KR20040025700A - 동물의 배양 세포의 스페로이드를 함유한 배양 세포구축물 및 그 사용 - Google Patents

동물의 배양 세포의 스페로이드를 함유한 배양 세포구축물 및 그 사용 Download PDF

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Abstract

특정한 친수성 중합체의 표면에 의해 격리되고 또한 패턴화된 배양 내피 세포 또는 배양 섬유아세포 상에서 실질 세포를 배양함으로써, 형성할 수 있는 패턴화된 배양 실질 세포 스페로이드를 함유한 배양물이 제공된다. 이 배양물은 실질 세포에 특이적인 기능을 장기간에 걸쳐 유지할 수 있다.

Description

동물의 배양 세포의 스페로이드를 함유한 배양 세포 구축물 및 그 사용{CULTURED CELL CONSTRUCT CONTAINING SPHEROIDS OF CULTURED ANIMAL CELLS AND UTILIZATION THEREOF}
동물 세포는 기능적인 관점에서 크게 실질 세포(parenchymal cell)와 그 이외의 비실질 세포(nonparenchymal cell)로 분류할 수 있다. 이들 중에서 실질 세포는 조직 또는 기관의 기능을 담당하는 세포이다. 예컨대, 간장의 실질 세포인 간 세포(hepatocyte)는 다종 다양한 물질의 합성, 분해, 저장을 맡고 있어 생명체에 있어서 매우 중요한 기본적 단위이다.
따라서, 생명체에서의 간 세포 기능의 발현을 생체외에서 모방하기 위해서, 이 세포의 각종 배양계가 제안되고 있다. 예컨대, R. Singhvi et al. 미국 특허공보 제5,976,826호 명세서에는, 친수성 및 세포 비친화성(cytophobic) 물질로 형성된 영역에 의해 격리된 세포 친화성(cytophilic) 영역에서의 간 세포의 배양 방법 또는 이를 위한 디바이스가 기재되어 있다. 이 디바이스에서는 소수성 표면 또는 하전부(-COO-, -PO3H-)를 갖는 화합물 또는 세포외 매트릭스 구성 단백질 등으로 형성된 표면 영역(일반적으로는 1∼2500㎛2, 바람직하게는 1∼500㎛2)에 각각의 세포가 접종되어 있다. 이 특허 명세서에서 주로 기재되거나 의도되고 있는 배양은 소위 단층 배양에 속하는 것으로 간주한다. 한편, 간 세포 기능의 향상, 예컨대 간 특이적 단백질 분비의 증강을 목적으로 한 입체 배양(three-dimensional growth pattern)도 시도되고 있다(M. Smalley et al. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. (1999) 35, pp.22-32). 이 배양법에서는 I형 콜라겐이나 특수한 세포외 매트릭스의 겔 상에서 정상적인 인간의 간 세포 유래의 세포주가 배양되고 있다.
또한, 각종 실질 세포 또는 비실질 세포의 각 배양 세포를, 독성 시험을 비롯한 각종 목적에 따라 알맞게 사용할 수 있게 하기 위한 디바이스로서 배양 세포가 일정한 양식으로 배열되도록 패턴화된 것도 제공되고 있다[예컨대, 일본 공개특허공보 평3-7576호(세포 접착성 표면과 세포 비접착성 표면을 갖는 세포의 배열 제어 용구), 상기 기술한 미국 특허공보 제5,976,826호(간 세포의 배양), 일본 특허공보 제2973976호(내피 세포의 배양), 일본 공개특허공보 평7-308186호(내피 세포의 배양) 등].
상기 기술한 바와 같이 단층 배양에 비해 입체 배양쪽이 일반적으로 보다 생체내 간 세포의 기능에 가까운 기능을 갖는 배양 세포를 수득할 수 있으나, 이러한 입체 배양계 배양 세포는 배양 지지체로부터 박리되기 쉬워 입체 배양계를 패턴 표면 상에 실현한 예는 없으므로, 아직 이러한 기능 발현의 정도 및 기능의 유지 기간 등에 대해서 만족할 만한 것이라고는 할 수 없다.
또, 본래 동물의 기관은 여러가지 성질의 조직(동일한 기능을 갖는 세포의 집합임)으로 구성되어 있고, 이들 구성 단위인 세포는 동일하거나 다른 종류의 세포 간의 상호 작용을 통해 기능 등이 보전되어 있는 경우가 많다. 그래서, S. N. Bhatia et al. The FASEB Journal, Vol.13(1999); 1883-1900에는, 실질 세포와 인접하는 비실질 세포 간의 이형 세포 상호 작용이 세포의 증식, 이동 및/또는 분화를 수식한다는 관점에서, 간 세포와 비실질 세포인 섬유아세포의 공배양(cocultivation)에 의한 간 세포의 표현형 보존에 대해서 연구한 결과가 기재되어 있다. 이러한 공배양에서는, 동일 평면 상에서 배양 비실질 세포에 의해 주위가 둘러싸인 단층의 배양 간 세포는 이들 경계선으로부터 3∼4개 이상의 세포가 떨어지면, 예컨대 세포내 알부민 생산능은 순수 간 세포 배양물과 동일 정도까지 저하되는 것이 교시되어 있다. 그래서, 이러한 공배양계에서는 배양 간 세포의 응집물 중의 세포가 이들 전체에 걸쳐 안정적으로 간 특이적 기능을 발휘시키기는 어렵다.
따라서, 본 발명의 목적은 간 세포를 포함한 실질 세포의 특이적인 기능이 보다 강하며 또한 장기간에 걸쳐 유지할 수 있고, 게다가 미세패턴화(micropatterning)시켰을 때에는, 이 패턴을 안정적으로 유지할 수 있는 배양 동물 세포계를 제공하는 것이다.
