JP2570621B2 - 細胞培養用基板とその作製方法および細胞配列形成方法 - Google Patents
細胞培養用基板とその作製方法および細胞配列形成方法Info
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- C12M25/02—Membranes; Filters
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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- C12N5/0068—General culture methods using substrates
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
- C12N2535/10—Patterned coating
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞の配列を形成する
ために用いられる細胞培養用基板とその作製方法、およ
びこれを用いた細胞配列形成方法に関する。
ために用いられる細胞培養用基板とその作製方法、およ
びこれを用いた細胞配列形成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、いろいろな動物や植物の細胞培養
が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発され
ている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質
の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されてい
る。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬
剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発され
ている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質
の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されてい
る。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬
剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
【０００３】一部の細胞、特に多くの動物細胞は、何か
に接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の
浮遊状態では長期間生存することができない。このよう
な接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着する
ための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフ
ィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗
布したプラスティック製の培養皿が用いられている。こ
れらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細
胞の接着を容易にしたり、細胞の形態に影響を与えるこ
とが知られている。
に接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の
浮遊状態では長期間生存することができない。このよう
な接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着する
ための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフ
ィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗
布したプラスティック製の培養皿が用いられている。こ
れらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細
胞の接着を容易にしたり、細胞の形態に影響を与えるこ
とが知られている。
【０００４】一方、培養細胞を基板上の微小な部分にの
み接着させ、配列させる技術が報告されている。このよ
うな技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、
バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培
養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の
容易さが異なるような表面がパターンをなしているよう
な基板を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着す
るように加工した表面だけに細胞を接着させることによ
って細胞を配列させる方法がとられている。
み接着させ、配列させる技術が報告されている。このよ
うな技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、
バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培
