KR20070013335A - 트랜스티레틴 안정화 - Google Patents

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제프리 더블유. 켈리
마이클 에이치. 페트라시
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Abstract

본 발명은 세 가지 상이한 유형의 연결에 의해 C1 위치에서 디벤조푸란 고리에 부착된 방향족 치환기를 갖는 디벤조푸란-4,6-디카르복실산 코어 구조체를 개시하며, 상기 화합물이 모든 다른 혈장 단백질에 비해 TTR에 대한 친화성 및 결합 선택성이 주요 화합물 1에 비해 매우 증가된 우수한 아밀로이드 형성 억제제를 제공하는 것을 밝혀내었다. 본 발명은 또한 이들 화합물이 TTR 사합체에 역학적인 안정성을 부여하는 기능을 갖는다는 것을 개시한다.
트랜스티레틴, 안정화, 디벤조푸란, 아밀로이드 형성

Description

트랜스티레틴 안정화{Transthyretin Stabilization}
본 발명은 트랜스티레틴 아밀로이드 피브릴 형성의 억제제에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 트랜스티레틴 아밀로이드 피브릴 형성의 억제제로서 유도체화 디벤조푸란에 관한 것이다.
구조적으로 구별되는 부류의 여러 소분자 트랜스티레틴 (TTR) 안정화제가 발견되었고, 디벤조푸란-4,6-디카르복실산 (1)이 특히 관심을 받고 있다 (도 1, 문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003, 299, 713-716]; [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]; [Razavi, H.; et al. Angew Chem 2003, 42, 2758-2761]; [Miroy, G. J.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 15051-15056]; [Peterson, S. A.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12956-12960]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1389-1401]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1339-1347]; [Petrassi, H. M.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2178-2192]; [McCammon, M. G.; et al. Structure 2002, 10, 851-863]; [Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-332]; [Sacchettini, J. C.; et al. Nature Rev. Drug Disc. 2002, 1, 267-275]; [Green, N. S.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13404-13414]; [Adamski-Werner, S. L.; et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 355-374]; [Miller Sean, R.; et al. Lab. Inv. 2004, 84, 545-552]). 이 억제제 (1; 7.2 μM)는 72 시간에 걸쳐 WT-TTR (3.6 μM) 아밀로이드 형성 (pH 4.4)의 정도를 90％ 감소시킨다. TTR·12의 X-선 공결정 구조로부터, 억제제가 각각의 티록신 결합 부위의 외측 부분에만 결합함으로써 그의 인상적인 활성을 발휘하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]). 화합물 1을 티록신 결합 포켓의 내측 공극으로 돌출되는 하위 구조체로 변형시켜, 인간 혈액에서 TTR과의 결합에 대한 그들의 친화성 및 선택성을 증가시킬 필요가 있다.
<개요>
본원에는 세 가지 상이한 유형의 연결에 의해 C1 위치에서 디벤조푸란 고리에 부착된 방향족 치환기를 갖는 디벤조푸란-4,6-디카르복실산 코어 구조체를 개시하며, 상기 화합물이 모든 다른 혈장 단백질에 비해 TTR에 대한 친화성 및 결합 선택성이 주요 화합물 1에 비해 매우 증가된 우수한 아밀로이드 형성 억제제를 제공하는 것을 밝혀내었다 (문헌 [Purkey, H. E.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 5566-5571]). 본원은 또한 이들 화합물이 TTR 사합체에 역학적인 안정성을 부여하는 기능을 갖는다는 것을 개시한다.
트랜스티레틴 (TTR) 아밀로이드 형성에는 속도 제한적인 사합체 해리 및 부분적인 단량체 변성이 따르기 때문에, 잘못 배열된 종이 생성된다. 이 과정은 디벤조푸란-4,6-디카르복실산 (1)을 비롯한 트랜스티레틴 아밀로이드 형성 억제제를 확인하기 위한 혼탁도에 의해 확인되었다. TTR·12의 X-선 공결정 구조로부터, 억제제는 2개의 티록신 결합 포켓의 외측 부분만을 이용하여 결합하여 TTR 아밀로이드 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 본원에서, 구조에 기초한 디자인을 이용하여, 디벤조푸란 고리의 C1에서 세가지 상이한 화학 연결을 통해 아릴 치환기를 부착시킴으로써, 티록신 결합 포켓의 사용되지 않는 내측 부분을 상호 보완하였다. 증가된 효능 및 극적으로 증가된 혈장 TTR 결합 선택성을 가진 28 가지 아밀로이드 형성 억제제는, TTR의 천연 사합체 구조체에 역학적 안정성을 부여하여, 생리학적 조건하에서는 넘을 수 없는 장벽을 생성하는 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 대립 유전자간 상호 억제에 의한 TTR 천연 상태의 역학적 안정화가 질병을 완화시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 디벤조푸란-기재 억제제가 동일한 역할을 할 것이라고 기대된다. 잘못 배열된 TTR 중간체의 무엇이 독성을 나타내는지 아직 불확실하기 때문에, 아밀로이드 형성의 개시를 방지하는 것이 임상적으로 개입하는 가장 전형적인 전략이다. 우수한 결합 선택성은 이들 억제제가 인간에서 아밀로이드 형성의 억제를 요하는 혈장과 유사한 복합 생물학적 유체 중에서 티록신 결합 부위(들)를 차지할 수 있게 한다. 본 발명에 이르러, 디벤조푸란 기재의 아밀로이드 형성 억제제가 높은 선택성, 친화성 및 효능을 갖는다는 것이 확립되었다.
본 발명의 한 측면은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물에 관한 것이다.
Figure 112006094148118-PCT00001
화학식 I에서, X는 부재하거나, -0-, -S- 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 라디칼이고, R2, R3, R4 및 R5는 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -CF3 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 라디칼이다. 본 발명의 제1 측면의 제1 하위 군에서, 상기 화합물은 하기 화학식 II로 표시된다.
Figure 112006094148118-PCT00002
화학식 II의 하위 군에서, 바람직한 실시양태는 R2가 -H, -F, -Cl 및 -CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있고, 추가의 바람직한 실시양태는 R4가 -H, -Cl 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있고, 추가의 바람직한 실시양태는 R5가 -H, -F 및 -Cl로 이루어진 군 으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있다. 화학식 II의 하위 군의 바람직한 화합물은 하기 구조식으로 표시되는 군으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
Figure 112006094148118-PCT00003
본 발명의 제1 측면의 제2 하위 군에서, 상기 화합물은 화학식 III으로 표시된다.
Figure 112006094148118-PCT00004
화학식 III의 하위 군에서, 바람직한 실시양태는 R3이 -H, -F, -Cl, -Br 및 -CF3으로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있고; 추가의 바람직한 실시양태는 R5는 -H, -F, -Cl 및 -Br로 표시되는 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있다. 화학식 III의 하위 군의 바람직한 화합물은 하기 구조식으로 표시되는 군으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
Figure 112006094148118-PCT00005
본 발명의 제1 측면의 제3 하위 군에서, 상기 화합물은 화학식 IV으로 표시된다.
Figure 112006094148118-PCT00006
화학식 IV의 하위 군에서, 바람직한 실시양태는 R2가 -H, -F 및 -Cl로 이루 어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있고, 추가의 바람직한 실시양태는 R3이 -H, -F, -Cl, -CF3 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있고, 추가의 바람직한 실시양태는 R4가 -H 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있고, 추가의 바람직한 실시양태는 R5가 -H, -F, -Cl 및 -CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물을 포함할 수 있다.
화학식 IV의 하위 군의 바람직한 화합물은 하기 구조식으로 표시되는 군으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
Figure 112006094148118-PCT00007
본 발명의 추가의 측면은 아밀로이드 피브릴 형성을 억제하기에 충분한 농도의 상기 기재된 화학식 I 내지 IV로부터 선택된 화합물과 트랜스티레틴을 접촉시키 는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
도 1A는 TTR·12의 X-선 결정학적 구조이다 (문헌 [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]).
도 1B는 티록신 결합 포켓에 위치한 1-치환된-디벤조푸란-4,6-디카르복실산의 디자인의 선형 대표도이다 (식 중, X는 NH, O 또는 C아릴-C아릴 직접 연결을 나타내고, R은 TTR의 내측 결합 공동을 상호 보완하는 구조를 갖는 아릴 고리의 치환기임).
