CN1976693A - 转甲状腺素蛋白的稳定 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有芳香取代基的二苯并呋喃－4，6－二羧酸母核结构，所述取代基是应用三种不同类型的键在C1位引入的，并且该母核结构提供了极好的淀粉蛋白形成抑制剂，该抑制剂相对于母体化合物1显示出对TTR比对所有其它血浆蛋白具有增强的亲和力和显著增强的结合选择性。本发明还公开了这些化合物通过利用在TTR四聚体上的动力学稳定性来起作用。

Description

转甲状腺素蛋白的稳定
技术领域
本发明涉及转甲状腺素蛋白淀粉状蛋白原纤维形成抑制剂。更具体地讲，本发明涉及作为转甲状腺素蛋白淀粉状蛋白原纤维形成抑制剂的衍生的二苯并呋喃类化合物。
背景技术
人们已经发现了多种结构上不同的小分子转甲状腺素蛋白(TTR)稳定剂，其中特别令人关注的为二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)，图1(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.等人.Nature Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L.等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller Sean，R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。该抑制剂(1；7.2μM)历经72小时后可以减少90％WT-TTR(3.6μM)淀粉状蛋白形成(pH 4.4)。TTR·12的X射线共结晶结构显示该抑制剂通过特异性结合各个甲状腺素结合位点的外部来发挥其抑制活性(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Bio2000，7，312-321)。需要用伸入甲状腺素结合囊的内腔中的亚结构来修饰1以增强其在人血液中与TTR结合的亲和力和选择性。
发明内容
本发明公开了具有芳香取代基的二苯并呋喃-4，6-二羧酸母核结构，该取代基通过三种不同类型的键于C1位与二苯并呋喃环连接，并且该母核结构提供了极好的淀粉蛋白形成抑制剂，该抑制剂相对于母体化合物1显示出对TTR较之对所有其它的血浆蛋白增强的亲和力和显著增强的结合选择性(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。本发明还公开了这些化合物是通过赋予TTR四聚体动力学稳定性来起作用。
转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉蛋白形成需要限制四聚体解离和部分单体变性的速率来产生具有错聚集能力的物质类型。该过程产生混浊，可用于鉴别转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉蛋白形成抑制剂，该抑制剂包括二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)。TTR·12的X射线共结晶结构显示其仅利用两个甲状腺素结合囊的外部进行结合并且可以抑制TTR淀粉蛋白的形成。因此，通过对结构进行设计，采用三种不同的化学键在二苯并呋喃环的C1位引入芳基取代基来填补未使用的甲状腺素结合囊的内部。28个具有增强效力并且显著增强血浆TTR结合选择性的淀粉蛋白形成抑制剂通过赋予天然的TTR四聚体结构动力学稳定性来起作用，其建立了在生理条件下不能逾越的屏障。由于已知TTR天然状态的动力学稳定性可以通过等位基因间的反式抑制来改善疾病，因此优化的基于二苯并呋喃的抑制剂也将起到该作用。预防淀粉蛋白形成的启动是进行临床干预的最保守的策略，这是因为人们仍不清楚究竟是哪种TTR错聚集中间体产生毒性。极好的结合选择性使这些抑制剂能够在复杂的生物液(如血浆)中占据甲状腺素的结合位点，这对于在人体中抑制淀粉蛋白形成是必要的。现在明确了基于二苯并呋喃的淀粉蛋白形成抑制剂具有很高的选择性、亲和力和效力。
本发明的一方面涉及式I代表的化合物：
Figure A20058002172300091
                                  (式I)。
在式I中，X不存在或是选自-O-、-S-和-NH-的二价基团；并且R2、R3、R4和R5是独立地选自-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-CF3和-CO2H的基团。在本发明第一方面的第一种情况中，该化合物是式II代表的化合物：
Figure A20058002172300092
                                  (式II)。
在式II的情况中，优选的实施方案可以包括其中R2是选自-H、-F、-Cl和CF3的基团的化合物；另外优选的实施方案可以包括其中R4是选自-H、-Cl和-CO2H的基团的化合物；另外优选的实施方案可以包括其中R5是选自-H、-F和-Cl的基团的化合物；优选的式II的化合物包括选自以下结构式代表的化合物：
Figure A20058002172300101
在本发明第一方面的第二情况中，该化合物是式III代表的化合物：
Figure A20058002172300111
                                   (式III)。
在式III的情况中，优选的实施方案包括其中R3是选自-H、-F、-Cl、-Br和CF3的基团的化合物；另外优选的实施方案包括其中R5是选自-H、-F、-Cl和-Br的基团的化合物；优选的式III的化合物还包括选自以下结构式代表的化合物：
在本发明第一方面的第三情况中，该化合物是式IV代表的化合物：
                                  (式IV)。
在式IV的情况中，优选的实施方案包括其中R2是选自-H、-F和-Cl的基团的化合物；另外优选的实施方案包括其中R3是选自-H、-F、-Cl、-CF3和-CO2H的基团的化合物；另外优选的实施方案包括其中R4是选自-H和-CO2H的基团的化合物；另外优选的实施方案包括其中R5是选自-H、-F、-Cl和-CF3的基团的化合物。