발명의 개시
본 발명자들은 서로 다른 두 종류의 세포 중에서 하나의 세포로서 간 세포의 배양계 및 이 배양계에서 취득되는 배양 간 세포의 기능에 대해서 검토하였다. 그 결과, 상기 기술한 S. N. Bhatia et al.에 교시된 바와 같은 동일 평면 상에서 이형 경계면(heterotypic interface)을 통한 상호 작용이 일어나도록 간 세포와 비실질 세포의 공배양을 실시하는 것이 아니라, 간 세포를 배양 내피 세포 또는 섬유아세포의 일정 영역의 세포 단층 상에서 배양하면, 배양 간 세포는 이 단층 표면 상에 접촉되어 접착된 스페로이드를 형성하고, 또한 이렇게 형성된 스페로이드는 간 세포에 특이적인 기능, 예컨대 알부민을 장기간에 걸쳐 안정적으로 생산할 수 있음을 발견하였다. 또한, 이들 스페로이드와 이들 스페로이드에 접촉된 하부층을 형성하는 간 세포와는 다른 세포의 단층을 포함하여 이루어진 공배양물, 그리고 이 공배양물과 이들 지지체로 이루어진 배양 세포 구축물(이하, 스페로이드/배양 세포 단층/지지체라고 하는 경우가 있음)은 지지체로부터의 각 배양 세포의 박리에 대하여 저항성(안정성)도 나타낸다. 또한, 이러한 배양 세포 구축물은 간 세포 이외의 스페로이드를 형성할 수 있는 실질 세포 또는 비실질 세포에 적용한 경우에도, 이들 세포의 기능을 유지하는 스페로이드 함유 배양 세포 구축물을 제공할 수 있음도 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 이 스페로이드의 하부층을 형성하는(또는 기초가 되는)세포 중의 내피 세포 또는 섬유아세포는, 일반적으로 증식력 및/또는 운동성이 강하여, 접종되고 그리고 배양되는 지지체의 소영역 주변에 이주하여 증식하는 경향을 갖고 있는데, 일정한 친수성 및 세포 비친화성 물질로 이루어질 수 있는 중합체 표면으로 이 소영역을 둘러싸면, 이 내피 세포 또는 섬유아세포 등의 배양 세포의 이 소영역으로부터의 이주 내지는 이동을 억제할 수 있고, 또한 이들 배양 세포 상에 형성되는 스페로이드의 이주 내지는 이동도 억제할 수 있으며, 이렇게 해서 특수한 형태를 한 공배양물이 안정적으로 지지체 상에 유지될 수 있음도 발견하였다.
따라서, 본 발명에 따르면, 지지체 상에 서로 다른 동물 세포의 1 또는 2 이상의 공배양물을 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물이 제공된다. 이러한 배양 세포 구축물 중의 각 공배양물은,
서로 다른 세포의 1 종류, 바람직하게는 실질 세포의 배양 세포에서 유래되는 스페로이드 및
이 스페로이드에 접촉된 하부층을 형성하고, 그리고 이 스페로이드를 형성하는 세포를 생존 및 기능시킬 수 있는 이 세포와는 다른 또 1 종류의 세포에서 유래되는 배양 세포의 실질적으로 단층을 포함하여 이루어진 것이다.
또 다른 태양의 본 발명으로서, 2 이상의 상기 공배양물로 형성된 표면을 포함하여 이루어진 바이오 디바이스가 제공된다.
또 다른 태양의 본 발명으로서, 지지체 상에 서로 다른 동물 세포의 1 또는 2 이상의 공배양물을 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물의 작성 방법으로, 공배양물을 접착할 재료 표면에 동물 세포 표면 수용체에 대한 리간드의 결합 도메인을구성하는 단당 또는 올리고당 및 올리고 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 어느 한쪽 말단에 공유 결합시켰거나 또는 미결합된 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 중합체층을 형성하고, 적어도 약 100㎛씩 격리된 약 50∼100㎛ 직경을 갖는 원 형상의 홀을 복수개 갖는 마스크 패턴을 통해 상기 중합체층을 플라스마 처리하고, 이렇게 해서 상기 홀에 상당하는 영역의 중합체층을 제거하고, 필요하면 중합체층이 제거된 소영역을 세포 친화성 물질을 도포하고, 이 소영역 상에서 내피 세포 또는 섬유아세포를 배양하여 배양 세포의 단층을 형성하고, 이어서 이 배양 세포 상에서 이 배양 세포와는 다른 세포를 배양함으로써 이 다른 세포의 스페로이드를 형성하는 것을 특징으로 하는 격리된 복수개의 소영역 상에 배양 세포로 형성된 스페로이드를 담지하는 공배양물을 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물의 작성 방법도 제공된다.
또한, 본 발명은 상기 배양 세포 구축물의 지지체로부터 박리된 공배양물 그 자체도 제공된다.
이들 본 발명에 따르면, 상기 기술한 간 세포와 내피 세포 또는 섬유아세포를 사용하는 배양에 의해 수득되는 것과 동일한 효과가 달성된다. 예컨대, 본 발명에 따른 배양 간 세포 스페로이드는 최저 3주일은 높은 수준으로 알부민 생산능을 유지한다.
본 발명은 동물 세포의 배양물 및 이 배양 세포 구축물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 배양 세포의 스페로이드를 함유한 공(共)배양물 및 이 공배양물을 표면에 담지하는 바이오 디바이스에 관한 것이다. 바이오 디바이스 또는 공배양물 그 자체는 예컨대 동물 세포의 생리학적 또는 병태 생리학적 성질에 관련된 검사 또는 이식 의료, 기관 재생 공학, 하이브리드형 인공 기관 등의 기술 분야에서 사용할 수 있다.
도 1은 실시예에서 조제된 마스크 패턴에 따라 형성된 유리 표면의 노출 구멍을 나타낸 도면을 대신하는 현미경 사진이다.
도 2는 도 1의 패턴화된 구멍에서 유래되는 세포 배양 바닥에 배양 내피 세포가 접착된 상태를 나타낸 도면을 대신하는 현미경 사진이다.
도 3은 도 2의 패턴 형상으로 도메인을 형성한 내피 세포의 위에만 간 세포가 접착되어 간 세포 스페로이드가 형성된 상태를 나타낸 도면을 대신하는 현미경 사진이다.
도 4는 100㎛ 원 형상의 구멍 간의 거리가 100㎛ 미만으로 된 경우에, 배양 내피 세포의 패턴이 이어지는 경우가 있는 것을 나타낸 도면을 대신하는 현미경 사진이다.
도 5는 내피 세포 위에 패턴 형상으로 형성된 간 스페로이드의 3차원 상을 나타낸 도면을 대신하는 공초점 레이저 현미경 사진이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 따라 공배양되는 서로 다른 동물 세포 중 하나는, 후술하는 공배양으로 스페로이드를 형성할 수 있는 세포라면 어떠한 세포여도 되는데 바람직하게는 실질 세포이다. 실질 세포란 조직 또는 기관에서 그 기능을 담당하는 부분이 되는 세포를 의미한다. 예컨대, 간장의 실질 세포는 간 세포이고, 폐의 실질 세포는 폐포 상피 세포이다. 이러한 정의에 포함되고, 본 발명의 목적에 따른 세포 어느 것이나 본 발명에서 말하는 실질 세포이다. 한정되는 것은 아니지만, 본원 발명에서의 사용이 특히 강하게 기도되고 있는 실질 세포로는, 간 세포, 췌장 베타 세포, 심근 세포, 글리어 세포, 피부 상피 세포, 연골 세포, 골 세포 및 배성(胚性) 또는 성체 간(幹) 세포를 들 수 있다. 그러나, 상기 정의에포함된 실질 세포 이외의 비실질 세포여도, 상기 기술한 바와 같이 스페로이드를 형성할 수 있고, 본 발명의 목적에 따른 것이라면 상기 동물 세포에 포함된다.
