CN1798832B - 含有动物培养细胞球状体的培养细胞构成物及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供一种含有图案化的培养实质细胞球状体的培养物，该培养物可以通过在被特定的亲水性聚合物的表面隔开并图案化的培养内皮细胞或培养成纤维细胞上，培养实质细胞而得到。该培养物能够使实质细胞长期保持特异的功能。

Description

含有动物培养细胞球状体的培养细胞构成物及其用途
技术领域
本发明涉及动物细胞的培养物及该培养细胞的构成物，更具体地说，涉及含有培养细胞球状体的共培养物及表面载持该共培养物的生物装置。生物装置或共培养物本身可以用于例如动物细胞生理学或病态生理学状况的检查或移植治疗、器官再生工程学、杂交型人工器官等技术领域。
背景技术
从功能的观点来看，动物细胞大致可以分为实质细胞(parenchymal cell)和实质细胞以外的非实质细胞(nonparenchymal cell)。其中，实质细胞是掌管组织或器官的功能的细胞。例如，肝脏的实质细胞，即肝细胞(hepatocyte)，承担多种多样的物质的合成、分解、贮藏，对生命体来说是极其重要的基本单位。
因而，为了在生物体外模仿生命体中肝细胞功能的表达，已经提出了该细胞的各种培养体系。例如，在R.Singhvi等的美国专利第5,976,826号说明书中，记载了在通过由亲水性且细胞非亲和性(cytophobic)物质形成的区域隔离的细胞亲和性(cytophilic)区域培养肝细胞的方法或用于该方法的装置。该装置中，各个细胞接种在疏水性表面或者由具有电荷部分(-COO-、-PO3H-)的化合物或细胞外基质的组成蛋白质等形成的表面区域(一般为1-2500μm2，优选1-500μm2)上。该专利说明书中，主要记载或打算做的培养可以认为属于所谓的单层培养。另一方面，也尝试了以提高肝细胞的功能，例如增强肝特异性蛋白质的分泌为目的的立体培养(three-dimensional growth pattern)(M.Smalley等，In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.(1999)35，pp.22-32)。该培养方法中，在I型胶原或特殊的细胞外基质的凝胶上培养来源于正常的人肝细胞的细胞株。
此外，作为对各种实质细胞或非实质细胞的各培养细胞根据以毒性试验为主的各种目的都能够良好地使用的装置，还提供了将培养细胞图案化使之按一定方式排列的装置[例如特开平3-7576号(具有细胞粘结性表面和细胞非粘结性表面的细胞的排列控制用具)、上述美国专利第5,976,826号(肝细胞的培养)、专利第2973976号(内皮细胞的培养)、特开平7-308186号(内皮细胞的培养)等]。
如上所述，与单层培养相比，一般来说立体培养能够得到具有与生物体内肝细胞的功能更接近的功能的培养细胞，但这种立体培养体系的培养细胞容易从培养支持体上剥离，尚没有在图案表面上实现立体培养体系的例子，就上述功能的表现程度和功能的维持时间等而言，迄今为止还不能得到满足。
另外，本来动物的器官是由各种性质的组织(具有同样功能的细胞的集合)构成的，作为其构成单位的细胞在大多数情况下通过相同或不同种的细胞间的相互作用来保持其功能等。因此，在S.N.Bhatia等的The FASEB Journal，Vol.13(1999)；1883-1900中，记载了基于与实质细胞邻接的非实质细胞间的异型细胞相互作用对细胞的增殖、移动和/或分化进行修饰的观点，对通过肝细胞与作为非实质细胞的成纤维细胞的共培养(cocultivation)来保存肝细胞的表现型进行研究的结果。指出在这样的共培养中，如果通过在同一平面上培养非实质细胞，周围被包围的单层培养肝细胞离开其界线3至4个细胞以上，则例如细胞内的白蛋白产生能力降低至与纯粹肝细胞培养物相同的水平。因此，在这种共培养体系中，培养肝细胞的凝聚物中的细胞很难全部稳定地发挥肝特异性功能。
因此，本发明的目的在于提供一种包含肝细胞的实质细胞的特异性功能更强，且能够长期维持，并且在进行微图案化(micropatterning)时该图案能够稳定地维持的培养动物细胞体系。
发明公开