优选的式IV的化合物包括选自以下结构式代表的化合物：
Figure A20058002172300122
本发明的另一方面涉及有效抑制淀粉状蛋白原纤维形成的方法，该方法包括使转甲状腺素蛋白与一定浓度的选自上述的式I-IV的化合物接触的步骤。
附图说明
图1A是TTR·12的X射线晶体结构(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321)。
图1B是代表放入甲状腺素结合囊中的1-取代的-二苯并呋喃-4，6-二羧酸的设计的线图，其中X代表NH、O或直接的C芳基-C芳基键。R代表为填补TTR内部结合腔而设计的芳环取代基。
图2是突出了在pH 4.4(72小时)对抗WT-TTR(3.6μM)淀粉状蛋白原纤维形成(f.f.)的浓度依赖的酸取代的二苯并呋喃的活性的表。
图3是显示了对抗WT-TTR(3.6μM)淀粉状蛋白原纤维形成(pH 4.4，72小时)的基于二苯并呋喃的淀粉状蛋白抑制剂活性(3.6μM)以及在人血浆中与TTR的结合化学计量的概要的表。
图4是合成1-羟基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相应的三氟甲基磺酸酯的流程图。
图5是合成1-苯基-、苯氧基-和苯胺基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相应的二羧酸酯的流程图。
图6是显示在pH 4.4(72小时)对抗WT-TTR(3.6μM)淀粉状蛋白原纤维形成(f.f.)的基于二苯并呋喃的抑制剂的活性(7.2μM)的表。
图7是说明二苯并呋喃血浆TTR结合化学计量对原纤维形成抑制剂效力的图。
图8是在与27(7.2μM)预培养后并且在另外的pH降低为4.4的72小时培养周期(在无抑制剂时引起最大淀粉状蛋白形成的时间设计)后，在TTR(3.6μM)沉降速率研究中，280nm的吸光度对与中心的距离的点图。
图9是在与27(7.2μM)预培养后并且在另外的pH降低为4.4的72小时培养周期(在无抑制剂时引起最大淀粉状蛋白形成的时间设计)后，在TTR(3.6μM)平衡超速离心研究中，280nm的吸光度对与中心的距离的点图。
图10是由部分酸变性诱导的WT-TTR(3.6μM)原纤维形成的时间过程分析的点图，该分析在无(▲)和有7.2цM(◇)和3.6μM(○)抑制剂25、47和64的存在下进行，通过在500nm处的浊度进行测定(见图中不同抑制剂的明暗标记)。
图11是WT-TTR(3.6μM)四聚体解离(6.0M尿素)的时间过程分析的点图，该分析在无(▲)和有7.2μM(◇)和3.6μM(○)浓度的抑制剂25、47和64的存在下进行(见图中不同抑制剂的颜色标记)。
发明详述
C1-芳基取代的二苯并呋喃(7.2μM)除了一个外所有其他的二苯并呋喃均是体外(pH 4.4，37℃)极好的WT-TTR(3.6μM)酸介导的原纤维形成抑制剂，甚至那些带有未取代的芳基环的二苯并呋喃(图6)。唯一的对TTR淀粉蛋白形成无效的基于二苯并呋喃的抑制剂是34，其潜在地带有四个负电荷。因为所有的化合物完全抑制TTR原纤维形成(在±5％试验误差内)，所以从7.2μM抑制剂的数据没有推导出构效关系(SAR)。但是，图3和7表明在抑制剂浓度等于TTR(3.6μM)时抑制效力的范围，由此得到一些关于SAR的结论，但是其受到制备的31类似物和试验误差的限制。具体地讲，在3.6μM时所有的抑制剂(除了34外)相对于母体化合物(1)均具有增强的效力(图3)。最重要的是，在30个显示出增强的效力的抑制剂中，除了两个(31和35)外所有其他的抑制剂均显示出在人血浆中对TTR的显著增强的结合选择性。C1取代的抑制剂具有极好的结合选择性对于在复杂的生物系统中抑制TTR淀粉蛋白形成而言是非常理想的。
将所有三个抑制剂系列中发现的四种C1-芳基取代的形式(H、3-CF3、3，5-F2和3，5-Cl2)进行比较发现，芳环直接与二苯并呋喃骨架的C1位相连的抑制剂(下文中称为二芳基化物)相对于其二芳基胺和二芳基醚对应物具有略微增强的抑制效力(图3)。这可能是由于结构的不同使环在内部结合腔中的取向不同；但是，值得注意的是，该优选可能不支持非常大的类似物系列。有人可能会争辩，其它的两个系列在血浆中产生选择性最强的TTR结合物；但是，在此SAR被多至100种蛋白竞争该抑制剂这样一个事实所混淆。而并不令人吃惊的是大多数潜在的抑制剂具有2-F或3，5-Cl2取代基(36、63和67)，其可能在甲状腺素结合位点识别卤素结合囊，略微令人吃惊的是3-CO2H取代的芳基抑制剂33和69是其中最具潜力的(尽管它们对TTR的血浆结合选择性是中等的)。先前的简单的二苯基和二苯基胺抑制剂的晶体学结果说明该化合物在内部结合腔中优选为具有带有羧基的芳环(使H与S117和T119键合)(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Adamski-Werner，S.L等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374)。
在C1位引入芳基不仅增强了抑制剂的效力，更重要的是显著增强了对TTR的血浆结合选择性，这大概是通过相对于所有的其它血浆蛋白增强对TTR的结合亲和力来实现的。在血浆中C1-芳基取代的基于二苯并呋喃的抑制剂对TTR的较高的结合选择性清楚地被制备的～2/3的化合物显示出TTR结合化学计量大于1的事实证明。非常有趣的是仅应用TTR的外腔结合选中的1显示出在血浆中测量不到的对TTR的结合选择性。先前的不同化学结构的淀粉蛋白形成抑制剂的经验揭示极少的化合物显示出超过1的结合化学计量(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew.Chem.2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998，95，12956-12960；Baures，P.W.；Peterson，S.A.；Kelly，J.W.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nature Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L.等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller S.R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。图7中用灰色覆盖的面积包括满足高体外活性(＜40％原纤维形成)和高结合选择性(在血浆中与TTR键合＞1当量)标准的基于二苯并呋喃的化合物。最重要的是几乎所有的基于二苯并呋喃的抑制剂、特别是那些在灰色正方形(图7)中的抑制剂的活性和结合选择性在血浆中在动力学方面对于稳定TTR是足够的，这些抑制剂显示出令人满意的口服生物利用度、药物动力学和毒性特征。