공배양되는 서로 다른 동물 세포 중 또 하나의 세포로는, 공배양했을 때 상기 스페로이드를 형성할 수 있는 세포를 생존 및 기능시키는데에 도움이 될 수 있는 이 세포와는 다른 세포라면 어떠한 세포여도 되고, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포 등과 같은 세포를 들 수 있다. 바람직하게는 내피 세포, 특히 혈관 내피 세포, 특히 바람직하게는 제대 정맥 혈관 내피 세포이다. 또한, 다른 바람직한 것으로는 섬유아세포로, 섬유아세포는 동물 개체 내의 거의 모든 조직 중에 분산되어 존재하는 중배엽 유엽(中胚葉 由葉) 세포이지만, 상기 배양을 실시함으로써 스페로이드를 형성하는 세포에 따라, 즉 이 세포가 존재하는 장기의 형태 형성에 중요한 역할을 하는 섬유아세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 공배양되는 서로 다른 동물 세포의 조합으로는 한정되는 것은 아니지만, 상기 조합에 추가하여 섬유아세포-내피 세포, 상피 세포-내피 세포와 같은 비실질 세포-비실질 세포, 심근 세포-간 세포, 췌장 베타 세포-간 세포와 같은 실질 세포-실질 세포의 조합일 수도 있다.
이상과 같은 세포는 이들이 존재하는 동물 기원의 것이라면, 어떠한 동물의 것이어도 되고 예컨대 가금류, 포유 동물, 특히 인간 유래의 것일 수 있다.
이들 서로 다른 동물 세포는 본 발명에 따라 공배양하면, 내피 세포, 상피 세포 또는 섬유아세포가 배양 지지체 표면 상에서 기반 의존성 세포 또는 피더 세포로서 실질적으로 배양 세포의 단층을 형성하고, 이어서 이 단층 상에서 배양된이 단층을 형성하는 세포와는 다른 세포, 바람직하게는 실질 세포는 단층을 구성하는 배양 세포와 접촉되며 이형 상호 작용을 실시함으로써, 상당하는 세포에 특이적인 기능을 장기간에 걸쳐 안정적으로 유지한다. 여기서 말하는 실질적으로 배양 세포의 단층을 형성한다는 것은, 이 세포층을 형성하는 영역의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상이 배양 세포의 단층으로 이루어진 것을 의미한다. 또한, 공배양이란 어느 한 시기에 상기 서로 다른 동물 세포가 함께 배양되면 되고, 본원 발명에서는 예컨대 내피 세포 또는 섬유아세포가 먼저 배양되어 단층을 형성한 후에, 이들 배양 세포와 또한 실질 세포가 함께 배양되는 경우를 참조하면 쉽게 이해될 것이다.
이러한 예컨대 내피 세포, 상피 세포 또는 섬유아세포는 배양 지지체 표면의 소영역 상에서 배양되고, 이 소영역 상에 이들 배양 세포로 이루어진 피더층이 구축되고, 그 다음 피더층의 표면 상에 이 피더층과 직접 접촉되는, 바람직하게는 실질 세포 유래의 스페로이드로 이루어진 공배양물을 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물을 제공할 수 있다. 임의의 세포 유래의 배양 세포로 형성된 스페로이드란 「스페로이드」의 단어가 의미하는 바의 실질적으로 구 형상을 한 배양 실질 세포의 응집괴를 의미하고, 도 5로서 첨부된 공초점 레이저 현미경 사진에서 보이는 형태 또는 그것에 근사한 형태의 것을 말한다. 실질적으로 구 형상이라고 칭하는 것은 완전한 구 형상의 것에 한정되는 것이 아니라, 약간 편평 형상으로 된 형태도 포함시키는 의도 하에서 사용하고 있다.
상기 소영역은 본 발명의 목적을 달성시킬 수 있은 것이면 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 약 1,000∼약 200,000㎛2, 바람직하게는 약 1,500∼약 50,000㎛2를 갖는 어떠한 형상, 예컨대 원형, 사각형을 비롯한 다각형, 타원형 등일 수 있다. 원형의 것이 바람직하지만, 이 경우 직경이 약 40∼약 500㎛, 바람직하게는 약 50∼약 200㎛, 보다 바람직하게는 약 50∼약 100㎛이고, 보다 큰 직경을 갖는 소영역 상에 피더 세포층 및 추가로 그 위에 스페로이드를 담지하는 배양 세포 구축물은, 지지체 표면으로부터 각 배양물 또는 공배양물이 박리되기 쉬운 경향을 나타내거나, 또는 스페로이드가 그 기원의 실질 세포의 기능을 안정적으로 유지하지 못하는 경우가 발생한다.
상기 기술한 바와 같이 예컨대 이러한 소영역 상에서 내피 세포, 상피 세포 또는 섬유아세포를 배양할 때에, 이들 배양 세포는 소영역 이외에 이주하여 상기에 특정한 소영역 상에서의 배양물을 형성할 수 없는 경우가 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 문제점을 회피하기 위한 수단으로서 이 소영역 주위를 둘러싼 친수성 및 세포 비친화성 물질로 제작한 표면이 제공된다. 이러한 물질의 상세한 내용에 대해서는 후술하겠지만, 종래에 예컨대 상기 기술한 미국 특허공보 제5,976,826호에 따르면, 시알산, 렉틴, 폴리갈락토오스 및 다른 탄수화물이 세포의 결합을 매개한다("to mediate cell binding")는 교시가 있고, 또한 예컨대 P. H. Weigel et al., J. Bio. Chem. Vol. 254(1979) 10830-10838에 따르면, 평평한 폴리아크릴아미드 겔에 공유 결합된 당류에 간 세포가 특이적으로 접착된다는 예증이 있는데, 본 발명에서 말하는 「세포 비친화성 물질」은 상기 교시와는 독립되고, 오히려 대립되는 것도 포함하는 경우가 있는 것에 주의할 필요가 있다.