도 2는 pH 4.4 (72 시간)에서 WT-TTR (3.6 μM) 아밀로이드 피브릴 형성 (f.f.)에 대한 농도 의존적인 산-치환된 디벤조푸란의 활성을 보여주는 표이다.
도 3은 WT-TTR (3.6 μM) 피브릴 형성 (pH 4.4, 72 시간)에 대한 디벤조푸란 기재의 아밀로이드 억제 활성 (3.6 μM) 및 인간 혈장에서 TTR에 대한 결합 화학량론을 요약하여 보여주는 차트이다.
도 4는 1-히드록시-디벤조푸란-4,6-디카르복실레이트 디메틸 에스테르 및 상응하는 트리플레이트의 합성에 대한 반응식이다.
도 5는 1-페닐-, 페녹시-, 및 페닐아민-디벤조푸란-4,6-디카르복실레이트 디메틸 에스테르 및 상응하는 디카르복실레이트의 합성에 대한 반응식이다.
도 6은 pH 4.4 (72 시간)에서 WT-TTR (3.6 μM) 아밀로이드 피브릴 형성 (f.f.)에 대한 디벤조푸란-기재 억제제의 활성 (7.2 μM)을 보여주는 차트이다.
도 7은 피브릴 형성 억제 효능에 대해 플롯팅한 디벤조푸란 혈장 TTR 결합 화학량론을 도시하는 표이다.
도 8은 TTR (3.6 μM)에 대한 침강 속도 연구에서 화합물 27 (7.2 μM)과 함께 예비 인큐베이션한 다음, pH를 4.4로 저하시켜 72 시간 동안 (억제제의 부재하에 최대 아밀로이드 형성을 나타내는 시간임) 더 인큐베이션한 후에, 중심으로부터의 거리에 대한 280 nm에서의 흡광도의 플롯을 도시한다.
도 9는 TTR (3.6 μM)에 대한 평형 초원심분리 연구에서 화합물 27 (7.2 μM)과 함께 예비 인큐베이션한 다음, pH를 4.4로 저하시켜 72 시간 동안 (억제제의 부재하에 최대 아밀로이드 형성을 나타내는 시간임) 더 인큐베이션한 후에, 중심으로부터의 거리에 대한 280 nm에서의 흡광도의 플롯을 도시한다.
도 10은 500 nm에서의 혼탁도로 측정하였을 때, 억제제 25, 47 및 64 (이들 억제제는 도면에서 명암으로 구별함)의 부재하에 (▲), 7.2 μM 하에서 (◇) 및 3.6 μM 하에서 (○), 부분 산 변성에 의해 매개된 WT-TTR (3.6 μM) 피브릴 형성을 시간 경과에 따라 분석한 플롯을 도시한다.
도 11은 억제제 25, 47 및 64 (이들 억제제는 도면에서 색깔로 구별함)의 부재하에 (▲), 7.2 μM 하에서 (◇) 및 3.6 μM 하에서 (○), WT-TTR (3.6 μM) 사합체 해리 (6.0 M 우레아)를 시간 경과에 따라 분석한 플롯을 도시한다.
하나를 제외한 모든 C1-아릴 치환된 디벤조푸란 (7.2 μM)은, 심지어 비치환된 아릴 고리를 갖는 경우에도, 시험관내 (pH 4.4, 37℃) WT-TTR (3.6 μM) 산-매개된 피브릴 형성의 우수한 억제제이다 (도 6). TTR 아밀로이드 형성에 대해 효과를 나타내지 않는 유일한 디벤조푸란-기재 억제제는 잠재적으로 4가의 음전하를 갖는 화합물 34이다. 모든 화합물이 TTR 피브릴 형성을 완전히 억제하였기 때문에 (실험 오차 ±5％ 이내), 구조-활성 관계 (SAR)가 7.2 μM 억제제 데이타로부터 유추될 수가 없다. 그러나, 도 3 및 7에서 TTR의 농도 (3.6 μM)와 동일한 억제제 농도에서 억제 효능의 범위를 밝혀냈으며, 이는 제조된 31개의 유사체 및 실험 오차로 제한되는 일부 SAR 결론을 유도하였다. 특히, 모든 억제제 (화합물 34 제외)가 3.6 μM에서 모 화합물 1에 비해 증가된 효능을 나타내었다 (도 3). 가장 중요하게는, 증가된 효능을 나타내는 30개의 억제제 중에서 2개 (화합물 31 및 35)를 제외한 모든 억제제가 인간 혈장에서 TTR에 대해 극적으로 증가된 결합 선택성을 나타낸다. C1-치환된 억제제에 의해 나타나는 우수한 결합 선택성은 복잡한 생물학적 시스템에서 TTR 아밀로이드 형성을 억제하는데 이상적이다.
세가지 부류의 모든 억제제에서 발견된 4가지 C1-아릴 치환 패턴 (H, 3-CF3, 3,5-F2, 및 3,5-Cl2)을 비교한 결과, 디벤조푸란 골격의 C1에 직접 연결된 아릴 고리를 갖는 억제제 (이후, 비아릴로서 지칭됨)가 그의 비아릴아민 및 비아릴에테르 대응체에 비해 약간 증가된 억제 효능을 나타내었다 (도 3). 이는 내측 결합 공동 내에서 고리가 상이하게 배향되게 하는 구조의 차이로 인한 것일 수 있지만, 본 발명자들은 이러한 선호도가 매우 큰 유사체 부류에서는 유지될 수 없다는 것에 주의한다. 이는 나머지 두가지 부류가 혈장에서 가장 선택적인 TTR 결합제를 제공한다는 것으로서 반박될 수 있지만, 100가지 정도나 많은 단백질이 이들 억제제와 경쟁한다는 사실 때문에 SAR은 매우 놀라운 것이다. 티록신 결합 부위에서 할로겐 결합 포켓을 택하기 때문에, 가장 강력한 억제제가 2-F 또는 3,5-Cl2 치환기 (화합물 36, 63 및 67)를 갖는다는 것은 놀랍지 않지만, 3-CO2H 치환된 아릴 억제제 33 및 69가 가장 강력하다는 것은 다소 놀라운 것이다 (TTR에 대한 혈장 결합 선택성은 적당하다). 단순한 비페닐 및 비페닐아민 억제제에 대한 이전의 결정학적 결과는, 내측 결합 공동에서 카르복실-함유 아릴 고리 (S117 및 T119에 대한 H-결합을 가능하게 함)를 갖는 것이 바람직할 수 있다는 것을 입증한다 (문헌 [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]; [Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-332]; [Adamski-Werner, S. L.; et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 355-374]).
C1 위치에 부착된 아릴기는 억제 효능을 증가시킬 뿐만 아니라, 더욱 중요하게는, 아마도 다른 혈장 단백질에 비해 TTR에 대한 결합 친화성을 증가시킴으로써, TTR에 대한 혈장 결합 선택성을 극적으로 증가시킨다. 혈장에서 TTR에 대한 C1-아릴 치환된 디벤조푸란-기재 억제제의 우수한 결합 선택성은, 화합물의 대략 2/3가 1보다 큰 TTR 결합 화학량론을 나타낸다는 사실에 의해 명백히 입증된다. 결합을 위해 TTR의 외측 공동만을 이용하는 경우에는 1이라는 화학량론이 혈장에서 TTR에 대해 측정가능한 결합 선택성을 나타내지 않기 때문에, 이러한 사실은 매우 흥미로운 것이다. 다양한 화학 구조를 갖는 아밀로이드 형성 억제제를 이용한 이전의 경험에서는 결합 화학량론이 1을 넘는 화합물이 거의 없었다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003, 299, 713-716]; [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]; [Razavi, H.; et al. Angew. Chem. 2003, 42, 2758-2761]; [Miroy, G. J.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 15051-15056]; [Peterson, S. A.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12956-12960]; [Baures, P. W.; Peterson, S. A.; Kelly, J. W. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1389-1401]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1339-1347]; [Petrassi, H. M.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2178-2192]; [McCammon, M. G.; et al. Structure 2002, 10, 851-863]; [Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-332]; [Sacchettini, J. C.; Kelly, J. W. Nature Rev. Drug Disc. 2002, 1, 267-275]; [Green, N. S.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13404-13414]; [Adamski-Werner, S. L.; et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 355-374]; [Miller S. R.; et al. Lab. Inv. 2004, 84, 545-552]). 도 7에서 회색으로 표시된 영역은 높은 시험관내 활성 (40％ 미만의 피브릴 형성) 및 높은 결합 선택성 (혈장에서 1 초과의 TTR에 대한 결합 당량)에 대한 요건을 충족시키는 디벤조푸란 기재의 화합물을 함유한다. 가장 중요한 점은 거의 대부분의 디벤조푸란-기재 억제제, 특히 회색 박스 안의 화합물 (도 7)의 활성 및 결합 선택성이 혈장에서 TTR을 역학적으로 안정화시키는데 충분하고, 이들이 바람직한 경구 생체이용률, 약력학 및 독성 프로파일을 나타낸다는 것이다.