并不奇怪的是体外抑制剂效力(3.6μM)和在血浆中抑制剂对TTR的结合选择性(10.8μM)并不相关(图7)。对TTR比对其它血浆蛋白显示出较高结合选择性的化合物应该是极好的原纤维形成抑制剂。但是，反之未必正确：极好的抑制剂不一定显示出很高的TTR血浆结合选择性。显示出很高的TTR血浆结合选择性的极好的抑制剂是在人类中最有用的化合物，因为这些抑制剂可以选择性地稳定TTR的天然状态而使其不处于解离过渡状态并且在富含蛋白的生物液中赋予TTR动力学稳定性。这些抑制剂与TTR的结合常数是很重要的，因为动力学稳定性的程度与结合常数是成比例的。但是，关注结合常数和体外效力可能会产生误导，因为化合物可能是体外极好的TTR淀粉蛋白形成抑制剂，但与其它的血浆蛋白可以结合，因此在人类中没有作用(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。不显示出对TTR很好的结合选择性的体外有效的抑制剂很可能与其它的血浆蛋白、例如白蛋白相互作用(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。因为二苯并呋喃抑制剂作为一组抑制剂相对于迄今为止已鉴定的抑制剂具有空前的结合选择性和抑制效力(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew.Chem.2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.；Peterson，S.A.；Kelly，J.W.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nature Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller S.R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)，这些化合物对于进一步的药理学评价是很理想的。因为TTR是T4的三级载体(tertiary carrier)，其99％以上的结合位点是未被占据的；因此，结合TTR的抑制剂不应该干扰T4的体内稳态。
C1取代的基于二苯并呋喃的TTR淀粉蛋白形成抑制剂由于其体外淀粉状蛋白抑制效力、其在血浆中对于TTR极好的结合选择性、其降低TTR解离速率(这是通过本发明中应用的方法可见高血浆选择性的证据)、它们赋予TTR四聚体动力学稳定性的能力、其在血浆中的化学稳定性以及其在低pH时的化学稳定性(使其是极好的口服施用候选物)，因此这类抑制剂是有前途的。这些抑制剂用于治疗TTR淀粉状蛋白疾病，包括SSA、FAP和FAC，因为已知TTR的动力学稳定性可以改善FAP(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Coelho，T.等人.J.Rheumatol. 1993，20，179-179；Coelho，T.等人.Neuromuscular Disord.1996，6，27-27)。
设计与合成：
图1A描述了在TTR甲状腺素结合位点之一中1的两种对称等价结合方式(绿色和黄色)，该结合位点的表面用灰色画出轮廓线(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321)。4和6位的羧酸基(carboxylate)与赖氨酸15和15，的ε-NH3 +基团在甲状腺素结合位点的入口处发生静电相互作用。除去其中一个羧酸基会使二苯并呋喃的活性大大降低，该活性在大多数情况下随着羧酸基与芳环的间距而变化(图2)。另外，二苯并呋喃环很好地填补了甲状腺素结合腔外部的形状和疏水性。观察图1A的TTR·12晶体结构发现在与1结合的甲状腺素结合位点的内部具有大量的未占据的体积。基于此结构，清楚的是取代基、例如芳环可以通过与1的二苯并呋喃环的C1位相连来伸入结合位点的内部。如图1B所示，该取代基可以通过杂原子(N或O)与二苯并呋喃骨架键合或直接通过C芳基-C芳基键与之键合(未示出)。选择芳香族取代基(图3)以使其在内腔中与卤素结合囊或氢键合亚结构相互作用，其基于苯环在内部结合腔中的预期的取向以及先前的来自于被认为是类似决定其芳环位置的其它化学系列的SAR数据(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.等人.Nature Rev.Drug.Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller Sean，R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。
如先前所述，C1取代的基于二苯并呋喃的抑制剂的合成开始于商购的2，4-二叔丁基-6-溴苯酚(2)的酚基全偶联(homo-coupling)，得到二苯并呋喃衍生物3，此过程中应用六氰合铁(III)酸钾(Tashiro，M.Y.等人.Synthesis1980，6，495-496)(图4)。将该四-叔丁基二苯并呋喃衍生物在甲苯中进行烷基转移以形成1-羟基二苯并呋喃(4)，其从2的总收率为33％(已经出现合成该中间体的选择性策略)(Labiad，B.；Villemin，D.Synthesis 1989，143-144；Lee，Y.R.等人.Org.Lett.2000，2，1387-1389)。酚的保护之后，将甲硅烷基醚5在4-和6-位与仲丁基锂选择性地邻位金属化(1-氧上的三异丙基甲硅烷基使其不作为金属化的主体)(Snieckus，V.Chem.Rev.1990，90，879-933)。将二价阴离子用气态CO2淬灭并且酯化，得到6，然后，将6用TBAF脱保护并且以很高的总收率将其转化为三氟甲基磺酸酯8。
