JP2973976B2 - 接着性細胞を用いた毒性試験方法 - Google Patents
接着性細胞を用いた毒性試験方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、食品、医薬品、有
機溶剤等、身体に影響を与えるような物質の毒性試験方
法に関する。
機溶剤等、身体に影響を与えるような物質の毒性試験方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の物質の毒性試験では、人間で試験
を行う代りにラット、マウス、ビーグル犬、サルなどの
動物を用いていた。しかし、動物愛護などの見地から近
年は動物実験を廃止する方法に移行してきており、培養
細胞を用いたコロニー形成試験法、ニュートラルレッド
取り込みによる毒性試験法、クリスタルバイオレット染
色法などにより毒性試験が行われている。ところが、こ
れら従来の培養細胞を用いた毒性試験法は操作が煩雑で
あり、実験的にも数日から数十日の期間が必要であっ
た。例えば、再現性がよく定量的な結果が得られるコロ
ニー試験法の場合では、予備試験を含めて１２〜２０日
程度の期間が必要である。以下に、培養細胞を用いた代
表的な毒性試験法であるコロニー試験法のプロセスを示
す。
を行う代りにラット、マウス、ビーグル犬、サルなどの
動物を用いていた。しかし、動物愛護などの見地から近
年は動物実験を廃止する方法に移行してきており、培養
細胞を用いたコロニー形成試験法、ニュートラルレッド
取り込みによる毒性試験法、クリスタルバイオレット染
色法などにより毒性試験が行われている。ところが、こ
れら従来の培養細胞を用いた毒性試験法は操作が煩雑で
あり、実験的にも数日から数十日の期間が必要であっ
た。例えば、再現性がよく定量的な結果が得られるコロ
ニー試験法の場合では、予備試験を含めて１２〜２０日
程度の期間が必要である。以下に、培養細胞を用いた代
表的な毒性試験法であるコロニー試験法のプロセスを示
す。
【０００３】まず、予備試験として以下の操作を行う。
培養細胞を３５ｍｍシャーレまたは６ウエルマルチシャ
ーレに１０3〜１０4個の割合で１．５ｍｌ培地中に分散
させ、１０〜１５枚のシャーレに播種し、一夜培養を行
う。各シャーレの培養液ごとに異なる濃度の検体（培地
中での最終濃度が０．１〜５０００ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに濃度段階を調製）をそれぞれ８μｌずつ添加し、２
〜３日更に培養を行った後に、光学顕微鏡で細胞の変化
を観察、細胞毒性作用が見られる変化を含むような濃度
範囲を設定する。この操作に５〜６日の期間を必要とす
る。この操作を所要日数でまとめると以下のとおりであ
る。 １日目： 細胞播種：濃度設定用 １）３５ｍｍシャーレに１０3〜１０4個播種 １枚／用量×１０用量＝計１０枚 ２日目： 検体処理 ２）濃度調整１０用量（対照含む） ３）処理 ３５ｍｍシャーレに添加 １枚／用量×１０用量＝１０枚 ５〜６日目 ４）細胞毒性観察 ５）濃度設定：コロニー形成用６用量（対照含む）につ
いて このようにして濃度範囲が決定されたら、以下のプロセ
スでコロニー形成試験を行う。 細胞を０．０２％ＥＤＴＡで一回洗った後、トリプシ
ンで処理し、培地に分散させて単個細胞の懸濁液とす
る。このとき、細胞密度は２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
となるようにし、合計で１００ｍｌ（４ｍｌ／シャーレ
×４シャーレ×６群）以上となるように細胞懸濁液を調
整する。 細胞懸濁液を一つの培地瓶に調製し、瓶を攪拌しなが
ら細胞が均一となるようにしつつ、６０ｍｍシャーレに
４ｍｌずつ分注する。各処理群毎に少なくとも４枚のシ
ャーレを作製する。 培養器内で培養を行う。 １８〜２４時間後、各濃度の検体を２０μｌずつ添加
する。 検体を添加した後、ＢＡＬＢ ３Ｔ３Ａ３−１−１細
胞では約７日間、ＨｅＬａ．Ｓ３（ｓｃ）細胞では約１
３日間、Ｖ７９細胞では約５日間培養を行う。培地効果
は行わない。 培養終了後、メタノールで固定してギザム染色を行
う。 コロニーの計数を行う。
培養細胞を３５ｍｍシャーレまたは６ウエルマルチシャ
ーレに１０3〜１０4個の割合で１．５ｍｌ培地中に分散
させ、１０〜１５枚のシャーレに播種し、一夜培養を行
う。各シャーレの培養液ごとに異なる濃度の検体（培地
中での最終濃度が０．１〜５０００ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに濃度段階を調製）をそれぞれ８μｌずつ添加し、２
〜３日更に培養を行った後に、光学顕微鏡で細胞の変化
を観察、細胞毒性作用が見られる変化を含むような濃度
範囲を設定する。この操作に５〜６日の期間を必要とす
る。この操作を所要日数でまとめると以下のとおりであ