本发明人对相互不同的二种细胞中之一的肝细胞的培养体系，和由该培养体系获得的培养肝细胞的功能进行了研究。结果发现，如果不按上述S.N.Bhatia等所指出的那样在同一平面上进行肝细胞与非实质细胞的共培养，使其发生通过异型界面(heterotypicinterface)的相互作用，而是将肝细胞在培养内皮细胞或成纤维细胞的一定区域的细胞单层上培养，则培养肝细胞与该单层表面接触，形成粘结的球状体，而且这样形成的球状体对肝细胞具有特异性功能，例如能长期稳定地产生白蛋白。此外，包含这些球状体、以及和形成与这些球状体接触的下层的肝细胞不同的细胞的单层的共培养物；以及包括该共培养物及其支持体的培养细胞构成物(以下有时称为球状体/培养细胞单层/支持体)对从支持体上剥离各种培养细胞表现出抵抗性(稳定性)。还发现，这样的培养细胞构成物应用于肝细胞以外的能形成球状体的实质细胞或非实质细胞中时，也能提供含有保持这些细胞功能的球状体的培养细胞构成物。
本发明人还发现，形成该球状体下层(或成为基础)的细胞中的内皮细胞或成纤维细胞一般增殖力和/或运动性强，有向接种并培养的支持体的小区域的周围移住并增殖的倾向，但是，如果用有一定的亲水性而且能够成为细胞非亲和性物质的聚合物表面将此小区域包围，则可以抑制该内皮细胞或成纤维细胞等培养细胞从该小区域移住或移动，而且也能抑制在这些培养细胞上形成的球状体的移住或移动，使这样形成特殊形态的共培养物能够稳定地保持在支持体上。
因此，根据本发明，提供支持体上含有相互不同的动物细胞的1种或2种以上共培养物的培养细胞构成物。这种培养细胞构成物中的各共培养物包含：
相互不同的细胞中的一种，优选来源于实质细胞的培养细胞的球状体，以及
形成与该球状体接触的下层，且能够使形成该球状体的细胞生存和发挥功能的来源于与该细胞不同的另1种细胞的培养细胞形成的实质上的单层。
作为本发明的另一方案，提供包含2种以上上述共培养物形成的表面的生物装置。
作为本发明的其它方案，提供一种培养细胞构成物的制作方法，其是在支持体上含有相互不同的动物细胞的1种或2种以上共培养物的培养细胞构成物的制作方法，该培养细胞构成物包含在多个隔离的小区域上载有培养细胞形成的球状体的共培养物，其特征在于，在应粘结共培养物的材料表面上，形成以聚乙二醇片段为基础的聚合物层，该聚乙二醇片段的任意一个末端共价结合了或未结合从构成对动物细胞表面受体的配体的结合域的单糖或寡糖以及寡肽中选择的化合物，通过有多个圆形孔的遮盖图案对上述聚合物层进行等离子体处理，每个圆形孔之间的间隔至少为约100μm，圆形孔的直径为约50-100μm，这样除去与上述孔相应的区域的聚合物层，必要时，在除去了聚合物层的小区域内涂布细胞亲和性物质，并在该小区域内培养内皮细胞或成纤维细胞，形成培养细胞的单层；然后，通过在该培养细胞上培养与该培养细胞不同的细胞，形成该不同细胞的球状体。
此外，本发明还提供从上述培养细胞构成物的支持体上剥离下来的共培养物本身。
根据这些本发明，采用上述肝细胞和内皮细胞或成纤维细胞，达到与通过培养得到的细胞同样的效果。例如，按照本发明的培养肝细胞球状体，最低3周能高水平地维持白蛋白产生能力。
附图说明
图1是代替表示实施例中制备的按照遮盖图形形成的玻璃表面露出孔的附图的显微镜照片。
图2是代替表示来自图1的图形化孔的细胞培养床上培养内皮细胞粘结状态的附图的显微镜照片。
图3是代替表示肝细胞只在图2的图形状形成结合域的内皮细胞上粘结、并形成肝细胞球状体的状态的附图的显微镜照片。
图4是代替表示100μm圆形孔之间的距离小于100μm时，培养内皮细胞的图形连在一起时的附图的显微镜照片。
图5是代替表示在内皮细胞上图形状形成的肝球状体3维图象的附图的共焦点激光显微镜照片。
实施发明的最佳方式
根据本发明，共培养的相互不同的动物细胞之一，只要是通过后面所述的共培养能够形成球状体的细胞，可以是任何一种细胞，优选实质细胞。所谓实质细胞是指在组织或器官中，成为承担其功能的部分的细胞。例如，肝脏的实质细胞是肝细胞，肺的实质细胞是肺泡上皮细胞。该定义所包含的、遵循本发明目的的任何细胞都是本发明所说的实质细胞。对实质细胞无限定，但作为本发明中特别强调要使用的实质细胞，可以例举肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经胶质细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、骨细胞。但是，即使是上述定义包括的实质细胞之外的非实质细胞，只要如上所述，能形成球状体、遵循本发明的目的，都包含在上述动物细胞内。