구체적으로는 본 발명에 따른 친수성 및 세포 비친화성 물질은 이 물질에 의해 제작된 표면에 상기 기반 의존성 배양 세포 또는 피더층 형성 배양 세포를 후술하는 바와 같은 배양 조건 하에서는 전혀 접착시킬 수 없거나, 가령 접착시켜도 완화적인 세정 또는 헹굼에 의해 쉽게 탈착할 수 있고, 그 이후의 실질 세포의 배양시에 안정적으로 장기간에 걸친 배양을 실시할 수 없거나, 또는 배양 실질 세포도 접착시키기 어려운 성질의 표면을 제작할 수 있는 물질이다. 이러한 표면을 형성할 수 있는 물질의 일부는 예컨대 상기 기술한 미국 특허공보 제5,976,826호 명세서에 기재되어 있는 세포 비친화성 또는 소생물성(biophobic) 단분자층을 형성하는 물질일 수 있다. 바람직한 것으로는 폴리에틸렌글리콜(이하, 「PEG」라고 하는 경우가 있음) 부분을 포함한 화합물을 들 수 있다. 덧붙여서, 이 특허 명세서에는 6개의 에틸렌글리콜 단위를 갖는 화합물(예, HS(CH2)11(OCH2CH2)6OH)이 구체적으로 사용되고 있다.
또한 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있고 본 발명을 한층 더 독특한 것으로 하는 것은, 세포 표면 수용체에 대한 리간드의 결합 도메인을 구성하고, 보다 구체적으로는 당류에 간 세포가 접착된다고 알려져 있음에도 불구하고, 단당 또는 올리고당 또는 임의의 종류의 올리고 펩티드를 어느 한쪽 말단에 공유 결합시킨 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 당 유도체 또는 펩티드 유도체 또는 다당을 세포 비친화성 물질로서 사용할 수 있는 데에 있다.
따라서, 상기 소영역을 둘러싼 표면도 미국 특허공보 제5,976,826호에 기재되어 있는 바와 같은 화합물을 사용하여 제작할 수 있는데, 바람직하게는 PEG 세그멘트를 베이스로 하는 중합체를 사용하는 것이 바람직하다. PEG 세그멘트를 베이스로 한다는 것은 이들 중합체가 당 잔기를 갖지 않는 경우에는, 형성된 표면이 주로 PEG 세그멘트의 자유 사슬에 의해 덮이는 것을 가능하게 하도록 PEG 세그멘트를 함유하여 이루어진 것을 의미하고, 이러한 작용을 발휘하는 한 호모 중합체 또는 블록 공중합체 또는 이들 유도체일 수 있다. 또, 자유 사슬이란 수성 매체 중에 놓였을 때에, 이 세그멘트가 실질적으로 자유로운 컨포메이션을 취할 수 있는 중합체 사슬의 상태를 말한다.
한정되는 것은 아니지만, 이러한 중합체, 나아가서는 당 잔기를 갖는 당 유도체 또는 올리고 펩티드 잔기를 갖는 펩티드 유도체는 다음 화학식(Ⅰ)로 표시할 수 있다.
Y-L1-(B)m-L2-(CH2CH2O)n-L3-X
상기 식에서, L1, L2및 L3는 독립적으로 원자가 결합, 산소 원자 또는 링커를 나타내고, 단 m이 0인 경우에는 L1과 L2는 일체가 되어 원자가 결합, 산소 원자 또는 1개의 링커가 될 수 있고,
B는 식
을 나타내고, 여기서 R1및 R2는 독립적으로 수소 원자, 탄소 원자 1∼5개의 알킬기이고, 그리고 p는 2∼5의 정수이고,
X는 수소 원자, 당 잔기 또는 펩티드 잔기를 나타내고,
Y는 수소 원자 또는 디바이스 표면에 이 중합체를 결합 또는 부착할 수 있는 관능기를 나타내고,
m은 0∼10,000의 정수이고, 그리고
n은 10∼20,000의 정수이다.
또, L1, L2및 L3는, L1이 원자가 결합, -(CH2)q-O-, -(CH2)q-COO-, -(CH2)q-S- 또는 -CO-(CH2)q-NH-의 링커를 나타내거나, 또는 m이 0인 경우에는 L1과 L2는 일체가 되어 상기에서 L1에 대해서 정의한 링커일 수 있고, 여기서 q는 2∼6의 정수이며 또는 m이 0 이외의 경우에는 L2는 -O- 또는 -O-CH2CH2-O이고,
L3가 원자가 결합 또는 -(CH2)r-이고, 여기서 r은 1∼6의 정수일 수 있다.
이들 중합체는 예컨대 본 발명자들의 일부에 의해 개시된 WO96/32434(또는 미국 특허공보 제5,037,969호), WO96/33233(또는 미국 특허공보 제5,925,720호) 및WO97/06202(또는 미국 특허공보 제5,929,177호), 그리고 Jo et al., Biomaterials, 21, 605-612, 2002에 기재된 중합체 이들 자체 또는 약간 수식하거나 또는 이들에 준하여 제조한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 화학식(Ⅰ)의 X가 당 잔기, 예컨대 세포 표면 수용체에 대한 리간드의 결합 도메인을 구성하는 단당 또는 올리고당(예컨대, 당 단위를 11개까지, 바람직하게는 7개까지 함유할 수도 있음), 특히 2 당의 잔기이면, 이러한 중합체로 형성된 표면은 본 발명에서 말하는 배양 세포의 접착을 강하게 방지할 수 있으므로 특히 바람직하다. X가 단당을 나타내는 중합체에 대해서는 상기 기술한 WO96/32434(또는 미국 특허공보 제5,037,969호)에 기재되어 있으며, 또한 거기에 기재된 방법에 따라 원하는 각종 당 잔기를 담지할 수 있다. 동일하게 X가 다당 잔기를 나타내는 중합체도 올리고당 잔기를 나타내는 중합체도, 상기 방법을 약간 개변함으로써 제조할 수 있다. 그러나, 별도 방법으로서, 상기 기술한 WO96/33233(또는 미국 특허공보 제5,925,720호)에 기재되어 있는 X 부분에 아세탈기를 갖는 중합체를 알데히드기로 전환시킨 후, 단당 또는 올리고당에 필요에 따라 미리 아미노기를 도입해 두고, 그 아미노기와 상기 알데히드기를 이용하는 환원 아미노화 반응에 의해 X가 당 잔기인 중합체를 수득할 수도 있다. 이러한 단당 또는 올리고당으로는, 적어도 1 개의 갈락토피라노실기를 함유하는 것이 바람직하다. 한정되지는 않지만, 이러한 올리고당으로는 갈락토오스, 각종 시알로 올리고당을 들 수 있다. 또한, 상기 화학식(Ⅰ)의 X가 세포 표면 수용체에 대한 리간드의 결합 도메인을 구성하는 올리고 펩티드 잔기인 친수성 중합체도 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 이 리간드는 렉틴 수용성 시그널 분자(예컨대, 단백질 호르몬, 성장 인자 단백질)일 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 올리고 펩티드로는 적어도 아르기닌(Arg), 글리신(Gly), 아스파라긴산(Asp)을 포함하고, 전체적으로 수용성이 될 수 있는 아미노산 잔기가 10 개까지인 것을 들 수 있다.