る。 １日目： 細胞播種：濃度設定用 １）３５ｍｍシャーレに１０3〜１０4個播種 １枚／用量×１０用量＝計１０枚 ２日目： 検体処理 ２）濃度調整１０用量（対照含む） ３）処理 ３５ｍｍシャーレに添加 １枚／用量×１０用量＝１０枚 ５〜６日目 ４）細胞毒性観察 ５）濃度設定：コロニー形成用６用量（対照含む）につ
いて このようにして濃度範囲が決定されたら、以下のプロセ
スでコロニー形成試験を行う。 細胞を０．０２％ＥＤＴＡで一回洗った後、トリプシ
ンで処理し、培地に分散させて単個細胞の懸濁液とす
る。このとき、細胞密度は２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
となるようにし、合計で１００ｍｌ（４ｍｌ／シャーレ
×４シャーレ×６群）以上となるように細胞懸濁液を調
整する。 細胞懸濁液を一つの培地瓶に調製し、瓶を攪拌しなが
ら細胞が均一となるようにしつつ、６０ｍｍシャーレに
４ｍｌずつ分注する。各処理群毎に少なくとも４枚のシ
ャーレを作製する。 培養器内で培養を行う。 １８〜２４時間後、各濃度の検体を２０μｌずつ添加
する。 検体を添加した後、ＢＡＬＢ ３Ｔ３Ａ３−１−１細
胞では約７日間、ＨｅＬａ．Ｓ３（ｓｃ）細胞では約１
３日間、Ｖ７９細胞では約５日間培養を行う。培地効果
は行わない。 培養終了後、メタノールで固定してギザム染色を行
う。 コロニーの計数を行う。
【０００４】以上の操作を所要日数でまとめると以下の
とおりである。 １日目： 細胞播種：コロニー形成用 ６０ｍｍシャーレに１００個播種 ４枚／用量×６用量＝２４枚 ２日目： 検体処理 ２）濃度調整６用量（対照含む） ３）処理 ６０ｍｍシャーレに添加 ４枚×６用量＝２４枚 ６〜１４日目： コロニーカウント ４）固定、染色、水洗、風乾 ５）コロニー数の計測 以上の試験では、６〜１４日の期間が必要であり、予備
試験とあわせると１１〜２０日間と長い期間が必要であ
る。また、操作も煩雑であり、コロニー形成もランダム
になるため、試験操作に熟練した技術が要求される。
とおりである。 １日目： 細胞播種：コロニー形成用 ６０ｍｍシャーレに１００個播種 ４枚／用量×６用量＝２４枚 ２日目： 検体処理 ２）濃度調整６用量（対照含む） ３）処理 ６０ｍｍシャーレに添加 ４枚×６用量＝２４枚 ６〜１４日目： コロニーカウント ４）固定、染色、水洗、風乾 ５）コロニー数の計測 以上の試験では、６〜１４日の期間が必要であり、予備
試験とあわせると１１〜２０日間と長い期間が必要であ
る。また、操作も煩雑であり、コロニー形成もランダム
になるため、試験操作に熟練した技術が要求される。
【０００５】一方、基板へ細胞を配列する方法が知られ
ており、例えば特開平７−９９９６２号公報には「細胞
配列培養装置及びその方法」が、特開平７−３０８１８
６号公報には「細胞の配列制御用具及び細胞の配列制御
方法」が、特開平８−９９６０号公報には「細胞培養基
板とその作製方法および細胞配列形成方法」がそれぞれ
開示されている。更に、基体への細胞付着方法として
は、例えば特開昭６３−３９５８３号公報には生物学的
活性部位の基体への付着方法が示されている。しかしな
がら、これら公報には、基体や基板に配列または付着さ
せた細胞を毒性試験に用いることについての記載や示唆
は全くない。更に、特開平３−１６２６６３には、接着
性細胞を用いたバイオセンサが提示されているが、この
センサは、接着性細胞層を透過するグルコース、乳酸、
アンモニア、プロトンの濃度を測定して細胞活性の判定
を行うことで毒性を試験する構成を採るものである。
ており、例えば特開平７−９９９６２号公報には「細胞
配列培養装置及びその方法」が、特開平７−３０８１８
６号公報には「細胞の配列制御用具及び細胞の配列制御
方法」が、特開平８−９９６０号公報には「細胞培養基
板とその作製方法および細胞配列形成方法」がそれぞれ
開示されている。更に、基体への細胞付着方法として
は、例えば特開昭６３−３９５８３号公報には生物学的
活性部位の基体への付着方法が示されている。しかしな
がら、これら公報には、基体や基板に配列または付着さ
せた細胞を毒性試験に用いることについての記載や示唆
は全くない。更に、特開平３−１６２６６３には、接着
性細胞を用いたバイオセンサが提示されているが、この
センサは、接着性細胞層を透過するグルコース、乳酸、
アンモニア、プロトンの濃度を測定して細胞活性の判定
を行うことで毒性を試験する構成を採るものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の毒性試
験には以下のような改善すべき問題点があった。第１の
問題点は、試験期間に数日から数十日の期間が必要であ
り、迅速に試験結果を得ることが難しいことである。第
２の問題点は操作が煩雑であり、熟練を要することであ
る。本発明の目的は、このような問題点を解決するこ