作为共培养的相互不同的动物细胞的另一种细胞，只要是在共培养时，能起到使上述可形成球状体的细胞生存和发挥功能的作用的不同于该细胞的细胞，可以是任何一种细胞，可以例举内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等细胞。优选内皮细胞，特别是血管内皮细胞，特别优选脐带静脉血管内皮细胞。此外，作为其他优选的细胞，有成纤维细胞，成纤维细胞是分散并存在于动物个体内几乎所有组织中的中胚叶由叶细胞，根据通过进行上述培养形成球状体的细胞进行使用，亦即优选使用对该细胞存在的脏器的形态形成起重要作用的成纤维细胞。另外，对共培养的相互不同的动物细胞的组合没有限制，除了上述组合以外，也可以是成纤维细胞-内皮细胞、上皮细胞-内皮细胞之类的非实质细胞-非实质细胞；心肌细胞-肝细胞、胰β细胞-肝细胞之类的实质细胞-实质细胞的组合。
以上的细胞只要是其存在的动物起源的细胞，可以是任何动物的细胞，例如，可以是家禽类、哺乳动物、特别是人来源的细胞。
这些相互不同的动物细胞按照本发明进行共培养时，内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞在培养支持体的表面上形成实质上是培养细胞的单层作为支架依赖性细胞或饲养细胞，然后，在该单层上培养的与形成该单层的细胞不同的细胞，优选是实质细胞，与构成该单层的培养细胞接触，通过进行异型相互作用，长期稳定地保持相应的细胞特异功能。这里所说的形成实质上是培养细胞的单层是指形成该细胞层的区域的80％以上、优选90％以上、更优选95％以上由培养细胞的单层构成。此外，所谓的共培养，可以在任何时期，上述相互不同的动物细胞一起进行培养，本发明中，参照例如首先培养内皮细胞或成纤维细胞，形成单层后，这些培养细胞进一步与实质细胞一起培养的情况，则更容易理解。
这样在培养支持体表面的小区域上培养例如内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞，在该小区域上构建成这些培养细胞形成的饲养层，然后，可以提供在饲养层的表面上与该饲养层直接接触的含有优选来源于实质细胞的球状体构成的共培养物的培养细胞构成物。所谓来源于某种细胞的培养细胞形成的球状体，正如“球状体”这一用语的含意，表示实质上形成球状的培养实质细胞的凝集块；是指作为图5附加的共焦点激光显微镜照片中所看到的形态，或与其近似的形态。称为实质上呈球状，并不限于完全的球状，也包括有点扁平状的形态，“实质上呈球状”就是在这样的意图下使用。
上述的小区域只要能够达到本发明的目的，则没有限定，一般可以是具有约1,000-约200,000μm2，优选约1,500-约50,000μm2的任何形状，例如圆形、以四角形为主的多角形、椭圆形等。优选圆形，这时，其直径为约40-约500μm，优选约50-200μm，更优选约50-约100μm，在具有较大直径的小区域上，饲养细胞层以及进一步在其上面载有球状体的培养细胞构成物，表现出各种培养物或共培养物容易从支持体表面剥离的倾向，或者出现球状体不能稳定保持其起源实质细胞的功能的情况。
如上所述，例如，在这样的小区域上，培养内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞时，有时这些培养细胞移住至小区域之外，不能在上述特定的小区域上形成培养物。
根据本发明，作为避免这种不合适的情况的手段，提供了用亲水性且细胞非亲和性的物质制成的包围该小区域周围的表面。有关这种物质的详细情况在后面描述，以前，根据上述美国专利第5,976,826号，提示唾液酸、凝集素、聚半乳糖及其他碳水化物介导细胞的结合(to mediate cell binding)；另外，根据P.H.Weigel等，J.Bio.Chem.Vol.254(1979)10830-10838，举例证明了肝细胞与共价结合在平坦的聚丙烯酰胺凝胶上的糖类特异性连接，但本发明中所说的“细胞非亲和性物质”与这些提示相独立，必须要注意有时反而包含相对立的物质.