상기와 같은 당류를 공유 결합시킨 PEG 를 베이스로 하는 중합체의 당 유도체 외에, 본 발명에서는 다당, 예컨대 폴리갈락토오스, 시알산, 기타 렉틴이 결합될 수 있는 다당 이들 자체를 친수성 중합체로서 사용할 수 있다. 친수성 중합체는 당업자라면 상기에 예시한 중합체로부터 이해할 수 있는데, 본원 발명에 따른 세포의 배양 조건 하에서는 중합체 전체가 주위 조건 하에서 물에 가용성이거나, 또는 중합체를 구성하는 세그멘트에 상당하는 중합체(상기 예에서 말하자면, 폴리에틸렌)가 물에 가용성인 중합체를 의미한다. 당업자라면, 예컨대 후술하는 실시예를 참조로, 이러한 중합체로부터 본 발명에서 알맞게 이용할 수 있는 구체적인 중합체를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
화학식(Ⅰ)에서, Y, 경우에 따라 Y-L1-(B)-는 이 친수성 물질의 표면을 형성하고자 하는 그 하부층(배양 지지체 표면, 디바이스 표면을 직접 또는 간접적으로 형성하는 기판, 필름, 도막 또는 증착막일 수 있음)의 성질에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예컨대, 이 지지체 표면은 화학식(Ⅰ)의 중합체를 확실히 부착 또는 결합시킬 수 있는 표면을 가질 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 이 지지체표면에 실리콘이 도포되어 있거나, 또는 예컨대 수산기를 갖는 표면이 실란 처리와 같은 소수화 처리가 되어 있는 경우에는, 화학식(Ⅰ)의 m이 0 이외이고, 예컨대 5 이상의 정수를 나타내는 블록 공중합체가 되도록 Y-L1-(B)- 부분을 선택하고, 이러한 에스테르 세그멘트의 소수성을 이용하여 이 중합체를 이 지지체 표면에 부착시켜 친수성 물질의 표면을 형성할 수 있다. 이러한 예에서는, 중합체의 부착을 더욱 강화시키기 위하여, 이 에스테르 세그멘트에 상당하는 호모 중합체를 미리 지지체 표면에 부착시켜 두고, 이어서 이 블록 공중합체를 부착시키면, 박리 등에 대하여 양호한 저항성을 나타내는 친수성 물질의 표면을 제작할 수 있다.
또한, 상기 기술한 미국 특허공보 제5,976,826호 명세서에 기재되어 있는 바와 같은 관능기를 지지체 표면이 갖고 있는 경우에는, 기 Y는 이러한 관능기와 반응하여 공유 결합, 예컨대 -CONH-, -CONHCO-, -S-S-, -O-, -Si-O-, -NH- 등을 형성할 수 있는 다른 관능기일 수 있다. Y 에 이들 관능기를 도입하는 방법, 또한 이러한 관능기를 갖는 중합체는 상기 본 발명자들의 일부에 의한 개시에 따른 특허 명세서에 기재되어 있다. 한편, 관능기를 갖는 지지체 표면의 제공은 상기 미국 특허공보 제5,976,826호에 일부는 기재되어 있으며, 기타 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리아크릴아미드 등을 도포한 표면을 그 자체 공지된 방법으로 플라스마 처리하거나, 또는 상기 관능기에 상당하는 보호된 관능기를 갖는 단량체를 그 자체 공지된 플라스마 중합법을 실시하고, 이어서 필요에 따라 보호기를 이탈시킴으로써 조제할 수 있다.
또한, 지지체 표면이 금, 은, 구리 등과 같은 금속으로 이루어질 때에는 기 Y를 예컨대 메르캅토기로 함으로써, 화학식(Ⅰ)의 중합체를 하부층에 소위 화학 흡착시킬 수 있어 목적하는 표면을 제작할 수 있다.
한편, 이 소영역은 그 표면을 필요에 따라 세포 친화성이 되도록 처리해도 된다. 본 명세서에서 말하는 「세포 친화성」이란, 상기 기술한 내피 세포, 상피 세포 또는 섬유아세포를 이러한 성질을 갖는 표면에서 배양하였을 때, 배양 세포가 접착되고, 이렇게 접착된 세포가 완화적인 세정이나 헹굼에 의해 탈착되지 않는 표면을 말한다. 이러한 표면은 소수성 기(탄화수소기, 알킬실릴기, 플루오르화 알킬기 등)를 갖는 화합물 또는 하전기(예, -COO-, -PO3H-등)를 갖는 화합물(세포외 매트릭스를 구성하는 단백질을 포함함)로 형성된 것일 수 있다. 이러한 표면의 제작은 상기 기술한 친수성 물질 표면의 제작법에 있어서, 친수성 물질(또는 친수성 중합체)대신에 상기 중 어느 한 화합물을 이용하여 처리함으로써 실시할 수 있다.
세포 친화성 표면의 소영역은 당업자에게 그 자체 주지된 패턴 형성법 또는 마이크로 패턴화(micropatterning)법에 따라 제작할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 먼저 친수성 중합체의 표면을 적당한 지지체 위에 형성해 두고, 그 위에 소영역에 상당하는 홀이 원하는 형식으로 배열되어 있는 패턴을 설치하고, 그 홀을 통하여 예컨대 H2+N2를 사용하는 플라스마 처리를 실시하여 이 표면을 형성한 중합체층을 제거하고, 이렇게 수득된 소영역을 필요에 따라 상기 세포 친화성 표면을형성할 수 있는 화합물로 처리하여 제작할 수 있다. 상기 「필요에 따라」 라고 기재한 것은 친수성 중합체의 표면을 퇴적시킨 표면(디바이스 자체의 표면일 수 있음)이 상기 플라스마 처리에 의해 악영향을 받지 않도록 형성된 세포 친화성 표면이면 상기 임의의 처리는 필요 없음을 의도하고 있다.
이렇게 제작되는 소영역 간의 간격은 최단 약 100㎛ 인 것이 바람직하다. 기반 의존성 세포 또는 피더층 작성 세포로서 내피 세포 또는 섬유아세포 등을 선택한 배양계에서는, 복수의 소영역이 이러한 간격으로 친수성 중합체의 표면 영역에 의해 격리되어 있으면, 상기 소영역 상의 배양 내피 세포 또는 섬유아세포, 그리고 배양 실질 세포, 특히 간 세포 스페로이드 상호간에 연접 또는 가교가 실질적으로 일어나지 않는다. 「연접 또는 가교가 실질적으로 일어나지 않는다」라는 것은 다수 있는 것 중의 하나의 소영역 상의 배양 간 세포 스페로이드가 다른 소영역 상의 그것과 형태상 접속된 것이 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 0%인 것을 의미한다.
