いて脾細胞を、１０
％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に集めた。また同じ
マウスの大腿骨よりシリンジを用いて骨髄細胞を洗い出
し、ＲＰＭＩ１６４０培養液に集めた。浮遊している両
細胞を２〜３回洗浄した後、それぞれを８×１０^６ｃｅ
ｌｌ／ｍｌに調整し、これらを１：１の割合で混合し、
予め９Ｇｙの放射線処理を行ったＢ６Ｃ３Ｆ_１マウスの
尾静脈より、前記混合液０．５ｍｌを注入した。移植前
日より、当日を除き、移植後３０日まで、本結合体
（Ｉ）又は比較物質Ｉを２ｍｇ／ｋｇ（０．５％メチル
セルロース生理食塩水分散剤）の量で連日経口的に投与
した。コントロール群には０．５％メチルセルロース生
理食塩水のみを投与した。マウスの生存について観察し
た。結果を表１７に示す。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６２】

【表１８】 １）リンパ球への^３Ｈ−チミジンの取り込み百分率：コ
ントロールを１００とした。ｎ＝３，平均±ＳＤ ２）結合体類とは本結合体又は比較物質を示す。 免疫抑制物質（ＴＧＦ−β）の抑制と同程度に本結合体
のＭＬＣ反応の抑制がみられ、更にＴＧＦ−βとの併用
効果が認められた。抗ＴＧＦ−β抗体はＭＬＣ反応へ影
響を与えず、本結合体との併用で、本結合体（Ｉ）の単
独で認められたＭＬＣ反応の抑制作用をほぼ中和した。
これらの傾向は比較物質Ｉと同様であった。従って、本
結合体（Ｉ）のＭＬＣ反応の抑制作用は、ＴＧＦ−β産
生と深く関与しているものと考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松平 忠弘 埼玉県浦和市鹿手袋４−30−10 リュミエ ール武蔵浦和301 (72)発明者 浅野 喜朗 茨城県稲敷郡茎崎町高崎1820−６

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ）： 【化１】 のエストラジオール誘導体−クロラムブチル結合体。
2. 【請求項２】 エストラジオール誘導体の１７位が１７
   βである請求項１に記載の結合体。
3. 【請求項３】 Ｒ² のアシル基がベンゾイル基、ダンシ
   ル基、アセチル基、パルミトイル基、ステアリル基及び
   リノレイル基からなる群から選ばれた基である請求項１
   に記載の結合体。
4. 【請求項４】 Ｒ² のアルキル基が炭素数１〜４のアル
   キル基である請求項１に記載の結合体。
5. 【請求項５】 Ｒ³ 、Ｒ⁴ 又はＲ⁵ のアシルオキシ基が
   ベンゾイルオキシ基、アセトキシ基、プロパノイルオキ
   シ基、ブタノイルオキシ基及びペンタノイルオキシ基か
   らなる群から選ばれた基である請求項１に記載の結合
   体。
6. 【請求項６】 一般式（II）： 【化２】 の化合物。
7. 【請求項７】 １７位が１７βである請求項６に記載の
   化合物。
8. 【請求項８】 一般式（III)： 【化３】 の化合物。
9. 【請求項９】 １７位が１７βである請求項８に記載の
   化合物。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載の一般式（II）の化合
    物とクロラムブチルの塩、酸ハライド又は酸無水物とを
    反応させることを特徴とする、請求項１に記載の一般式
    （Ｉ）のエストラジオール誘導体−クロラムブチル結合
    体の製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載のエストラジオール誘
    導体−クロラムブチル結合体を含有することを特徴とす
    る、抗腫瘍剤。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のエストラジオール誘
    導体−クロラムブチル結合体を含有することを特徴とす
    る免疫抑制剤。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載のエストラジオール誘
    導体−クロラムブチル結合体を含有することを特徴とす
    る注射剤。
14. 【請求項１４】 ヨード化ケシ油脂肪酸エステルに溶解
    した、請求項１に記載のエストラジオール誘導体−クロ
    ラムブチル結合体を含有することを特徴とする注射剤。
15. 【請求項１５】 請求項１に記載のエストラジオール誘
    導体−クロラムブチル結合体を含有することを特徴とす
    るカプセル剤。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載のエストラジオール誘
    導体−クロラムブチル結合体を含有することを特徴とす
    る錠剤。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載のエストラジオール誘
    導体−クロラムブチル結合体を含有することを特徴とす
    る座剤。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載のエストラジオール誘
    導体−クロラムブチル結合体を含有することを特徴とす
    る外用剤。