と、すなわち試験期間の短縮と操作の簡便化を可能とす
る毒性試験方法を提供することにある。
験には以下のような改善すべき問題点があった。第１の
問題点は、試験期間に数日から数十日の期間が必要であ
り、迅速に試験結果を得ることが難しいことである。第
２の問題点は操作が煩雑であり、熟練を要することであ
る。本発明の目的は、このような問題点を解決するこ
と、すなわち試験期間の短縮と操作の簡便化を可能とす
る毒性試験方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の毒性試験方法
は、細胞非接着性の表面に、細胞接着性領域の多数が所
定間隔で配列された基板を培養液内に配置した状態で、
毒性成分の非存在下では前記細胞接着性領域に接着し、
毒性成分の存在下ではその接着が阻害される細胞を、被
験物質の存在下で培養する過程と、該培養過程終了後
に、該細胞接着性領域に接着している細胞数を計測し、
得られた計測値を基に前記被験物質の毒性を判断する過
程と、を有することを特徴とする。本発明においては、
培養液へ添加する細胞を予め被験物質と接触させておい
てから、細胞接着性領域を設けた基板が配置された培養
液へ添加しても良い。あるいは、細胞接着性領域を設け
た基板が配置された培養液中で細胞の培養を行ってか
ら、被験物質を添加しても良い。
は、細胞非接着性の表面に、細胞接着性領域の多数が所
定間隔で配列された基板を培養液内に配置した状態で、
毒性成分の非存在下では前記細胞接着性領域に接着し、
毒性成分の存在下ではその接着が阻害される細胞を、被
験物質の存在下で培養する過程と、該培養過程終了後
に、該細胞接着性領域に接着している細胞数を計測し、
得られた計測値を基に前記被験物質の毒性を判断する過
程と、を有することを特徴とする。本発明においては、
培養液へ添加する細胞を予め被験物質と接触させておい
てから、細胞接着性領域を設けた基板が配置された培養
液へ添加しても良い。あるいは、細胞接着性領域を設け
た基板が配置された培養液中で細胞の培養を行ってか
ら、被験物質を添加しても良い。
【０００８】本発明の毒性試験方法は、細胞接着因子か
ら形成した細胞接着性領域への細胞の接着（付着）が、
毒性成分の存在下で阻害される点を利用して毒性試験対
照としての被験物質の毒性を評価するものであり、培養
後に基板上に設けた細胞接着性領域のなかの、細胞（ま
たは細胞群）が接着している領域の数を計測するという
簡易な操作によって被験物質の毒性を検定できる。ま
た、基板全面に細胞を付着させた状態でその数を計数す
るのではなく、細胞接着性領域を適度な密度で配置し
て、接着する細胞を効果的に分散させるので、計数位置
を低減化して計数操作をより簡便化できるとともに、基
板に接着する細胞を適度に分散させることで計数精度の
向上も図れる。
ら形成した細胞接着性領域への細胞の接着（付着）が、
毒性成分の存在下で阻害される点を利用して毒性試験対
照としての被験物質の毒性を評価するものであり、培養
後に基板上に設けた細胞接着性領域のなかの、細胞（ま
たは細胞群）が接着している領域の数を計測するという
簡易な操作によって被験物質の毒性を検定できる。ま
た、基板全面に細胞を付着させた状態でその数を計数す
るのではなく、細胞接着性領域を適度な密度で配置し
て、接着する細胞を効果的に分散させるので、計数位置
を低減化して計数操作をより簡便化できるとともに、基
板に接着する細胞を適度に分散させることで計数精度の
向上も図れる。
【０００９】
【発明の実施の形態】次に、本発明の毒性試験方法の一
例について説明する。本発明においては、まず基板の所
定位置に基板への細胞の選択的接着（付着）を可能とす
る細胞接着因子からなる細胞接着性領域のパターンが設
けられる。このパターン、すなわち細胞接着性領域の形
状及び配列としては、試験操作を良好かつ簡便に行うの
に必要なパターンを選択して用いればよく、例えば、図
１に示すような一定間隔で配列された円形ドット状パタ
ーンを好適なものとして挙げることができる。更に、パ
ターンの形状として、楕円あるいは多角形等のパターン
形状も利用可能である。図１のようにドット状とする場
合の各ドットの大きさは、２０〜１００μｍ、好ましく
は５０μｍ程度とすることができる。更に、各ドットの
間隔は、５０〜２００μｍ、好ましくは１００μｍ程度
とすることができる。
例について説明する。本発明においては、まず基板の所
定位置に基板への細胞の選択的接着（付着）を可能とす
る細胞接着因子からなる細胞接着性領域のパターンが設
けられる。このパターン、すなわち細胞接着性領域の形
状及び配列としては、試験操作を良好かつ簡便に行うの
に必要なパターンを選択して用いればよく、例えば、図
１に示すような一定間隔で配列された円形ドット状パタ
ーンを好適なものとして挙げることができる。更に、パ
ターンの形状として、楕円あるいは多角形等のパターン