시험관내 억제 효능 (3.6 μM) 및 혈장에서 TTR에 대한 억제제 결합 선택성 (10.8 μM)은 상호 관련이 없다는 것은 놀라운 사실이다 (도 7). 다른 모든 혈장 단백질보다도 TTR에 대해 우수한 결합 선택성을 나타내는 화합물은 우수한 피브릴 형성 억제제이어야 한다. 그러나, 그 반대는 반드시 참이 아니며, 우수한 피브릴 형성 억제제가 높은 TTR 혈장 결합 선택성을 나타낼 필요는 없다. 높은 TTR 혈장 결합 선택성을 나타내는 우수한 억제제는 TTR의 해리 전이 상태에 비해 천연 상태를 선택적으로 안정화시켜서, 단백질이 풍부한 생물 유체에서 TTR에 역학적 안정성을 부여할 수 있기 때문에, 이러한 억제제가 인간에서 가장 유용한 화합물이다. 역학적 안정화의 정도가 TTR에 대한 결합 상수에 비례하기 때문에, 이들의 결합 상수가 중요하다. 그러나, 화합물이 시험관내에서는 우수한 TTR 아밀로이드 형성 억제제일 수 있지만, 다른 인간에서는 혈장 단백질에 결합하여 쓸모없게 될 수 있기 때문에, 결합 상수 및 시험관내 효능에 주안을 두는 것은 바람직하지 않다 (문헌 [Purkey, H. E.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 5566-5571]). 마찬가지로, TTR에 대해 양호한 결합 선택성을 나타내지 않는 강력한 시험관내 억제제는 알부민과 같은 다른 혈장 단백질과 상호작용한다 (문헌 [Purkey, H. E.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 5566-5571]). 디벤조푸란 억제제가 지금까지 특성 분석된 억제제에 비해 일군으로서 전례가 없는 결합 선택성 및 억제제 효능을 나타내기 때문에 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003, 299, 713-716]; [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]; [Razavi, H.; et al. Angew. Chem. 2003, 42, 2758-2761]; [Miroy, G. J.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 15051-15056]; [Peterson, S. A.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12956-12960]; [Baures, P. W.; Peterson, S. A.; Kelly, J. W. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1389-1401]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1339-1347]; [Petrassi, H. M.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2178-2192]; [McCammon, M. G.; et al. Structure 2002, 10, 851-863]; [Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-332]; [Sacchettini, J. C.; Kelly, J. W. Nature Rev. Drug Disc. 2002, 1, 267-275]; [Green, N. S.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13404-13414]; [Adamski-Werner, S. L.; et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 355-374]; [Miller S. R.; et al. Lab. Inv. 2004, 84, 545-552]), 이들은 추가의 약리학적 평가에 이상적이다. TTR이 T4의 4차 담체이기 때문에, 그의 결합 부위는 99％ 넘게 비어 있으며, 따라서 TTR에 대한 억제제의 결합은 T4 항상성을 방해하지 않아야 한다.
C1-치환된 디벤조푸란 기재의 TTR 아밀로이드 형성 억제제는 그의 시험관내 아밀로이드 억제 효능, 혈장에서 TTR에 대한 뛰어난 결합 선택성, 느린 TTR 해리 속도 (이는 본원에서 이용되는 방법에 의해 높은 혈장 선택성을 나타내는 경우이어야 함), TTR 사합체에 역학적 안정성을 부여하는 능력, 혈장에서의 화학적 안정성, 및 낮은 pH에서의 화학적 안정성 (이는 경구 투여를 위한 우수한 후보가 되게 함) 때문에 기대가 된다. TTR의 역학적 안정화가 FAP를 완화시키는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이들 억제제는 SSA, FAP 및 FAC를 비롯한 TTR 아밀로이드 질병의 치료에 유용하다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003, 299, 713-716]; [Coelho, T.; et al. J. Rheumatol. 1993, 20, 179-179]; [Coelho, T.; et al. Neuromuscular Disord. 1996,6, 27-27]).
디자인 및 합성:
도 1A는 TTR 티록신 결합 부위 중 하나 (그의 표면은 회색으로 표시함) 내에서 화합물 1의 2원 대칭 동등 결합 방식 (녹색 및 황색)을 도시한다 (문헌 [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]). 4 및 6 위치에 있는 카르복실레이트는 티록신 결합 부위의 입구에 있는 Lys 15 및 15'의 ε-NH3 + 기와 정전기적으로 상호작용한다. 카르복실레이트 중 하나를 제거하면, 디벤조푸란의 활성이 매우 저하되는데, 대부분의 경우 방향족 고리와 카르복실레이트의 간격에 따라 활성이 달라지기 때문이다 (도 2). 또한, 디벤조푸란 고리는 티록신 결합 공동의 외측 부분의 형태 및 소수성을 잘 상호 보완한다. 도 1A의 TTR·12 결정 구조를 통해, 화합물 1이 결합된 티록신 결합 부위의 내측 부분에 차지되지 않은 큰 용적이 있다는 것이 밝혀졌다. 이 구조에 기초하여, 아릴 고리와 같은 치환기를 화합물 1의 디벤조푸란 고리의 C1 위치에 부착시킴으로써, 상기 치환기를 결합 부위의 내측 부분으로 돌출시킬 수 있다는 것이 명백하다. 도 1B에 도시된 바와 같이, 상기 치환기는 헤테로원자 (N 또는 O)를 통해 또는 C아릴-C아릴 직접 결합에 의해 (도시되지 않음) 디벤조푸란 골격에 연결될 수 있다. 내측 결합 공동에서 페닐 고리의 예상된 배향, 및 아릴 고리가 유사하게 배치된 것으로 생각되는 다른 화합물 부류로부터의 기존의 SAR 데이타에 기초하여, 방향족 치환기 (도 3)는 내측 공동 내에서 할로겐 결합 포켓 또는 수소 결합 하위 구조체와 상호 작용하도록 선택되었다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003, 299, 713-716]; [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]; [Razavi, H.; et al. Angew Chem 2003, 42, 2758-2761]; [Miroy, G. J.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 15051-15056]; [Peterson, S. A.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12956-12960]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1389-1401]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1339-1347]; [Petrassi, H. M.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2178-2192]; [McCammon, M. G.; et al. Structure 2002, 10, 851-863]; [Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-332]; [Sacchettini, J. C.; et al. Nature Rev. Drug Disc. 2002, 1, 267-275]; [Green, N. S.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13404-13414]; [Adamski-Werner, S. L.; et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 355-374]; [Miller Sean, R.; et al. Lab. Inv. 2004,84, 545-552]).