具体地说，本发明的亲水性且细胞非亲和性的物质，是能够制备具有以下性质的表面的物质：在后面所述的培养条件下，上述的支架依赖性培养细胞或形成饲养层的培养细胞，完全不会粘结在该物质制成的表面上，或者即使粘结，经过缓和的洗涤或洗涮也能够容易地脱落，随后培养实质细胞时，不能稳定地进行长期培养，或者培养实质细胞也很难粘结。一部分能够形成这种表面的物质可以是上述美国专利第5,976,826号说明书中所记载的形成细胞非亲和性或疏生物性(biophobic)的单分子层的物质。作为优选的物质，可以例举包含聚乙二醇(以下称为“PEG”)部分的化合物。另外，该专利说明书中，具体使用了含有6个乙二醇单元的化合物(例如，HS(CH2)11(OCH2CH2)6OH)。
进一步在本发明中可优选使用，并使本发明变得更为独特的是构成对细胞表面受体的配体的结合域，更具体地说，尽管说肝细胞与糖类粘结，但任意末端共价结合了单糖或寡糖或者某种寡聚肽的以聚乙二醇片段为基础的糖衍生物或肽衍生物或者多糖可以作为细胞非亲和性物质使用。
因此，包围上述小区域的表面也可以用美国专利第5,976,826号记载的化合物制备，但优选使用以PEG链段为基础的聚合物。所谓以PEG链段为基础是指含有PEG链段，从而在这些聚合物不带有糖残基的情况下，能够使所形成的表面主要被PEG链段的自由链覆盖，只要能够发挥这种作用，可以是均聚物或嵌段共聚物，或者是它们的衍生物。另外，所谓自由链是指放置在水性介质中时，该链段实质上能保持自由构象的聚合物链的状态。
对此没有限定，这类聚合物、进一步带有糖残基的糖衍生物或带有寡聚肽残基的肽衍生物可以用以下的通式(I)表示。
通式(I)
Y-L1-(B)m-L2-(CH2CH2O)n-L3-X    (I)
上式中，L1、L2和L3独立地表示原子键、氧原子或接头，其中m为0时，L1和L2可以连在一起，成为原子键、氧原子或1个接头。
B表示下式
Figure G028148428D00071
其中，R1和R2独立地表示氢原子、1-5个碳原子的烷基，而且p为2-5的整数；
X表示氢原子、糖残基或肽残基；
Y表示氢原子或者能将该聚合物结合或粘附到装置表面的官能团；
m为0-10,000的整数，且
n为0-20,000的整数。
另外，L1、L2和L3中，L1表示原子键、-(CH2)q-O-、-(CH2)q-COO-、-(CH2)q-S-、或-CO-(CH2)q-NH-的接头；或者m为0的场合，L1和L2可以连在一起，成为上述对L1所定义的接头，其中，q是2-6的整数，或者m为0以外的场合，L2为-O-或-O-CH2CH2-O；L3是原子键或-(CH2)r-，其中r可以是1-6的整数。
这些聚合物可以使用例如由部分本发明人公开的WO96/32434(或美国专利第5,037,969号)、WO96/33233(或美国专利第5,925,720号)和WO97/06202(或美国专利第5,929,177号)、以及Jo等，Biomaterials，21，605-612，2002记载的聚合物本身，或者经若干修饰或根据其制备的聚合物。
按照本发明，上述通式(I)的X如果是糖残基，例如构成对细胞表面受体的配体的结合域的单糖或寡糖(例如，糖单元可以达到11个，优选达到7个)，特别是二糖的残基时，由相关聚合物形成的表面可以有力地防止本发明中所说的培养细胞粘结，所以特别优选。关于X表示单糖的聚合物，记载在上述WO96/32434(或美国专利第5,037,969)中，另外，按照其中记载的方法，可以担载所需的各种糖残基。同样，X表示多糖残基的聚合物、表示寡糖残基的聚合物都可以通过将上述方法作一些改变来制备。但是，作为另一种方法，将上述WO96/33233(或美国专利第5,925,720号)记载的X部分具有缩醛基的聚合物转化为醛基后，根据需要，将氨基预先导入单糖或寡糖中，利用该氨基和上述醛基，通过还原氨基化反应，可以得到X为糖残基的聚合物。作为这种单糖或寡糖，优选至少含有1个吡喃半乳糖基。对这种寡糖没有限定，作为这种寡糖，可以例举乳糖、各种唾液寡糖。此外，上述通式(I)的X是构成细胞表面受体的配体结合域的寡聚肽残基的亲水性聚合物在本发明中也可以优选使用。该配体可以是凝集素水溶性信号分子(例如蛋白质激素、生长因子蛋白质)。对寡聚肽没有限定，作为寡聚肽，可以例举至少含有精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)，且作为整体可以为水溶性的，氨基酸残基达到10个的寡聚肽。
