JP2002510969A - マイクロパターン化形態における細胞の共培養 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 少なくとも2種の細胞を基質上でマイクロパターン形態とし、その結果、ヘテロティピックの細胞-細胞接触の程度を調節して細胞の代謝および/または合成機能を調節することができる、細胞の共培養物を産生する方法を提供する。共培養は、コラーゲンのようなタンパク質を用いて基質を被覆することにより、そのタンパク質が基質のマイクロパターンを規定し、培地中の被覆された基質を肝細胞のような第一型の細胞と接触させて該細胞をタンパタ質に結合させてマイクロパターン化細胞被覆基質を作り、第二培地中でマイクロパターン化基質を繊維芽細胞のような第二型の細胞と接触させてその細胞を基質に結合させることにより、行うことができる。第一または第二の培地は無血清培地などの非接着性培地であり、他の培地は血清含有培地などの接着性培地である。接着性培地はフィブロネクチンまたは抗体のような接着因子を含有していてもよい。マイクロパターンは、第一種または第二種いずれか一方の細胞の島（island）によって形成することができ、該細胞はもう一方の種の細胞により囲まれている。

Description

【発明の詳細な説明】 マイクロパターン化形態における細胞の共培養 連邦政府後援研究に関する記述 本発明は、少なくともその一部を、国立予防衛生研究所認可DK5270による合衆 国政府基金により行ったものである。従って、合衆国政府は本発明について一定 の権利を有する。 発明の背景 本発明は、マイクロパターン化された形成（例えば、生物人工器官生成用）に おける細胞の共培養方法に関する。 肝細胞と他の細胞型との共培養は、細胞の生存率を延長させ、表現型を維持し 、肝細胞におけるアルブミン分泌を誘導することが知られている。これまでその ような共培養は他の研究者たちによって研究されてはきたが、それは培養液中で 二種の細胞型の相互作用を操作もしくは制御できる形態の研究ではなかった。そ のような共培養物の製造においては、一つの型の細胞を基質に播種し、第二の型 の細胞を第一型の細胞上に播種するまでの間に、第一型の細胞を接着させる。そ のような共培養では、細胞数のようなパラメーターを制御することは可能である が、空間配置の規定や制御はできない。ヘテロティピックの細胞-細胞接触はラ ンダムのままであり、ある細胞機能をアップレギュレーションしたり最適化する 能力はそうした培養では不可能である（Clement，B.ら、「成人ヒト肝細胞とラ ット肝上皮細胞の長期共培養：アルブミン分泌調節と細胞外物質の蓄積（Long-T erm Co-Culture of Adult Human Hepatocytes with Rat Liver Epithelial Cell s:Modulation of Albumin Secretion and Accumulation of Extracellular Mate rial）」Hepatology 4(3):373-380(1984);Schrode，W.ら、「肝上皮細胞株との 共培養による門脈周辺肝細胞のグルタミンシンセターゼ誘導（Induction of Glu tamine Synthetase in Periportal Hepatocytes by Cocultivation with a Live r Epithelial Cell Line）」European Journal of Cell Biology 53:35-41(1990 );Michalopoulos，G.ら、「ヒト繊維芽細胞の一次培養（Prlmary Culture of He patocytes on Human Fibroblasts）」In Vitro 15(10):796-806(1979);Guguen-G uillouzo，C.ら、「他の肝上皮細胞型と共培養した成体ラット肝細胞によ る活性アルブミン分泌の維持と可逆性（Maintenance and Reversibility of Act ive Albumin Secretion by Adult Rat Hepatocytes Co-Cultured with Another Liver Epithelial Cell Type）」Experimental Cell Research 143:47-54(1983) ;Begue，J.ら、「他の肝細胞型と共培養した成体ラット肝細胞における活性チト クロームP-450の持続維持（Prolonged Maintenance of Active Cytochrome P-45 0 in Adult Rat Hepatocytes Co-Cultured with Another Liver Cell Type）」H epatology 4(5):839-842(1984);Aglus，L．「実質肝細胞の代謝相互作用と共培 養における上皮細胞の分割（Metabolic Interactions of Parenchymal Hepatocy tes and Dividing Epithelial Cells in Co-culture）」Biochemical Journal 2 52:23-28(1988);およびReid，L.ら、「肝細胞と他の分化細胞の培養（Culturing Hepatocytes and Other Differentiated Cells）」Hepatology 4(3):548-559(1 984)）。 発明の概要 本発明は、少なくとも二種の細胞型を基質上でマイクロパターン化形態にする 、細胞の共培養物を産生する方法を提供する。ヘテロティピックの細胞-細胞接 触の程度を調節するマイクロパターン法を用いることにより、今や細胞の代謝お よび/または合成機能を調節（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレ ギュレーション）することが可能である。 従って、本発明は、以下の段階を含む、少なくとも二種の細胞型を含有するマ イクロパターン化共培養物を産生する方法を提供する： i）基質を被覆する蛋白質が基質のマイクロパターンを規定する、タンパク質 被覆基質を提供する段階； ii）第一細胞型の細胞がタンパク質被覆基質のタンパク質に結合するような条 件下で、タンパク質被覆基質と第一の細胞培地に懸濁した第一細胞型の細 胞とを接触させ、それによりマイクロパターン化された細胞被覆基質が生 成される段階；および iii）第二細胞型の細胞が前記基質に結合する条件下で、マイクロパターン化 細胞被覆基質と第二の細胞培地に浮遊させた第二細胞型の細胞とを接触さ せ、それによりマイクロパターン化された共培養物が生成される段階であ って、前記細胞培地の一つは非接着性培地であり、前記細胞培地の一つは 接着性培地である。 本発明を実施するにあたり、第一および第二の細胞型の細胞は典型的には哺乳 類の細胞であるが、これらは二種の異なる種に由来するものであってもよい（例 えば、ヒト、ラット、マウスなど）。共培養物を産生する細胞の適当な組合せを 以下に例示するが、これらの例には限定されない。 a)肝細胞（例えば、原発性肝細胞）と繊維芽細胞（例えば、NIH3T3-J2細胞） ； b)肝細胞と、少なくとも一つの他の細胞型、特にクッパー細胞、伊東細胞、上 皮細胞、および胆管細胞のような肝細胞； c)上皮細胞と平滑筋細胞； d)腫瘍化実質細胞と間葉細胞； e)造血細胞と骨髄細胞（例えば、脂肪細胞、繊維芽細胞）；ならびに f)皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）と繊維芽細胞。細胞のその他組合せも 本発明の範囲に含まれる。 細胞が増殖する基質は、ガラス、ポリマー（フッ素ポリマー、フッ素化エチレ ンプロピレン、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ポリ カーボネートおよびポリビニルクロリドなど）およびシリコン基質（溶融シリカ 、ポリシリコンまたはシリコン単結晶など）のような、細胞が接着できる生物学 的に適合可能な物質であればよい。共培養した細胞型のマイクロパターンを形成 するには、マイクロパターンを規定する（すなわち、生成する）ため、まずタン パク質を基質に接着させる。タンパク質により産生されたマイクロパターンは細 胞マイクロパターン生成用の「鋳型」となる。二またはそれ以上のタンパク質を 用いてマイクロパターンを規定することができるが、典型的には単一のタンパク 質が基質に接着すると考えられる（例えば、一つの細胞型を引きつけるのに一個 のマイクロパターン化タンパク質を用いてもよく、一方、第二の細胞型を引きつ けるのに第二のマイクロパターン化タンパク質が用いられる）。本発明の実施に おいて、基質に対して二またはそれ以上の細胞型の選択的細胞接着を促進するに は様々な手法を用いることができる。その手法としては、局所的なタンパク質吸 着、有機シランによる表面修飾、アルカンチオール自己集合単層表面改変、三次 元基質を生成する湿乾エッチング法、高周波改変およびイオン注入などの方法が 含まれる(Lom，1993;Brittland，1992;Singhvi，1994b;Singhvi，1994a;Ranier ，1994;Bellamkonda，1993;およびValentini，1993)が、これらに限定されない 。 マイクロパターンを作るのに適当なタンパク質は、共培養に用いられる細胞培 養条件（すなわち、通常の細胞培養条件）下、共培養の細胞型の一つが特異的に 結合するタンパク質である。例えば、肝細胞はコラーゲンに結合することが知ら れている。従って、コラーゲンはマイクロパターンにおいて肝細胞の結合を助け るのに非常に適している。他の適切なタンパク質としては、フィブロネクチン、 ラミニンおよびエンタクチン、ならびにこれらの組合せが含まれる。 本発明の実施において、典型的には、まず第一細胞型の細胞（例えば、肝細胞 ）を「非接着性」細胞培地（例えば、無血清培地および「接着因子」不含培地） に浮遊させておき、一方、第二細胞型の細胞は「接着性」培地[例えば、典型的 には1〜10%（例えば、5〜10%）の血清を含有する細胞培養培地、または、フィブ ロネクチン、その他の細胞外マトリックス、セレクチン、RGDタンパク質、ICAM 、E-カドヘリン、および細胞表面タンパク質（例えば、インテグリン、ICAM、セ レクチンもしくはE-カドヘリン）と特異的に結合する抗体のような一つまたは複 数の「接着因子」（典型的には少なくとも1ng/mL例えば、5〜100ng/ml）を含有 する細胞培養培地]に浮遊させる。本発明を実施する他の方法において、第二種 の細胞は内因性の接着能力をもっており、従って血清もしくは外因性接着因子を 添加する必要がない。ある細胞種は、荷電細胞培養基質に接着し、細胞表面タン パク質を介して、また、細胞外マトリックス分子の分泌により、その基質に接着 する。繊維芽細胞は、これらの条件下で細胞培養基質に接着する一細胞型の一例 である。従って、本発明はまた少なくとも二種の細胞型を含有するマイクロパタ ーン化共培養物を製造する方法を含み、この方法には、以下の段階が含まれる： i）基質を被覆する蛋白質が基質のマイクロパターンを規定する、タンパク質 被覆基質を提供する段階； ii）第一細胞型の細胞がタンパク質被覆基質のタンパク質に結合する条件下で 、タンパク質被覆基質と第一の細胞培地に浮遊させた第一細胞型の細胞と を接触させ、それによりマイクロパターン化された細胞被覆基質が製造さ れる段階；および、 iii）第二細胞型の細胞が前記基質に結合する条件下で、マイクロパターン化 された細胞被覆基質と第二の細胞培地に浮遊させた第二細胞型の細胞とを 接触させ、それによりマイクロパターン化された共培養物が製造される段 階であって、前記第一の細胞型（例えば、皮膚の皮膚繊維芽細胞）は非接 着性培地に存在し、第二の細胞型はそれを基質に接着させる自然の接着力 をもっている。荷電した基質は本発明のこの態様を実施するのに特に有用 である。 マイクロパターン化共培養物を製造するこれら方法の変法において、第一の細 胞型は、（通常の手法を用いて）遺伝子操作して所望の遺伝子産物を産生させて もよく、また、第二の細胞型はタンパク質を産生する。第一の細胞型は、第二の 細胞型を再生させ増殖させることができる。 本明細書に記載のようなマイクロパターン化法を用いることによって、第一お よび第二の細胞型はマイクロパターンを規定する（すなわち、ミクロン規模の分 解能をもつパターンを形成する）。共培養物のマイクロパターンでは、第一もし くは第二細胞型のいずれか一方の細胞は、それぞれ第二もしくは第一細胞型のど ちらか一方の細胞により取り囲まれる。例えば、共培養物の細胞は、肝細胞（第 一細胞型の細胞）の「島」が繊維芽細胞（第二細胞型の細胞）により包囲される よう形成されうる。そのような島は完全に円形である必要はない。例えば、島は 縞様あるいは長方形にすることができる。島の形態とは関係なく、島細胞の少な くとも30%は、細胞（例えば、肝細胞）の島とこれを取り囲む細胞（例えば、繊 維芽細胞）との境界面の100μm以内であることが好ましい。さらに好ましくは、 島細胞の少なくとも50%、80%または90%が該境界面の100μm以内である。島が本 質的に円形である場合、島は典型的に25〜1,000μmの直径をもつ（好ましくは、 30〜500μm（または100〜500μm）である）。 上記方法の変法において、本発明は、第一細胞型の細胞の代謝もしくは合成機 能をアップレギュレーションする方法を提供する。