C1-치환된 디벤조푸란-기재 억제제의 합성은 이미 보고된 바와 같이 칼륨 헥사시아노페레이트(III)를 이용하는 시판되는 2,4-디tert부틸-6-브로모페놀 (2)의 라디칼 페놀성 호모-커플링에 의해 디벤조푸란 유도체 3을 수득하는 것으로 시작된다 (도 4) (문헌 [Tashiro, M. Y., et al. Synthesis 1980, 6, 495-496]). 이 테트라-t-부틸 디벤조푸란 유도체를 톨루엔 중에서 알킬 교환시켜, 화합물 2로부터 1-히드록시디벤조푸란 (4)을 33％의 전체 수율로 수득하였다 (이 중간체의 합성을 위한 대안적인 방법이 있음) (문헌 [Labiad, B.; Villemin, D. Synthesis 1989, 143-144]; [Lee, Y. R.; et al. Org. Lett. 2000, 2, 1387-1389]). 페놀을 보호한 다음, 실릴 에테르 5를 4- 및 6-위치에서 sec-부틸리튬으로 선택적으로 오르토-금속화하였다 (1-산소 상의 트리이소프로필실릴기는 화합물이 대사 지시제로 작용하는 것을 방해함) (문헌 [Snieckus, V. Chem. Rev. 1990, 90, 879-933]). 기체상 CO2를 이용하여 2음이온을 켄칭하고 에스테르화하여 화합물 6을 수득한 후, 이를 TBAF를 이용하여 탈보호하고, 높은 전체 수율로 트리플레이트 8로 전환시켰다.
Buchwald 및 Hartwig에 의해 개발된 팔라듐 매개된 N-아릴화 반응을 이용하여, 선택된 아닐린을 트리플레이트 8과 커플링하여, 디벤조푸란 기재의 비아릴아민 유사체 9 내지 23을 수득하였다 (도 5) (문헌 [Louie, J. D., et al. J. Org. Chem. 1997, 62, 1268-1273]; [Wolfe, J. P. B., Stephen L. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 6359-6362]). 디벤조푸란의 C1-위치에 아릴 에테르를 부착시키기 위해, 페놀 7 및 여러 페닐보론산을 Chan 및 Evans의 구리-매개된 비아릴 에테르 커플링 방법에 의해 교차 커플링하여, 화합물 39 내지 43를 수득하였다 (문헌 [Chan, D. M. T.; et al. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2933-2936]; [Evans, D. A. et al. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2933]). 화합물 8 또한 여러 페닐보론산의 존재하에 스즈끼(Suzuki) 커플링 조건하에 두어, 디벤조푸란 기재의 비아릴 유사체 49 내지 59를 수득하였다 (문헌 [Suzuki, A. Modern Arene Chemistry 2002, 53-106]). 이들 전구체에서 메틸 에스테르의 에스테르 가수분해에 의해 잠재적인 TTR 아밀로이드 형성 억제제로서 평가되는 목적하는 디벤조푸란-4,6-디카르복실산 아민 (24 내지 38), 에테르 (44 내지 48), 및 비아릴 (60 내지 70)을 수득하였다.
결과:
효과적인 소분자 아밀로이드 형성 억제제의 가장 중요한 특징 중 두 가지는, 이들이 혈액 중 TTR에 대해 높은 친화성 및 선택성으로 결합할 수 있고, 그의 천연 사합체 4차 구조를 안정화시킬 수 있어야 한다는 것이다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003,299, 713-716]; [Razavi, H.; et al. Angew Chem 2003, 42, 2758-2761]; [Purkey, H. E.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 5566-5571]). 억제 효능 (화합물 24 내지 38, 44 내지 48, 및 60 내지 70)을 먼저 아밀로이드 형성 (pH 4.4, 37℃)을 촉진하는 부분 변성 완충액에서 재조합 TTR을 이용하여 평가하였다. 따라서, 인간 혈장 중의 다른 모든 단백질에 비해 TTR에 선택적으로 결합하는 효과적인 억제제의 능력을 평가하였다.
아밀로이드 형성 억제제로서 디벤조푸란 기재의 화합물의 평가.
TTR 아밀로이드 억제 효능을 상기 기재된 정체 피브릴 형성 검정법을 이용하여 증명하였으며, 여기서 부분 변성은 산성화 (pH 4.4, 37℃)에 의해 유도하였다 (문헌 [Colon, W.; Kelly, J. W. Biochemistry 1992, 31, 8654-8660]). 간략히, 시험 화합물 (7.2 또는 3.6 μM)을 TTR (3.6 μM)과 함께 pH 7 완충액 중에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, pH 4.4로 저하시킴으로써 아밀로이드 형성을 개시하였으며, 72 시간 후에 (37℃) WT-TTR과 함께 최대 피브릴 형성이 관찰되었다. 잠재적인 억제제 (T시험)의 존재하의 혼탁도를 시험 화합물이 부재하는 용액 (T대조군)과 비교하였다. 우수한 억제제는 0％ 피브릴 형성을 나타내는 반면, 억제제로서 기능하지 않는 화합물은 100％ 피브릴 형성을 나타낸다. 본 발명자들은 우수한 억제제가 7.2 μM의 소분자 농도에서 10％ 미만의 피브릴 형성을 나타내고, WT-TTR (3.6 μM)과 동일한 농도에서 40％ 미만의 피브릴 형성을 나타낸다는 것을 경험적으로 알고 있다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003,299, 713-716]; [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]; [Razavi, H.; et al. Angew Chem 2003, 42, 2758-2761]; [Miroy, G. J.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 15051-15056]; [Peterson, S. A.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12956-12960]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1389-1401]; [Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1339-1347]; [Petrassi, H. M.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2178-2192]; [McCammon, M. G.; et al. Structure 2002, 10, 851-863]; [Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-332]; [Sacchettini, J. C.; et al. Nature Rev. Drug Disc. 2002, 1, 267-275]; [Green, N. S.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13404-13414]; [Adamski-Werner, S. L.; et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 355-374]; [Miller Sean, R.; et al. Lab. Inv. 2004, 84, 545-552]). 평가된 31개의 화합물 중에서 하나 (화합물 34)를 제외한 모든 화합물이 TTR의 2배의 농도에서 (7.2 μM 억제제) 피브릴 형성을 완전히 억제하였다 (도 6; 7.2 μM에서, 첨가된 충분한 시험 화합물이 TTR (TTR·12)의 결합 부위 둘 다를 차지하였으나, 단, 이들의 해리 상수는 pH 4.4에서 낮은 nM 범위임). 소분자는 전형적으로 음의 조합으로 TTR에 결합하며, 따라서 Kd1 및 Kd2은 대개 1차수 또는 2차수로 분리된다. 따라서, 리간드 및 TTR 둘다 농도가 동일한 경우에는, 해리 상수로부터 알 수 있는 바와 같이, TTR·12, TTR·12 및 비리간드화 TTR의 비율이 관찰된다. 두 개의 TTR 결합 부위 중 한 부위만을 억제제가 차지하는 것으로도 아밀로이드 형성에 대하여 전체 사합체를 안정화시키는데 충분하다는 것이 다른 연구에 의해 확립되었다 (문헌 [Wiseman, R. L.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, in press]). 이러한 사실은 이들 디벤조푸란 중 26개가 TTR과 동일한 농도에서 (각각 3.6 μM, 도 3) 우수한 TTR 아밀로이드 형성 억제제 (40％ 미만의 피브릴 형성)라는 본 발명의 관찰 결과로부터 추가로 뒷받침된다. 세가지 모든 부류로부터의 대표적인 소분자 (화합물 25, 26, 27, 30, 45, 47, 62; 3.6 μM)를 TTR의 부재하에 산-매개된 아밀로이드 형성 조건 (pH 4.4, 37℃, 72 시간)하에 둔 결과, 어떠한 침전도 측정되지 않았다.
디벤조푸란 -기재 억제제의 혈장 TTR 결합 선택성의 평가.