形状も利用可能である。図１のようにドット状とする場
合の各ドットの大きさは、２０〜１００μｍ、好ましく
は５０μｍ程度とすることができる。更に、各ドットの
間隔は、５０〜２００μｍ、好ましくは１００μｍ程度
とすることができる。
【００１０】細胞接着性領域は基板の有する細胞非接着
性の表面全面に均一に配列するのが好ましい。また、ド
ット状の配列を得るには、例えば、特開平５−１７６７
５３号公報に記載の方法等を用いることができる。細胞
接着性領域を形成する細胞接着因子としては、基板上に
細胞が選択的に接着できる領域を形成可能なもので、毒
性試験操作に影響を与えない物質であれば良く、例えば
コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネク
チン等の細胞が接着可能な蛋白質を挙げることができ、
これらの被膜を基板上にパターン化して細胞接着因子か
らなる領域を基板上に形成することができる。この被膜
の膜厚は、単分子層以上の厚さ、好ましくは数１００ｎ
ｍ程度とすることができる。更に、細胞接着因子は、常
法により蛍光標識されたものでも良く、蛍光標識された
細胞接着因子を用いることで、形成された細胞接着因子
のパターンが光学顕微鏡で観察されないほど薄い場合に
おいても、パターンの有無の確認を、蛍光顕微鏡で観察
することにより、非破壊的に、かつ簡単に行うことがで
きる。
性の表面全面に均一に配列するのが好ましい。また、ド
ット状の配列を得るには、例えば、特開平５−１７６７
５３号公報に記載の方法等を用いることができる。細胞
接着性領域を形成する細胞接着因子としては、基板上に
細胞が選択的に接着できる領域を形成可能なもので、毒
性試験操作に影響を与えない物質であれば良く、例えば
コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネク
チン等の細胞が接着可能な蛋白質を挙げることができ、
これらの被膜を基板上にパターン化して細胞接着因子か
らなる領域を基板上に形成することができる。この被膜
の膜厚は、単分子層以上の厚さ、好ましくは数１００ｎ
ｍ程度とすることができる。更に、細胞接着因子は、常
法により蛍光標識されたものでも良く、蛍光標識された
細胞接着因子を用いることで、形成された細胞接着因子
のパターンが光学顕微鏡で観察されないほど薄い場合に
おいても、パターンの有無の確認を、蛍光顕微鏡で観察
することにより、非破壊的に、かつ簡単に行うことがで
きる。
【００１１】細胞接着因子からなる細胞接着のための領
域（細胞接着性領域）を配列する基板としては、毒性成
分の非存在下においても細胞の付着や接着がなく、ある
いは容易に洗浄除去できる程度に付着や接着が弱い細胞
非接着性の表面を形成できる基板で、良好な毒性試験操
作を達成できるものであればよく、例えばガラス、石
英、各種樹脂等からなる基板を使用することができる。
なお、基板は培養器内に配置して用いるので、培養器に
合う形状を有するものが用いられる。細胞接着性領域が
配列された基板は、培養器内の適当な位置、例えば底部
等に配置され、その状態で細胞の培養を行う。図１のド
ットを用いた場合を例にとると、毒性成分のない正常な
状態では細胞接着因子のパターン上に細胞が選択的に接
着する（図３参照）。これに対して、毒性成分が添加さ
れると、毒性の程度により図４及び図５に示すようにド
ットに空席（細胞が接着していない（−）ドット）が目
立つようになる。
域（細胞接着性領域）を配列する基板としては、毒性成
分の非存在下においても細胞の付着や接着がなく、ある
いは容易に洗浄除去できる程度に付着や接着が弱い細胞
非接着性の表面を形成できる基板で、良好な毒性試験操
作を達成できるものであればよく、例えばガラス、石
英、各種樹脂等からなる基板を使用することができる。
なお、基板は培養器内に配置して用いるので、培養器に
合う形状を有するものが用いられる。細胞接着性領域が
配列された基板は、培養器内の適当な位置、例えば底部
等に配置され、その状態で細胞の培養を行う。図１のド
ットを用いた場合を例にとると、毒性成分のない正常な
状態では細胞接着因子のパターン上に細胞が選択的に接
着する（図３参照）。これに対して、毒性成分が添加さ
れると、毒性の程度により図４及び図５に示すようにド
ットに空席（細胞が接着していない（−）ドット）が目
立つようになる。
【００１２】そこで、ドット内に接着している細胞数
を、必要に応じて各種固定、染色法等を併用して計測す
ることによって毒性の程度を測定することができる。毒
性についての陽性の判断方法としては、例えば被験物質
の濃度シリーズを調製して、同じ条件での試験を行い、
被験物質の濃度に応じて細胞接着因子のパターン上に接
着している細胞数が少なくなる場合を陽性（毒性あり）
と判定する方法が利用できる。更に、細胞数を直接計数
するのではなく、全ドットに占める空席ドット（（−）