すなわち、 i）基質を被覆する蛋白質が基質上のマイクロパターンを規定する、タンパク 質被覆基質を提供する段階； ii）第一細胞型の細胞がタンパク質被覆基質のタンパク質に結合する条件下で 、タンパク質被覆基質と第一の細胞培地に浮遊させた第一細胞型の細胞と を接触させ、それによりマイクロパターン化された細胞被覆基質が製造さ れる段階；および iii）第二細胞型の細胞が前記基質に結合する条件下で、マイクロパターン化 された細胞被覆基質と第二の細胞培地に浮遊させた第二細胞型の細胞とを 接触させ、それによりマイクロパターン化された共培養物が製造される段 階を含む、第一細胞型の細胞の代謝もしくは合成機能をアップレギュレー ションする方法であって、 a）前記細胞培地の一つは非接着性培地であり、前記細胞培地の一つは接着性 培地であり；且つ b）第一および第二細胞型の細胞はマイクロパターンを規定し、そのマイクロ パターン中第二細胞型の細胞は第一細胞型の細胞を取り囲み、そして第一 細胞型の細胞の少なくとも30%は第一細胞型の細胞と第二細胞型の細胞と の境界面の100μm以内にあり、 その結果マイクロパターン化された共培養物が産生され、該共培養物では、第一 細胞型の細胞と第二細胞型の細胞とを含むパターン化されていない共培養物の第 一細胞型の細胞に比べて、第一細胞型の細胞の代謝または合成機能がアップレギ ュレートされる。 この方法は、共培養物におけるヘテロティピックの細胞-細胞接触レベルを調 節するマイクロパターン化手法を用いることによって、共培養物細胞の合成また は代謝機能をアップレギュレートできるという本発明者らの知見から導かれたも のである。例えば、DNAおよび/またはタンパク質合成はこのマイクロパターン化 法によってアップレギュレートすることができる。肝細胞の島が繊維芽細胞によ って包囲されているマイクロパターン化共培養物において、細胞機能のアップレ ギュレーションは肝細胞の分子内または分泌アルブミンの増加として検出するこ とができる。その代替として、あるいは、それに加えて、細胞機能のアップレギ ュ レーションは肝細胞における尿素合成の増加として検出することができる。 細胞をマイクロパターン化形態に共培養する上記方法におけるように、共培養 用細胞の適当な組合せを以下に例示するが、これらに限定されない。 a)肝細胞（例えば、原発性肝細胞）と繊維芽細胞（例えば、NIH 3T3-J2細胞） b)肝細胞と、少なくとも一つの他の細胞型、特にクッパー細胞、伊東細胞、上 皮細胞、および胆管細胞のような肝細胞 c)上皮細胞と平滑筋細胞 d)腫瘍化実質細胞と間葉細胞 e)造血細胞と骨髄細胞（例えば、脂肪細胞、繊維芽細胞）、ならびに f)皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）と繊維芽細胞。 上記例示を引用すれば、典型的には、これらの組合せそれぞれにおいて第一と称 する細胞型の島は第二と称する細胞型の細胞により包囲され、第一とされた細胞 型の機能がアップレギュレートされるように、本発明を実施する。マイクロパタ ーン化共培養物を生成するには、他の細胞へ接着させる前の細胞機能がアップレ ギュレートされている細胞を基質に接着させる必要はない。しかしながら、肝細 胞と繊維芽細胞との共培養物を製造する場合、典型的にはその肝細胞は、基質を 繊維芽細胞に接触させる前に、タンパク質被覆基質に接着させておく。本発明の この局面におけるその他のパラメーター（例えば、島のサイズ、接着因子、基質 など）は本質的に上記の通りである。 第一細胞型の代謝および/または合成機能は、典型的には、パターン化されて いない共培養物の第一細胞型の細胞の代謝または合成機能に対して、マイクロパ ターン化共培養物では少なくとも1.5倍にアップレギュレートされる。以下に記 載する実験で示すように、少なくとも5〜10倍の増加も達成することができる。 代謝または合成機能調節を検出するには、以下に記載するような通常の分子学的 および生物化学的アッセイ法を用いることができる。 本方法を実施するにあたり、本発明者らは、マイクロパターン化共培養物にお いて（パターン化されていない共培養物に比べ）細胞機能が絶対値レベル（例え ば、アルブミン産生の）が高くなるアップレギュレーションだけでなく、このア ップレギュレーションの速度も増加することを見出した。換言すれば、パターン 化されていない共培養物において代謝または合成機能がアップレギュレートされ る速度にくらべ、マイクロパターン化共培養物においては代謝または合成機能が ある特定のレベルにアップレギュレートされる速度が増加される。従って、本発 明はまた、共培養物において細胞の代謝または合成機能がアップレギュレートさ れる速度を調節する方法を提供する。細胞機能アップレギュレーションのこの速 度増加は、細胞が代謝または合成機能の特定レベルに達する所要培養時間を減少 させるので、生物工学的視点からみて有利である。実際、本発明者らは、細胞機 能のある特定レベルに到達するのに、パターン化されていない共培養物が1〜2週 間を要するのに対し、マイクロパターン化共培養物は1日でそのレベルまでアッ プレギュレートできることを見出した。 本発明はまた、本明細書に記載の方法によって作られたマイクロパターン化共 培養物を包含する。そのようなマイクロパターン化細胞共培養物は、インビボ、 エクス・ビボまたはインビトロ目的の生物人工器官として使用することができる 。例えば、繊維芽細胞と組み合わせた肝細胞のマイクロパターン化共培養物は肝 機能を代替する（例えば、疾患、感染症、または外傷に応答して）、移植可能な （インビボ）もしくは体外の（エクス・ビボ）人工肝臓として、または、肝機能 のインビトロアッセイ（例えば、毒物学もしくは基本研究目的で）に使用するこ とができる。同様に、そのようなマイクロパターン化共培養物はタンパク質源（ 例えば、肝細胞からのアルブミンや凝血因子）として使用することができる。こ の点に関し、本発明の共培養物で生じる分子内翻訳後修飾により適当に修飾され た（例えば、グリコシル化）タンパク質が産生されるため、本発明は無細胞タン パク質製造法よりも有利である。 本明細書に用いられている通り、「マイクロパターン」という用語は、単一細 胞レベルにおいて細胞配置を空間的に制御できる空間分解能（例えば、1〜5μm ）をもつ、基質上に形成された（例えば、タンパク質、細胞または二以上のタイ プの細胞の組合せにより）パターンを意味する。従って、マイクロパターン化法 を用いて、細胞-細胞相互作用を正確に操作することができる。これに対し、細 胞の「パターン化されていない」共培養物においては、細胞はランダムに分布し ている。 本明細書に用いられている通り、細胞の「島」とは、一細胞型の単一細胞、ま たは典型的には細胞群であり、これは他の細胞型の細胞により包囲されている（ 例えば、繊維芽細胞により取り囲まれた肝細胞群）。従って、境界面が形成され 、その境界面で島の周囲にある細胞は、取り囲む細胞と出会う。島は円形を成し ている必要はない。本発明では、例えば、長方形の島やその他無定形の島も使用 することができる。島の形態には関係ないが、島の細胞のうち少なくとも30%（ 好ましくは少なくとも50%、80%または90%）は、その細胞型同士の境界面から100 μm以内になければならない。従って、島が本質的に円形である場合には、直径1 ,000μmより小さい島が適当である。典型的な島は直径が30〜500μmである。 図面の簡単な説明 図1は、マイクロパターン化共培養物を生じる方法を図示したものである。 図2A〜2Dは、マイクロパターン化共培養物の免疫蛍光染色によって得られた一 連の写真である。図2Aは、サイトケラチンの免疫蛍光により検出されたマイクロ パターン化共培養物を示す。図2Bは、サイトケラチンの免疫蛍光により検出され たランダム分布共培養物を示す。図2Cは、F-アクチンの免疫蛍光により検出され たマイクロパターン化共培養物を示す。図2Dは、F-アクチンの免疫蛍光により検 出されたランダム分布共培養物を示す。 図3は、ヘテロティピック相互作用パラメーターXの決定法を図示したものであ る。 図4は、細胞集団の分離方法を図示したものである。 好ましい態様の説明 本明細書に記載する実施例は、本発明を例示するものであってこれを限定する ためのものではない。これらの実施例に用いた科学的方法の様々なパラメーター を以下に詳述し、本発明を一般的に実施するためのガイダンスとする。 これら特定の実施例において、肝細胞は繊維芽細胞と共培養される。本明細書 に記載の通り、他の細胞組合せも同様の方法で共培養することができる。これら の実験は、共培養における二細胞型のマイクロパターン化をはじめて示すもので ある。換言すれば、二つの細胞型を用いてミクロン規模の分解能をもつパターン を示すことができる。これらの実験はまた、共培養におけるヘテロティピックの 細胞-細胞接触の程度を高めることにより、パターン化されていない形態の細胞 に比べて、マイクロパターン化共培養物の細胞代謝および合成機能をアップレギ ュレートすることができる。 第I部 方法および物質 マイクロファブリケーション手法を用いてガラス基質を生物分子で修飾した。 これらの修飾基質を利用して単一細胞型またはマイクロパターン共培養物を種々 の形態にパターン化した。図1は、マイクロパターン化共培養物を作る全体プロ セスを図示したものである。基質のマイクロファブリケーション 通常のマイクロファブリケーション手法を利用して実験用基質を作った。所望 の大きさをもつクロームマスクをパターン発生器(Gyrex)上に形成し、コンタク トプリンターおよび現像液を用いて、そのパターンをクロム被覆石英プレートに 転写した。丸い、直径2インチx厚さ0.02インチの硼珪酸塩ウェーファ(Erie Scie ntific)をピラニア溶液（3:1 H₂SO₄：30%H₂O₂）で10分間洗浄後リンスし、N₂ガ ンで風乾した。次いでウェーファを60分間200℃に加熱処理して脱水した。次に 、真空チャック付きヘッドウェイスピンコーター上でディスクを陽極フォトレジ スト(OCG 820-27センチストーク)により以下のように被覆した。フォトレジスト を2秒間500rpmで分注し、6秒間750rpmでフォトレジストを被覆、30秒間4000rpm で回転させると、1μmのコーティング層が得られる（図1、工程A）。次いで予め ウェーファを5分間90℃で加熱処理して残留溶媒を除き、フィルムの応力を焼き 入れておく。ウェーファはBottom Side Mask A1igner(Karl Suss)中所望のクロ ムマスクを通して紫外光に露光し、レジスト層に潜像を作る。露光は真空度を上 げた接触下で3秒間行った。次いで露光フォトレジストを現像し、現像液中70秒 間浸して最終的に三次元のレリーフ像を作り、脱イオン化水を流しながら3回洗 浄し、2分間カスケード洗浄を行った（図1、工程B）。次に、ディスタを30分間1 20℃でハードベーキングに付し残留現像液を除いてフィルムの接着を促進した。 最後に基質を4分間250ワットの酸素ブラズマに暴露し、その後修飾される部分の 不要なレジストを除去した。ウェーファは2ヶ月までの間室温に保存した。基質 は次いで、その 後の処理を行う前に24時間酸素プズマに再暴露して、基本真空50mTorr、100ワッ ト下100mTorrのO₂加圧下で2〜4分間Plasma Day Etcherで表面修飾用の硼珪酸塩 を確実に利用できるようにした。基質の表面修飾 LomらおよびBritlandらが開発した方法と同様の実験法を用いて、基質を修飾 した（図1、工程C）(Stenger et al.，1992;Lom et al.，1993)。簡単に説明す ると、蒸留脱イオン化(DD)水で2回基質を洗浄して風乾した。新しく作った3-[(2 -ア 溶液に試料を浸しDD水200mLで2回洗浄することによって、露出したガラス面のシ ラン不動化を行った。次に、ウェーファを窒素ガスで乾燥し、10分間120℃で加 熱処理した。次いで、25℃で1時間、グルタルアルデヒドの2.5% v/v PBS(pH7.4) 溶液に浸した。基質は次いで2回新鮮PBSで洗い、25℃で、1mg/mLコラーゲンI(Du nn et al.，1991)：DD水の1：1溶液4mLに15分間浸漬した。ディスクは次いでア セトンに浸漬し、15分間バスソニケーター(Bransonic)に入れて超音波により残 留フォトレジストを除去した（図1、工程D）。次にウェーファを2回DD水で洗浄 後、一夜70%エタノールに浸漬して滅菌した（図1、工程E）。基質の表面特性 自動蛍光 水銀ランプと電源を備えたNikon Diaphot顕微鏡(Nikon)を用いてウェーファを 観察した。フォトレジストの自動蛍光（励起：550nm、発光：575nm）を用い、表 面修飾前にマイクロパターン化された基質を可視化した。超音波処理後自動蛍光 が消失していれば指定の除去が確認されたものとする。プロファイルメトリー プロファイルメトリーを行って、走査速度100μm/s、12.5μm半径のプローブ をもつDektak 3 Profilometer(Veeco Instruments)のCenter for Material Scie nce Engineering(CMSE)で表面トポロジーを特性化した。原子間力顕微鏡(AFM) 走査サイズ100μmのねじ立てモード(tapping mode)で操作する標準117μmのシ リコン板バネを備えたNanoscope 3(Digital Instruments)のMIT、CMSEにおいて 、不動化基の空間分布を特性化するため、AFMを行った。コラーゲンIの間接免疫蛍光 抗血清1滴（50μL）を含むパラフィルム上に1時間基質を倒立させることによ り、未希釈ウサギ抗ラットコラーゲンI抗血清(Biosciences)と一緒に、37℃でコ ラーゲン由来の基質をインキュベートした。基質は次いでPBSで完全に洗浄し、2 5℃の回転振とう機に30分間入れた。この洗浄工程は2回繰り返した。次に、ブロ ック液中ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)結合ロバ抗ウサギIg G(Jackson)50μL(1:20)をもつパラフィルム上にディスクを倒立させた。ブロッ ク液は、3% w/wウシ血清アルブミン、1%ロバ血清、0.04%アジ化ナトリウム、pH7 .4からなる。最後に、一夜PBSで基質を洗浄した後、蛍光顕微鏡（励起：470nm、 発光：510nm）により観察した。細胞培養 肝細胞の分離と培養 Seglen(1976)の変法により、体重180〜200グラムで2〜3ヶ月令の成体雌性ルイ スラット(Charles River)から肝細胞を取り出した。肝細胞の分離および生成の 詳細な方法はDunnら(1989)に記載されている。