인간 혈장에서 TTR에 대한 억제제 결합 선택성을 기존에 확립된 항체 포획 방법을 이용하여 평가하였다 (문헌 [Purkey, H. E.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 5566-5571]). 이 평가에서, 억제제 (10.8 μM, TTR의 천연 농도의 대략 2 내지 3배)를 37℃에서 24 시간 동안 인간 혈장 중에서 인큐베이션한다. 그 후, 켄칭된 세파로즈 수지를 혈장에 첨가하여, TTR이 아니라 상기 수지에 결합하려는 임의의 소분자를 제거한다. 그 후, TTR 및 임의의 TTR-결합된 소분자를 폴리클로날 세파로즈 수지에 공유 결합된 TTR 항체를 이용하여 면역학적으로 포획한다. 상기 수지를 세척한 후에 (5x10 분 세척), 항체-TTR 복합체는 높은 pH에서 해리되며, 이를 RP-HPLC에 의해 분석한다. 그 후, TTR과 억제제 사이의 상대적인 화학량론을 표준 곡선을 이용하여 그들의 HPLC 피크 면적으로부터 계산한다. 전형적으로, 높은 해리 속도를 갖는 억제제에서 세척에 의한 손실이 관찰되기 때문에, 이 분석은 이들의 참 결합 화학량론을 과소 평가할 수 있지만, 낮은 해리 상수 및 해리 속도를 나타내는 화합물에 대해서는 신뢰할 만한 결과를 제공한다. 21개의 억제제는 1을 넘는 결합 화학량론을 나타내고 (2는 최대 결합 화학량론임), 9개는 3.6 μM의 농도에서 40％ 미만의 피브릴 형성을 나타낸다 (도 7, 어두운 박스). 모 디벤조푸란-4,6-디카르복실산 (1)이 TTR에 대해 결합 선택성을 나타내지 않는다는 것을 고려할 때, 관찰된 높은 혈장 TTR 결합 선택성은 현저한 것이고, 이는 다른 모든 혈장 단백질보다도 TTR에 대한 결합 선택성이 부여된다는 점에서 C1 아릴 치환기의 중요성을 증명한다.
아밀로이드 형성 조건하에서 사합체 4차 구조의 안정화.
이들 C1-아릴화 디벤조푸란이 천연 상태 안정화 (즉, 사합체 안정화)에 의해 TTR 피브릴 형성을 억제한다는 것을 보장하기 위해, 본 발명자들은 아밀로이드 형성 조건 (pH 4.4, 37℃)하에 72 시간 동안 예비 인큐베이션한 후에 분석적 초원심분리를 행함으로써 TTR 4차 구조에 대해 연구하였다. 화합물 27 (7.2 μM)의 존재하에서, TTR (3.6 μM)은 침강 속도 (도 8) 및 평형 분석적 초원심분리 (도 9)에서 사합체 TTR의 예상된 분자량 (55.0 kDa)과 비교할 때 각각 57.1 ± 0.3 및 55.1 ± 0.4 kDa의 수력학적 분자량을 갖는 것으로 관찰되었다. 화합물 27의 존재하에서, TTR은 초원심분리 실험에서 급속히 침강된 매우 높은 분자량의 올리고머로 응집되었다 (데이타는 도시하지 않음).
디벤조푸란 -기재 억제제는 TTR 에 역학적 안정성을 부여하는가?
이들 억제제가 사합체 TTR에 역학적 안정성을 부여하는 능력은 TTR 사합체 해리 속도를 평가함으로 가장 잘 평가된다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Science 2003, 299, 713-716]; [Hammarstrom, P.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 16427-16432). 산성 조건하에서는 사합체 해리가 아밀로이드 형성을 유도하는 반면, 카오트로프 (6M 우레아)의 존재하에서는 사합체 해리가 단량체 풀림을 유도한다. 세 가지 구조 부류의 디벤조푸란-기재 억제제를 대표하는 억제제 25, 47 및 64가 산- 및 우레아-매개된 변성 조건하에 사합체 해리 속도에 미치는 영향이 입증되었다. 대조군 (억제제 아님)에 비해 화합물 25, 47 및 64에 의한 부분 산성화에 의해 매개된 TTR 아밀로이드 형성이 투여량-의존적인 방식으로 극적으로 느려졌다 (도 4A). 6M 우레아 중에서의 TTR 사합체 해리 속도는 빠른 4차 구조 변화와 느린 4차 구조 변화를 연관시킴으로써 용이하게 모니터링될 수 있으며, 이는 분광법에 의해 용이하게 모니터링된다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 16427-16432]). 원자외선 CD에 의해 모니터링되는 TTR 사합체 (3.6 μM) 해리 속도는 6M 우레아 중에서 화합물 25, 47 및 64에 의해 투여량-의존적인 방식으로 현저하게 느려진다. 이러한 결과는 화합물 25, 47 및 64의 결합에 의한 해리 전이 상태와 바닥 상태의 안정화 차이와 일치한다.
실험:
TTR의 박테리아 발현에 이용된 절차 (문헌 [Lai, Z.; et al. Biochemistry 1996, 35, 6470-6482])인 정체 피브릴 형성 검정법 (문헌 [Colon, W.; Kelly, J. W. Biochemistry 1992, 31, 8654-8660]; [Lai, Z.; et al. Biochemistry 1996, 35, 6470-6482]), 혈장 결합 선택성 검정법 (문헌 [Purkey, H. E.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 5566-5571]), 및 분석적 초원심분리 (문헌 [Lashuel, H. A.; et al. Biochemistry 1998, 37, 17851-17864])에 대해서는 이전에 상세히 보고되었다.
화합물 25, 47 및 64에 의한 WT - TTR 피브릴 형성 억제의 시간 경과 분석. 화합물 25, 47 및 64를 DMSO에 용해하여 7.2 mM 1차 원액 (10배 원액)을 제공하고, 이를 5배 및 10배 DMSO 희석하여 각각 1.44 mM (2배) 및 0.72 mM (1배) 2차 원액을 수득하였다. 0.4 mg/mL (7.2 μM) WT-TTR 용액 (10 mM 인산나트륨, 100 mM KCl, 및 1 mM EDTA, pH 7.2) 495 ㎕, 및 1.44 mM 또는 0.72 mM 억제제 2차 원액 5 ㎕를 일회용 UV 큐벳에 첨가하고, 간단히 볼텍싱한 다음, 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 산성 완충액 (100 mM 아세테이트, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 4.2) 500 ㎕를 첨가하여 pH를 4.4로 조정하고, 최종 1 mL 용액을 다시 볼텍싱하고, 교반하지 않으면서 37℃에서 어둡게 하여 인큐베이션하였다. 산성화 이후 0, 4, 8, 12, 25, 49, 74, 100, 122, 145 및 169 시간에서, 용액을 볼텍싱하고, 500 nm에서의 혼탁도를 측정하였다. 순수한 DMSO 5 ㎕를 함유하는 대조군 샘플을 제조 하고, 비교를 위해 상기와 같이 분석하였다. 소분자 및 TTR 대조군 샘플을 10개의 군으로 제조하여, 인큐베이션하는 동안 큐벳의 교란을 방지하였다. 혼탁도를 측정한 후에 샘플을 폐기하였다.
우레아 중에서 연결된-단량체 풀림에 의해 평가된, 화합물 25, 47 및 64에 의한 WT- TTR 사합체 해리 억제의 시간 경과 분석. 화합물 25, 47 및 64를 DMSO에 용해하여 10 mM 1차 원액을 제공하고, 이를 10배 EtOH 희석하여 1 mM 2차 원액을 수득하였다. 1.0 mg/mL (18 μM) WT-TTR 용액 (50 mM 인산나트륨, 100 mM KCl, 및 1 mM EDTA, pH 7.2) 200 ㎕, 및 1 mM 억제제 2차 원액 7.2 ㎕ 또는 3.6 ㎕ (각각 2배 및 1배)을 2 mL 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 간단히 볼텍싱하고, 25℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. TTR·억제제 용액 100 ㎕를 우레아 완충액 (6.67 M 우레아, 50 mM 인산나트륨, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 7.2) 900 ㎕에 첨가하고, 최종 1 mL 용액을 다시 볼텍싱하고, 교반하지 않으면서 37℃에서 어둡게 하여 인큐베이션하였다. 우레아와 혼합한 후 0, 4, 11, 24, 49, 73, 97, 122, 146 및 170 시간에서, 218 nm와 215 nm 사이에서 매 0.5 nm마다 평균 5 초 동안 스캐닝하면서 원편광 이색성 스펙트럼을 측정하였다. 측정한 후, 샘플을 다시 각각의 에펜도르프 튜브에 넣고, 계속해서 인큐베이션하였다. EtOH 중 10％ DMSO 7.2 ㎕를 함유하는 대조군 샘플을 제조하고, 비교를 위해 상기와 같이 분석하였다. CD 증폭 수치를 215 nm와 218 nm 사이에서 평균하여, 실험하는 동안 β-시트의 손실량을 측정하였다. 이 β-시트 손실량을 통해 측정된 바와 같이 TTR 사합체 해리는 급속한 (대략 500,000배 더 빠름) 단량체 변성으로 이어졌다 (문헌 [Hammarstrom, P.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 16427-16432]).