養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の
容易さが異なるような表面がパターンをなしているよう
な基板を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着す
るように加工した表面だけに細胞を接着させることによ
って細胞を配列させる方法がとられている。
【０００５】例えば、特開平２−２４５１８１号公報に
は、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電
荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用
している。また、特開平３−７５７６号公報では、細胞
非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子を
フォトリソグラフィー法によりパターニングした表面上
への培養細胞の配列を試みている。また、細胞非接着性
表面を有した細胞培養材料に紫外線や放射線を照射する
ことによって細胞接着性の官能基を導入したり、細胞培
養材料に紫外線や放射線を照射することによって重合開
始種を誘導し、この上に細胞接着性あるいは細胞非接着
性モノマーを重合させるなどして表面をパターニング
し、これによって細胞の配列を制御した特開平３−７５
７７号公報の例がある。
は、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電
荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用
している。また、特開平３−７５７６号公報では、細胞
非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子を
フォトリソグラフィー法によりパターニングした表面上
への培養細胞の配列を試みている。また、細胞非接着性
表面を有した細胞培養材料に紫外線や放射線を照射する
ことによって細胞接着性の官能基を導入したり、細胞培
養材料に紫外線や放射線を照射することによって重合開
始種を誘導し、この上に細胞接着性あるいは細胞非接着
性モノマーを重合させるなどして表面をパターニング
し、これによって細胞の配列を制御した特開平３−７５
７７号公報の例がある。
【０００６】さらに、特開平５−１７６７５３号公報で
は、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなど
の物質がパターニングされた細胞培養用基板と、この基
板をフォトリソグラフィー法によって作製する方法につ
いて開示している。このような基板の上で細胞を培養す
ることによって、コラーゲンなどがパターニングされた
表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニング
を実現している。
は、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなど
の物質がパターニングされた細胞培養用基板と、この基
板をフォトリソグラフィー法によって作製する方法につ
いて開示している。このような基板の上で細胞を培養す
ることによって、コラーゲンなどがパターニングされた
表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニング
を実現している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来の細胞配列を形成
するための細胞培養用基板は、基板表面の細胞接着性が
固定されている。つまり、作製された基板の細胞接着性
表面を細胞非接着性表面に変えたり、逆に細胞非接着性
表面を細胞接着性表面に変えるような、基板表面の細胞
接着性の制御はできない。また、従来の細胞培養用基板
で、２種類以上の細胞の配列を得ることは非常に困難で
あった。
するための細胞培養用基板は、基板表面の細胞接着性が
固定されている。つまり、作製された基板の細胞接着性
表面を細胞非接着性表面に変えたり、逆に細胞非接着性
表面を細胞接着性表面に変えるような、基板表面の細胞
接着性の制御はできない。また、従来の細胞培養用基板
で、２種類以上の細胞の配列を得ることは非常に困難で
あった。
【０００８】本発明の目的は、表面の細胞接着性の制御
が可能な、細胞配列を形成するための細胞培養用基板と
その作製方法、およびこの細胞培養用基板を用いた細胞
配列形成方法を提供することである。
が可能な、細胞配列を形成するための細胞培養用基板と
その作製方法、およびこの細胞培養用基板を用いた細胞
配列形成方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明の第１の発明は、接着性細胞を接着させ生育
させる細胞培養用基板において、前記基板表面の一部分
に固定化酵素膜が形成されることを特徴とする細胞培養
用基板である。
め、本発明の第１の発明は、接着性細胞を接着させ生育
させる細胞培養用基板において、前記基板表面の一部分
に固定化酵素膜が形成されることを特徴とする細胞培養
用基板である。
【００１０】第２の発明は、前記固定化酵素膜に含まれ
る酵素の基質が、配列を得ようとする細胞の生育に必要
な物質であるかまたは細胞の生育を阻害する物質である
か、あるいは前記酵素膜に含まれる酵素の反応生成物