常法に従い、トリパンブルー排除 によって判断したところ、85%から95%の生存率で2〜3億個の細胞が分離された。 そのサイズ（直径<10μm）および形態学（非多角形または放射状）から判断した 非実質細胞は1%未満であった。培地は、10%胎児ウシ血清(FBS，JR Scientific) 、0.5U/mLインシュリン、7ng/mLグルカゴン、20ng/mL上皮増殖因子、7.5(g/mLハ イドロコーチゾン、200U/mLペニシリン、200(g/mLストレプトマイシン、50(g/mL ゲンタマイシン（「血清含有肝細胞培地」）添加ダルベッコ改変イーグル培地(D MEM，Gibco)であった。無血清培地は40(g/mL L-プロリン(Sigma)が添加されてお り、FBSがないことを除けば、同じであった(Leeら、1993)(「無血清肝細胞培地 」)。NIH 3T3-J2 培養 NIH 3T3-J2はHoward Green(Harvard Medical School)の提供による。プレコン フルエンスまで増殖した細胞を、0.01%トリプシン(ICN Biomedicals)/0.01% EDT A(Boehringer Mannheim)のPBS溶液中で5分間トリプシン化した後、25mLの培地 に再浮遊させた。約10%の細胞を新鮮組織培養フラスコに接種した。細胞は12回 を超えないプレコンフルエンシーまで継代した。細胞は、10% CO₂以外は湿潤空 気を入れた75cm²フラスコ(Corning)で培養した。培地は、10%ウシ血清(BCS，JRH Biosciences)、200U/mLペニシリン、200μg/mLストレプトマイシン添加、高グ ルコースDMEM(Gibco)からなる。修飾表面における細胞培養 ウェーファを滅菌水で洗浄し、37℃で1時間、水中0.05% w/wウシ血清アルブミ ンでインキュベートし、基質を予め非接着性タンパク質で被覆した。次に、37℃ で1.5時間、10% CO₂の外は空気の無血清培地に肝細胞を高濃度（4x10⁶/mL）に播 種した。次いで、無血清培地を4mLピペットで加えた後吸引することにより表面 を2回洗浄した。肝細胞を1.5時間再播種し4mLの無血清培地で洗浄後一夜インキ ュベートした（図1、工程F）。翌日、上記の通り3T3細胞をトリプシン化し、血 球計数器で計数後、血清含有高グルコースDMEMに1x10⁶/mLを平板培養して一昼夜 接着させた（図1、工程G）。「ランダム分布」（すなわち、パターン化されてい ない）共培養物は、均一にコラーゲンを誘導した表面に所望の数（通常25,000個 ）を播種した肝細胞と24時間後に播種した3T3からなる。免疫蛍光染色 培養体を2回2mLのPBSで洗浄し、-20℃で2分間アセトン10mLで固定透過させ、P BS 10mLで2回洗浄した。1滴の抗血清50μLを含有するパラフィルム上に基質を1 時間倒立させることにより、ウェーファ上の培養体を37℃で未希釈ウサギ抗ラッ ト頭蓋骨（pan）サイトケラチン抗血清(Accurate Chemical)と一緒にインキュベ ートした。その後基質を洗浄し、第二抗体とインキュベートした後洗浄した（コ ラーゲンの間接免疫蛍光用として上記したように）。第二抗体もF-アクチンを蛍 光標識するためのローダミン-ファロイジン(1:100、Molecular Probes)を含んで いる。水銀ランブと電源(Nikon)、遮光システム(Uniblitz D122)、CCDカメラ（ オプティトロニクスCCD V1470）を備えたNikon Diaphot顕微鏡(Nikon)およびデ ジタル画像捕捉用のMetaMorph Image Analysis System(Universal Imaging)を用 いて、試料を観察し記録した。画像分析 ヘテロティピック相互作用の程度を定量的に記載するため、本発明者らは異な る細胞型(X)の隣接細胞に接触している細胞周辺のフラクションを測定した。例 えば、単一細胞島に対してはX=1であるのに対し、肝細胞周辺の細胞はX=0である 。上記のように画像を捕捉してMetaMorph Image Analysis Systemにより分析し た。各フィールドから細胞をサンプリングして手作業の概算により各細胞の周辺 長さPを得た。その後、ヘテロティピックの細胞-細胞接触の範囲Fを同様に図示 した。各細胞にはその特性X=F/Pを与え、これらのX値を各条件毎20〜50個の細胞 について平均した。集団分布については、各ｘ値を適当な「bin」に割り当て、 ヒストグラムプロットを行った。結果 以下に述べるように、本発明者らは、細胞の不存在下における基質の表面特性 研究を行って、まず空間的に定義された表面化学反応性を確認した。次いで以下 に記載する通り、単一細胞培養物と二種の細胞型を含む共培養物をマイクロパタ ーン化する能力を示した。表面特性 プロファイルメトリーとフォトレジストの自動蛍光性を用いて、フォトレジス トパターンのトポロジー的および空間的均一性を調べた。特定されたスピンコー トパラメーターを用いると、フォトレジスト被覆層は約1.35μmの厚さになるこ とがわかった。さらに、フォトレジストの厚さは各走査内では<5%の変動であっ た。フォトレジストの自動蛍光を利用して、処理の前および処理中のフォトレジ ストの結合性と分布を調べた。厚さ〜1μmの変動に相当する自動蛍光領域が検出 された。暗いレーンに汚染蛍光がないことは、現像中に露光されたフォトレジス トが完全かつ均一に除去されたことを示す。 硼珪酸塩の局所的アミノシラン(AS)修飾を確認するため、基質をASに暴露した 後フォトレジストを除去した。アミノシラン修飾を行うと、水と表面との三相接 触角が変わることが既に報告されている(Lom et al.，1993)。従って、水一滴の 周辺には親水性を変更するパターンに顕微鏡的波形が生じなければならない。こ れらの波形が観察され、20μm AS修飾レーンは、隣接する50μm未修飾レーンに 対して区別できる湿潤性を示す。従って、元の20μm/50μm縞模様フォトレジス トパ ターンのパターンで、露光ガラスの選択的AS修飾が確認され、それは、フォトレ ジストが下のガラスをAS修飾する「化学マスク」として作用する能力を示してい る。パターン化AS表面のグルタルアルデヒド誘導化によるコラーゲン固定化も特性化 された 推定コラーゲン固定化領域の間接免疫蛍光染色結果を示す蛍光顕微鏡写真を得 た。コラーゲン局在領域に対応する蛍光領域を、ミクロンレベルの空間分解能で 均一にパターン化した。さらに、蛍光パターンは、アンダーカットの証拠なしで 、最初のフォトレジストパターンに対応した。さらに重要なことは、アセトンお よび70%エタノールでの処理にも拘わらず、コラーゲンが抗体結合に対して十分 な免疫活性を保持していたことである。 コラーゲン誘導表面もAFMにより分析して未修飾および修飾硼珪酸塩間のトポ ロジーにおける差異を調べた。幅20μmの修飾領域は、未修飾の50μmレーンの上 に平均高さ4nmを示すことがわかった。これらのデータは、AS上のコラーゲン単 層の数を概算するのに利用することができる。共培養物のマイクロパターン化 前記実験は、固定化コラーゲンパターンを生じるフォトレジストパターンを利 用できる再現性を示すものである。以下の実験は、これらの手法を分子のマイク ロパターン化に応用できることを示す。第一細胞型の肝細胞を播種すると、コラ ーゲン誘導領域の局在化と正常な多角形モルフォロジーが生じた。細胞の形態は 、ガラス上のコラーゲンの位置によって決まり、それは次にマイクロファブリケ ーション法におけるクロムマスクの選択による制御された。さらに、肝細胞は、 修飾ガラスのコラーゲンパターンの端部と同じ形になった。浮遊液中の典型的な 肝細胞の直径は20μmであるのに対し、接着・未制約被覆の際には、細胞の直径 は30〜40μmまで増える。従って、20μmのラインに接着後、細胞は被覆の際、軸 方向へ伸びることが観察された。同様の細胞骨格の変化は、より大きいパターン の角部あるいは円形パターンの周辺部細胞で観察された。 この手法の多様性は位相差顕微鏡写真で見られた。血清含有培地に繊維芽細胞 を添加することによって、20μmおよび200μmの最初の肝細胞パターンを変更し た 。繊維芽細胞は、パターン化された基質の未修飾（ガラス）領域だけを局在化さ せて、20μm/50μmおよび200μm/500μmのマイクロパターン化共培養物を生じる ことが観察された。使用した格子パターンはその説明的可能性に対して選択され たものである。しかしながら、原則として、共培養物はどのような所望の形態で も達成することができる。従って、本発明者らのアプローチは、単一細胞培養の マイクロパターン化にも二種の異なる細胞型の共培養物のマイクロパターン化に も明らかに適用できるものである。 第一細胞型の被覆は無視できる程度ではあるがコラーゲン誘導体の残留サイト を生じた。従って、本実施例における第二細胞型の接着は未修飾ガラスかパター ン第一細胞型の表面のいずれか一方に制限されるべきである。本発明者らは、4 時間のインキュベーション後でさえ接着を示さなかった肝細胞の単層に繊維芽細 胞のプレーティング実験を行うことにより、3T3繊維芽細胞が肝細胞表面には実 質的に接着しないと判断した（データ示さず）。さらに、細胞をガラスカバース リップの血清含有培地中に播種することによって、ガラスに対する繊維芽細胞の 接着被覆が特徴づけられ、細胞は4時間以内に高い効率で接着被覆されることが 観察された（データ示さず）。 間接免疫蛍光を利用して、細胞集団を選択的に染色し、異なる細胞型間を視覚 的に識別する助けとした。本発明者らは、サイトケラチンの存在（図2A，2B）、 F-アクチンに対し、肝細胞にはあるが間葉細胞にはない中間体フィラメント（図 2C、2D）、全ほ乳類細胞に存在する細胞骨格タンパタ質を比較した。本発明者ら はまた、両方の細胞集団の同じ接着細胞数をもつ「ランダム分布」共培養物と比 べて、200μm/500μmのパターン化共培養の比較も行った。ホモティピック肝細 胞相互作用のレベルは、図2A、200μmの縞の細胞対図2B、細胞のランダム分布に おいて顕著であった。200μm縞の肝細胞は、元々ホモティピック接触であったの に対し、図2Bの肝細胞はヘテロティピック接触のほうが優勢であった。さらに、 パターン化細胞集団のヘテロティピック相互作用分布は、ランダム共培養物につ いては非常に減少することが観察され、肝細胞は単一細胞島、ダブレット、トリ プレットに存在することが示された（図2B）。 ヘテロティピック接触の程度を定量的に説明するため、本発明者らは画像分析 と周辺記録を用いて、前記のように、Xとしてヘテロティピック細胞接触に関与 する断片細胞周辺を明らかにした。図3は、デジタルで得られた位相顕微鏡写真 において、肝細胞に相当するヘテロティピック接触のハイライト境界面で試料周 辺記録（黒い線）を図示したものである。目視観察された通り、この特定パター ン（200μm/500μm）にはほとんどヘテロティピッタ接触がなかった。従って、 大多数の細胞がX=0であることから、集団全体の平均X値は小さい。本発明者らは 、細胞集団に対するXの平均値をランダム分布培養物の0.7からマイクロパターン 化を用いて0.8に変える能力を実証した。さらに、異なるパターン（20/50）の場 合Xの平均値は異なってくる（X=0.55）。平均値からのXの変動も、規定のパター ン（20/50）に対比した場合のランダム分布培養物について調べた。顕微鏡観察 によれば、ランダム分布培養の肝細胞は異種の微細環境を体験する。すなわち、 与えられた培養物中には、単一の肝細胞、ダブレットおよび多細胞凝集体をが観 察できる。Xの平均値に比較的小さい変動を示すマイクロパターン(20/50および5 0/50)に比べた場合、集団分布の定量分析は、ランダム分布培養におけるXの変動 性を裏付けている。従って、細胞の微細環境は、量および変動性の両方において 、各サブ集団の細胞数を変えることなく変動させることができた。検討 細胞の局所的播種濃度を細胞数と独立に変えることができないこと、並びに細 胞集団全体の細胞接触の分布における固有の変化率のため、ほとんどの通常共培 養系には制約があった。本発明者らは、上記のように、生物分子にリンクしたア ミノシランにより、また細胞培養培地の血清量を操作することによって、通常の 表面修飾ストラテジーから二種の異なる細胞型をマイクロパターン化する多様な 手法を開発した。この共培養法によれば、接着細胞数を変えることなく、初期の 細胞微細環境を操作することができる。具体的に述べると、本発明者らは、最初 の細胞-細胞接触の程度および型の両方を制御することができた。ホモティピッ クおよびヘテロティピック相互作用の違いは実証された。これは、細胞-表面受 容体、局部的に分泌された細胞外マトリックス、および可溶性因子の局所濃度に 対する影響(in exposure to)の変更を可能にするものである。 この特定の実施例に用いたパターン化方法はいくつかの点で常法とは違ってい る。例えば、ASはフォトレジストパターン化後であるがフォトレジストを剥離す る前に被覆した。これは、フォトレジスト被覆前にASを被覆するLomら(1993)と は異なる。これらの系において、西洋ワサビペルオキシダーゼのような生物分子 とインキュベーションを行うと、8M尿素中非特異的に結合したタンパク質の変性 後特異的になる二つの領域に吸着を生じる。コラーゲンのような多くのタンパク 質は、不可逆的な吸着を受ける(Deme et al.，1986)ので、未修飾領域から脱着 しない。このフォトレジストは、表面修飾工程の間保持され、コラーゲンの沈着 後に除去された。これは、通常フォトレジストに害を与えない水中でASを沈着さ せることにより行った。ASは水溶液中でオリゴマー化することが知られている（ Arkles et al.，1991）が、少なくとも数時間は安定である。この方法で、本発 明者らは、非特異的タンパク質吸着から硼珪酸塩をマスクするためにフォトレジ ストを用いたので、タンパク質の変性や脱着にも、またフォトレジストパターン 化前のAS沈着にも依存する必要がなかった。 原子間力顕微鏡を利用して固定化コラーゲン層の深さを概算した。修飾領域は 未修飾領域の上〜4nmであった。AS分子は末端から末端まで1.2nmの高さであるこ とがわかった（Lom et al.