억제제 합성: 화학적 합성을 위한 시약을 시판 공급자로부터 구입하여, 달리 언급하지 않는 한 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 실리카 겔 60 F254 코팅된 알루미늄 플레이트 상의 박막 크로마토그래피 (이엠 사이언시즈(EM Sciences)) 또는 분석적 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 반응 과정을 모니터링하였다. HPLC는 워터스(Waters) 486 조정가능한 흡광도 검출기 및 워터스 717 플러스 자동 샘플러를 이용하는 워터스 600E 다용매 전달 시스템을 사용하여 수행하였다. 모든 역상 HPLC 분석에는 C18 웨스턴(Western) 분석 컬럼을 이용하였다 (모델 033-715, 150 Å 공극 크기, 3 ㎛ 입자). 아세토니트릴/물/트리플루오로아세트산산 용매계를 사용하였고, 용매 A의 비율은 각각 4.8％, 95％ 및 0.2％인 반면, 용매 B는 각각 95％, 4.8％ 및 0.2％이었다. 2 분간의 100％ A의 단일 용매 흐름 이후, 8 분에 걸쳐 0 내지 100 ％ B의 선형 구배를 1.5 mL/분으로 작동시켰다. 모든 플래쉬 크로마토그래피는 230 내지 400 메쉬 실리카 겔 60 (이엠 사이언시즈)을 이용하여 수행하였다. 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼을 브루커(Bruker) 분광기 상에서 300, 400, 500 또는 600 MHz에서 기록하였다. 화학적 이동은 내부 표준 (Me4Si, 0.0 ppm)으로부터 하류 ppm으로 기록하였다.
( 디벤조푸란 -1- 일옥시 )- 트리이소프로필 - 실란 (5). 건조 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 페놀 4 (문헌 [Tashiro, M. Y., et al. Synthesis 1980, 6, 495-496]) (492 mg, 2.67 mmol) 및 교반 막대를 첨가하고, 플라스크를 격막으로 밀폐하였다. CH2Cl2 (5 mL)를 첨가한 후, DMAP (391 mg, 3.2 mmol) 및 트리이소프로필실릴 클로라이드 (800 ㎕, 3.73 mmol)를 첨가하였다. 생성된 무색 용액이 밤새 백색 현탁액으로 되었다. 반응물을 250 mL 분리로로 옮기고, H2O (3x10 mL)로 세척하였다. 수성 층을 합하고, CH2Cl2 (3x30 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, MgSO4로 건조하고, 감압하에 농축하여, 엷은 황색 오일을 수득하였다. 상기 오일을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피 (100％ 헥산)로 정제하여, 화합물 5를 무색 오일로서 0.70 g (77％) 수득하였다. MALDI-FTMS 341.1932 m/z (M+H)+, C21H29O2Si의 이론치는 341.1931이다.
1- 트리이소프로필실라닐옥시 - 디벤조푸란 -4,6-디카르복실산 디메틸 에스테르 (6). 실릴 에테르 5 (654 mg, 1.92 mmol)를 건조 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가한 후, Et2O (7.4 mL) 및 TMEDA (0.87 mL, 5.77 mmol)를 첨가하였다. 플라스크를 아세톤/CO2(s) 중에서 10 분 동안 -78℃로 냉각시킨 후, 10 분에 걸쳐 sec-부틸 리튬 (시클로헥산 중 1.3 M 용액 4.44 mL, 5.77 mmol)을 첨가하였다. 생성된 오렌지색 현탁액을 실온으로 가온시키고, 24 시간 동안 교반하였다. 플라스크를 상기 기재한 바와 같이 -78℃로 다시 냉각시키고, 15 psi 증기의 CO2(g)를 반응 현탁액에 통과시켰다 (CO2는 활성화 실리카를 함유하는 건조 튜브를 통과함으로써 건조된다). CO2(g)의 초기 첨가 후, 냉각조를 제거하고, 반응물을 30 분 동안 교반하였다. 반 응 혼합물을 얼음물 (50 mL)을 함유하는 1 L 비커에 부었다. 0.05 M KOH를 천천히 첨가하여 용액을 pH 9로 조정한 다음, 얼음/H2O 조를 이용하여 0℃로 냉각시켰다. 용액을 0.5 M HCl에 의해 pH 2로 산성화시키고, 이로써 백색 고체가 침전되었다. 수성 현탁액 (pH 2)을 1 L 분리로로 옮기고, EtOAc (5x50 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 MgSO4로 건조하고, 감압하여 농축하여, 오일로서 조 이산을 수득하였다. 상기 조 이산을 함유하는 100 mL 플라스크에 교반 막대를 장착하고, 격막으로 밀폐하고 배기시켰다. 그 후, 플라스크를 아르곤으로 충전하였다. 무수 MeOH (2 mL) 및 ACS 시약 등급 벤젠 (8 mL)을 시린지를 통해 첨가하였다. 트리메틸실릴디아조메탄 (TMSCHN2; 헥산 중 2 M 용액 2.5 mL, 5 mmol)을 격막을 통해 시린지로 천천히 첨가하였다. TMSCHN2 첨가를 완료한 후, 반응물을 10 분 동안 교반하고, 용매를 감압하에 제거하여, 적색 오일을 수득하였다. 잔류물을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피 (헥산 중 15％ EtOAc)에 의해 정제하여, 화합물 6을 백색 고체로서 0.36 g (43％) 수득하였다. MALDI-FTMS 479.1874 m/z (M+Na)+, C25H3206SiNa의 이론치는 479.1860이다.
1-히드록시- 디벤조푸란 -4,6-디카르복실산 디메틸 에스테르 (7). 건조 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 교반 막대를 장착하고, 화합물 6 (363 mg, 0.95 mmol)으로 채우고, 격막으로 밀폐하고, 배기시키고, 아르곤으로 충전하였다. 무수 THF (6.3 mL) 및 테트라-부틸암모늄 플루오라이드 (THF 중 1 M, 1.2 mL, 1.19 mmol)을 시린지를 통해 반응에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음, 250 mL 분리로 중 H2O 30 mL에 부었다. 수성 층을 CHCl3 (4x20 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, MgSO4로 건조하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피 (헥산 중 30％ EtOAc)에 의해 정제하여, 화합물 7을 백색 고체로서 0.23 g (97％) 수득하였다. LC-MS m/z 301, C16H12O6의 이론치는 301이다.
1- 트리플루오로메탄술포닐옥시 - 디벤조푸란 -4,6-디카르복실산 디메틸 에스테르 (8). Stille에 의해 이전에 기재된 트리플레이트화 절차를 이용하여 화합물 8을 합성하였다 (문헌 [Echavarren, A. M.; et al. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486]). 페놀 7 (120 mg, 0.4 mmol)을 건조 10 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가한 다음, 플라스크를 격막으로 밀폐하였다. 용매인 무수 피리딘 (2 mL)을 격막을 통해 시린지로 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음/H2O 조에서 0℃로 냉각시켰다. 반응을 개시하기 위해, 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (81 ㎕, 12 mmol)을 격막을 통해 시린지로 첨가하였다. 얼음 조를 제거하고, 반응물을 실온으로 가온시키고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음/H2O 슬러리를 함유하는 250 mL 비커에 붓고, 125 mL 분리로로 옮겼다. 수성 층을 Et2O (4x40mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 포화 CuSO4 (4x20 mL) 및 염수 (2x20mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조한 다음, Et2O를 감압하에 제거하여, 옅은 황색 고체를 수득하였다. 이 고체를 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피 (헥산 중 30％ EtOAc)에 의해 정제하여, 화합물 8을 백 색 고체로서 159 mg (92％) 수득하였다. FAB-MS (NBA/NaI) m/z 433.0215 (M+H)+, C17H12F3O8S의 이론치는 433.0205이다.
화합물 8과 치환된 아닐린의 팔라듐 촉매된 교차 커플링을 위한 대표적인 절차.