が、配列を得ようとする細胞の生育に必要な物質である
かまたは細胞の生育を阻害する物質であることを特徴と
する第１の発明に記載の細胞培養用基板である。
る酵素の基質が、配列を得ようとする細胞の生育に必要
な物質であるかまたは細胞の生育を阻害する物質である
か、あるいは前記酵素膜に含まれる酵素の反応生成物
が、配列を得ようとする細胞の生育に必要な物質である
かまたは細胞の生育を阻害する物質であることを特徴と
する第１の発明に記載の細胞培養用基板である。
【００１１】第３の発明は、基板にフォトレジストを塗
布した後に、露光および現像を行うことにより前記基板
表面の一部分のフォトレジストを除去する工程と、前記
フォトレジスト除去工程後に基板の表面に固定化酵素膜
を製膜する工程と、前記製膜後に前記基板のフォトレジ
ストを除去する工程を有することを特徴とする細胞培養
用基板の作製方法である。
布した後に、露光および現像を行うことにより前記基板
表面の一部分のフォトレジストを除去する工程と、前記
フォトレジスト除去工程後に基板の表面に固定化酵素膜
を製膜する工程と、前記製膜後に前記基板のフォトレジ
ストを除去する工程を有することを特徴とする細胞培養
用基板の作製方法である。
【００１２】第４の発明は、基板表面の一部分に固定化
酵素膜が形成された第１の発明または第２の発明に記載
の細胞培養用基板を用い、前記固定化酵素膜に含まれる
酵素の基質を一定濃度含む培地と共に細胞を培養するこ
とを特徴とする細胞配列形成方法である。
酵素膜が形成された第１の発明または第２の発明に記載
の細胞培養用基板を用い、前記固定化酵素膜に含まれる
酵素の基質を一定濃度含む培地と共に細胞を培養するこ
とを特徴とする細胞配列形成方法である。
【００１３】
【作用】本発明の細胞培養用基板は、基板表面の一部分
に固定化酵素膜が形成されている。この基板を、固定化
酵素膜に含まれる酵素の基質を含む培地に浸漬すると、
培地中の基質は固定化酵素膜の酵素によって消費され対
応する生成物が酵素膜表面に生成する。そのため、固定
化酵素膜が設けられていない表面に比べ、固定化酵素膜
表面の局所的基質濃度は低く、局所的生成物濃度は高く
なる。つまり、本発明の細胞培養用基板を用い、基質を
含む培地中で細胞を培養すると、その基質が細胞の生育
に必要な物質であったり、生成物が細胞の生育を阻害す
る物質であれば、固定化酵素膜表面への細胞の接着、生
育は抑制される。一方、基質が細胞の成育を阻害する物
質であったり、生成物が細胞の生育に必要な物質であれ
ば、固定化酵素膜表面への細胞の接着、生育は促進され
る。このような機構により基板表面に所望の細胞のパタ
ーニングが実現する。
に固定化酵素膜が形成されている。この基板を、固定化
酵素膜に含まれる酵素の基質を含む培地に浸漬すると、
培地中の基質は固定化酵素膜の酵素によって消費され対
応する生成物が酵素膜表面に生成する。そのため、固定
化酵素膜が設けられていない表面に比べ、固定化酵素膜
表面の局所的基質濃度は低く、局所的生成物濃度は高く
なる。つまり、本発明の細胞培養用基板を用い、基質を
含む培地中で細胞を培養すると、その基質が細胞の生育
に必要な物質であったり、生成物が細胞の生育を阻害す
る物質であれば、固定化酵素膜表面への細胞の接着、生
育は抑制される。一方、基質が細胞の成育を阻害する物
質であったり、生成物が細胞の生育に必要な物質であれ
ば、固定化酵素膜表面への細胞の接着、生育は促進され
る。このような機構により基板表面に所望の細胞のパタ
ーニングが実現する。
【００１４】また、基板の固定化酵素膜表面の局所的基
質濃度や局所的生成物濃度は、培地中に含まれる基質の
濃度によって変化するので、培地に含まれる基質の濃度
を制御することによって、固定化酵素膜表面への細胞の
接着、生育を制御することができる。例えば、固定化酵
素膜に含まれる酵素の反応生成物が細胞の生育を阻害す
る物質である細胞培養用基板で細胞を培養する場合、基
質を含む培地を用いると、固定化酵素膜表面には生成物
が生成されるので、固定化酵素膜表面での細胞の接着が
抑制される。しかし、基質を含まない培地を用いると、
固定化酵素膜表面の局所的生成物濃度は０であるので、
固定化酵素膜による細胞接着抑制効果はなくなり、細胞
は固定化酵素膜表面に接着、生育する。このように、培
地に含まれる基質の濃度によって、固定化酵素膜表面を
細胞非接着性表面に変えたり、細胞接着性表面に変えた
りすることができる。
質濃度や局所的生成物濃度は、培地中に含まれる基質の
濃度によって変化するので、培地に含まれる基質の濃度
を制御することによって、固定化酵素膜表面への細胞の
接着、生育を制御することができる。例えば、固定化酵
素膜に含まれる酵素の反応生成物が細胞の生育を阻害す
る物質である細胞培養用基板で細胞を培養する場合、基
質を含む培地を用いると、固定化酵素膜表面には生成物
が生成されるので、固定化酵素膜表面での細胞の接着が
抑制される。しかし、基質を含まない培地を用いると、
固定化酵素膜表面の局所的生成物濃度は０であるので、
固定化酵素膜による細胞接着抑制効果はなくなり、細胞
は固定化酵素膜表面に接着、生育する。このように、培
地に含まれる基質の濃度によって、固定化酵素膜表面を
細胞非接着性表面に変えたり、細胞接着性表面に変えた
りすることができる。
【００１５】さらに、本発明の細胞培養用基板を用いれ
ば、２種類以上の細胞の配列を得ることが容易になる。
例えば、固定化酵素膜に含まれる酵素の反応生成物が細
胞の生育を阻害する物質である細胞培養用基板で細胞を