이와 같은 원하는 양식으로 정렬된(또는 패턴화된) 배양 세포로 형성된 스페로이드를 함유한 공배양물을 담지하는 배양 세포 구축물은, 바람직하게는 또 하나의 본 발명의 태양인 배양 세포 구축물의 작성 방법으로 수득할 수 있다.
(A) 세포를 배양할 지지체 표면에 PEG 세그멘트를 베이스로 하는 중합체, 바람직하게는 상기 화학식(Ⅰ)로 표시되는 중합체, 특히 바람직하게는 식 중의 X가 당 잔기 또는 올리고 펩티드 잔기인 중합체의 유기 용매(예컨대, 톨루엔)의 용액 또는 수성 용액을 스핀 코팅한다. 또, 예컨대 이 지지체 표면의 재료가 유리제인 경우에는, 그 표면 상의 수산기를 소수성 실란커플링제를 사용하여 미리 소수화 처리해 두면, 그 이후 소영역을 세포 친화성 처리할 필요가 없는 경우가 있다. 실란 처리는 그 자체 이미 알려진 방법, 예컨대 H. Otsuka et al., Biomacromolecules, 2000, 1, 21-27에 기재되어 있는 방법을 참조할 수 있다. 또, 화학식(Ⅰ)의 X에 상당하는 기가 아세탈인 경우의 중합체를 미리 스핀 코팅하고, 그 이후 미리 아미노기를 도입한 당의 아미노기와 상기 아세탈의 탈보호에 의해 노출되는 알데히드 사이에서 환원 아미노화 반응을 실시하고, 당 잔기를 상기 중합체에 도입해도 된다. 이 중합체층의 두께는 사용할 중합체의 종류에 따라 최적의 두께가 변동되므로 한정할 수 없지만, 소영역 상의 피더 배양 세포 또는 이 배양 세포와는 다른, 예컨대 배양 실질 세포와 다른 소영역 상의 이들 세포 간의 접착을 방지할 수 있는 두께이면 된다. 이러한 두께에 대해 당업자는 소실험을 실시함으로써 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 한정되는 것은 아니지만, 일반적인 단분자 막두께가 최소한 필요할 것이다.
(B) 단계 (A)에서 수득되는 표면 상에 소영역(바람직하게는 약 50∼500㎛ 직경을 갖는 원 형상)의 홀을 복수개 갖는 마스크 패턴을 두고, 플라스마 발생장치에 의해 H2+N2를 사용하는 플라스마 처리를 실시하고, 이렇게 해서 홀에 상당하는 영역의 중합체층을 파괴, 제거하여 예컨대 소수성 처리 표면을 노출시킨다.
(C) 필요하면, 중합체층을 제거하여 노출한 표면에 상기 마스크 패턴을 통해 세포 친화성 기를 갖는 단량체를 플라스마 중합 또는 이 단량체 유래의 중합체를코팅함으로써, 이 표면을 세포 친화성으로 수식해도 된다.
(D) 이렇게 해서 세포 친화성 소영역을 갖는 표면 상에서, 예컨대 내피 세포(적당하다면 시판되는 세포, 예컨대 다이닛폰 제약 제조의 「인간 제대 정맥 혈관 내피 세포」 등)를 이러한 세포를 배양할 수 있는 배양 기(적당하다면 시판되는 배양 기, 예컨대 다이닛폰 제약 제조의 「VE 배지」)를 사용하여 배양하여 배양 세포층을 형성한다. 이 배양은, 예컨대 일본 특허공보 제2973976호에 기재된 방법에 따르거나 또는 이들을 개변하여 실시할 수 있다.
(E) 단계 (D)에서 형성된 피더 배양 세포층 상에서, 이 세포층을 형성하는 세포와는 다른 세포, 바람직하게는 실질 세포를 배양한다. 실질 세포를 비롯한 세포는 초대 세포가 바람직하나, 본 발명의 방법에 따라 배양했을 때, 상기 세포층 상에 배양 세포 스페로이드를 형성할 수 있는 것이면, 계통화(또는 주화(株化))된 세포나 어떠한 형질 전환 또는 트랜스펙션된 세포일 수도 있다. 또, 피더층을 형성하는 내피 세포 또는 섬유아세포도 스페로이드를 형성하는 세포, 바람직하게는 실질 세포도 기원에 제한받지 않고 사용할 수 있는데, 같은 종류의 동물 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 세포 중에서 세포의 배양도 그 자체 이미 알려진 배양법(예컨대, S. N. Bhatia, et al., Biotech. Prog. 1998, 14, 378-387 참조)으로 배양할 수 있다. 이러한 세포로서 간 세포를 사용하는 경우의 배양은 통상 적어도 24시간 후에는 배양 간 세포 스페로이드가 상기 소영역 상의 피더 배양 세포층 상에 형성할 수 있다.
간 세포 이외의 다른 세포도 그 자체 이미 알려진 배양법으로 배양하고, 배양 실질 세포의 스페로이드를 상기 소영역 상의 피더 배양 세포층 상에 형성할 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 심근 세포의 배양에 대해서는 T. Shimizu et al., Journal of Biomedical Materials Research, 60(1) (2002):110-117, G. Illiano et al., American Journal of Hypertension 15(2002):638-643을, 글리어 세포의 배양에 대해서는 C. Gamboa et al., Neurochemistry International 40(2002):397-403을, 그리고 췌장 베타 세포의 배양에 대해서는 J. L. Petit-Thevenin et al., Biochemica et Biophysica Acta 1530(2001):184-198을 각각 참조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동물 세포는 각각 이미 알려진 예컨대 외과적 수법에 의해 각각 수득되는 바람직하게는 초대 세포일 수 있으나, 예컨대 (재)휴먼사이언스 진흥재단, 그 외의 공급원으로부터 시판되고 있는 것이어도 된다.