，1993）。らせん形態において、コラーゲンIフィブ リルは長さ300nm、直径1.2nmである（Darnell et al.，1990）。これらのデータ は、「サイド(side-on)」に詰まったフィブリルの単層あたり上限0.1μg/cm²に 相当する長さ方向に形成されたコラーゲンフィブリルの1〜2層があることを示唆 している(Deyme et al.，1986)。従って、達成可能なコラーゲン表面濃度は、吸 着されたコラーゲン系で観察された大きさのオーダー内である(0.37μg/cm²)(De yme et al，1986)。もう一つ考えられるのはアセトンおよびエタノールに曝露後 の生物分子の生物活性である。本発明者らは、細胞接着・被覆により、ならびに 間接免疫蛍光の抗体結合によりコラーゲンIの生物活性が保持されていることを 示した。他にもラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIVおよびウシ血清アル ブミンの機能保存が示されている（Lom et al.，1993）。アセトン感受性のタン パタ質はフォトレジスト剥離手順に適応するため有利である。 この特定の例では、ウシ血清アルブミンを表面に吸着させて非特異的接着を抑 制することにより、固定化コラーゲンに対する選択的な細胞接着を高めた。これ は、肝細胞、神経芽細胞(Lom et al.，1993;Miyamoto et al.，1993;Bhatia et al，1994)および多くの抗体-抗原相互作用に有効であることを示している。これ に対し、フッ素化エチレンブロピレンフィルムの（モノ）アミノシランに対する アルブミン吸着は、大動脈上皮細胞の接着を仲介する逆の効果をもっていること が示された（Ranieri et al.，1993）。従って、他の細胞型を用いる場合、この 特定の方法についてのこの点は最適な結果となるよう変更することができる。 本発明者らは、一次ラット肝細胞および3T3繊維芽細胞を用いて、培養中の細 胞集団の割合は保持しながら、最初のヘテロティピック(X)相互作用を広範に変 更する能力を示した。従って、共培養相互作用は今や全く新しい次元で操作する ことができる。さらに、マイクロパターン化共培養物は、ランダム共培養にくら べ、ヘテロティピック接触(X)のレベルにおいて変動が少ないことがわかった。 従って、マイクロパターン化共培養物において巨視的に生化学量を測定すること は、パターン化されていない共培養物でのそれに比べて、特異的な細胞-細胞相 互作用をさらに良く表すことになる。 一般に、このマイクロパターン化共培養方法は、自己集合単層のような生物分 子をパターン化する他の手法にも応用することができる。さらに、二種の異なる 細胞特異性生物分子をパターン化することにより、三相共培養を行うこともでき る。要約 本発明は、培養における少なくとも二種の細胞型のホモティピック対ヘテロテ ィピック相互作用を制御する簡単で多様な方法を提供する。各サブ集団において 細胞数を変更することなくXを変更できるので、与えられた培養における細胞型 の割合を変更することができる。 第II部 以下の実施例は、本発明の方法を用いてマイクロパターン化共培養における細 胞の代謝および合成機能（例えば、肝特異的機能）をアップレギュレートするこ とができる。物質と方法 マイクロパターン形成用基質は基本的に上記と同様にして作った。肝細胞の分離と培養 Seglen(1976)の変法により、体重180〜200グラムで2〜3ヶ月令の成体雌性ルイ スラット(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)から肝細胞を取り出し た。肝細胞の分離および生成の詳細な方法はDunnら(FASEB，1989)に記載されて いる。常法に従い、トリパンブルー排除によって判断したところ、85%から95%の 生存率で2〜3億個の細胞が分離された。そのサイズ（直径<10μm）および形態学 （非多角形または放射状）から判断した非実質細胞は1%未満であった。培地は、 10%胎児ウシ血清(FBS，Sigma，St．Lois，MO)、0.5U/mLインシュリン、7ng/mLグ ルカゴン、20ng/mL上皮増殖因子、7.5mg/mLハイドロコーチゾン、200U/mLペニシ リン、200mg/mLストレプトマイシン（「血清含有肝細胞培地」）添加ダルベッコ 改変イーグル培地(DMEM，Gibco)であった。無血清培地は、FBSがないことを除け ば、同じであった。NI H3T3-J2 培養 NIH 3T3-J2細胞はHoward Green(Harvard Medical School)により提供された。 プレコンフルエンスまで増殖した細胞を、0.01%トリブシン(ICN Biomedicals，C osta Mesa，CA)/0.01% EDTA(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)のPBS溶 液中で5分間トリプシン化して継代した後、希釈し、新鮮組織培養フラスコに接 種した。細胞は10回を超えないプレコンフルエンシーまで継代した。細胞は、10 %CO₂以外は湿潤空気を入れた175cm²フラスコ(Fisher，Springfield，NJ)で培養 した。培地は、10%ウシ血清(BCS，JRH Biosciences，Lenaxa，KS)、200U/mLペニ シリン、200μg/mLストレプトマイシン添加、高グルコースDMEM(Gibco)からなる （「繊維芽細胞培地」）。ある場合には、培地中で2時間（使用直前に戻す）10m g/mLのマイトマイシンCとインキュベーションした後培地で3回洗浄することによ り、DNA分析用として増殖抑制細胞を得た。マイトマイシンC処理繊維芽細胞は、 培養10日間にわたって一定のDNAレベルを示すことがわかった。これはこれらの 条件下で繊維芽細胞の増殖がないことを確認するものである。修飾表面における細胞培養 室温で水中70%エタノールに2時間浸漬してウェーファを滅菌した。次に、ウェ ーファを滅菌水で洗浄し、37℃で1時間、水中0.05% w/wウシ血清アルブミン(BSA )でインキュベートし、基質を予め非接着性タンパク質で被覆した。次に、基質 を無菌P-60組織培養皿(Corning，Corning，NY)において、滅菌水で洗浄後、無血 清培地で最終洗浄を行った。次に、37℃で1.5時間、10% CO₂の外は空気の無血清 培地に肝細胞を高濃度（1〜2x10⁶/mL）に播種した後無血清培地で2回洗浄した。 このプロセスを2回繰り返し、特に大きいサイズのパターンで肝細胞のコンフル エンスを確認した。翌日、上記の通り3T3細胞をトリプシン化し、血球計数器で 計数後、血清含有高グルコースDMEMの2mLに3.75x10⁵/mLを平板培養して一昼夜接 着させた。次に、2mLの肝細胞培養培地（上記）を毎日サンプリングし補充した 。実験デザイン マスクの大きさを変えることによって、マイクロパターン化共培養物の空間形 態を操作した。クロムマスクの透明円形領域（すなわち「ホール」）は、ガラス 基質の誘導された最終的に肝細胞接着性領域に対応する。変動するマイクロパタ ーン化形態を超えて同じ肝細胞数を達成するため、ホール直径と中心から中心ま での空間に変化があるにも拘わらず、全「ホール」の総表面積を全マスクにわた り一定に保った。直径17800μmの単一ユニットからなる最大のホールを除いて、 全列を六角形に詰めた。従って、パターンの大きさは以下の通り（ホール直径（ ミクロンで））変化した。中心から中心までの空間（ミクロンで）：36，90;100 ，250;490，1229;6800，16900；および直径17800μmの単一ユニット、ここに、 直径2インチのガラス基質で得られた総肝細胞接着性領域は全例において同一に なるはずである。分析アッセイ 毎日培地試料を集めて、後に尿素量およびアルブミン量を測定するため4℃で 保存した。尿素合成は、市販のキット（Sigma Chemical Co.，kit No．535-A） を使って測定した。酸性加熱下でジアセチルモノオキシムと反応させると、540n mで検出される色変化を生じる。アルブミン量は、前記の通り(Dunn et al，1991 )酵素結合免疫吸着剤検定法(ELISA)により測定した。ラットアルブミンと抗ラッ トアルブミンはCappel Laboratories(Cochranville，PA)から購入した。 DNA分析はMacDonaldおよびPittの方法(1991)を変えて行った。PBSで洗浄する ことにより、細胞を培養の指定時間に死滅させ、ウェーファの除去およびPBSへ の浸 漬を行って基質下の死細胞を除去した。次いでクレーブスリンゲル緩衝液中、37 ℃で30分間、0.05%(w/v)タイプ4コラーゲナーゼ(Sigma)とインキュベーションし て下の基質から細胞層をはがす。次に、ラバーポリスマンで細胞を除去し、細胞 /コラーゲナーゼ混合物を除去した。基質をPBSで洗浄し、これは上記溶液と合わ せた。得られた溶液をコラーゲナーゼ中和用の肝細胞培地等量と合わせ、1000rp mで5分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞は2mLのPBSに再浮遊させた。次いで 試料を1ヶ月間までの間-80℃に凍結した。 分析に際しては、凍結試料を37℃の水浴で急速に戻して膜破壊を促進した。凍 結解凍手順は、細胞内容を得るために細胞膜を破壊する有効な方法として確立さ れている(Rago et al，1990)。完全な細胞溶解を確実にするには、次にプローブ ソニケーター(Branson)を用いて4℃で10分間、試料を超音波処理する。試料をボ ルテックス処理し、試料20mlを96ウエルプレート(NUNC，Denmark)に入れた。同 様に、PBS中100〜0mg/mLのDNA標準液(二本鎖ウシ胸腺DNA、Sigma)20mLをボルテ ックス処理して各プレートに入れた。この容量を、100ml塩/染料緩衝液(2M NaCl ，10mM Tris，1mM EDTA，1.6mM Hoechst 33258(Molecular Probes、Eugene，OR) )と合わせた。試料および標準液を暗所室温で30分間、塩/染料緩衝液とインキュ ベートした後、蛍光分光光度計(Millipore，Bedford，MA)により励起360nm、1/2 バンド幅40nm、発光460nm、1/2バンド幅40nmで読み取りを行った。DNA 量の分析 増殖抑制繊維芽細胞をもつ培養中の総DNA量を以下のように測定した。増殖抑 制繊維芽細胞にマイトマイシンCを利用した（上記の通り）。血球計数器で1.5x1 0⁶の繊維芽細胞を数えてマイクロパターン化肝細胞培養液に加えた。繊維芽細胞 播種6時間後か、または、共培養9日後に重複培養をやめ、上記のように総DNAを 測定した。免疫組織化学 培養物をPBSで2回洗浄し、PBS中4%のパラホルムアルデヒドで30分間固定した 後、PBS中0.1%トリトンで10分間透過させた。50mM Tris-HCl中0.1%アビジンおよ び0.01%アビジンとそれぞれ20分間インキュベーションすることにより、肝組織 の内因性アビジン結合活性をブロックした(Biotin Blocking System X590，DAKO ，Ca rpinteria，CA)。内因性ペルオキシダーゼ活性は、過酸化水素およびアジ化ナト リウム溶液と30分間インキュベーションすることによりブロックした(Peroxidas e Blocking Reagent，DAKO)。基質としての3-アミノ-9-エチルカルバゾールの存 在下、ウサギIgGに対するビオチン化第二抗体、ストレプトアビジン標識西洋ワ サビペルオキシダーセおよび過酸化水素の使用による西洋ワサビペルオキシダー ゼ可視化を伴う、ウサギ抗ラットアルブミン抗体(Cappell)を利用した(Rabbit P rimary Universal Peroxidase Kit #K684，DAKO)。機能的胆管染色 培養物を3回培地で洗浄し、LeCluyseら(1994)の変法により、2μMのカルボキ シフルオレセインジアセテート(Molecular Probes)と5時間インキュベートした 。その後、培養物を再び3回洗浄し、顕微鏡で調べた。水銀ランプを備え、470nm 励起光で励起し、510nmで発光するNikon Diaphotでデジタル画像を得た。画像の取得と分析 CCDカメラ（オプトロニクスCCD V1470）を備えたNikon Diaphot顕微鏡(Nikon) および、デジタル画像捕捉用のMetaMorph Image Analysis System(Universal Im aging，Westchester，PA)を用いて、試料を観察し記録した。免疫染色画像の画 像分析は、MetaMorphの限界機能および明視野画像との視覚的相関を利用して行 った。統計およびデータ分析 実験は、各条件について2組または3組の培養プレートで2回から3回繰り返して 行った。2つの2組ウエルは生物化学分析用に測定した。複数回の実験で同じ傾向 が見られるがそれぞれの動物分離で絶対産生率が変動する場合には、1つの代表 実験を示す。各データポイントは、-3皿の平均値を示す。統計的有意はTurkey H SD(HOnest Significant Difference)Post-Hoc分析p<0.05をもつStatistica(Stat soft)のワンウェイANOVA(変動分析)を用いて測定した。結果 マイクロパターン化共培養物は、ヘテロティピック境界面であるが、肝細胞お よび繊維芽細胞接着の両方に供される同一の表面積（すなわち、細胞数）に変形 (Variation)して生成した。2個の生物化学マーカー（アルブミンおよび尿素合成 ）、免疫組織化学（分子内アルブミン染色）、頂表面を通る輸送（胆管分泌）お よびDNA量を使う肝特異的機能の発現について、最大のヘテロティピック接触（ 最小の島）から最小のヘテロティピック接触（単一島）まで5個の異なる形態を 特性化した。これらの結果は、ヘテロティピック相互作用の増加が肝特異的機能 の増加に相関していることを示す。