Buchwald 및 Hartwig에 의해 보고된 아릴 커플링 절차를 이용하여 화합물 9 내지 23을 제조하였다. 교반 막대가 장착되고 격막으로 밀폐되는, 화염 건조된 10 mm x 13 cm 보로실리케이트 시험관을 화합물 8 (140 mg, 0.324 mmol), 팔라듐 디벤질리덴 아세톤, Pd2(dba)3 (15 mg, 0.016 mmol), (±)-binap (15 mg, 0.024 mmol), Cs2CO3 (147 mg, 0.456 mmol), 및 아닐린 (32 ㎕, 0.356 mmol)으로 채웠다. 모든 시약을 첨가한 후, 시험관을 10 분 동안 아르곤으로 퍼징하였다. 그 후, 무수 톨루엔 (2.4 mL)을 격막을 통해 첨가하고, 반응 혼합물을 오일 조 중에서 36 시간 동안 100 ℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 감압하에 여액으로부터 제거하였다. 생성된 짙은색 오일을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피 (헥산 중 30％ EtOAc)에 의해 정제하여, 비아릴 아민 17을 백색 고체 (0.12 g, 68％)로서 수득하였다. 화합물 10 내지 23의 구체적인 합성 방법 및 특성 분석 데이타에 대한 보충 정보는 하기 화합물 9에 대해 보고된 것과 유사하다는 것을 참고한다.
1- 페닐아미노 - 디벤조푸란 -4,6-디카르복실산 디메틸 에스테르 (9). MALDI- FTMS 375.1094 m/z (M)+, C22H17NO5의 이론치는 375.1106이다.
페놀 7과 치환된 페닐보론산의 구리 매개된 교차 커플링에 의해 1-페녹시디벤조푸란 39 내지 43을 수득하는 대표적인 절차.
비아릴 에테르 커플링에는 Chan 및 Evans에 의해 보고된 절차를 바로 채택하였다. 자성 교반 막대가 장착된 20 mL 섬광 바이알을 페놀 7 (150 mg, 0.50 mmol), 구리(II) 아세테이트 (91 mg, 0.5 mmol), 새로 활성화된 4 Å 분자체 (대략 250 mg), 및 페닐보론산 (180 mg, 1.5 mmol)으로 채웠다. 디클로로메탄 (5 mL)을 첨가한 다음, 피리딘 (201 ㎕, 2.5 mmol)을 첨가하여, 아쿠아색 현탁액을 수득하였다. 반응 현탁액이 대기로 일부 개방되도록, 캡을 매우 느슨하게 덮었다. 반응을 TLC에 의해 모니터링하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 실리카 겔 대략 6 g 상에서 흡습시키고, 실리카 겔을 반응 혼합물에 첨가한 다음, 감압하에 용매를 제거하였다. 반응 혼합물의 실리카 상 크로마토그래피 (헥산 중 30％ EtOAc)에 의해 비아릴 에테르 39를 백색 고체 (29 mg, 15％)로서 수득하였다. 화합물 40 내지 43의 구체적인 합성 방법 및 특성 분석 데이타에 대한 보충 정보는 하기 화합물 39에 대해 보고된 것과 유사하다는 것을 참고한다.
1- 페녹시 - 디벤조푸란 -4,6-디카르복실산 디메틸 에스테르 (39). MALDI-FTMS 399.0825 m/z (M+Na)+, C22H16O6Na의 이론치는 399.0839이다.
트리플레이트 8과 치환된 페닐보론산의 팔라듐 촉매된 교차 커플링에 대한 대표적인 절차.
교반 막대가 장착되고 격막으로 밀폐된, 화염 건조된 10 mm x 13 cm 시험관을 화합물 8 (100 mg, 0.23 mmol), Pd(PPh3)4 (14 mg, 0.01 mmol), LiCl (29 mg, 0.69 mmol), Na2CO3 (2 M 수용액 300 L) 및 톨루엔 (3 mL)으로 채웠다. 페닐보론산 (43 mg, 0.35 mmol)을 EtOH (0.5 mL)에 용해하고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 에스테르 교환 반응이 관찰되기 때문에 다른 모든 화합물에 대한 절차에서는 EtOH 대신에 MeOH를 사용하였며, 따라서, 화합물 49는 디에틸 에스테르로서 단리되었고, 다른 모든 화합물은 디메틸 에스테르로서 단리되었다. 시약을 첨가한 후에, 시험관을 아르곤으로 퍼징하고, 반응 혼합물을 오일 조에서 12 시간 동안 100℃로 가열하였다. 그 후, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 감압하에 여과물로부터 제거하고, 생성된 짙은색 잔류물을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피 에 의해 정제하여, 비아릴 49을 백색 고체 (52 mg, 63％)로서 수득하였다. 화합물 50 내지 59의 구체적인 합성 방법 및 특성 분석 데이타에 대한 보충 정보는 하기 화합물 49에 대해 보고된 것과 유사하다는 것을 참고한다.
1- 페닐 - 디벤조푸란 -4,6-디카르복실산 디에틸 에스테르 (49). MALDI-FTMS 411.1197 m/z (M+Na)+, C24H2005Na의 이론치는 411.1203이다.
에스테르 가수분해에 의해 최종 억제제 24 내지 38, 44 내지 48 및 60 내지 70을 수득하는 대표적인 절차.
자석 막대를 구비한 20 mL 섬광 바이알에서 메틸 에스테르 9 (25 mg, 0.067 mmol)를 THF:MeOH:H2O (3:1:1, 1 mL) 중에서 에스테르 가수분해하였다. LiOH·H2O (22 mg, 0.53 mmol)를 현탁액에 첨가하고, TLC 또는 분석적 역상 HPLC 모니터링에 의해 측정시 반응이 완료될 때까지 (전형적으로 4 시간 동안) 교반하였다. 반응 혼합물을 염수 (2 mL)로 희석하고, 1 M HCl에 의해 pH 2로 산성화시켜 (pH 종이), 2상 용액을 수득하였다. 상층 (THF)을 제거하고, 수성 층을 THF (3x3 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO4에 의해 건조한 다음, 감압하에 농축하여, 이산 24를 백색 고체 (21 mg, 92％)로서 수득하였다. 화합물 25 내지 38, 44 내지 48 및 60 내지 70의 구체적인 합성 방법 및 특성 분석 데이타에 대한 보충 정보는 하기 화합물 24에 대해 보고된 것과 유사하다는 것을 참고한다.
1- 페닐아미노 - 디벤조푸란 -4,6-디카르복실산 (24). MALDI-FTMS 347.0794 m/z (M)+, C20H13NO5의 이론치는 347.0788이다.
도 1A는 TTR·12의 X-선 결정학적 구조이다 (문헌 [Klabunde, T.; et al. Nature Struct. Biol. 2000, 7, 312-321]). 결합 부위 내부의 잔기들은 막대 모델로 표시되어 있으며 (산소는 붉은 색, 질소는 청색, 탄소는 회색), 단백질의 코놀리(Connolly) 표면은 회색으로 도시되어 있다. 화합물 1은 2원 C2 대칭 동등 결합 방식 (황색 및 녹색)으로 도시된다. 결합 채널은 이들이 티록신의 요오드와 상호결합하기 때문에 할로겐 결합 포켓 (HBP)으로 지칭되는 세가지 집합의 침강부를 갖는다. 화합물 1은 결합 포켓의 외측 부분만을 차지하며, HBP1 및 1' 둘 다를 채운 다. 화합물 1의 카르복실산은 K15 및 K15'의 ε-NH3 +와 인접한다.
도 1B는 티록신 결합 포켓에 위치한 1-치환된-디벤조푸란-4,6-디카르복실산의 디자인의 선형 대표도이다 (식 중, X는 NH, O 또는 C아릴-C아릴 직접 연결을 나타내고, R은 TTR의 내측 결합 공동을 상호 보완하는 구조를 갖는 아릴 고리의 치환기임).
도 2는 pH 4.4 (72 시간)에서 WT-TTR (3.6 μM) 아밀로이드 피브릴 형성 (f.f.)에 대한 농도 의존적인 산-치환된 디벤조푸란의 활성을 보여주는 표이다. 수치는 f.f.의 정도를 나타내며, 따라서 억제제 부재하에 WT-TTR 피브릴 형성에 대한 억제 효능은 100％로 표시되고, 완전한 억제는 0％ f.f.에 해당한다.