将选择的苯胺应用Buchwald和Hartwig开发的钯介导的N-芳基化反应与三氟甲基磺酸酯8偶联，得到基于二苯并呋喃的二芳基胺类似物9-23(图5)(Louie，J.D等人。J.Org.Chem.1997，62，1268-1273；Wolfe，J.P.B.，Stephen L.Tetrahedron Lett.1997，38，6359-6362)。为了将芳基醚引入到二苯并呋喃的C1位上，应用Chan和Evan的铜介导的二芳基醚偶联方法将酚7与数种苯基硼酸交联，得到化合物39-43(Chan，D.M.T.等人.Tetrahedron Lett.1998，39，2933-2936；Evans，D.A.等人.Tetrahedron Lett.1998，39，2933)。在数种苯基硼酸的存在下使化合物8经历Suzuki偶联条件，得到基于二苯并呋喃的二芳基类似物49-59(Suzuki，A.Modern AreneChemistry 2002，53-106)。在这些前体中将甲基酯皂化获得所需的二苯并呋喃-4，6-二羧酸胺(24-38)、醚(44-48)和二芳基化物(60-70)，这些化合物被评价为潜在的TTR淀粉蛋白形成抑制剂。
结果：
有效的小分子淀粉蛋白形成抑制剂的两个最重要的特征是它们必须能够在血中以高亲和力和选择性与TTR结合并且稳定TTR天然的四聚体结构(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Razavi，H.等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。应用重组TTR在促进淀粉蛋白形成的部分变性缓冲液(pH 4.4，37℃)中首次评价抑制效力(化合物24-38、44-48以及60-70)。然后，评价在人类血浆中相对于其它蛋白与TTR选择性结合的有效的抑制剂的能力。
评价作为淀粉蛋白形成抑制剂的基于二苯并呋喃的化合物。
应用前述的静止原纤维(stagnat fibril)形成分析研究TTR淀粉状蛋白抑制效力，其中部分变性是通过酸化(pH 4.4，37℃)引发的(Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-8660)。简言之，将试验化合物(7.2或3.6μM)与TTR(3.6μM)在pH 7的缓冲液中温育30分钟。然后，通过将pH降低至4.4启动淀粉蛋白形成，72小时(37℃)之后可观察到WT-TTR的最大的原纤维形成。潜在的抑制剂中出现的浊度(T试验)与不加入试验化合物的溶液的浊度(T对照)比较。极好的抑制剂显示出0％原纤维形成，而无抑制作用的化合物将显示出100％的原纤维形成。从经验可知，极好的抑制剂在小分子浓度为7.2цM时仅有＜10％原纤维形成，在浓度等于WT-TTR的浓度(3.6μM)时有＜40％原纤维形成(Hammarstrom，P.等人.Science2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Naal.Acad.Sci. USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.等人.Nature Rev.DrugDisc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L.等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller Sean，R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。在被评价的31个化合物中，在浓度为TTR浓度的二倍(7.2μM抑制剂)时除了一个(34)外均完全抑制原纤维形成，图6(在7.2μM时加入足够的试验化合物以占据TTR的两个结合位点(TTR·I2)，前提是在pH 4.4时它们的解离常数均在低nM范围内)。小分子典型地以负协同性与TTR结合，因此Kd1和Kd2通常会有一或两个数量级的差别。因此，当配体与TTR浓度相等时，可以观察到由解离常数决定的TTR·I组、TTR·I2组和无配体的TTR组。由其它的研究表明仅占据两个TTR结合位点之一的抑制剂对于稳定全部的四聚体不进行淀粉蛋白形成是足够的(Wiseman，R.L.等人.J.Am.Chem.Soc.2005，inpress)。该结论也被本发明中观察到的在浓度等于TTR的浓度(各3.6μM，图3)时26个二苯并呋喃是极好的TTR淀粉蛋白形成抑制剂(＜40％原纤维形成)所支持。使来自于所有三个系列的代表性的小分子(25、26、27、30、45、47、62；3.6μM)经历无TTR的情况下酸介导的淀粉蛋白形成条件(pH4.4，37℃，72小时)，未显示出可测量的沉淀。
评价基于二苯并呋喃的抑制剂的血浆TTR结合选择性。
应用先前建立的抗体捕获方法评价在人血浆中抑制剂对TTR的结合选择性(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。在该评价中，将抑制剂(10.8μM，～2-3×天然浓度的TTR)在人血浆中37℃培养24小时。然后将淬灭的琼脂糖树脂加入到血浆中以除去将与树脂结合而不与TTR结合的任何小分子。然后应用与琼脂糖树脂共价连接的多克隆TTR抗体将TTR和任何键合小分子的TTR免疫捕获。洗涤树脂(5×10分钟洗涤)后，将抗体-TTR复合物在高pH下解离并且通过RP-HPLC分析。然后应用标准曲线从TTR和抑制剂之间的HPLC峰面积计算二者的相对化学计量。可典型地观察到对于具有很高的解离速率的抑制剂的与洗涤相关的损失；因此，该分析可能低估了TTR和具有很高的解离速率的抑制剂之间的真实结合化学计量，但给出了对于显示出低解离常数和解离速率的化合物的可信结果。在浓度为3.6μM时，21个抑制剂显示出大于1的结合化学计量(最大的结合化学计量为2)，19个抑制剂显示出＜40％原纤维形成(图7，覆盖的正方形)。由于母核二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)不显示出对TTR的结合选择性，因此观察到的高血浆TTR结合选择性是显著的，这说明C1芳基取代基在相对于所有其它血浆蛋白赋予对TTR结合选择性方面的重要性。