ドット）の割合、あるいは細胞が接着しているドット
（（＋）ドット）の割合を求める簡便法によって被験物
質の毒性を判断することができる。細胞としては、上述
した毒性成分の存在における細胞接着因子との関係で接
着性が変化するもので、増殖性や取扱性等を考慮して選
択すれば良く、例えば、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽
細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細
胞、軟骨細胞、骨細胞等の培養細胞（株化した細胞）を
挙げることができる。
を、必要に応じて各種固定、染色法等を併用して計測す
ることによって毒性の程度を測定することができる。毒
性についての陽性の判断方法としては、例えば被験物質
の濃度シリーズを調製して、同じ条件での試験を行い、
被験物質の濃度に応じて細胞接着因子のパターン上に接
着している細胞数が少なくなる場合を陽性（毒性あり）
と判定する方法が利用できる。更に、細胞数を直接計数
するのではなく、全ドットに占める空席ドット（（−）
ドット）の割合、あるいは細胞が接着しているドット
（（＋）ドット）の割合を求める簡便法によって被験物
質の毒性を判断することができる。細胞としては、上述
した毒性成分の存在における細胞接着因子との関係で接
着性が変化するもので、増殖性や取扱性等を考慮して選
択すれば良く、例えば、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽
細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細
胞、軟骨細胞、骨細胞等の培養細胞（株化した細胞）を
挙げることができる。
【００１３】なお、正常状態において各ドットに細胞が
接着していることが測定の操作性という点から好まし
い。そこで、毒性成分の添加のない状態で各ドットに細
胞が接着した状態が得られる初期細胞濃度を予め求めて
おき、この初期細胞濃度を用いて本試験を開始するのが
好ましい。初期細胞濃度としては、細胞接着因子の種類
やそれにより形成パターンの総面積などに応じて異なる
が、例えば、１×１０4〜１×１０5cells／ml、好まし
くは５×１０4cells／ml程度とすることができる。更
に、被験物質の添加量は、毒性の測定ができる範囲に設
定され、予備試験により毒性の検出が可能な被験物質濃
度の範囲を予め決定しておくのが好ましい。一方、上記
の例では、被験物質と細胞を培養器内の培地に添加して
から培養が行なわれているが、（Ａ）被験物質と接触さ
せた細胞を培養器に添加して培養する方法や、（Ｂ）培
養器へ最初に細胞を添加して培養を行った後に被験物質
を添加する方法を用いることもできる。
接着していることが測定の操作性という点から好まし
い。そこで、毒性成分の添加のない状態で各ドットに細
胞が接着した状態が得られる初期細胞濃度を予め求めて
おき、この初期細胞濃度を用いて本試験を開始するのが
好ましい。初期細胞濃度としては、細胞接着因子の種類
やそれにより形成パターンの総面積などに応じて異なる
が、例えば、１×１０4〜１×１０5cells／ml、好まし
くは５×１０4cells／ml程度とすることができる。更
に、被験物質の添加量は、毒性の測定ができる範囲に設
定され、予備試験により毒性の検出が可能な被験物質濃
度の範囲を予め決定しておくのが好ましい。一方、上記
の例では、被験物質と細胞を培養器内の培地に添加して
から培養が行なわれているが、（Ａ）被験物質と接触さ
せた細胞を培養器に添加して培養する方法や、（Ｂ）培
養器へ最初に細胞を添加して培養を行った後に被験物質
を添加する方法を用いることもできる。
【００１４】（Ａ）の方法の場合の被験物質と細胞との
接触方法としては、例えば被験細胞の前培養時間、ある
いは増殖速度によって１時間〜数日程度の期間、被験物
質を各被験物質のシリーズに応じた濃度となるように添
加した状態で、その他の条件は通常方法と同じ条件で細
胞の培養を行う方法を挙げることができる。（Ｂ）の方
法における細胞の培養方法としては、例えば細胞を通常
の条件で細胞接着因子のパターン上で培養を行い、細胞
が細胞接着因子上に接着、伸展する培養後３０分〜１時
間後、あるいは数時間後に被験物質を各被験物質のシリ
ーズに応じた濃度となるように添加する方法を挙げるこ
とができる。
接触方法としては、例えば被験細胞の前培養時間、ある
いは増殖速度によって１時間〜数日程度の期間、被験物
質を各被験物質のシリーズに応じた濃度となるように添
加した状態で、その他の条件は通常方法と同じ条件で細
胞の培養を行う方法を挙げることができる。（Ｂ）の方
法における細胞の培養方法としては、例えば細胞を通常
の条件で細胞接着因子のパターン上で培養を行い、細胞
が細胞接着因子上に接着、伸展する培養後３０分〜１時