初期細胞分布の特性化 5つのマイクロパターンをすべて、接着肝細胞と同数に相当すると思われる肝 細胞接着性表面積(2.5cm²)と同様のレベルになるようデザインした。空間形態の 変化を利用して、5.6cmから2800cmまで肝細胞島の全周辺を違わせた。それは、 繊維芽細胞を添加する際、全肝細胞境界面の変形に対応していなければならない 。マイクロパターンは、直径36μmの多数の単一肝細胞島から直径17.8mmの単一 島までの範囲であった(100μm、490μmおよび6800μmの島も検出された)。マイ クロパターン化肝細胞は、全初期肝細胞島周辺の理論値および計測値間にぴった り一致する5条件すべてにおいて、コラーゲン修飾領域と優先的に接着すること がわかった（データ示さず）。 種々の空間形態を超えて接着した肝細胞の同様な数を確認するため、本発明者 らは、肝細胞播種24時間後（すなわち、繊維芽細胞の播種前）にマイクロパター ン化肝細胞培養液のDNA量を測定した。最小島（直径36μm）マイクロパターンで DNA量が増加したことを除いて、全培養物は統計的に類似したDNAレベル(8±1.8 μg)をもっていた。 最小島は単一細胞の島を形成するようデザインされた。これら島の大きさ（直 径36μm）は、1000μm²の固定化コラーゲンIにおいて実験的に定めた単一被覆肝 細胞の投影表面積と対応するように選択された（データ示さず）。しかしながら 、分離されたラット肝細胞は約20μmの直径をもっており、濃縮細胞浮遊液を播 種する際、個々の島に1個より多い肝細胞を保持させることができる。さらに、 肝細胞は、低い播種濃度で分裂指数を増加することがわかっている(Nakamura et al.，1983)。そのことは、この条件下肝細胞DNAの増加に貢献した可能性がある 。増加した倍数性にくらべて増加した細胞数を区別するため、細胞播種の開始後 6時間で、36μmの島1000個の画像分析を終了した。この分析によれば、例のうち 57%にお いて細胞は1個よりも多く、島あたり平均1.9±1.2個の細胞であった。従って、 増加したDNAは、最小パターンで増加した肝細胞数によるものであると結論した 。 3T3-J2繊維芽細胞をマイクロパターン化肝細胞に添加したところ、条件を交差 した繊維芽細胞および肝細胞の同様な数であるにも拘わらず、最初のヘテロティ ピック境界面において著しく変化したマイクロパターン化共培養物が生じた。5 形態(36μm、100μm、480μmおよび6800μmの島)のうち4つの位相差顕微鏡写真 により、肝細胞の微細環境に有意な変化を示し、これはマイクロパターンの大き さを変えることによって達成された。肝特異的機能の生物化学分析 肝特異的機能における局所肝細胞環境の調節効果を示すため、分化機能の標識 としてアルブミン分泌と尿素合成を測定した。これら二つのマーカーは、繊維芽 細胞の存在下および不存在下、マイクロパターンの大きさの関数として測定した 。繊維芽細胞だけの培養物では、繊維芽細胞によるアルブミン分泌と尿素合成は 検出できないことがわかった。従って、培養物におけるこれらマーカーの変化は 、肝細胞代謝の差によるものであった。 5つの異なる空間形態のアルブミン分泌を純粋肝細胞培養物について測定した 。 最初の値8.8+0.9μg/日から検出不可能なレベルまで、全部で5つの条件(36μm、 100μm、6800μmおよび17,800μmの島)について肝特異的機能の急速な低下を検 出した。 本発明者らは、繊維芽細胞を添加した、同じ5つのマイクロパターンについて アルブミン分泌も測定した。10μg/日より少ない量から34μg/日より多い量まで 全形態において培養の時間を超えて、アルブミン合成は増加した。これは繊維芽 細胞との共培養により肝特異的機能がアップレギュレートしたことを示している 。これらのマイクロパターン化共培養物は、最小の肝細胞島大きさ（36μm）で 生じる最高レベルおよび単一の大きい肝細胞島(17.8mm)で起こる最小レベルの初 期ヘテロティピック接触について減少量を示した。高レベルのヘテロティピック 接触をもつより小さい島は、培養5日後、より大きい島(より少ないヘテロティピ ック接触)よりもさらに大きいアルブミン分泌を示した。アップレギュレーショ ンには以下二つの基本パターンが観察された。(1)3個の最小島形態における同様 レベル のアルブミン分泌に対する劇的なアップレギュレーション（初期レベルの19〜26 倍）、および(2)二個のより大きい島形態における比較的控えめなアップレギュ レーション(〜7倍)。従って、初期の細胞微細環境を調節することにより、特定 のパターン形態でアルブミン産生での3倍増加が達成された。 マイクロパターン化共培養物における尿素合成分析により、同様の定量結果が 明らかとなった。尿素合成は、培養を通じ一定であるか、または、〜100μg/日 より低いほうから160μg/日まで増加するかであった。これは、繊維芽細胞との 共培養により他の肝特異的機能のアップレギュレーションを示している。さらに 、分化機能のこのマーカーを用いて、以下二つのアップレギュレーションパター ンが観察された。(1)三つの最小島形態において同様レベルまで尿素合成のアッ プレギュレーション(2倍までの増加)、および(2)二つのより大きい島形態におい て相対的にほとんどアップレギュレーションなし。従って、初期細胞の微細環境 調節により、特定のパターン形態で尿素合成産生の2倍増加が達成された。星印 は、変動のTurkey post-hoc分析において、p<0.05を示す。肝細胞のインサイチュー機能：分子内アルブミンの免疫染色 種々のマイクロパターン化共培養物により生じる肝特異的機能に観察されたバ リエーションをさらに調べるため、本発明者らは分子内アルブミンの免疫染色に よるインサイチュー肝細胞表現型を検討した。具体的に述べると、それは一代表 パターンである490μmの肝細胞島(2日目および6日目)のヘテロティピッタ境界面 に関係しているので、本発明者らはまず、アルブミン染色の分布に注目した。さ らに、分化に及ぼすホモティピック効果とヘテロティピック接触境界面変更から 生じる効果とを区別するため、本発明者らは、2日目および6日目にマイクロパタ ーン化純粋肝細胞培養物に免疫染色を行った。この結果によれば、分離48時間後 に培養肝細胞だけが分子内アルブミンのために均一に染色した。タンパク質レベ ルは日単位で徐々に減少した。これに対し、マイクロパターン化共培養物はさら に複雑な挙動を示した。共培養物もまた分子内アルブミンのために最初均一な染 色を示した。しかしながら、6日目以降はヘテロティピック境界面に近い肝細胞 が高濃度の分子内アルブミンのために染色したのに対し、ヘテロティピック境界 面から遠い肝細胞(3〜4細胞より少ない)中のタンパク質レベルは、純粋な肝細胞 培 養体におけるように減少を続けた。この強い染色の「リング」が、弱く染色され た領域から肝細胞または繊維芽細胞が剥落したのとは対照的に、肝細胞の分子内 アルブミン量の変動によるものであることを確認するため、これら培養物の位相 差顕微鏡検定を行った。肝細胞島の周辺に繊維芽細胞、肝細胞島の中央に分子構 造が存在することが明らかになった。490μmのマイクロパターン化共培養物を横 断して観察された強い染色のこの周辺「リング」は再現可能であった。 免疫染色パターンと、培地に分泌された生成物の生物化学分析によって本発明 者らが観察したバリエーションとを相関させるため、本発明者らは、比較的小さ い(100μm)と大きい(6800μm)マイクロパターン化共培養物の高濃度分子内アル ブミンの分布も調べた。これらの顕微鏡写真は、小さい島(最初の島サイズ100μ m)では均一な強い染色、中間サイズの島(最初のサイズ490μm)では輪郭のはっき りした〜120μmのリング、そして大きい島(最初のサイズ6800μm)では輪郭のは っきりした〜380μmのリングを示し、分化した肝細胞の表現型とヘテロティピッ ク境界面からの距離間には相関がないことを示している。肝細胞のインサイチュー機能：胆管分泌 肝特異的機能のもう一つのインサイチューマーカーは、肝細胞間の機能的胆小 管の形成である。カルボキシフルオレセインジアセテート(CFDA)を肝細胞に取り 込み、分子内エステラーゼで開裂し、正常な胆汁輸送の存在下、肝細胞の頂膜か ら分泌する。染料を正常胆汁で輸送することならびに小管と接する密着結合ドメ インの機能的結合の存在によって、肝細胞の間に肉眼で見える蛍光性胆管構造の 光が生じる。肝特異的機能のこのマーカーを調べるため、アルブミンおよび尿素 産生により測定したように、本発明者らは二つのパターンをプローブした。一つ は高度に機能する共培養物からのパターンであり(490μmの円)、一つはほとんど 機能しないグループからのものである(17800μmの円)。二つの培養体の位相差顕 微鏡写真を作った。本発明者らは、490μmのパターンが特に島周辺に機能性胆小 管を発現したのに対し、17800μmの島には蛍光胆管染色が観察されなかったこと を見出した。検討 本実験セットにおいて、本発明者らは、同一の分子成分を使用したにも拘わら ず、最初のヘテロティピック細胞-細胞相互作用を制御することにより肝特異的 組織機能を調節することができることを示した。さらに、肝細胞表現型における 空間的不均一性を誘導することによって、分子微細環境の機能として集団組織性 のこうした相違が起こることが測定された。ヘテロティピック境界面に隣接する 肝細胞には肝特異的機能レベルにおいて相対的な増加があった。従って、最大初 期境界面をもつ空間形態は優秀な機能を示した。分子の微細環境は肝特異的機能を調節する 肝特異的機能が最初の細胞-細胞相互作用におけるバリエーションによって制 御できるという証拠は、代謝(尿素合成)、合成機能(アルブミン分泌および細胞 質量)および頂輸送(胆汁分泌)のマーカーで評価した、顕著なヘテロティピック 共培養物(直径36μmの最小島)と顕著なホモティピック共培養物(直径17800μmの 最大島)との間の機能的な差に見られる。これらの細胞微細環境は以下のように 肝特異的機能を有意に変更した。尿素合成、アルブミン分泌、分子内アルブミン 染色および効果的な胆汁分泌において、相対的に減少して相関する肝細胞の島サ イズを増加する。最初の直径が36、100および490μmの小さい肝細胞島は、アル ブミン分泌において3倍の安定状態増加を示し、6800および17800μmをこえる島 の尿素合成では2倍の安定状態増加を示した。同様に、もっと小さいパターン(最 初の直径490μm)は、肝細胞間にある胆小管構造内の蛍光化合物の蓄積によって 測定されたものとして機能的胆汁分泌を示すのに対し、もっと大きい島(最初の 直径17,800μm)では、焦点の蛍光について何の証拠もなく、機能的胆汁分泌は低 下した。肝細胞間に蛍光胆管構造が存在することは、LeCluyseら(1994)により電 子顕微鏡分析で観察された胆管構造に関連づけられた。蛍光胆管構造の不存在は 、(1)頂ドメインを横切る低分泌率、(2)頂膜の境界における密着結合機能の不存 在または欠如、または(3)肝細胞による染料取り込みの減少、のいずれかに起因 するものであった。17800μmパターンにおける蛍光胆管構造の欠如は、そのよう なある機能の欠損を示している。従って、より小さい島共培養物の肝細胞は、改 善された胆管輸送ならびに、初期細胞微細環境の変更により他の肝特異的機能が 相対的に改善されている(もっと大きい島の共培養物に比べて)。 集団組織機能（分泌アルブミンおよび尿素）が初期細胞微細環境によって調節 されると結論するにあたり、肝細胞数を測定して、これら肝特異的マーカーの変 化が肝細胞機能のレベル変化によるものであることを確認した(細胞分割におけ る相違とは異なり)。機能のアップレギュレーションに比べた場合の肝細胞分割 の相対的貢献度を調べるため、繊維芽細胞の増殖を抑制し共培養物中の総DNAを 測定した。従って、総DNAの変化は肝細胞のみに起因すると考えられる。共培養6 時間目に共培養物の総DNAを測定し、共培養9日目にDNA量と比較した。この分析 によれば、9日を超える共培養で総DNAの有意な増加は起こらなかった。これは、 肝機能の増加が肝細胞集団の顕著な増加よりもむしろ合成のアップレギュレーシ ョンによるものであることを示している(データ示さず)。これらのデータは、種 々の共培養形態における最小肝細胞分割の報告とよく相関している(Guguen-Guil louzo，1986;Kuri-Harcuch and Mendoza-Figuera，1989;Donato et al，1990)。 さらに、この結果はもっと大きいマイクロパターン(直径490ミクロンの島および これ以上の島)の目視観察ともよく相関した。大きいマイクロパターンでは、肝 細胞島のサイズは培養の間比較的一定であることが観察されており、これは、有 意な細胞分割がないことを示している。総合すると、これらのデータは、培養形 態間の肝機能における変動が、肝細胞の分割とは対照的に、主として肝アップレ ギュレーションの相対レベルによるものであることを示す。 集団組織機能がヘテロティピック境界面における細胞-細胞相互作用のバリエ ーションによって調節されるという結論は、同様な初期肝細胞数を確認させ、分 泌生成物の変化が、初期肝細胞数の違いよりもむしろ、肝特異的機能のアップレ ギュレーションによるものであることを確認させるに至った。5形態すべてにお ける初期肝細胞総DNAの比較により、これが有効な概算(8±1.8μg DNA)であるこ とを示している。2倍に上昇したDNAレベルをもつことが判明した最小(36μm)島 はおそらく例外である。このことは、1個の被覆されていない肝細胞(直径20μm) より多い肝細胞の、36μmの島に接着する潜在能力によるのかもしれない。いず れにしても、以上の検討により、最大の初期ヘテロティピッタ境界面から生じる 肝特異的機能の持続性増加傾向は、依然として矛盾しない首尾一貫した知見のま まである。 上記実験は、全条件において繊維芽細胞専用の同一表面積で行われた。これに よって、細胞数の差およびその結果としての潜在的な信号因子（培地中の体液因 子のごとき）の濃度変動なしに、局所の細胞環境を隔離された変数として検討す ることができた。さらに、これらの実験では、肝細胞に対する酸素配送と培地量 の同時制御を行った。