이상에 의해 수득되는 공배양물을 지지체 표면 상에 갖는 배양 세포 구축물은 그 자체를 표면으로 하는 바이오 디바이스 또는 상기 공배양물로 표면을 형성한 바이오 디바이스를 제작하는데 사용할 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 이러한 바이오 디바이스로는, 배양 실질 세포의 독성을 검사하기 위한 디바이스, 배양 실질 세포의 기능을 부활화하는 물질을 스크리닝하기 위한 디바이스, 실질 세포 부전의 의료 서포트용 디바이스 및 실질 세포의 생리 작용을 모의 시험하기 위한 디바이스 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 바이오 디바이스 상에 담지되는 공배양물(배양 세포로 형성된 스페로이드 및 이 스페로이드에 접촉된 하부층을 형성한 이 스페로이드를 형성하는 세포와는 다른 배양 세포의 실질적으로 단층을 포함하여 이루어짐)은 장기간에 걸쳐 안정적으로 상기 디바이스 표면에 유지되고, 각 실질 세포에 특이적인 기능(간 세포 이외의 췌장 베타 세포에 있어서는 예컨대 인슐린 분비 기능, 심근 세포에 있어서는 박동 운동 기능)도 유지할 수 있다. 예컨대, 간 세포를 사용하여 제작될 수 있는 본 발명의 바이오 디바이스는 소정의 서열 패턴에 의해 형태가 균질한 스페로이드가 담지된 것으로, 또한 상기 스페로이드는 실질적으로 각 소영역마다 독립된 형상을 갖고 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오 디바이스 상의 스페로이드는 높은 레벨의 간 세포 기능(예컨대, 높은 레벨의 알부민 생산능)이 최저 3주일 안정적으로 유지되고 있다. 따라서, 이러한 바이오 디바이스는 예컨대 간기능에 영향을 미칠 수 있는 환경 또는 물질의 스크리닝에 사용할 수 있다. 이러한 영향은 스페로이드 형태의 변화나 산물, 예컨대 알부민 생산능의 변화를 모니터함으로써 판정할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 배양 세포 구축물 중에 함유된 공배양물은 물리적 또는 생화학적으로 처리함으로써 지지체로부터 박리된 배양물 이들 자체를 제공할 수 있다. 이러한 유리된 형태에 있는 공배양물도 본 발명의 일 태양으로, 예컨대 이식 의료, 기관 재생 공학, 하이브리드형 인공 기관에서 사용할 수 있다.
다음에, 구체예를 들어 본 발명을 더욱 설명하는데, 이들은 본 발명의 이해를 쉽게 하는 목적에서 제공하는 것에 불과하다.
a) 세포 배양 바닥의 작성
화이트 슬라이드 유리(26×76×0.8㎜/Takahashi Giken Glass Co., Ltd.)를황산/과산화수소(50/50)에서 60분간 끓이고 이어서 세정한 후, 에탄올/물(95/5) 중의 2%[3-(메타크릴로일옥시)프로필]트리메톡시실란 용액을 사용하는 실란 커플링으로 상기 유리 표면을 소수 처리하였다. 이렇게 조제된 소수 처리 슬라이드 유리 표면에 분자량 20000의 폴리락티드의 4% 톨루엔 용액을 스핀 코팅하고, 이어서 아세탈-폴리에틸렌글리콜(분자량 6000)-코-폴리락티드(분자량 8000)(이하, 아세탈-PEG/PLA라고 함)의 알데히드화물과 아미노페닐락토오스의 환원 아미노화에 의해 수득된 락토오스-PEG/PLA의 2% 톨루엔 용액을 다시 스핀 코팅하여 약 100㎛ 두께의 고분자층 표면을 형성하였다. 이렇게 수득된 고분자층 표면 상에 각각 서로 100㎛ 간격으로 떨어진 100㎛ 원 형상의 구멍을 갖는 마스크 패턴을 두고, H2+N2의 플라스마 처리를 하였다[ICP power: 500W, Bias power: 30W(Vdc=60V), N2+H2=50sccm/30sccm, 2×10-5Torr]. 플라스마 처리에 의해 상기 마스크 패턴에 따른 유리 표면이 노출된 구멍이 형성되었다(도 1 참조).
상기 표면에 둘베코의 개변 이글 배지(DMEN, Gibco)(인슐린, 소 태자 혈청, 글루카곤, 상피 증식 인자, 페니실린, 히드로 코르티존 및 스트렙토 마이신 보충)을 시용하여 상기 구멍에 대응한 세포 접착 도메인(또는 세포 배양 바닥)을 형성하였다.
b) 세포 배양
a)에서 수득된 세포 배양 바닥 상에 혈관 내피 세포(Bovine aortiendotherial cell)를 1×106cell/㎠로 파종한 후, 5% CO2분위기 하, 37℃에서 24시간 정치 배양하였다. 이렇게 해서 노출된 구멍의 유리 패턴에 따라 내피 세포가 접착되었다(도 2 참조). 이어서, 래트 간장으로부터 콜라게나아제 탁류법으로 조제한 초대 간 세포를 1×106cell/㎠로 파종한 후, 5% CO2분위기 하, 37℃에서 24시간 정치 배양하면, 상기 패턴 형상으로 도메인을 형성한 내피 세포 상에만 간 세포가 접착되어 스페로이드 형상의 어레이를 형성하였다(도 3 참조). 이들 간 스페로이드는 적어도 3주일은 간 기능(예컨대 알부민 생산능)을 유지하고, 세포 골격을 확인할 수 있다(스페로이드의 3차원 확대상에 대해서는 도 5 참조).
또, 락토오스-PEG/PLA 표면 상에서도 100㎛ 원 형상의 구멍이 100㎛ 간격 미만으로 되면, 내피 세포의 패턴이 인접한 것끼리 이어지고, 간격을 더 짧게 하면 세포는 시트 형상으로 되는 경우가 있다(도 4 참조). 통상 패턴화된 내피 세포층이 존재하지 않으면, 배양 간 세포의 스페로이드 패턴은 형성되지 않는다.
상기와 같이 해서 수득되는 예컨대 간 스페로이드 어레이는 이들 간 스페로이드가 장기간에 걸쳐 간 기능을 유지하고, 또한 컬처 디시 1 룸당 예컨대 수만개의 간 스페로이드를 존재시킬 수 있으(이론상으로는 무제한)므로, 한번에 수만 종류의 약물 어세이를 실시하는 데에 이용할 수 있다. 또한, 이 어레이로부터 박리되는 공배양물, 예컨대 배양 간 스페로이드는 이식 의료, 간 재생 공학의 기술분야에서 이용할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 약물 작용을 평가하기 위한 검사를 실시하는 산업 또는 의료 서포트용 산업에서 이용할 수 있다.

Claims (25)

  1. 지지체 상에 서로 다른 동물 세포의 1 또는 2 이상의 공배양물을 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물로서, 이 다른 세포의 1 종류에서 유래되는 배양 세포로 형성된 스페로이드 및
    이 스페로이드에 접촉된 하부층을 형성하고, 그리고 이 스페로이드를 형성하는 세포를 생존 및/또는 기능시킬 수 있는 또 1 종류의 세포에서 유래되는 배양 세포의 실질적으로 단층으로서, 지지체의 소영역 상에 존재하는 단층을 포함한 공배양물; 그리고 지지체를 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물.
  2. 제 1 항에 있어서, 스페로이드를 형성하는 세포가 실질 세포인 배양 세포 구축물.
  3. 제 1 항에 있어서, 스페로이드를 형성하는 세포가 간 세포, 췌장 베타 세포, 심근 세포, 글리어 세포, 피부 상피 세포, 연골 세포, 골 세포 및 간(幹) 세포로 이루어진 군에서 선택된 실질 세포이고, 그리고 이 스페로이드를 형성하는 세포와는 다른 또 1 종류의 세포가 내피 세포, 섬유아세포 및 상피 세포로 이루어진 군에서 선택된 배양 세포 구축물.