間後、あるいは数時間後に被験物質を各被験物質のシリ
ーズに応じた濃度となるように添加する方法を挙げるこ
とができる。
【００１５】
実施例１ 特開平５−１７６７５３号公報に記載の方法を用いて、
石英チップ基板（１．５×２ｃｍ、厚さ０．７ｍｍ）の
一方の面の全面にコラーゲンの円形ドット状パターン
（直径５０μｍ）を図１に示す配列（各ドット間の間
隔：１００μｍ）で形成した。このコラーゲンパターン
を有する基板を図２（寸法は内壁間での距離である）に
示す形状のシャーレの底部に配置したものを多数用意
し、以下の予備試験及び本試験に用いた。なお、各操作
は無菌的に行った。 予備試験 各シャーレ内に培養液（大日本製薬製ＶＥ培地）を充填
し、これらにヒト臍帯静脈血管内皮細胞（大日本製薬
製）を各ドットに空席ができない５×１０4cells／mlの
濃度で単細胞で懸濁するように加えた。更に、各シャー
レに被験物質としての四塩化炭素（ディメチルスルホキ
サイド［（ＣＨ3）2ＳＯ］溶液、各培地中での終濃度：
１０μｌ／ｍｌ）を濃度を変えて添加し、一昼夜室温
（本試験と同様：暗所、３７℃、ＣＯ2５％、湿度１０
０％）で培養した。対照としては、被験物質を添加しな
いもの、ジメチルスルホキサイドのみを同量添加したも
のを用いた。培養終了後、コラーゲンドット内に接着し
ている細胞数の計測を顕微鏡により行った。なお、細胞
の固定、染色も本試験と同様に常法により行った。
石英チップ基板（１．５×２ｃｍ、厚さ０．７ｍｍ）の
一方の面の全面にコラーゲンの円形ドット状パターン
（直径５０μｍ）を図１に示す配列（各ドット間の間
隔：１００μｍ）で形成した。このコラーゲンパターン
を有する基板を図２（寸法は内壁間での距離である）に
示す形状のシャーレの底部に配置したものを多数用意
し、以下の予備試験及び本試験に用いた。なお、各操作
は無菌的に行った。 予備試験 各シャーレ内に培養液（大日本製薬製ＶＥ培地）を充填
し、これらにヒト臍帯静脈血管内皮細胞（大日本製薬
製）を各ドットに空席ができない５×１０4cells／mlの
濃度で単細胞で懸濁するように加えた。更に、各シャー
レに被験物質としての四塩化炭素（ディメチルスルホキ
サイド［（ＣＨ3）2ＳＯ］溶液、各培地中での終濃度：
１０μｌ／ｍｌ）を濃度を変えて添加し、一昼夜室温
（本試験と同様：暗所、３７℃、ＣＯ2５％、湿度１０
０％）で培養した。対照としては、被験物質を添加しな
いもの、ジメチルスルホキサイドのみを同量添加したも
のを用いた。培養終了後、コラーゲンドット内に接着し
ている細胞数の計測を顕微鏡により行った。なお、細胞
の固定、染色も本試験と同様に常法により行った。
【００１６】以上の操作を所要日数でまとめると以下の
とおりである。 １日目： １）基板準備１０枚 検体処理 ２）濃度調整１０用量（対照含む） ３）細胞播種（５×１０4cells／ml）、処理 細胞懸濁液に被験物質溶液を添加して播種 １枚／用量×１０用量＝１０枚 ２日目： ４）細胞毒性観察 接着細胞因子パターン上の細胞数の計数 ５）濃度設定：６用量（対照を含む）について 以上の予備試験の結果、１〜１０ｍＭの濃度（培地中で
の濃度）の四塩化炭素の添加範囲で毒性が現れることが
わかった。
とおりである。 １日目： １）基板準備１０枚 検体処理 ２）濃度調整１０用量（対照含む） ３）細胞播種（５×１０4cells／ml）、処理 細胞懸濁液に被験物質溶液を添加して播種 １枚／用量×１０用量＝１０枚 ２日目： ４）細胞毒性観察 接着細胞因子パターン上の細胞数の計数 ５）濃度設定：６用量（対照を含む）について 以上の予備試験の結果、１〜１０ｍＭの濃度（培地中で
の濃度）の四塩化炭素の添加範囲で毒性が現れることが
わかった。
【００１７】本試験 まず、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞をリン酸緩衝液で洗浄
後、トリプシン処理し、適量の培養液に分散させて単細
胞の懸濁液とした。このとき、石英基板上に形成したコ
ラーゲンの各ドットの数（総面積）を考慮して、コラー
ゲンに空席ができないように５×１０4cells／mlの濃度
となるように懸濁させた。この細胞懸濁液をコラーゲン
のドットが配列された基板を底部に配置した各シャーレ
に１ｍｌずつ分注した後、各シャーレに被験物質として
の四塩化炭素（ジメチルスルホキサイドに溶解して使
用、各培地中でのジメチルスルホキサイドの終濃度：１
０μｌ／ｍｌ）を、培地中の濃度が１、２、３、５また
は１０ｍｌとなるように添加してから、暗所、３７℃、
ＣＯ2５％、湿度１００％の条件で一昼夜培養を行っ
た。培養終了後、顕微鏡でドットに接着している細胞数
の計測を行った。なお、染色等の操作は常法に従って行
った。以上の操作を所要日数でまとめると以下のとおり