除了上述与糖类共价结合的以PEG为基础的聚合物的糖衍生物以外，在本发明中还可以将多糖，如聚半乳糖、唾液酸、其它凝集素能结合的多糖本身作为亲水性聚合物使用。对于亲水性聚合物，只要是本领域的技术人员，根据上述举例说明的聚合物即可理解，但在本发明的细胞培养条件下，是指全部聚合物在周围的条件下可溶于水，或者与构成聚合物的链段相应的聚合物(以上述例子来说是聚乙烯)是水溶性的。只要是本领域技术人员，参照后述的实施例，就可以容易地从这些聚合物选择能够在本发明中很好地利用的具体聚合物。
通式(I)中的Y，根据情况有时是Y-L1-(B)-，可以根据欲形成该亲水性物质表面的下层(可以是直接或间接形成培养支持体表面、装置表面的基板、膜、涂膜或蒸镀膜)的性质而适当选择。例如，该支持体表面可以具有使通式(I)的聚合物能够牢固地附着或结合的表面。对形成亲水性物质的表面的方法没有限定，在该支持体表面涂布了硅氧烷，或者对例如含有羟基的表面实施了硅烷处理等疏水化处理的场合，选择部分Y-L1-(B)，使之成为通式(I)中的m表示0以外，例如5以上的整数的嵌段共聚物，利用这种酯链段的疏水性，将该聚合物附着在该支持体表面，从而形成亲水性物质的表面。在这样的例子中，为了使聚合物的附着更强化，将与该酯链段相应的均聚物预先附着在支持体表面，然后再使该嵌段共聚物附着，则能够制作对剥离等表现出良好抗性的亲水物质表面。
此外，支持体表面具有上述美国专利第5,976,826号说明书记载的官能团的场合，基团Y可以是能够与这种官能团反应，并形成共价键，例如-CONH-、-CONHCO-、-S-S-、-O-、-Si-O-、-NH-等的其他官能团。将这些官能团引入Y的方法、以及含有这些官能团的聚合物记载在上述的由部分本发明人公开的专利说明书中。另一方面，在上述美国专利第5,976,826号中，记载了一部分关于提供具有官能团的支持体表面的内容；此外，通过将涂布了聚酰胺、聚氨酯、聚丙烯酰胺等的表面按照其本身公知的方法进行等离子体处理，或者将具有与上述官能团相应的被保护官能团的单体按照其本身公知的等离子体聚合法处理，然后，根据需要将保护基脱去，可以制备。
此外，支持体表面由金、银、铜等金属形成时，通过使基团Y为巯基，可以使通式(I)的聚合物所谓化学吸附在下层，制成所需的表面。
另一方面，该小区域也可以根据需要进行处理，使其表面变成细胞亲和性。本说明书中所说的“细胞亲和性”是指在具有该性质的表面上培养上述内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞时，培养细胞粘结，这样粘结的细胞经过缓和的洗涤或洗涮不会脱落的表面。这种表面可以是由具有疏水性基团(烃基、烷基甲硅烷基、氟代烷基等)的化合物或者具有带电基团(例如，-COO-、-PO3H-等)的化合物(包括构成细胞外基质的蛋白质)形成的表面。这种表面的制备可以按照下述方法进行：在上述亲水性物质的表面的制作方法中，用上述任何一种化合物代替亲水性物质(或亲水性聚合物)进行处理。
细胞亲和性表面的小区域可以按照本领域技术人员众所周知的图案形成法或微图案化法(micropatterning)来制作。但是，可以优选按照下述方法制作，首先，在适合的支持体上形成亲水性聚合物的表面，在其上面设置相应于小区域的孔按需形式排列的图案，通过该孔，进行例如用H2+N2的等离子体处理，除去形成该表面的聚合物层，根据需要，用上述能形成细胞亲和性表面的化合物处理这样所得的小区域。上述“根据需要”所记述的是，只要是使亲水性聚合物表面沉积的表面(可以是装置本身的表面)不会受到上述等离子体处理所带来的不良影响而形成的细胞亲和性表面，就没有必要进行上述任意的处理。
这样制作的小区域之间的间隔优选最短为约100μm。在选择内皮细胞或成纤维细胞等作为支架依赖性细胞或饲养层形成细胞的培养体系中，如果以这种间隔，通过亲水性聚合物的表面区域将多个小区域隔离，则上述小区域上的培养内皮细胞或成纤维细胞、以及培养实质细胞，特别是肝细胞球状体相互之间，实质上不会发生连接或架桥。所谓“实质上不会发生连接或架桥”是指，存在多数的小区域中1个小区域上的培养肝细胞球状体与其他小区域上的培养肝细胞球状体在形态上连接的情况低于10％，优选低于5％，更优选为0％。
这样，按所要求的方式排列的(或图案化的)、担载包含培养细胞形成的球状体的共培养物的培养细胞构成物，可以按照本发明的另一实施方式，即培养细胞构成物的制备方法很好地获得。