これとは対照的に、培養プレート領域のバリエーションは 細胞集団の培地深さ（および酸素の拡散）を保持するため培地容量を変化させる か、または、培地容量を保持するため培地深さを変更する必要があった。従って 、細胞環境を制御するこれらの方法は、肝特異的機能(すなわち、代謝および合 成機能)の個別モジュレーターとしての局所的細胞微細環境の重要性を明確に実 証している。細胞微小環境によって誘導される肝細胞表現型における空間的不均一性 本明細書に記載される実験は、初期のヘテロティピック的細胞間相互作用を制 御することによって肝特異的組織機能を調節しうることを示すことに加えて、肝 細胞表現型の誘導における空間的不均一性が機能におけるこれらの差異の主な原 因であることを示す。マイクロパターン化された肝細胞／線維芽細胞共培養物に 関する細胞内アルブミンのインサイチュー免疫染色では、ヘテロティピック境界 面の近傍に強い染色が認められ、このことからこのマーカーのアップレギュレー ションが分化した機能であることが示された。具体的には、小型のもの（100μm の島）では肝細胞領域全体が染色されたが、より大きな島（490μmおよびそれ以 上）では周辺部の境界明瞭な環の内部が強く染色された。この染色パターンには 空間的にも種々の条件にわたっても高度の再現性が認められた。ヘテロティピッ ク境界面の100〜400μm以内では分化した肝細胞表現型が優位であるように思わ れ、このため、広い境界面領域を有するパターンほど高度の組織機能を呈すると 結論づけるのが妥当であると考えられる。 肝細胞表現型において認められた細胞内アルブミンの差がヘテロティピック相 互作用に起因することを確認するために、代表的なマイクロパターン（490μmの 島）における細胞内アルブミンの空間分布に対するヘテロティピック肝細胞相互 作用の影響を評価した。これらの実験では、純粋な肝細胞培養物は均一に染色さ れた後に1週間を経ると染色が低下することが示されたが、これはアルブミン分 泌の低下が認められたこと、および肝細胞の単離直後にはアルブミンmRNAが残存 す るが1週間を経るとmRNAが減少することを示した以前の研究（Dunnら、1992）と 一致する。このため、共培養物における免疫染色パターンは、ホモティピック相 互作用によるものではなく、確かに線維芽細胞とのヘテロティピック相互作用に よるものであった。 画像解析：細胞内アルブミン染色とアルブミン分泌データとの相関を調べるた め、免疫染色がなされた共培養物に関する画像解析を行った。具体的には、本発 明者らは培地中へのアルブミンの分泌に寄与した肝細胞の比率を推定した。細胞 内アルブミン染色の画像解析により、100μmパターンでは肝細胞のほぼ100％、4 90μmパターンではほぼ65％、6800μmパターンではほぼ20％が強く染色されたこ とが明らかになった。弱く染色された肝細胞のアルブミン産生への寄与は無視し うると仮定することにより、本発明者らは、比較的大きなパターンにおいてヘテ ロティピック境界面に隣接する肝細胞は、100μlマイクロパターンのものと比較 して細胞1個当たり35〜50％多くアルブミンを産生すると算出した。これらのデ ータは、比較的未分化なホモティピック近隣物と隣接する肝細胞におけるアルブ ミン産生はさらに増加しているとの可能性を示唆する。 共培養物のマイクロパターン形成により、上記の通り、ランダムな凝集および 細胞遊走によって生じるものよりも大型の肝細胞コロニーの形成が可能となる。 このため、これらのアッセイでは、大型の肝細胞コロニーの内側に向かう分化シ グナルの浸透距離が無限大であることを示すことができた。この結果は、肝細胞 が肝細胞コロニー全体にわたって効率的に情報伝達を行いうるとの概念とは矛盾 する。細胞間相互作用の制御に関する関連した観察 共培養物のマイクロパターン形成が可能になれば初期の細胞微小環境を介した 組織機能の調節を行えるようになるが、これらの操作された組織は細胞接着およ び細胞運動に固有の動態によってさらに変化すると思われる。形態形成の程度は 肝細胞島のサイズによって左右される。これらの実験では、肝細胞島が490μmで 中心間距離（center-to-center spacing）が1230μmの場合には比較的な安定な 配置（configuration）が生じたが、島が100μmおよびそれ未満の場合には若干 の再構築が起こって索様（cord-like）構造が生じた。組織の再構築はサイトカ ラシン Dなどの細胞骨格毒素によって阻止しうる可能性がある。一部の空間的配置に再 構築の傾向がみられたものの、初期の細胞微小環境において実現された擾乱は組 織機能に対して明らかな長期的影響をもたらすことが明らかになった。要約 これらの実験は、細胞数を大きく変化させずにヘテロティピック細胞間相互作 用を制御するための手段として微細加工を用いうることを示している。これまで 前例のない、独立変数としてのヘテロティピック境界面の調節が達成された。こ のヘテロティピック境界面の調節は、代謝、合成および排出機能のマーカーによ る測定では結果として得られた複合組織における検出可能な肝特異的機能レベル を3桁以上も劇的に変化させた。機能の変化は肝細胞表現型の調節によるもので あった。具体的には、上皮分化はヘテロティピック境界面からの距離に反比例し て変化し、細胞間相互作用が相対的に増加した培養物では機能増強が得られた。 ヘテロティピック細胞間相互作用を制御し、その結果得られる組織を細胞間コミ ュニケーションの証拠に関して探索しうることには、基礎科学（例えば組織機能 のインビトロアッセイ）および医学的適用のための機能的組織構築物の開発の双 方において用途がある。基礎的な見地からは、これらの共培養技術を用いて、細 胞間コミュニケーションの機序を明らかにするためのアッセイを開発することが できる。組織工学の領域では、2種またはそれ以上の細胞種をマイクロパターン 形式で共培養して細胞機能を調節しうることにより、皮膚、骨髄、およびその他 の多くの組織のインビトロ再構築に対して、これまで前例のないレベルでの制御 がもたらされる。 第III部 以下の実験において、本発明者らは、ヘテロティピック境界面での肝細胞分化 の誘導の機序をさらに検討することを目的として、従来の培養法に加えて微細加 工技術を用いた。これらの実験により、観察された肝細胞機能の誘導に関する生 物的シグナルは、「遊離分泌型（freely secreted）」（可溶性サイトカインお よび増殖因子などの体液性因子を含むものと広義に定義される）ではなく、「細 胞随伴型（cell-associated）」（膜結合型受容体、局所的に分泌される細胞外 基質、および局所的基質または細胞結合型の増殖因子を含むものと広義に定義さ れる ）であることが示された。材料および方法 ホモティピック肝細胞相互作用の寄与を評価するためのインサイチュー免疫染 色、およびヘテロティピック境界面に近接した肝細胞における肝細胞表現型の誘 導の原因となるシグナルの種類を探索するための種々の方法を用いて、肝細胞／ 3T3共培養物における細胞間コミュニケーションの様式を検討した。これらの技 法には、可溶性因子に関する探索のために前処理した培地（馴化培地）、不安定 な可溶性因子の探索および肝細胞表面に接着した線維芽細胞（スペーサー）の寄 与を除くための細胞集団の分離、および輸送の限界を探索するための重層培地の 連続的擾乱下での培養（撹拌）が含まれる。一般的技法 マイクロパターン化された基質の調製、肝細胞の単離および培養、NIH 3T3-J2 線維芽細胞の培養、免疫組織化学、分析アッセイ、および画像収集のための方法 は上記に詳細に提示されている。マイクロパターン化された培養物の免疫染色 アルブミン免疫染色の空間的パターンに対する肝細胞のホモティピック相互作 用の寄与を評価するために、付加的な線維芽細胞の存在下および非存在下の双方 において、種々のサイズにマイクロパターン化された肝細胞に関する精査を行っ た。肝細胞の島が以下の大きさである、肝細胞単独および肝細胞／線維芽細胞共 培養物のマイクロパターン化された培養物を上記の通りに作製した：36、100、4 90、6800および17800μm。肝細胞は単独で培養するか、750,000個のNIH 3T3-J2 線維芽細胞とともに共培養した。培地（2mL）は毎日交換した。48時間および144 時間の時点で培養物を固定および染色した。馴化培地 パターン化されていない配置で馴化培地実験を行った。ガラス基質をアミノシ ラン、グルタールアルデヒドおよびI型コラーゲンによって上記の通りに修飾し 、ウェーハ全体にわたってI型コラーゲンが固定されるようにした。肝細胞は、 前記の通りの「血清を含む肝細胞培地」中にP-60当たり250,000個の密度で播い た。4種の異なる培養形態に関して調べた。第1に、37℃の培地中での生化学的化 合物の ベースライン分解に関する対照を得るために、組織培養用プラスチック容器中で あらかじめ24時間インキュベートした培地2mLを肝細胞に毎日与えた。第2に、線 維芽細胞から分泌された産物の影響を検討するために、非修飾ガラスウェーハ上 に播いたNIH 3T3-J2細胞（最初750,000個を播いた）とともにあらかじめ24時間 インキュベートした培地2mLを肝細胞に毎日与えた。第3に、アップレギュレーシ ョンのために肝細胞との相互作用を必要とする、線維芽細胞から分泌された産物 の影響を検討するために、パターン化されていないコラーゲン修飾ウェーハ上で NIH 3T3-J2細胞（最初750,000個を播いた）および250,000個の肝細胞からなる共 培養物をあらかじめ24時間インキュベートした培地2mLを肝細胞に毎日与えた。 最後に、共培養による肝細胞特異的機能のアップレギュレーションの誘導のため の上記の条件と比較する「陽性対照」を得るために、750,000個のNIH 3T3-J2細 胞を培養2日後に添加することによって肝細胞をNIH 3T3-J2線維芽細胞と共培養 した。培地を毎日回収し、4℃で保存した。細胞種の物理的分離 肝細胞および線維芽細胞は以下の一般的な手順によって分離した：ガラス基質 上にポリマー製の環を乗せ、I型コラーゲン吸着によって環の内部の表面を修飾 し、中心のコラーゲン固定部に肝細胞を接着させ、肝細胞の上部表面への線維芽 細胞の到達を防ぐために肝細胞集団に「キャッピング」を施した上で線維芽細胞 を播き、キャップおよび環を除去する。スペーシングの差分化は、内径が同一で （このため、肝細胞の島のサイズも同一となる）、外形が徐々に大きくなるよう に（細胞集団間の分離の程度が大きくなる）環の幅を変化させることによって行 った。図4に本方法の概要図を示した。 環はポリジメチルシロキサン（PDMS）を用いて作製した（Sylgard 184、Dow C orning、Lansing、MI）。500μm厚のストッタシートは、ポリマー溶液（製造者 による記載の通りに混合）をポリスチレン製組織培養プラスチック容器中に入れ 、65℃で2時間おいて型取りを行うことによって調製した。環はディスポーザブ ル式皮膚パンチ生検器具を用いて内径0.6cmおよび種々の外径となるように作製 した。続いて、細胞傷害性の発生を抑えるために、上記の通りにアミノエチルア ミノプロピルトリメトキシシランおよびグルタルアルデヒドを用いてPDMS環をI 型コラー ゲンと結合させた。 「キャッブ」は、7mm厚マイラーフィルム（Kodak）から0.6cmディスクを作製 するための標準的な紙穿孔器を用いてポリエチレンテレフタラート（PET）製シ ートから作製した。ディスクは70％エタノール水溶液中に2時間浸漬した後に培 地ですすぎ洗いを行った。 環を直径2インチの清浄なホウケイ酸ウェーハに固定し、続いて10cmの距離か らヒートガンによる5秒間の照射を3回連続して行うことにより、剥離を防ぐため の「-熱固定」を行った。露出したガラスの環状領域内部へのコラーゲン吸着は 、1：1比のI型コラーゲン：水、pH5.0を200μl添加し、37℃で45分間インキュベ ートすることによって行った。次にウェーハを70％メタノール水溶液中に一晩浸 漬して滅菌し、水ですすぎ洗いをし、0.05％ウシ血清アルブミンにさらした後に 無血清肝細胞培地（前記の通り）ですすぎ洗いをした。肝細胞を前記の通りに無 血清培地中に播き、一晩おいて展開させた。 翌田こ無菌条件下でPETキャップをPDMS環に装着し、増殖停止状態（上記の通 りのマイトマイシンC処理による）の線維芽細胞を播き、1時間おいて接着させ、 「線維芽細胞培地」で2回すすぎ洗った後に、環およびキャップを除去した。分 離された共培養物をさらにもう1回線維芽細胞培地ですすぎ洗いし、線維芽細胞 を6時間展開させた後に、線維芽細胞培地を「血清を含む肝細胞培地」と交換し た。対照共培養は、0.68cmの肝細胞島パターン（上記の通り）に対して、前記の 方法によって行った。簡潔に述べると、I型コラーゲンの固定によってガラスを 修飾し、肝細胞を播き、続いて線維芽細胞を播いた。この条件ではキャップおよ びポリマー製環を用いなかった。 最後に、肝細胞島の上に重なっている線維芽細胞が存在しないことを、蛍光標 識であるCMFDA（クロロメチルフルロセインジアセテート、C-2925、Molecular P robes）およびCMFTR（クロロメチルベンゾイルアミノテトラメチルローダミン、 C-2927）を用いて確認した。細胞へのローディングは、25μMの色素を含む培地 中で45分間インキュベートし、すすぎ洗いし、30分間インキュベートした後に最 後のすすぎ洗いを行うことによって行った。次に線維芽細胞を前記の通りにトリ プシン処理し、上記の手順に用いた。分離された共培養物をすすぎ洗いし、最初 に 線維芽細胞を播いてから7時間後に画像を記録した。撹拌 肝細胞表現型における不均一性に対する液体対流の影響を検討するために、静 止および「振盪」条件で共培養を行った。本試験には1つの代表的なパターンを 用いた。肝細胞島が490μmで中心間距離が1230μmであるマイクロパターン化さ れた共培養物を、前記の通りに作製した。最初に肝細胞を播いてから24時間後に 750,000個のNIH 3T3-J2線維芽細胞を添加した。