である。 １日目： １）基板準備１０枚 ４枚／用量×７用量＝２８枚 検体処理 ２）濃度調整７用量（対照含む） ３）細胞播種（５×１０4cells／ml）、処理 細胞懸濁液に被験物質溶液を添加して播種 ４枚／用量×７用量＝２８枚 ２日目： 接着細胞が観察された細胞接着因子のドットの計測 ４）固定、染色、水洗、風乾 ５）接着細胞因子パターン上の細胞数の計数 得られた結果を図６に示す。図６に示すように、３ｍＭ
を境に四塩化炭素の毒性が現れており、この結果は従来
法における試験結果と一致しており、本発明がの培養細
胞を用いた毒性試験方法としての実用性が確認された。
後、トリプシン処理し、適量の培養液に分散させて単細
胞の懸濁液とした。このとき、石英基板上に形成したコ
ラーゲンの各ドットの数（総面積）を考慮して、コラー
ゲンに空席ができないように５×１０4cells／mlの濃度
となるように懸濁させた。この細胞懸濁液をコラーゲン
のドットが配列された基板を底部に配置した各シャーレ
に１ｍｌずつ分注した後、各シャーレに被験物質として
の四塩化炭素（ジメチルスルホキサイドに溶解して使
用、各培地中でのジメチルスルホキサイドの終濃度：１
０μｌ／ｍｌ）を、培地中の濃度が１、２、３、５また
は１０ｍｌとなるように添加してから、暗所、３７℃、
ＣＯ2５％、湿度１００％の条件で一昼夜培養を行っ
た。培養終了後、顕微鏡でドットに接着している細胞数
の計測を行った。なお、染色等の操作は常法に従って行
った。以上の操作を所要日数でまとめると以下のとおり
である。 １日目： １）基板準備１０枚 ４枚／用量×７用量＝２８枚 検体処理 ２）濃度調整７用量（対照含む） ３）細胞播種（５×１０4cells／ml）、処理 細胞懸濁液に被験物質溶液を添加して播種 ４枚／用量×７用量＝２８枚 ２日目： 接着細胞が観察された細胞接着因子のドットの計測 ４）固定、染色、水洗、風乾 ５）接着細胞因子パターン上の細胞数の計数 得られた結果を図６に示す。図６に示すように、３ｍＭ
を境に四塩化炭素の毒性が現れており、この結果は従来
法における試験結果と一致しており、本発明がの培養細
胞を用いた毒性試験方法としての実用性が確認された。
【００１８】
【発明の効果】本発明による毒性試験方法は、接着性の
ある培養細胞を、細胞接着性領域の多数が配列された基
板の存在下で培養する際に被験物質の添加によりその細
胞接着性領域への選択的接着性が阻害されることを利用
して被験物質の毒性を評価するもので、従来の細胞を用
いた試験方法に比べて短期間で試験結果を得ることがで
きる。また、接着性のある培養細胞を基板上の定位置に
配置することにより、従来法と比べて細胞数の計数が容
易なもとのなっており、熟練した技術が要求されず、簡
便に正確な測定が可能となる。
ある培養細胞を、細胞接着性領域の多数が配列された基
板の存在下で培養する際に被験物質の添加によりその細
胞接着性領域への選択的接着性が阻害されることを利用
して被験物質の毒性を評価するもので、従来の細胞を用
いた試験方法に比べて短期間で試験結果を得ることがで
きる。また、接着性のある培養細胞を基板上の定位置に
配置することにより、従来法と比べて細胞数の計数が容
易なもとのなっており、熟練した技術が要求されず、簡
便に正確な測定が可能となる。
【図１】基板面への細胞接着因子のドットパターンの配
列例を示す図である。
列例を示す図である。
【図２】培養器としてのシャーレの形状を示す斜視図で
ある。
ある。
【図３】基板面上に設けた細胞接着因子のドットパター
ンにおける細胞の接着状態を示す図である。
ンにおける細胞の接着状態を示す図である。
【図４】基板面上に設けた細胞接着因子のドットパター
ンにおける細胞の接着状態を示す図である。
ンにおける細胞の接着状態を示す図である。
【図５】基板面上に設けた細胞接着因子のドットパター
ンにおける細胞の接着状態を示す図である。
ンにおける細胞の接着状態を示す図である。
【図６】実施例１で得られた被験物質濃度と計測された
細胞数の関係を示すグラフである。横軸において「Ｃ」
はコントロール（培養液のみ）、「０」はジメチルスル
ホキサイドのみを被験物質の添加の場合と同量添加した
系での結果を示す。
細胞数の関係を示すグラフである。横軸において「Ｃ」
はコントロール（培養液のみ）、「０」はジメチルスル
ホキサイドのみを被験物質の添加の場合と同量添加した
系での結果を示す。
１ 細胞が付着しているドット ２ 細胞が付着していないドット
Claims (7)
- 【請求項１】 細胞非接着性の表面に、細胞接着性領域
の多数が所定間隔で配列された基板を培養液内に配置し
た状態で、毒性成分の非存在下では前記細胞接着性領域
に接着し、毒性成分の存在下ではその接着が阻害される
細胞を、被験物質の存在下で培養する過程と、該培養過
程終了後に、該細胞接着性領域に接着している細胞数を
計測し、得られた計測値を基に前記被験物質の毒性を判
断する過程と、を有することを特徴とする細胞毒性試験