  4. 제 1 항에 있어서, 스페로이드를 형성하는 세포가 간 세포이고, 그리고 이스페로이드를 형성하는 세포와는 다른 또 1 종류의 배양 세포가 내피 세포 또는 섬유아세포에서 유래되는 것인 배양 세포 구축물.
  5. 제 1 항에 있어서, 공배양물이 2 이상 존재하고, 또한 이들이 서로 격리된 형태에 있는 배양 세포 구축물.
  6. 제 1 항에 있어서, 소영역이 약 1500∼30000㎛2인 면적을 갖는 배양 세포 구축물.
  7. 제 1 항에 있어서, 소영역이 직경 약 50∼500㎛의 실질적으로 원형인 배양 세포 구축물.
  8. 제 1 항에 있어서, 공배양물이 2 이상 존재하고, 소영역이 직경 약 50∼200㎛의 실질적으로 원형이고 또한 각 인접하는 다른 소영역과의 최단 간격이 약 100㎛인 배양 세포 구축물.
  9. 제 1 항에 있어서, 공배양물이 2 이상 존재하고, 각 배양물을 담지하는 소영역이 친수성 및 세포 비친화성 물질로 제작된 지지체 표면에 의해 격리되어 있는 배양 세포 구축물.
  10. 제 1 항에 있어서, 친수성 및 세포 비친화성 물질이 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 중합체로서, 이 세그멘트의 어느 한쪽 말단이 수산기를 갖는 중합체인 배양 세포 구축물.
  11. 제 1 항에 있어서, 친수성 및 세포 비친화성 물질이 폴리에틸렌글리콜 세그멘트와 폴리락티드 세그멘트를 갖는 배양 세포 구축물.
  12. 제 1 항에 있어서, 친수성 및 세포 비친화성 물질이 세포 표면 수용체에 대한 리간드의 결합 도메인을 구성하는 단당 또는 올리고당 및 올리고 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 어느 한쪽 말단에 공유 결합시킨 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 유도체 그리고 다당으로 이루어진 군에서 선택된 배양 세포 구축물.
  13. 제 1 항에 있어서, 친수성 및 세포 비친화성 물질이 갈락토실기를 적어도 1개 함유한 단당 또는 올리고당을 어느 한쪽 말단에 공유 결합시킨 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 당 유도체인 배양 세포 구축물.
  14. 제 1 항에 있어서, 친수성 및 세포 비친화성 물질이 갈락토피라노실기를 적어도 1개 함유한 단당 또는 올리고당을 어느 한쪽 말단에 공유 결합시킨 폴리에틸렌글리콜 세그멘트와 폴리락티드 세그멘트를 함유하여 이루어진 당 유도체인 배양 세포 구축물.
  15. 제 1 항에 있어서, 친수성 및 세포 비친화성 물질이 아르기닌-글리신-아스파라긴산의 아미노산 서열을 함유하여 이루어진 올리고 펩티드를 어느 한쪽 말단에 공유 결합시킨 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 펩티드 유도체인 배양 세포 구축물.
  16. 제 1 항에 있어서, 소영역이 세포 친화성 물질로 제작된 표면을 갖는 배양 세포 구축물.
  17. 제 1 항에 있어서, 소영역이 탄화수소기, 알킬실릴기 및 플루오르화 알킬기를 갖는 화합물; 카르복실레이트 음이온 및 포스페이트 음이온을 갖는 화합물; 그리고 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질로 이루어진 군에서 선택된 세포 친화성 물질로 제작된 표면을 갖는 배양 세포 구축물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 배양 세포 구축물의 지지체로부터 박리된 공배양물.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 배양 세포 구축물로 형성된표면을 포함하여 이루어진 바이오 디바이스.
  20. 제 19 항에 있어서, 배양 세포 구축물 중의 2 이상의 공배양물에서의 각 스페로이드가 약 50∼100㎛ 직경을 갖는 실질적으로 구형이고, 각 스페로이드가 각 인접하는 스페로이드와의 사이의 최단 간격이 약 100㎛이고, 그리고 일정한 패턴을 형성하도록 정렬되어 있는 바이오 디바이스.
  21. 제 19 항에 있어서, 바이오 디바이스가 스페로이드를 형성하는 세포의 독성을 검사하기 위한 디바이스, 스페로이드를 형성하는 세포의 기능을 부활화하는 물질을 스크리닝하기 위한 디바이스, 스페로이드를 형성하는 세포 부전의 의료 서포트용 디바이스 및 실질 세포의 생리 작용을 모의 시험하기 위한 디바이스로 이루어진 군에서 선택된 바이오 디바이스.
  22. 지지체 상에 서로 다른 동물 세포의 1 또는 2 이상의 공배양물을 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물의 작성 방법으로, 공배양물을 접착할 재료 표면에 동물 세포 표면 수용체에 대한 리간드의 결합 도메인을 구성하는 단당 또는 올리고당 및 올리고 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 어느 한쪽 말단에 공유 결합시켰거나 또는 미공유 결합된 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 중합체층을 형성하고, 적어도 약 100㎛씩 격리된 약 50∼100㎛ 직경을 갖는 원 형상의 홀을 복수개 갖는 마스크 패턴을 통해 상기 중합체층을 플라스마 처리하고, 이렇게 해서상기 홀에 상당하는 영역의 중합체층을 제거하고, 필요하면 중합체층이 제거된 소영역을 세포 친화성 물질을 도포하고, 이 소영역 상에서 내피 세포 또는 섬유아세포를 배양하여 배양 세포의 단층을 형성하고, 이어서 이 배양 세포 상에서 이 배양 세포와는 다른 세포를 배양함으로써 이 다른 세포의 스페로이드를 형성하는 것을 특징으로 하는 격리된 복수개의 소영역 상에 배양 세포로 형성된 스페로이드를 담지하는 공배양물을 함유하여 이루어진 배양 세포 구축물의 작성 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 스페로이드를 형성하는 세포가 간 세포, 췌장 베타 세포, 심근 세포, 글리어 세포, 피부 상피 세포, 연골 세포, 골 세포 및 배성(胚性) 또는 성체 간(幹) 세포로 이루어진 군에서 선택된 배양 세포 구축물의 작성 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 스페로이드를 형성하는 세포가 간 세포인 배양 세포 구축물의 작성 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 중합체층이 단당 또는 올리고당을 어느 한쪽 말단에 공유 결합시킨 폴리에틸렌글리콜 세그멘트를 베이스로 하는 중합체로 이루어진 배양 세포 구축물의 작성 방법.
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