在淀粉蛋白形成条件下四聚体结构的稳定性。
为了通过天然状态稳定性(即四聚体稳定性)确保这些C1-芳基化的二苯并呋喃抑制TTR原纤维形成，发明人通过在淀粉蛋白形成条件下(pH4.4，37℃)的72小时预培养周期后的分析超速离心研究了TTR四聚体结构。在27(7.2μM)的存在下，与预期的四聚体TTR分子量(55.0kDa)相比，分别通过沉降速率(图8)和平衡分析超速离心(图9)发现TTR(3.6μM)具有流体动力学的分子量为57.1±0.3和55.1±0.4kDa。在无27的存在下，TTR聚集为分子量很大的低聚物，该低聚物在超速离心试验中快速沉降(数据未示出)。
基于二苯并呋喃的抑制剂是否赋予TTR动力学稳定性？
通过评价TTR四聚体解离速率来最佳评价这些抑制剂影响四聚体TTR的动力学稳定性的能力(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Hammarstrom，P.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002，99，16427-16432)。在酸性条件下四聚体的解离引起淀粉蛋白形成，而在离液剂(6M尿素)的存在下，四聚体的解离引起单体解折叠。探测了代表基于二苯并呋喃抑制剂的三种结构的抑制剂25、47和64在酸性介导的和尿素介导的变性条件下对四聚体的解离速率的影响。与对照(无抑制剂)相比，部分酸化介导的TTR淀粉蛋白形成在25、47和64的剂量依赖方式中显著降低(图4A)。通过将慢四聚体结构改变与快四聚体结构改变(这两种结构改变通过光谱学方法监控)相关联来监控TTR四聚体在6M尿素中的解离速率(Hammarstrom，P.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002，99，16427-16432)。通过远-UV CD监控的TTR四聚体(3.6μM)的解离速率在25、47和64的剂量依赖方式中显著降低。这些结果与背景状态对通过25、47和64的结合的解离过渡状态的差别稳定性一致。
试验：
用于TTR细菌表达的方法(Lai，Z.等人.Biochemistry 1996，35，6470-6482)、静止原纤维形成分析(Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry1992，31，8654-8660；Lai，Z.等人Biochemistry 1996，35，6470-6482)、血浆结合选择性分析(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)和分析超速离心(Lashuel，H.A.等人.Biochemistry 1998，37，17851-17864)均已在先前详细描述。
化合物25、47和64对WT-TTR原纤维形成抑制的时间过程分析。将化合物25、47和64溶解于DMSO中，得到7.2mM一级储备液(10×储备液)，由该储备液进行5-和10-倍DMSO稀释，得到1.44mM(2×)和0.72mM(1×)二级储备液。将495μL 0.4mg/mL(7.2μM)WT-TTR溶液(10mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA，pH7.2)和5μL1.44或0.72mM抑制剂二级储备液加入到一次性UV比色杯中，简单涡旋，然后在25℃下培养30分钟。然后通过加入500μL酸性缓冲液(100mM乙酸盐、100mMKCl、1mM EDTA，pH 4.2)将pH调节至4.4，将最终的1mL溶液再次涡旋并且在37℃暗处培养而无搅拌。在酸化后0、4、8、12、25、49、74、100、122、145和169小时时，将溶液涡旋并且在500nm处测定浊度。制备包含5μL纯DMSO的对照样品并且按照上述进行分析以作为比较。制备10组小分子和TTR对照样品以防止在培养中比色杯的干扰。在测定浊度后将样品丢弃。
通过键合的单体在尿素中解折叠评价的化合物25、47和64的WT-TTR四聚体解离抑制的时间过程分析。将化合物25、47和64溶解于DMSO中，得到10mM一级储备液，由该储备液进行10-倍EtOH稀释，得到1mM二级储备液。将200μL 1.0mg/mL(18μM)WT-TTR溶液(50mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA，pH 7.2)和7.2或3.6μL(分别为2×和1×)的1mM抑制剂二级储备液加入到2mL eppendorf管中，简单涡旋并且在25℃下培养15分钟。将100μL TTR·抑制剂溶液加入到900μL尿素缓冲液(6.67M尿素、50mM磷酸钠、100mM KCl、1mM EDTA，pH 7.2)中，将最终的1mL溶液再次涡旋并且在25℃暗处培养而无搅拌。在与尿素混合后的0、4、11、24、49、73、97、122、146和170小时时，在218和215nm之间测定圆二色谱，每0.5nm扫描一次并且平均为5秒。测定后，将样品放回各自的eppendorf管中并且继续培养。制备包含7.2μL10％DMSO的EtOH溶液的对照样品并且按照上述进行分析以作为比较。将CD振幅值在215和218nm之间平均以确定在试验过程中β-折叠损失程度。在β-折叠损失中测定的TTR四聚体解离与快速(～500,000×更快)单体变性相关(Hammarstrom，P.等人.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 2002，99，16427-16432)。