方法。 - 【請求項２】 細胞非接着性の表面に、細胞接着性領域
の多数が所定間隔で配列された基板を培養液内に配置す
る過程と、毒性成分の非存在下では前記細胞接着性領域
に接着し、毒性成分の存在下ではその接着が阻害される
細胞を、被験物質と接触させた後、前記培養液に添加し
て培養する過程と、該培養過程終了後に、該細胞接着性
領域に接着している細胞数を計測し、得られた計測値を
基に前記被験物質の毒性を判断する過程と、を有するこ
とを特徴とする細胞毒性試験方法。 - 【請求項３】 細胞非接着性の表面に、細胞接着性領域
の多数が所定間隔で配列された基板を培養液内に配置す
る過程と、該培養液に、毒性成分の非存在下では前記細
胞接着性領域に接着し、毒性成分の存在下ではその接着
が阻害される細胞を添加して培養した後に、被験物質を
添加して更に培養を行う過程と、該培養過程終了後に該
細胞接着性領域に接着している細胞数を計測し、得られ
た計測値を基に前記被験物質の毒性を判断する過程と、
を有することを特徴とする細胞毒性試験方法。 - 【請求項４】 前記細胞数の計測を、前記細胞接着性領
域のうちの、細胞が接着していない領域の個数または細
胞が接着している領域の個数を計測して簡便化した請求
項１〜３のいずれかに記載の毒性試験方法。 - 【請求項５】 前記細胞接着性領域が、コラーゲン、フ
ィブロネクチン、ラミニン及びビトロネクチンから選択
された１種以上から形成される請求項１〜４のいずれか
に記載の毒性試験方法。 - 【請求項６】 前記細胞接着性領域が、蛍光標識されて
いる請求項５に記載の毒性試験方法。 - 【請求項７】 前記細胞が、肝細胞、血管内皮細胞、繊
維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神
経細胞、軟骨細胞及び骨細胞から選択された１種以上で
ある請求項１〜６のいずれかに記載の毒性試験方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9166085A JP2973976B2 (ja) | 1997-06-23 | 1997-06-23 | 接着性細胞を用いた毒性試験方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9166085A JP2973976B2 (ja) | 1997-06-23 | 1997-06-23 | 接着性細胞を用いた毒性試験方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH119299A JPH119299A (ja) | 1999-01-19 |
| JP2973976B2 true JP2973976B2 (ja) | 1999-11-08 |
Family
ID=15824715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9166085A Expired - Fee Related JP2973976B2 (ja) | 1997-06-23 | 1997-06-23 | 接着性細胞を用いた毒性試験方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2973976B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1939280A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-07-02 | Transparent Inc. | Cultured cell construct which contains spheroids of cultured animal cells and the use thereof |
-
1997
- 1997-06-23 JP JP9166085A patent/JP2973976B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1939280A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-07-02 | Transparent Inc. | Cultured cell construct which contains spheroids of cultured animal cells and the use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH119299A (ja) | 1999-01-19 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
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