続いて、ホモティピック培養を 以下の2つの異なる条件下で行った：（1）前記の通りの静止培養条件下、および （2）別のインキュベーター内で約1Hzで揺れ動く合上で培養することによる「振 盪」条件下。培地（2mL）は毎日交換した。指定した時点で培養物を固定し、細 胞内アルブミンに関して染色した。結果 免疫染色の空間的パターンに対するホモティピック肝細胞相互作用の影響 本発明者らは、線維芽細胞との共培養によって細胞内アルブミン染色における 空間的不均一性が誘導されたとの前記の観察結果を詳細に検討した。具体的には 、本発明者らは、線維芽細胞の存在下および非存在下において、ホモティピック 相互作用の程度が異なるマイクロパターンを検討することにより、空間的不均一 性に対するホモティピック肝細胞相互作用の寄与の可能性を検討した。5つの異 なるマイクロパターン化された肝細胞コンフィギュレーションに関する細胞内ア ルブミンのパターンを培養48および144時間後に比較した。48時間後にはすべて のパターンで細胞内アルブミンの均一な分布が検出されたが、マイクロパターン 化された肝細胞のみの場合にはこれは時間の経過とともに低下した。マイクロパ ターン化された共培養物（すなわち、培養24時間後に線維芽細胞を添加したもの ）では、マイクロパターン化された肝細胞培養物で観察されたものと同様に細胞 内アルブミンの均一な分布が認められた。しかし、培養6日後には肝細胞は異な るレベルの染色を呈した。ヘテロティピック境界面から遠く離れた肝細胞は線維 芽細胞の非存在下で培養した肝細胞と同様の挙動を示し、染色レベルは低かった 。これに対して、ヘテロティピック境界面に近接した肝細胞では細胞内アルブミ ンのレベルが相対的に高かった。このため、ホモティピック肝細胞相互作用は肝 細胞表 現型に関して観察された空間的不均一性の唯一の原因ではないと考えられる。馴化培地の使用 分泌された線維芽細胞産物によって肝細胞分化が誘導されたとの可能性を検討 するために、「馴化培地」で処理した肝細胞を用いて実験を行った。尿素合成は 、この種の種々の培養条件において肝特異的機能のマーカーとして用いられてい る。（1）対照としての組織培養プラスチック容器（肝細胞＋培地）、（2）線維 芽細胞のみ（肝細胞＋線維芽細胞馴化培地）または（3）線維芽細胞と肝細胞と の共培養（共培養馴化培地の肝細胞）、とともに24時間インキュベーションする ことにより、培地を「馴化」した。これらのデータを、肝特異的機能に関して予 想されるレベルの陽性対照（共培養＋培地）として用いる共培養した線維芽細胞 および肝細胞と比較した。 これらのデータは、培養1週目には純粋な肝細胞における肝特異的機能が50μg ／日未満へと予想された通り低下したことを示している。線維芽細胞馴化培地で 処理した培養物でも肝特異的機能に同様の低下が認められ、このことから肝分化 を誘導するには体液性因子の濃度が不十分であったことが示された。これに対し て、肝細胞および線維芽細胞の共培養物では、培養10日間で尿素合成がほぼ60μ g／日からほぼ175μg／日へとアップレギュレートされ、その後は尿素が安定的 に産生されたことが示された。両方の細胞種に情報伝達を行わせた時期のみ存在 する体液性因子を探索するために、一部の培養物は共培養馴化培地で処理した。 これらは共培養物で認められたものを上回る肝特異的機能の誘導を示さず、この ことから肝分化を誘導するには体液性因子の濃度が不十分であったことが示され た（注：この培地における尿素の検出は馴化培地を用いた共培養物による尿素産 生によるものである―このため、標的肝細胞集団における尿素合成の誘導があれ ば対照共培養を上回る尿素産生のさらなる増加がもたらされる）。細胞集団の物理的分離 肝機能の誘導における不安定で遊離的に分泌される因子の役割を検討するため に、無処理ガラス製の環によって分離した条件で、肝細胞および線維芽細胞集団 を同じ培養皿の中で共培養した。位相差顕微鏡写真では、2つの異なる接触可能 な幅に転換された2つの異なる初期サイズの環が得られた。増殖停止状態の線維 芽細 胞は中央の肝細胞領域に向かって1日当たり約500μmの速度で移動した。3日後に は、最初1500μmであった分離間隔の完全な消失が観察され、肝細胞島の周辺で は細胞接触が生じた。その後、細胞を8日間相互作用させた（「接触」条件）。 これに対して、最初の細胞分離間隔を6000μmとした場合には同じ期間で500μm に縮小した（「非接触」）。この実験デザインでは、肝機能の誘導における細胞 近接／細胞接触、ならびに蛍光色素標識によって確認される重層線維芽細胞の除 去の役割を検討することができる。 「接触」条件にある肝細胞は、対照共培養物で観察された周辺部の環状染色と 同様に、肝細胞島の周辺に強い染色パターンを呈した。これに対して、「非接触 」条件にある肝細胞では、細胞内アルブミンに関して明らかな染色は認められな かった。これらの結果は、肝細胞の分化には細胞の近接（＜500μm）が重要であ ることを示した。さらに、肝細胞の表面には線維芽細胞が接着しなかったにもか かわらず、肝細胞表現型における空間的不均一性は持続し、このことから肝細胞 染色における領域差は線維芽細胞の重層によるものではないことが示された。共培養物の撹拌 線維芽細胞による分泌産物の役割を検討するもう1つの方法は、共培養物に対 して液体対流を加えることである。これらの「振盪」条件下では、生物活性のた めに高い局所濃度を理論的に必要とする体液性因子が大量の液相中に希釈され、 その結果生じる肝細胞分化のパターンは静止条件のものとは異なると考えられる 。さらに、培地の撹拌によって栄養分（酸素、グルコース）の混合もなされるた め、大きな肝細胞島の中心への輸送に関して考えられる限界も軽減されると思わ れる。 本発明者らは、1つの代表的なマイクロパターン化された共培養物である490μ mのものに対する撹拌の効果を、静止条件と比較して評価した。位相差顕微鏡写 真では、撹拌によって機械的ずれに起因する線維芽細胞の障害は生じないことが 示された。さらに、細胞内アルブミンに関して染色した培養物の低倍率明視野像 により、空間的不均一性のパターンには明らかな差がないことが示された。ヘテ ロティピック境界面からの肝細胞分化シグナルの「浸透」距離には、静止培養物 と比べて明らかな変化はなかった。これらのデータは、(1)静止培養物における 肝 細胞表現型の空間的不均一性は拡散輸送に起因する有意な栄養分の限界によるも のではないこと、および（2）分泌された因子の混合による希釈は、観察される 空間的不均一性のパターンを調節しないこと、を示している。考察 本発明者らは、マウス3T3-J2線維芽細胞とともにマイクロパターン化された配 置で共培養することにより、初代肝細胞における肝機能が局所的に誘導されるこ とを以前に報告した。上記に概要を述べた実験は、従来の技術および微細加工技 術の両方を用いて、これらの細胞が相互作用する機序を詳細に検討したものであ る。これらの実験は、細胞随伴型または遊離分泌型と広義に定義したシグナルの 分類に向けたものである。さらに、本発明者らは、肝細胞表現型における空間的 不均一性をもたらすこのシグナルの無限「浸透」距離の原因と考えられる因子に 関して検討した。これらの実験の結果は以下にまとめた通りである。肝細胞機能の誘導には細胞随伴型シグナルが関与する 分化シグナルが遊離型か結合型のいずれであるかを分類するための実験により 、シグナルが細胞随伴型であるとの証拠が得られた。総合すると、これらの実験 （馴化培地の使用、共培養物内での細胞集団の分離、およびマイクロパターン化 された共培養物の撹拌）の結果は、細胞随伴型分子の存在を指示するものである 。線維芽細胞馴化培地および共培養馴化培地はいずれも標的肝細胞における肝細 胞機能の誘導能を有せず、このことから遊離型の可溶性シグナル伝達分子は存在 しないことが示された。これらのデータは、間葉馴化培地またはトランスウェル を用いた他の研究者によって肝機能の誘導が一般に認められなかったことからも 裏づけられた（Shimaokaら、1987；Morinら、1988；Kuri-HarcuchおよびMendoza -Figueroa、1989；Donatoら、1990）。 本発明者らは、分離細胞集団を用いて行った共培養から、遊離型で可溶性の高 度に不安定なシグナルが生じるとは考えにくいと推論した。本発明者らのデータ からは、細胞接触（または5μm未満に極めて近接すること）が肝細胞における肝 特異的機能の誘導と相関する一方で、接触がなければ（＞500μm）、細胞内アル ブミンの免疫染色によって測定される観測可能なシグナルが誘導されないことが 示された。一酸化窒素などのいくつかの独特な生化学分子を例外として、その他 の高度に不安定なシグナルはこの分離型培養コンフィギュレーションにおいて50 0μmを介して肝細胞へのシグナル伝達を行うと考えられる。 本発明者らは、1mm厚のI型コラーゲンヒドロゲルを介して下方の線維芽細胞か ら隔てられた肝細胞の形態を検討し、培養2、3日後には線維芽細胞状の脱分化し た形態を観察しているが、このことは遊離型で可溶性の高度に不安定なシグナル が存在しないことをさらに示すものである（データは提示せず）。 その生物活性が局所的な高濃度に依存的である遊離型の可溶性因子に関して考 えられる役割が極めてわずかであることは、馴化培地および撹拌実験の結果を総 合することによっても明らかとなった。比較的大きな容積の培地中で希釈される ために馴化培地におけるシグナルを誘導しない可溶性因子は、撹拌実験において も培地中の液体対流のために希釈されると思われる。このため、液体混合が原因 となって、何らかの推定上の可溶性シグナル伝達因子の濃度が生物活性濃度未満 に低下するのであれば、撹拌実験においても肝細胞機能の局所的誘導は起こらな いと考えられる。実際、本発明者らは、マイクロパターン化された共培養物にお ける肝細胞において、静止対照と比べて細胞内アルブミンの局所的誘導に同様の パターンを認めており、このことは肝細胞機能の誘導において可溶性因子の希釈 は重大な限界ではないことを示している。分化シグナルの無限浸透距離に関する分析 共培養物の肝細胞表現型において観察された空間的不均一性の原因として考え られるものに関して、本明細書に記載した実験により、その影響を無視しうるも のとして3つの因子が同定される：（i）肝細胞島の中心部への酸素またはその他 の栄養分の送達が不十分であること、（ii）島の周辺部における近隣肝細胞の欠 失によって機能のアップレギュレーションが誘導されるという一次ホモティピッ ク効果、および（iii）肝細胞の上部表面に接着した線維芽細胞からの不均一な シグナル伝達。 本発明者らは、肝細胞表現型の空間的不均一性の誘導における一次肝細胞ホモ ティピック相互作用の役割は重大ではないことを明らかにした。具体的には、本 発明者らは、肝細胞を単独で培養した場合に、ホモティピック相互作用の変化の 結果としての細胞内アルブミンの空間的変動を認めなかった。小さな島における 肝細胞は、大きな島の周辺および中心の双方における肝細胞の染色パターンと同 様に強く均一な染色を呈し、第6日には肝特異的機能が空間的に均一に低下した 。これに対して、マイクロパターン化された共培養物では肝細胞表現型に著しい 変動が認められ、ヘテロティピック境界面の近傍にある肝細胞はアルブミンを比 較的多く発現し、このことから空間的不均一性がホモティピック相互作用のアー チファクトではないことが示された。その他の予備的な結果からは、ホモティピ ック可溶性産物が肝細胞の分化シグナルに対する感受性に影響する可能性が示唆 される（データは提示せず）。 酸素およびその他の輸送物の拡散輸送が十分であることは、静止および撹拌下 でのマイクロパターン化された共培養物の比較によって明らかになった。いずれ の場合にも第４日には同様の誘導パターンが観察され、このことから培地の対流 性混合が肝細胞の挙動を変化させないことが示された。なお、観察された空間的 不均一性における重層線維芽細胞の寄与も極めてわずかであることも明らかにな った。肝細胞島が比較的大きな場合には、生体色素による二重標識により、線維 芽細胞が広がった肝細胞の上部表面に接着することがが認められた（データは提 示せず）。しかし、細胞集団を分離するために実施した実験では、これらの条件 下での肝細胞の表面への線維芽細胞の接着は完全に阻止されている。このため、 本発明者らは、空間的不均一性の存在は高度に特徴的な初期条件によってもたら されたものと推定した。細胞種同士の接触から8日後には、細胞内アルブミン免 疫染色により、周辺部の染色の存在および不均一な肝細胞反応の持続が示された 。本発明者らは、空間的不均一性は、重層した線維芽細胞から生じるシグナルの 変化に起因するものではないと考えられると結論した。 これに対して、空間的不均一性にはその他の原因が存在すると考えられ、重大 な役割を果たすと思われる。これらには、ギャップ結合を介した情報伝達、線維 芽細胞突起の物理的貫入、および「液相」の重層とは異なる「組織層」を介した 因子の拡散が含まれる。ホモティピックなギャップ結合は、ヘテロティピック境 界面からの分化シグナルを内部に伝播する上で役割を果たす可能性がある。間接 免疫蛍光染色（Harvard Medical SchoolのDavid Paul博士から得たコネキシン32 抗体を使用）により、第6日の共培養物におけるギャップ結合の存在が示された （データは提示せず）。さらに、ルシファーイエローのマイクロインジェクショ ンからは、これらの結合が第7日には機能を有することが示唆された（データは 提示せず）。1200ダルトン未満の分子の通過を許容するこれらの細胞間結合は、 ヘテロティピック境界面から次の肝細胞へのシグナルの伝播において不可欠な役 割を果たしている可能性がある（Lowensteinら、1979）。形態形成 ここでは肝細胞表現型における空間的不均一性に対する組織再構築の役割につ いて取り扱う。明瞭に、培養物（肝細胞単独および共培養物の両方）の再構築は 相対的に小型のパターンで認められ、大きな肝細胞島（490μmを超えるもの）で は明らかに低下した。これらの検討では、後期の時点でのパターン配置は組織中 の形態形成による擾乱を受けており、すなわち観察された染色パターンは初期の パターン配置のみならず培養によって選択された長期的構造によっても決定され た。