抑制剂合成：除非其它说明，用于化学合成的试剂均是商购的并且可以应用而无需进一步纯化。应用在硅胶60 F254包被的铝板(EM Sciences)上的薄层色谱或分析性反相柱高效液相色谱(HPLC)监控反应过程。应用Waters 600E多溶剂输送系统进行HPLC，该系统应用Waters 486可变波长紫外检测器和Waters 717加自动进样器。对于所有反相HPLC分析应用C18 Western Analytical柱(型号033-715，150孔径，3μm颗粒)。应用乙腈/水/三氟乙酸溶剂体系；溶剂A比例分别为4.8％、95％和0.2％，而溶剂B分别为95％、4.8％和0.2％。在2分钟的100％A等度流动后，进行历经8分钟的0至100％B的线性梯度，流速为1.5mL/分钟。应用230-400目硅胶60(EM Sciences)完成所有的快速色谱。1H和13C-NMR谱在Bruker光谱仪上300、400、500或600MHz记录。化学位移以低场区距内标(Me4Si，0.0ppm)的百万份给出。
(二苯并呋喃-1-基氧基)-三异丙基-硅烷(5)。向干燥的250mL圆底烧瓶中加入酚4(Tashiro，M.Y.等人.Synthesis 1980，6，495-496)(492mg，2.67mmol)和搅拌棒并且将烧瓶用封口膜封好。加入CH2Cl2(5mL)，然后加入DMAP(391mg，3.2mmol)和三异丙基甲硅烷基氯(800μL，3.73mmol)。产生的无色溶液过夜后变为白色混悬液。将反应物转移至250mL分液漏斗中并且用H2O洗涤(3×10mL)。将水层合并并且用CH2Cl2(3×30mL)萃取。将有机层合并，用MgSO4干燥，并且在减压下浓缩，得到浅黄色油状物。将该油状物通过经硅胶的快速色谱(100％己烷)纯化，得到0.70g(77％)的5，为无色油状物。MALDI-FTMS 341.1932m/z(M+H)+，C21H29O2Si理论值为341.1931。
1-三异丙基硅烷基氧基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(6)。将甲硅烷基醚5(654mg，1.92mmol)加入到干燥的50mL圆底烧瓶中，接着加入Et2O(7.4mL)和TMEDA(0.87mL，5.77mmol)。将烧瓶在丙酮/CO2(固体)浴中冷却至-78℃达10分钟，然后历经10分钟加入仲丁基锂(4.44mL的1.3M环己烷溶液，5.77mmol)。将产生的橙色混悬液温至室温并且搅拌24小时。如上所述将烧瓶再次冷却至-78℃并且将15psi的CO2(气体)气流以气泡通过反应混悬液(CO2通过将其经过含有活化硅胶的干燥管干燥)。在最初加入CO2(气体)后，除去冷却浴并且将反应物搅拌30分钟。将反应混合物倾倒至1L包含冰水(50mL)的烧杯中。通过缓慢加入0.05M KOH将溶液调节至pH 9，然后将其用冰/H2O浴冷却至0℃。将溶液用0.5M HCl酸化至pH 2，产生白色固体沉淀。将水混悬液(pH 2)转移至1L分液漏斗中并且用EtOAc(5×50mL)萃取。将合并的萃取物用MgSO4干燥并且在减压下浓缩，得到粗的二酸，为油状物。将100mL包含粗的二酸的烧瓶安装上搅拌棒，用封口膜封好并且抽真空。然后将烧瓶用氩气反填。通过注射器加入无水MeOH(2mL)和ACS试剂级的苯(8mL)。穿过膜通过注射器缓慢加入三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMSCHN2；2.5mL的2M己烷溶液，5mmol)。完成TMSCHN2的加入后将反应物搅拌10分钟并且在减压下除去溶剂，得到红色油状物。将残留物通过经硅胶的快速色谱(15％EtOAc的己烷溶液)纯化，得到0.36g(43％)的6，为白色固体。MALDI-FTMS 479.1874m/z(M+Na)+，C25H32O6SiNa理论值为479.1860。
1-羟基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(7)。将干燥的100mL圆底烧瓶安装上搅拌棒，装入6(363mg，0.95mmol)，用封口膜封好，抽真空并且用氩气反填。通过注射器将无水THF(6.3mL)和四丁基氟化铵(1M的THF溶液，1.2mL，1.19mmol)加入到反应物中。将反应物在室温下搅拌1小时，然后将其倾倒至含有30mL H2O的250mL分液漏斗中。将水层用CHCl3(4×20mL)萃取。将有机层合并，用MgSO4干燥并且在减压下浓缩。将残留物通过经硅胶的快速色谱(30％EtOAc的己烷溶液）纯化，得到0.23g(97％)的7，为白色固体。LC-MS m/z 301，C16H12O6理论值为301。
1-三氟甲磺酰基氧基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(8)。应用先前由Stille描述的三氟甲基磺酸酯化过程来合成8(Echavarren，A.M.等人.J.Am.Chem.Soc.1987，109，5478-5486)。将酚7(120mg，0.4mmol)加入到干燥的10mL圆底烧瓶中，然后将其用封口膜封好。通过封口膜用注射器加入溶剂-无水吡啶(2mL)。将反应混合物用冰/H2O浴冷却至0℃。为了使反应开始，通过封口膜用注射器加入三氟甲磺酸酐(81μL，12mmol)。除去冰浴并且将反应物温至室温并搅拌过夜。将反应混合物倾倒至250mL包含30mL冰/H2O淤浆的烧杯中并且将其转移至125mL分液漏斗中。将水层用Et2O(4×40mL)萃取。将有机层合并，用饱和的CuSO4(4×20mL)和盐水(2×20mL)洗涤，经MgSO4干燥，然后在减压下除去Et2O，获得淡黄色固体。将该固体通过经硅胶的快速色谱(30％EtOAc的己烷溶液）纯化，获得159mg(92％)的8，为白色固体。FAB-MS(NBA/NaI)m/z 433.0215(M+H)+，C17H12F3O8S理论值为433.0205。
8与取代的苯胺的钯催化交联的代表性过程。
应用Buchwald和Hartwig报道的芳基偶联过程制备化合物9-23。将火焰干燥的10mm×13cm硼硅酸盐试验管安装上搅拌棒并且用封口膜封好，向其中加入8(140mg，0.324mmol)，二亚苄基丙酮化钯，Pd2(dba)3(15mg，0.016mmol)、(±)-binap(15mg，0.024mmol)、Cs2CO3(147mg，0.456mmol)和苯胺(32μL，0.356mmol)。在加入所有试剂后将该管用氩气清洗10分钟。然后通过封口膜加入无水甲苯(2.4mL)并且在油浴中将混合物加热至100℃达36小时。反应混合物通过硅藻土过滤并且在减压下将溶剂从滤液中除去。将产生的深色油状物通过经硅胶的快速色谱(30％EtOAc的己烷溶液）纯化，获得二芳基胺17，为白色固体(0.12g，68％)。涉及化合物10-23的具体合成细节和特征数据的支持信息与下面的9中描述的类似。