(A)在应培养细胞的支持体表面，旋涂以PEG片段为基础的聚合物，优选上述通式(I)所示的聚合物，特别优选式中X为糖残基或寡聚肽残基的聚合物的有机溶剂(例如甲苯)溶液或水性溶液。另外，例如该支持体表面的材料是玻璃制的场合，如果用疏水性的硅烷偶联剂预先对其表面上的羟基进行疏水化处理，则随后有时没有必要对小区域进行细胞亲和性处理。硅烷处理可以参照其本身的已知方法，例如H.O tsuka等，Biomacromolecules，2000，1，21-27记载的方法。另外，也可以预先旋涂与通式(I)中X相应的基团为缩醛时的聚合物，然后，使预先导入了氨基的糖中的氨基与通过上述缩醛的脱保护暴露的醛之间进行还原氨基化反应，从而将糖残基引入上述聚合物中。根据使用的聚合物的种类，该聚合物层的最适厚度发生改变，因此不能限定该聚合物层的厚度，其厚度只要能够防止小区域上的饲养培养细胞或与该培养细胞不同的细胞，例如培养实质细胞，与其他小区域上的这些细胞之间粘结即可。就该厚度而言，本领域技术人员通过小实验即可容易地确定。虽然对厚度没有限定，但最低必需是一般的单分子膜的厚度。
(B)在步骤(A)所得的表面上，放置具有多个小区域(优选直径约50-500μm的圆形状)孔的遮盖图形，通过等离子体发生装置，用H2+N2进行等离子体处理，破坏并除去相应于孔的区域的聚合物层，露出疏水性处理表面。
(C)必要时，也可以在除去聚合物层露出的表面上，通过上述遮盖图形，使具有细胞亲和性基团的单体等进行等离子体聚合、或者涂布来源于该单体的聚合物，从而将该表面修饰成细胞亲和性。
(D)在这样具有细胞亲和性小区域的表面上，用能够培养例如内皮细胞(只要合适，可用市售的细胞，例如大日本制药生产的“人脐带静脉血管内皮细胞”)的培养基(只要合适，可用市售的培养基，例如大日本制药生产的“VE培养基”)培养这些细胞，形成培养细胞层。该培养可以按照例如特许第2973976号公报记载的方法，或将其改变来进行。
(E)在步骤(D)形成的饲养培养细胞层上，培养与形成该细胞层的细胞不同的细胞，优选实质细胞。以实质细胞为首的细胞优选是初代细胞，但按照本发明的方法培养时，只要能够在上述细胞层上形成培养细胞球状体，也可以是系统化(或株化)的细胞或者任何性状转化或转染的细胞。此外，形成饲养层的内皮细胞或成纤维细胞也可以使用形成球状体的细胞，优选实质细胞，而不受其来源的限制，但优选使用同种的动物细胞。这种细胞中，细胞的培养也可以按照其本身已知的培养方法(例如，参照S.N.Bhatia等，Biotech.Prog.1998，14，378-387)进行培养。使用肝细胞作为这种细胞时的培养，通常至少24小时后才能够在上述小区域上的饲养培养细胞层上形成培养肝细胞球状体。
肝细胞以外的其它细胞也可以按照其本身已知的培养方法进行培养，在上述小区域上的饲养培养细胞层上形成培养实质细胞的球状体。对细胞的培养方法没有限定，关于心肌细胞的培养，可以参照T.Shimizu等，Journal of Biomedical Material Research，60(1)(2002)：110-117；G.Illiano等，American Journal ofHypertension 15(2002)：638-643；关于胶质细胞的培养，可以参照C.Gamboa等，Neurochemistry International 40(2002)：397-403；另外，关于胰β细胞的培养，可以参照J.L.Petit-Thevenin等，Biochemica et Biophysica Acta 1530(2001)：184-198。
本发明中使用的动物细胞可以按照各自的已知方法，例如外科方法，分别得到，优选初代细胞，但是也可以使用例如由(财)Humanscience振兴财团以及其他供给商市售的细胞。
如上所述能够得到的共培养物可以用于制作以支持体表面上具有的培养细胞构成物本身作为表面的生物装置，或者通过该共培养物形成表面的生物装置。对这种生物装置没有限定，作为这种生物装置，可以例举用于检查培养实质细胞的毒性的装置、用于筛选活化培养实质细胞功能的物质的装置、实质细胞不全的医疗支持用装置以及用于进行实质细胞生理作用模拟试验的装置。
按照本发明，生物装置上担载的共培养物(包含由培养细胞形成的球状体，以及实质上是单层的形成与该球状体接触的下层并与形成该球状体的细胞不同的培养细胞)能够长期稳定地保持在该装置表面，并保持各实质细胞的特异功能(例如，肝细胞以外的胰β细胞的情况下，是胰岛素的分泌功能；心肌细胞的情况下，是搏动运动功能)。例如，用肝细胞能够制备的本发明的生物装置，是以规定排列图案担载形态均匀的球状体的生物装置，另外，该球状体实质上每个小区域具有独立的形状。而且，本发明的生物装置上的球状体最低也能稳定维持3周的高水平的肝细胞功能(例如高水平的白蛋白产生能力)。因此，这种生物装置例如可以用于筛选能够影响肝功能的环境或物质。这种影响可以通过监测球状体形态的变化和产物，如白蛋白产生能力的变化来进行评价。