도 3은 WT-TTR (3.6 μM) 피브릴 형성 (pH 4.4, 72 시간)에 대한 디벤조푸란 기재의 아밀로이드 억제 활성 (3.6 μM) 및 인간 혈장에서 TTR에 대한 결합 화학량론을 요약하여 보여주는 차트이다. 가운데 컬럼의 피브릴 형성 ％ (f.f.) 수치는 f.f.의 정도를 나타내며, 따라서 억제제 부재하에 WT-TTR f.f.에 대한 억제 효능은 100％로 표시된다. 완전한 억제는 0％ f.f.에 해당한다. 우측 컬럼은 항체 포획 방법을 이용하여 측정하였을 때 혈장 중에서 TTR에 결합한 억제제의 관찰된 화학량론을 도시한다 (10.8 mM에서 투여, 혈장 TTR 농도의 대략 2 내지 3배).
도 4는 1-히드록시-디벤조푸란-4,6-디카르복실레이트 디메틸 에스테르 및 상응하는 트리플레이트의 합성에 대한 반응식이다: a) K3[Fe(CN)6], KOH, H2O, 벤젠; b) AlCl3, 톨루엔, 두 단계 모두에서 33％; c) TIPSCI, DMAP, CH2Cl2, 77％; d) sec-BuLi, Et2O, -78℃, 기체상 CO2, TMSCH N2, 43％; e) TBAF, THF, 97％; f) Tf2O, 피리딘, 92％.
도 5는 1-페닐-, 페녹시-, 및 페닐아민-디벤조푸란-4,6-디카르복실레이트 디메틸 에스테르 및 상응하는 디카르복실레이트의 합성에 대한 반응식이다: a) Pd2(DBA)3, (±)binap, Cs2CO3, 톨루엔 100℃; b) LiOH·H2O, THF/MeOH/H2O (3:1:1); c) CuII(OAc)2, 4Å MS, CH2Cl2; d) Pd(PPh3)4, LiCl, 수성 Na2CO3, 톨루엔, MeOH, 80℃.
도 6은 pH 4.4 (72 시간)에서 WT-TTR (3.6 μM) 아밀로이드 피브릴 형성 (f.f.)에 대한 디벤조푸란-기재 억제제의 활성 (7.2 μM)을 보여주는 차트이다. 수치는 f.f.의 정도를 나타내며, 따라서 억제제 부재하에 WT-TTR 피브릴 형성에 대한 억제 효능은 100％로 표시되고, 완전한 억제는 0％ f.f.에 해당한다.
도 7은 피브릴 형성 억제 효능에 대해 플롯팅한 디벤조푸란 혈장 TTR 결합 화학량론을 도시하는 표이다. 약간 어두운 영역은 높은 활성 및 높은 선택성 (40％ 미만의 피브릴 형성 및 1 초과의 결합 화학량론)에 해당하고, 진하게 어두운 영역은 우수한 화합물 (30％ 미만의 피브릴 형성 및 1.25 초과의 결합 화학량론)에 해당한다. 데이타 점은 세가지 상이한 연결기를 나타낸다: NH (▲), O ( ), 및 C아 릴-C아릴 직접 연결 (●). 디벤조푸란-4,6-디카르복실산 (1) 데이타 점 (●)은 비교를 위해 도시하였다.
도 8은 TTR (3.6 μM)에 대한 침강 속도 연구에서 화합물 27 (7.2 μM)과 함께 예비 인큐베이션한 다음, pH를 4.4로 저하시켜 72 시간 동안 (억제제의 부재하에 최대 아밀로이드 형성을 나타내는 시간임) 더 인큐베이션한 후에, 중심으로부터의 거리에 대한 280 nm에서의 흡광도의 플롯을 도시한다. 속도 분석 - 50,000 rpm에서 15 분마다 취한 데이타 집합의 중첩. 데이타 (기호들)는 MW 57.1 ± 0.2 kDa의 이상적인 단일 종 모델 (실선)로 조정된다.
도 9는 TTR (3.6 μM)에 대한 평형 초원심분리 연구에서 화합물 27 (7.2 μM)과 함께 예비 인큐베이션한 다음, pH를 4.4로 저하시켜 72 시간 동안 (억제제의 부재하에 최대 아밀로이드 형성을 나타내는 시간임) 더 인큐베이션한 후에, 중심으로부터의 거리에 대한 280 nm에서의 흡광도의 플롯을 도시한다. 평형 분석 - 17,000 rpm의 속도에서 샘플에 원심력을 가한지 24 시간 후에 관찰된 평형 농도 구배. 데이타 (○)는 MW 55.0 ± 0.2 kDa의 이상적인 단일 종 모델 (실선)로 조정된다. 실험 데이타와 조정된 데이타 사이의 차이는 삽입하여 도시한다.
도 10은 500 nm에서의 혼탁도로 측정하였을 때, 억제제 25, 47 및 64 (이들 억제제는 도면에서 명암으로 구별함)의 부재하에 (▲), 7.2 μM 하에서 (◇) 및 3.6 μM 하에서 (○), 부분 산 변성에 의해 매개된 WT-TTR (3.6 μM) 피브릴 형성을 시간 경과에 따라 분석한 플롯을 도시한다. 흑색 및 백색 플롯에서 어떤 화합 물이 가장 효능이 있는지 식별하기가 어렵다. 플롯 종료시에 또는 169 시간이 지난 후에, 화합물 47이 피브릴을 가장 많이 형성하였고, 그 다음으로는 화합물 64 및 화합물 25의 순이었다.
도 11은 억제제 25, 47 및 64 (이들 억제제는 도면에서 색깔로 구별함)의 부재하에 (▲), 7.2 μM 하에서 (◇) 및 3.6 μM 하에서 (○), WT-TTR (3.6 μM) 사합체 해리 (6.0 M 우레아)를 시간 경과에 따라 분석한 플롯을 도시한다. 원자외선 CD 분광법에서 느린 사합체 해리가 관찰되지 않았지만, 이 과정은 원편광 이색성 분광법에 따라 용이하게 β-시트 함량의 손실이 측정된 바와 같이 급속한 (대략 500,000 배 더 빠름) 단량체 변성으로 이어졌다. 흑색 및 백색 플롯에서 어떤 화합물이 가장 효능이 있는지 식별하기가 어렵다. 플롯 종료시에 또는 169 시간이 지난 후에, 화합물 25가 사합체 해리에 가장 효과적이었고, 그 다음으로는 화합물 64 및 화합물 47의 순이었다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 화합물.
    <화학식 I>
    Figure 112006094148118-PCT00008
    상기 식에서,
    X는 부재하거나, -0-, -S- 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 라디칼이고,
    R2, R3, R4 및 R5는 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -CF3 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 독립으로 선택된 라디칼이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 II로 표시되는 화합물.
    <화학식 II>
    Figure 112006094148118-PCT00009
  3. 제2항에 있어서, R2가 -H, -F, -Cl 및 -CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  4. 제2항에 있어서, R4가 -H, -Cl 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  5. 제2항에 있어서, R5가 -H, -F 및 -Cl로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  6. 제2항에 있어서, 하기 구조식으로 표시되는 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 112006094148118-PCT00010
  7. 제1항에 있어서, 하기 화학식 III으로 표시되는 화합물.
    <화학식 III>
    Figure 112006094148118-PCT00011
  8. 제7항에 있어서, R3이 -H, -F, -Cl, -Br 및 -CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  9. 제7항에 있어서, R5가 -H, -F, -Cl 및 -Br로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  10. 제7항에 있어서, 하기 구조식으로 표시되는 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 112006094148118-PCT00012
  11. 제1항에 있어서, 하기 화학식 IV로 표시되는 화합물.
    <화학식 IV>
    Figure 112006094148118-PCT00013
  12. 제11항에 있어서, R2가 -H, -F 및 -Cl로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  13. 제11항에 있어서, R3이 -H, -F, -Cl, -CF3 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  14. 제11항에 있어서, R4가 -H 및 -CO2H로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  15. 제11항에 있어서, R5가 -H, -F, -Cl 및 -CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼인 화합물.
  16. 제11항에 있어서, 하기 구조식으로 표시되는 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 112006094148118-PCT00014
  17. 아밀로이드 피브릴 형성을 억제하는데 충분한 농도의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항으로부터 선택된 화합물과 트랜스티레틴을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
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