1-苯基氨基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(9)。
MALDI-FTMS 375.1094 m/z(M·)+，C22H17NO5理论值为375.1106。
酚7与取代的苯基硼酸的铜介导的交联以获得1-苯氧基二苯并呋喃39-43的代表性过程。
二芳基醚的偶联采用改进的Chan和Evans报道的方法。在安装有磁力搅拌棒的20mL闪烁瓶中装入酚7(150mg，0.50mmol)、乙酸铜(II)(91mg，0.5mmol)、新活化的4分子筛(～250mg)和苯基硼酸(180mg，1.5mmol)。加入二氯甲烷(5mL)，然后加入吡啶(201μL，2.5mmol)，产生浅绿色混悬液。应用的盖非常松以便反应混悬液部分暴露于大气中。通过TLC监控反应。反应完成后，使反应混合物吸附于～6g硅胶上-将硅胶加入至反应混合物中，然后在减压下除去溶剂。反应混合物经硅胶色谱(30％EtOAc的己烷溶液)获得二芳基醚39，为白色固体(29mg，15％)。涉及化合物40-43的具体合成细节和特征数据的支持信息与下面的39中描述的类似。
1-苯氧基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(39)。
MALDI-FTMS 399.0825 m/z(M+Na)+，C22H16O6Na理论值为399.0839。
三氟甲基磺酸酯8和取代的苯基硼酸的钯催化的交联的代表性过程。
将火焰干燥的10mm×13cm试管安装上搅拌棒并且用封口膜封好，向其中加入8(100mg，0.23mmol)、Pd(PPh3)4(14mg，0.01mmol)、LiCl(29mg，0.69mmol)、Na2CO3(300μL 2M水溶液)和甲苯(3mL)。将苯基硼酸(43mg，0.35mmol)溶解于EtOH(0.5mL)中并且将其加入到反应混合物中。对于所有其它化合物，在该过程中MeOH代替了EtOH，因为可以观察到酯交换；因此分离的化合物49为二乙酯，而所有其它的化合物为二甲酯。加入试剂后，将该管用氩气清洗并且将反应混合物在油浴中加热至100℃达12小时。然后将反应混合物通过硅藻土过滤。在减压下从滤液中除去溶剂并且将产生的深色残留物通过经硅胶的快速色谱纯化，获得二芳基化物49，为白色固体(52mg，63％)。涉及化合物50-59的具体合成细节和特征数据的支持信息与下面的49中描述的类似。
1-苯基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二乙酯(49)。MALDI-FTMS 411.1197m/z(M+Na)+，C24H20O5Na理论值为411.1203。
酯水解以获得最终的抑制剂24-38、44-48和60-70的代表性过程
在安装有搅拌棒的20mL闪烁瓶中将甲酯9(25mg，0.067mmol)在THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，1mL)中皂化。将LiOH·H2O(22mg，0.53mmol)加入到混悬液中并且搅拌反应物直到反应完成(典型地为4小时)，该反应完成是通过TLC或分析性反相HPLC的监控确定的。将反应混合物用盐水(2mL)稀释并且将其用1M HCl酸化至pH2(pH试纸)，产生二相溶液。将上层(THF)除去并且将水层用THF(3×3mL)萃取。合并的有机层用MgSO4干燥，然后在减压下浓缩，获得二酸24，为白色固体(21mg，92％)。涉及化合物25-38、44-48和60-70的具体合成细节和特征数据的支持信息与下面的24中描述的类似。
1-苯基氨基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸(24)。MALDI-FTMS 347.0794 m/z(M·)+，C20H13NO5理论值为347.0788。
图1A是TTR·12的X射线晶体结构(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321)。在结合位点排列成行的残基显示为棒状模型(氧为红色，氮为蓝色并且碳为灰色)，蛋白的Connolly表面表示为灰色。化合物1在其两种C2对称等价结合方式中均有显示(黄色和绿色)。结合通道具有三组凹陷，即卤素结合囊(HBP)，因为其与甲状腺素的碘相互作用。化合物1仅占据结合囊的外部并且填入HBP1和1’。1的羧酸接近K15和K15，的e-NH3 +。
图1B是代表放入甲状腺素结合囊中的1-取代的-二苯并呋喃-4，6-二羧酸的设计的线图，其中X代表NH、O或直接的C芳基-C芳基键。R代表为填补TTR内部结合腔而设计的芳环的取代基。
图2是突出了在pH4.4(72小时)对抗WT-TTR(3.6μM))淀粉状蛋白原纤维形成(f.f.)的浓度依赖性酸取代的二苯并呋喃的活性的表。值代表f.f.的程度，因此抑制剂的效力是相对于无抑制剂的WT-TTR原纤维形成(赋值100％)：完全抑制相当于0％f.f.。
图3是显示了对抗WT-TTR(3.6mM)淀粉状蛋白原纤维形成(pH 4.4，72小时)的基于二苯并呋喃的淀粉状蛋白抑制剂活性(3.6mM)以及在人血浆中与TTR的结合化学计量的概要的表。中间栏的％原纤维形成(f.f.)值代表f.f.的程度，因此抑制剂的效力是相对于无抑制剂的WT-TTR原纤维形成(赋值100％)。完全抑制相当于0％f.f.。右栏表示观察到的在血浆中抑制剂(剂量为10.8mM，～2-3×血浆TTR浓度)结合TTR的化学计量，应用抗体捕获方法测定。