按照本发明，上述培养细胞构成物中所含的共培养物通过物理或生物化学的处理，可以提供从支持体上剥离的培养物本身。这种游离形态的共培养物也是本发明的一种方式，例如，可以用于移植医疗、器官再生工程、杂交体型人工器官。
以下，结合具体实例，进一步说明本发明，但是提供这些实例的目的只不过是为了便于理解本发明。
a)细胞培养床的制作
将白色载玻片(26×76×0.8mm/Takahashi Giken GlassCo.，Ltd.)用硫酸/过氧化氢(50/50)煮沸60分钟，接着洗净，然后用乙醇/水(95/5)中的2％[3-(甲基丙烯酰氧基)丙烷]三甲氧基硅烷溶液，进行硅烷偶联，对上述玻璃表面进行疏水处理。在这样制备的疏水处理载玻片表面上，旋涂分子量为20000的聚交酯的4％甲苯溶液，然后进一步旋涂通过乙缩醛-聚乙二醇(分子量6000)-共聚交酯(分子量8000)(以下称为乙缩醛-PEG/PLA)的醛化物与氨基苯基乳糖的还原氨基化得到的乳糖-PEG/PLA的2％甲苯溶液，形成约100μm厚的高分子层表面。在这样得到的高分子层表面上放置具有以100μm间隔隔开的100μm圆形孔的遮盖图案，进行H2+N2的等离子体处理[ICP power：500W，Bias power：30W(Vdc＝60V)，N2+H2＝50sccm/30sccm，2×10-5Torr]。通过等离子体处理，形成按照上述遮盖图案露出玻璃表面的孔(参照图1)。
在上述表面上，施加Dulbecco的改进的Eagle培养基(DMEN，Gibco)(补充胰岛素、胎牛血清、胰高血糖素、上皮增殖因子、青霉素、氢化可的松和链霉素)，形成与上述孔对应的细胞粘结区(或细胞培养床)。
b)细胞培养
在a)得到的细胞培养床上，按1×106cell/cm2接种血管内皮细胞(Bovine aorti endotherial cell)后，在5％CO2环境中，在37℃下，静置培养24小时。这样，内皮细胞就沿着露出的孔的玻璃图案粘结在其上面(参照图2)。随后，将由大鼠肝脏通过胶原酶灌流法制备的初代细胞按1×106cell/cm2接种后，在5％CO2环境中，在37℃下，静置培养24小时，肝细胞仅粘结在以上述图案状形成区域的内皮细胞上，形成球状的阵列(参照图3)。这些肝球状体能维持肝功能(例如白蛋白产生能力)至少3周，可以确认细胞骨架(关于球状体的3维放大图，参照图5)。
另外，在乳糖-PEG/PLA表面上，100μm的圆形孔的间隔低于100μm时，内皮细胞的图案与邻接的细胞连在一起，如果间隔进一步缩短，有时细胞会变成片状(参照图4)。通常，如果不存在图案化的内皮细胞层，则不能形成培养肝细胞的球状体。
工业实用性
如上所述得到的例如肝球状体阵列中，这些肝球状体能长期维持肝功能，而且，每个培养皿可以存在例如数万个的肝球状体(理论上没有限制)，因此可以1次用于数万种的药物检定。此外，由该阵列剥离的共培养物，例如培养肝球状体，可以用于移植医疗、肝再生工程学的技术领域。因此，本发明能够应用于为评价药物作用进行检查的产业、或医疗支持用产业。

Claims (22)

1.一种培养细胞构成物，其是在支持体上含有相互不同的两种动物细胞的共培养物的培养细胞构成物，其中，该共培养物的1种是由来源于实质细胞的培养细胞形成的球状体，所述实质细胞选自肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、胶质细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、骨细胞；该共培养物的另1种形成与该球状体接触的下层，且与用细胞亲和性物质制成的表面相接触，这样由来源于能够使形成该球状体的细胞生存和/或发挥功能的细胞的培养细胞形成实质上单层的形态，而且该单层存在于该支持体上各个分离的小区域上；而且所述的小区存在2个以上，且通过用亲水性且细胞非亲和性的聚合物制成的表面处于相互隔离的状态。
2.根据权利要求1所述的培养细胞构成物，其中，形成球状体的细胞是肝细胞，与形成该球状体的细胞不同的另1种培养细胞来源于内皮细胞或成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的培养细胞构成物，其中，小区域具有1500-30000μm2的面积。
4.根据权利要求1所述的培养细胞构成物，其中，小区域是直径50-500μm的实质上的圆形。
5.根据权利要求1所述的培养细胞构成物，其中，小区域为直径50-200μm的实质上的圆形，而且，各邻接的小区域之间的最短距离为100μm。
6.根据权利要求1所述的培养细胞构成物，其中，担载各培养物的小区域通过由亲水性且细胞非亲和性的物质制成的支持体表面隔开。