例えば、100μmの島はアルブミン染色において空間的不均一性を示さないが 、これはおそらく、すべての肝細胞がヘテロティピッタ境界面に近接するように それらが再構築されるためと考えられる。これに対して、36μmの島は、一部の 肝細胞でヘテロティピック境界面との距離が拡大する、より大きな「索様」肝構 造へと再構築され、その結果、肝細胞表現型の空間的不均一性がもたらされた。 これらの組織では何らかの再構築がみられたものの基本的な空間的不均一性のパ ターンは一定に保たれた。また、100pmよりも大きな肝構造では肝細胞表現型に おける空間的不均一性が示され、ヘテロティピッタ境界面から大きく隔たった肝 細胞で認められた細胞内アルブミンは低いレベルであった。以上の通り、上記に おいて到達した結論には十分な根拠がある。要約 これらの実験では、肝細胞／線維芽細胞共培養における肝細胞の分化のための 主要シグナルが線維芽細胞に明確に随伴することを示すために、従来の培養技法 を微細加工を施した共培養物と組み合わせた。馴化培地、共培養物の分離および 撹拌実験の結果を総合すると、「細胞随伴型」のシグナルが肝特異的機能の調節 （例えばアップレギュレーション）を促すことが示された。分化シグナルに関し て観察される無限浸透はギャップ結合、シグナル伝達分子の「組織相」拡散、お よび／または線維芽細胞突起の物理的貫入に起因する可能性がある。 共培養物に基づくバイオリアクターの設計に関する意義に関していえば、シグ ナルが線維芽細胞随伴性であるとの所見から、十分なレベルの肝特異的機能が生 じるためには線維芽細胞および肝細胞が直接接触する（すなわち、バイオリアク ター内で同じ区域にある）必要のあることが示唆される。これらの共培養物によ り、候補となる生化学シグナル、ならびにヘテロティピック境界面から大きく隔 たった肝細胞部分が最小となる空間的配置の検討が可能になり、これによって全 体的な組織機能がさらに改善される可能性が生じると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 11/14 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 ヤームッシュ マーティン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ ンブリッジ マサチューセッツ アベニュ ー 950 アパートメント 403 (72)発明者 トナー メフメト アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ウ ェルズリー ピルグリム ロード 100

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．下記の段階を含む、少なくとも2つの細胞種を含むマイクロパターン化された 共培養物を作製するための方法： i）基質を被覆する蛋白質により基質上のマイクロパターンが規定される、蛋 白質被覆された基質を提供する段階、 ii）第1の細胞種の細胞が蛋白質被覆された基質の蛋白質と結合するような条 件下で、蛋白質被覆された基質と、第1の細胞培地中に懸濁された第1の細胞種の 細胞とを接触させ、それによってマイクロパターン化された細胞被覆基質が製造 される段階、および iii）第2の細胞種の細胞が基質と結合するような条件下で、マイクロパターン 化された細胞被覆基質と、第2の細胞培地中に懸濁された第2の細胞種の細胞とを 接触させ、それによってマイクロパターン化された共培養物が製造される段階で あって、細胞培地の1つが非接着性培地であって細胞培地の1つが接着性培地であ る段階。 2．第1および第2の細胞種のうち一方の細胞が肝細胞である、請求項1記載の方法 。 3．第1および第2の細胞種のうち一方の細胞がクッパー細胞、伊東細胞、内皮細 胞および胆管細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。 4．第1および第2の細胞種のうち一方の細胞が線維芽細胞である、請求項1記載の 方法。 5．第1の細胞種の細胞が肝細胞であって第2の細胞種の細胞が線維芽細胞である 、請求項1記載の方法。 6．第1および第2の細胞種の一方または両方の細胞が、筋細胞、骨髄細胞、間質 細胞、皮膚細胞、間葉細胞、および実質性腫瘍細胞からなる群より選択される、 請求項1記載の方法。 7．筋細胞が平滑筋細胞である、請求項6記載の方法。 8．皮膚細胞がケラチノサイトである、請求項6記載の方法。 9．非接着性培地が無血清培地である、請求項1記載の方法。 10．接着性培地が血清を含む、請求項1記載の方法。 11．接着性培地がフィブロネクチン、セレクチン、RGDペプチド、ICAM、E-カド ヘリン、インテグリン、および細胞表面蛋白質と特異的に結合する抗体からなる 群より選択される接着因子を少なくとも1つ含む、請求項1記載の方法。 12．抗体がインテグリン、ICAM、セレクチン、RGDペプチド、およびE-カドヘリ ンからなる群より選択される細胞表面蛋白質と特異的に結合する、請求項11記載 の方法。 13．蛋白質被覆された基質がコラーゲンを含む、請求項1記載の方法。 14．蛋白質被覆された基質がフィブロネクチン、ラミニンまたはエンタクチンお よびそれらの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。 15．第1および第2の細胞種が、第1または第2の細胞種のいずれかの細胞の島（is land）がそれぞれ第2または第1の細胞種のいずれかの細胞によって取り囲まれる マイクロパターンを規定する、請求項1記載の方法。 16．細胞の島が直径25〜1,000μmである、請求項15記載の方法。 17．細胞の島が直径30〜500μmである、請求項16記載の方法。 18．細胞の島が直径100〜500μmである、請求項17記載の方法。 19．第1および第2の細胞種が、第1または第2の細胞種のいずれかの細胞の島がそ れぞれ第2または第1の細胞種のいずれかの細胞によって取り囲まれるマイクロパ ターンを規定し、細胞の島の細胞の少なくとも30％が細胞の島と周囲の細胞との 間の境界面の100μm以内に存在する、請求項1記載の方法。 20．基質がガラス、ポリマーおよびシリコン基質からなる群より選択される、請 求項1記載の方法。 21．請求項1記載の方法によって製造される、少なくとも2つの細胞種の共培養物 。 22．共培養物が肝細胞および線維芽細胞を含む、請求項21記載の共培養物。 23．a）肝細胞、ならびにクッパー細胞、伊東細胞、内皮細胞および胆管細胞か らなる群より選択される少なくとも1つの細胞種、 b）内皮細胞および平滑筋細胞、 c）間質細胞および腫瘍形成性実質細胞、 d）骨髄細胞および線維芽細胞、ならびに e）ケラチノサイトおよび線維芽細胞 からなる群より選択される細胞の組み合わせを含む、請求項21記載の共培養物。 24．i）基質を被覆する蛋白質が基質上のマイクロパターンを規定する、蛋白質 で被覆された基質を提供する段階、 ii）第1の細胞種の細胞が蛋白質被覆された基質の蛋白質と結合するような条 件下で、蛋白質被覆された基質と、第1の細胞培地中に懸濁された第1細胞種の細 胞とを接触させ、それによってマイクロパターン化された細胞被覆基質が製造さ れる段階、および iii）第2の細胞種の細胞が基質と結合するような条件下で、マイクロパターン 化された細胞被覆基質と、第2の細胞培地中に懸濁された第2の細胞種の細胞とを 接触させ、それによってマイクロパターン化された共培養物が製造される段階を 含む、第1の細胞種の細胞の代謝または合成機能を調節するための方法であって 、 a）細胞培地の1つが非接着性培地であって細胞培地の1つが接着性培地であり 、 b）第1および第2の細胞種の細胞がマイクロパターンを規定していて、第2の細 胞種の細胞が第1の細胞種の細胞を取り囲み、第1の細胞種の細胞の少なくとも30 ％が第1の細胞種の細胞と第2の細胞種の細胞との間の境界面の100μm以内に存在 し、 それによって、第1の細胞種の細胞の代謝または合成機能が、第1および第2の 細胞種の細胞を含むパターン化されていない共培養物における第1の細胞種の細 胞と対比して調節される、マイクロパターン化された共培養物が作製される方法 。 25．調節が第1の細胞種の細胞の蛋白質産生の増加によって検出される、請求項2 4記載の方法。 26．第1の細胞種の細胞が肝細胞であって調節が肝細胞の細胞内または分泌され たアルブミンの変化として検出される、請求項25記載の方法。 27．第1の細胞種の細胞が肝細胞であって調節が肝細胞における尿素合成の変化 として検出される、請求項25記載の方法。 28．調節が第1の細胞種の細胞におけるDNA合成の変化として検出される、請求項 25記載の方法。 29．共培養物が、 a）肝細胞、ならびにクッパー細胞、伊東細胞、内皮細胞および胆管細胞から なる群より選択される少なくとも1つの細胞種、 b）内皮細胞および平滑筋細胞、 c）間質細胞および腫瘍形成性実質細胞、 d）骨髄細胞および線維芽細胞、ならびに e）ケラチノサイトおよび線維芽細胞 からなる群より選択される細胞の組み合わせを含む、請求項24記載の方法。 30．共培養物が肝細胞および線維芽細胞を含む、請求項24記載の方法。 31．請求項24記載の方法に従って製造された細胞の共培養物。 32．非接着性培地が無血清培地である、請求項24記載の方法。 33．接着性培地が血清を含む、請求項24記載の方法。 34．蛋白質被覆された基質がコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよびエ ンタクチンまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される蛋白質を含む、 請求項24記載の方法。 35．第1および第2の細胞種の細胞によって規定されるマイクロパターンが、第2 の細胞種の細胞によって取り囲まれた第1の細胞種の細胞の島を含む、請求項24 記載の方法。 36．細胞の島が直径25〜1,000μmである、請求項35記載の方法。 37．細胞の島が直径30〜500μmである、請求項36記載の方法。 38．細胞の島が直径100〜500μmである、請求項37記載の方法。 39．マイクロパターン化された共培養物において代謝または合成機能が調節され る程度が、パターン化されていない共培養物における代謝または合成機能が調節 される程度と比べて大きい、請求項24記載の方法。 40．マイクロパターン化された共培養物における第1の細胞種の細胞の代謝また は合成機能が、パターン化されていない共培養物における第1の細胞種の細胞の 代謝または合成機能と比べて少なくとも1.5倍である、請求項24記載の方法。 41．マイクロパターン化された共培養物における第1の細胞種の細胞の代謝また は合成機能が、パターン化されていない共培養物における第1の細胞種の細胞の 代謝 または合成機能と比べて少なくとも5倍である、請求項40記載の方法。 42．i）基質を被覆する蛍白質が基質上のマイクロパターンを規定する、蛍白質 被覆された基質を提供する段階、 ii）第1の細胞種の細胞が蛋白質被覆された基質の蛋白質と結合するような条 件下で、蛋白質被覆基質と、第1の細胞培地中に懸濁された第1の細胞種の細胞と を接触させ、それによってマイクロパターン化された細胞被覆基質が製造される 段階、および iii）第2の細胞種の細胞が基質と結合するような条件下で、マイクロパターン 化された細胞被覆基質と、第2の細胞培地中に懸濁された第2の細胞種の細胞とを 接触させ、それによってマイクロパターン化された共培養物が製造される段階を 含む、第2の細胞種の細胞の代謝または合成機能を調節するための方法であって a）細胞培地の1つが非接着性培地であって細胞培地の1つが接着性培地であり 、 b）第1および第2の細胞種の細胞がマイクロパターンを規定していて、第1の細 胞種の細胞が第2の細胞種を取り囲み、第2の細胞種の細胞の少なくとも30％が第 2の細胞種の細胞と第1の細胞種の細胞との間の境界面の100μm以内に存在し、 それによって、第2の細胞種の細胞の代謝または合成機能が、第2および第1の 細胞種の細胞を含むパターン化されていない共培養物における第2の細胞種の細 胞と対比して調節されるような、マイクロパターン化された共培養物が作製され る方法。 43．共培養物が、 a）肝細胞、ならびにクッパー細胞、伊東細胞、内皮細胞および胆管細胞から なる群より選択される少なくとも1つの細胞種、 b）内皮細胞および平滑筋細胞、 c）間質細胞および腫瘍形成性実質細胞、 d）骨髄細胞および線維芽細胞、 e）ケラチノサイトおよび線維芽細胞、ならびに f）肝細胞および線維芽細胞 からなる群より選択される細胞の組み合わせを含む、請求項42記載の方法。 44．請求項42記載の方法に従って作製された共培養物。 45．調節が細胞の代謝または合成機能のアップレギュレーションを含む、請求項 24記載の方法。 46．下記の段階を含む、少なくとも2つの細胞種を含むマイクロパターン化され た共培養物を製造するための方法： i）基質を被覆する蛋白質が基質上のマイクロパターンを規定する、蛋白質被 覆された基質を提供する段階、 ii）第1の細胞種の細胞が蛋白質被覆された基質の蛋白質と結合するような条 件下で、蛋白質被覆された基質と、第1の細胞培地中に懸濁された第1の細胞種の 細胞とを接触させ、それによってマイクロパターン化された細胞被覆基質が製造 される段階、および iii）第2の細胞種の細胞が基質と結合するような条件下で、マイクロパターン 化された細胞被覆基質と、第2の細胞培地中に懸濁された第2の細胞種の細胞とを 接触させ、それによってマイクロパターン化された共培養物が製造される段階で あって、第1の細胞種が非接着性培地中にあって第2の細胞種がそれを基質と接着 させる天然の接着能を有する段階。 47．細胞が線維芽細胞である、請求項46記載の方法。 48．基質が荷電している、請求項46記載の方法。 49．第1の細胞種が所望の産物を産生するように遺伝的に操作され、第2の細胞種 が蛋白質を産生し、該第1の細胞種が該第2の細胞種の複製および増殖を可能にす る、請求項1記載の方法。