图4是合成1-羟基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相应的三氟甲基磺酸酯的流程图：a)K3[Fe(CN)6]、KOH、H2O、苯；b)AlCl3、甲苯、各步骤均为33％；c)TIPSCl、DMAP、CH2Cl2、77％；d)仲-BuLi、Et2O，-78℃、气态CO2、TMSCHN2、43％；e)TBAF、THF、97％；f)Tf2O、吡啶、92％。
图5是合成1-苯基-、苯氧基-和苯胺基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相应的二羧酸酯的流程图：a)Pd2(DBA)3、(±)binap、Cs2CO3、甲苯、100℃；b)LiOH·H2O、THF/MeOH/H2O(3∶1∶1)；c)CuII(OAc)2、吡啶、4MS、CH2Cl2；d)Pd(PPh3)4、LiCl、含水Na2CO3、甲苯、MeOH、80℃。
图6是显示在pH 4.4(72小时)对抗WT-TTR(3.6μM)淀粉状蛋白原纤维形成(f.f.)的基于二苯并呋喃的抑制剂的活性(7.2μM)的表。值代表f.f.的程度，因此抑制剂的效力是相对于无抑制剂的WT-TTR原纤维形成(赋值100％)：完全抑制相当于0％f.f.。
图7是说明二苯并呋喃血浆TTR结合化学计量对原纤维形成抑制剂效力的点状图。浅阴影区域相应于高活性和高选择性(＜40％原纤维形成并且结合化学计量＞1)，而深阴影区域相应于极好的化合物(＜30％原纤维形成并且结合化学计量＞1.25)。数据点表示三种不同的键合：NH(▲)、(○)和直接的C芳基-C芳基键(●)。示出二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)的数据点作比较。
图8是在与27(7.2mM)预培养后并且在另外的pH降低为4.4的72小时培养周期(在无抑制剂时引起最大淀粉状蛋白形成的时间设计)后，在TTR(3.6mM)沉降速率研究中，280nm的吸光度对与中心的距离的点图。速率分析-在50,000rpm下分离15分钟获得的数据。数据(符号)适合分子量为57.1±0.2kDa的单一的理想个体模型(实线)。
图9是在与27(7.2mM)预培养后并且在另外的pH降低为4.4的72小时培养周期(在无抑制剂时引起最大淀粉状蛋白形成的时间设计)后，在TTR(3.6mM)平衡超速离心研究中，280nm的吸光度对与中心的距离的点图。平衡分析-在以17,000rpm的速率对样品使用离心力24小时后观察平衡浓度梯度。数据(○)适合分子量为55.0±0.2kDa的单一的理想个体模型(实线)。残差(试验和理论数据的不同)在小图中表示。
图10是由部分酸变性诱导的WT-TTR(3.6μM)原纤维形成的时间过程分析的点图，该分析在无(▲)和有7.2μM(◇)和3.6μM(○)抑制剂25、47和64的存在下进行，通过在500nm处的浊度进行测定(见图中不同抑制剂的明暗标记)。很难辨别黑点和白点的哪个化合物最有效。在点的最终或169小时后，化合物47显示最大的原纤维形成，其次是化合物64，再其次是化合物25。
图11是WT-TTR(3.6μM)四聚体解离(6.0M尿素)的时间过程分析的点图，该分析在无(▲)和有7.2μM(◇)和3.6μM(○)浓度的抑制剂25、47和64的存在下进行(见图中不同抑制剂的颜色标记)。通过远-UV CD检测不到慢四聚体解离，但是该方法与快速(～500,000×更快)单体变性相关，可以通过由圆二色谱得到的β-折叠损失容易地监控。很难辨别黑点和白点的哪个化合物最有效。在点的最终或169小时后，化合物25在解离四聚体中最有效，其次是化合物64，再其次是化合物47。

Claims (17)

1.式I代表的化合物：
Figure A2005800217230002C1
                            (式I)
其中：
X不存在或是选自-O-、-S-和-NH-的二价基团；并且
R2、R3、R4和R5是独立地选自-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-CF3和-CO2H的基团。
2.根据权利要求1中所述的化合物，其为式II代表的化合物：
Figure A2005800217230002C2
                            (式II)。
3.根据权利要求2中所述的化合物，其中：
R2是选自-H、-F、-Cl和-CF3的基团。
4.根据权利要求2中所述的化合物，其中：
R4是选自-H、-Cl和-CO2H的基团。
5.根据权利要求2中所述的化合物，其中：
R5是选自-H、-F和-Cl的基团。
6.根据权利要求2中所述的化合物，其选自以下结构式代表的化合物：
Figure A2005800217230003C1
7.根据权利要求1中所述的化合物，其为下式代表的化合物：
Figure A2005800217230004C1
                                  (式III)。
8.根据权利要求7中所述的化合物，其中：
R3是选自-H、-F、-Cl、-Br和-CF3的基团。
9.根据权利要求7中所述的化合物，其中：
R5是选自-H、-F、-Cl和-Br的基团。
10.根据权利要求7中所述的化合物，其选自以下结构式代表的化合物：
Figure A2005800217230004C2
11.根据权利要求1中所述的化合物，其为下式代表的化合物：
Figure A2005800217230005C1
                                    (式IV)。
12.根据权利要求11中所述的化合物，其中：
R2是选自-H、-F和-Cl的基团。
13.根据权利要求11中所述的化合物，其中：
R3是选自-H、-F、-Cl、-CF3和-CO2H的基团。
14.根据权利要求11中所述的化合物，其中：
R4是选自-H和-CO2H的基团。
15.根据权利要求11中所述的化合物，其中：
R5是选自-H、-F、-Cl和-CF3的基团。
16.根据权利要求11中所述的化合物，其选自以下结构式代表的化合物：
Figure A2005800217230006C1
17.有效抑制淀粉状蛋白原纤维形成的方法，该方法包括使转甲状腺素蛋白与一定浓度的选自权利要求1-16的化合物接触的步骤。
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