7.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，亲水性且细胞非亲和性的物质是以聚乙二醇链段为基础的聚合物中，该链段的任意一个末端具有羟基的聚合物。
8.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，亲水性且细胞非亲和性的物质具有聚乙二醇链段和聚交酯链段。
9.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，亲水性且细胞非亲和性的物质选自以聚乙二醇链段为基础的衍生物和多糖，该聚乙二醇链段的任意一个末端共价结合了从构成细胞表面受体的配体的结合域的单糖或寡糖以及寡聚肽中选择的化合物。
10.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，亲水性且细胞非亲和性的物质是以聚乙二醇链段为基础的糖衍生物，该聚乙二醇链段的任意一个末端共价结合了含有至少1个半乳糖基的单糖或寡糖。
11.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，亲水性且细胞非亲和性的物质是包含在任意一个末端共价结合了含有至少1个吡喃半乳糖基的单糖或寡糖的聚乙二醇链段和聚交酯链段的糖衍生物。
12.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，亲水性且细胞非亲和性的物质是以聚乙二醇链段为基础的肽衍生物，该聚乙二醇链段的任意一个末端共价结合了含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的氨基酸序列的寡聚肽。
13.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，小区域具有用细胞亲和性物质制成的表面。
14.根据权利要求6所述的培养细胞构成物，其中，小区域具有用细胞亲和性物质制成的表面，该细胞亲和性物质选自具有烃基、烷基甲硅烷基和氟代烷基的化合物；具有羧酸根阴离子和磷酸根阴离子的化合物；以及构成细胞外基质的蛋白质。
15.一种共培养物，是由权利要求1-14中任意一项所述的培养细胞构成物的支持体剥离的共培养物。
16.一种生物装置，包含由权利要求1-14中任意一项所述的培养细胞构成物形成的表面。
17.根据权利要求16所述的生物装置，其中，培养细胞构成物中的各球状体实质上是直径50-100μm的球形，各球状体与各邻接的球状体之间的最短间隔为100μm，并排列成一定的图案。
18.根据权利要求16所述的生物装置，该生物装置是选自用于检查形成球状体的细胞毒性的装置、用于筛选活化形成球状体的细胞功能的物质的装置、形成球状体的细胞不全的医疗支持用装置以及用于进行实质细胞生理作用的模拟试验的装置之一的装置。
19.一种支持体上含有2种相互不同的动物细胞的共培养物的培养细胞构成物的制备方法，该培养细胞构成物包含被隔离的多个小区域上的该培养细胞的单层上担载该球状体的共培养物，其特征在于，在应粘结共培养物的材料表面上，形成以聚乙二醇链段为基础的聚合物层，该聚乙二醇链段的任意一个末端共价结合了或未共价结合从构成动物细胞表面受体的配体的结合域的单糖或寡糖以及寡聚肽中选择的化合物，通过具有多个间隔至少约100μm的直径约50-100μm的圆形孔的遮盖图案，对上述聚合物层进行等离子体处理，从而除去与上述孔相应区域的聚合物层，根据需要，在除去了聚合物层的小区域上涂布细胞亲和性物质，在该小区域上培养内皮细胞或成纤维细胞，形成培养细胞的单层，然后在该培养细胞上培养选自肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、胶质细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、骨细胞的实质细胞，形成该实质细胞的球状体。
20.根据权利要求19所述的培养细胞构成物的制备方法，其中，形成球状体的细胞是肝细胞。
21.根据权利要求19所述的培养细胞构成物的制备方法，其中，聚合物层由在任意一个末端共价结合了单糖或寡糖的以聚乙二醇链段为基础的聚合物构成。
22.根据权利要求1所述的培养细胞构成物，其中，共培养物中的各个球状体实质上是直径50-100μm的球形，各球状体与各邻接的球状体之间的最短间隔为100μm，并排列成一定的图案。
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