培養する場合、まず、第１の種類の細胞を基質を含む培
地で培養すると、細胞は固定化酵素膜表面を避けて接着
する。次に、第２の細胞の種類を基質を含まない培地で
培養すると、細胞は固定化酵素膜表面に接着、生育す
る。このようにして、細胞培養用基板の固定化酵素膜表
面以外には第１の細胞が、固定化酵素膜表面には第２の
細胞が接着し、２種類の細胞の配列を得ることができ
る。
ば、２種類以上の細胞の配列を得ることが容易になる。
例えば、固定化酵素膜に含まれる酵素の反応生成物が細
胞の生育を阻害する物質である細胞培養用基板で細胞を
培養する場合、まず、第１の種類の細胞を基質を含む培
地で培養すると、細胞は固定化酵素膜表面を避けて接着
する。次に、第２の細胞の種類を基質を含まない培地で
培養すると、細胞は固定化酵素膜表面に接着、生育す
る。このようにして、細胞培養用基板の固定化酵素膜表
面以外には第１の細胞が、固定化酵素膜表面には第２の
細胞が接着し、２種類の細胞の配列を得ることができ
る。
【００１６】
【実施例】次に本発明の実施例について図面を参照して
説明する。
説明する。
【００１７】（実施例１）図１は、本発明の細胞培養用
基板の一実施例を示した平面図（図１（ａ））および断
面図（図１（ｂ））である。細胞培養用基板の本体は厚
さ０．５mmの石英基板１である。基板表面には、固定化
酵素膜として固定化グルコースオキシダーゼ膜２が幅１
００μm 、間隔２００μm の縞模様で形成されている。
固定化グルコースオキシダーゼ膜は、牛血清アルブミン
のグルタルアルデヒド架橋膜を基体とし、グルコースオ
キシダーゼが包括固定化されたものである。
基板の一実施例を示した平面図（図１（ａ））および断
面図（図１（ｂ））である。細胞培養用基板の本体は厚
さ０．５mmの石英基板１である。基板表面には、固定化
酵素膜として固定化グルコースオキシダーゼ膜２が幅１
００μm 、間隔２００μm の縞模様で形成されている。
固定化グルコースオキシダーゼ膜は、牛血清アルブミン
のグルタルアルデヒド架橋膜を基体とし、グルコースオ
キシダーゼが包括固定化されたものである。
【００１８】細胞培養用基板本体の材質は、ガラス、石
英、シリコン、金属、ポリスチレンなどのプラスティッ
クが使用できる。特に透明なガラス、石英、ポリスチレ
ンは、透過型の生物顕微鏡で培養細胞の観察を行うこと
ができる点で適している。
英、シリコン、金属、ポリスチレンなどのプラスティッ
クが使用できる。特に透明なガラス、石英、ポリスチレ
ンは、透過型の生物顕微鏡で培養細胞の観察を行うこと
ができる点で適している。
【００１９】細胞培養用基板に設けられる固定化酵素膜
に含まれる酵素は、その基質や生成物が細胞の生育に必
要な物質であったり、細胞の生育を阻害する物質であれ
ばよい。グルコースオキシダーゼの場合、細胞の生育に
必要なグルコースと酸素を消費し、細胞の成育を阻害す
る過酸化水素を生成するので、本発明に適用することが
できる。そのほかにも、ウレアーゼ、ウリカーゼ、乳酸
オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどが使用でき
る。
に含まれる酵素は、その基質や生成物が細胞の生育に必
要な物質であったり、細胞の生育を阻害する物質であれ
ばよい。グルコースオキシダーゼの場合、細胞の生育に
必要なグルコースと酸素を消費し、細胞の成育を阻害す
る過酸化水素を生成するので、本発明に適用することが
できる。そのほかにも、ウレアーゼ、ウリカーゼ、乳酸
オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどが使用でき
る。
【００２０】細胞培養用基板に設けられる固定化酵素膜
の基体は、一般的な酵素固定化用材料を用いることがで
きる。牛血清アルブミンの他にも、コラーゲンやアルギ
ン酸ゲル、ポリビニルアルコールやポリアクリルアミド
などが利用できる。
の基体は、一般的な酵素固定化用材料を用いることがで
きる。牛血清アルブミンの他にも、コラーゲンやアルギ
ン酸ゲル、ポリビニルアルコールやポリアクリルアミド
などが利用できる。
【００２１】細胞培養用基板の細胞接着性を向上させる
ためには、基板全面にコラーゲン吸着などの前処理を行
ってもよい。また、本実施例の細胞培養用基板に設けら
れる固定化酵素膜は１種類であるが、２種類以上の固定
化酵素膜を設けると、各々の固定化酵素膜の表面の細胞
接着性を独立して制御できるためより複雑な細胞配列を
得ることができる。
ためには、基板全面にコラーゲン吸着などの前処理を行
ってもよい。また、本実施例の細胞培養用基板に設けら
れる固定化酵素膜は１種類であるが、２種類以上の固定
化酵素膜を設けると、各々の固定化酵素膜の表面の細胞
接着性を独立して制御できるためより複雑な細胞配列を
得ることができる。
【００２２】（実施例２）図２（ａ）〜（ｄ）は、本発
明の細胞培養用基板の作製方法の一実施例を示した作製
工程断面図である。以下に作製工程を順に説明する。ま
ず、直径４インチの石英基板１に図２（ａ）のようにフ
ォトレジスト３（シプレイ製マイクロポジットＭＰ１３
００−３７）を３０００ｒｐｍで３０秒間スピン塗布
し、９０℃で３０分間乾燥させた。この際、ヘキサメチ
ルジシラザンなど、基板とフォトレジストの接着性を向
上させる試薬を基板に前処理してもよい。続いて、この
基板にフォトマスクを通じて水銀ランプを照射し、デペ
ロッパー（シプレイ製マイクロポジットＭＦ−３１２）
で現像処理を行い、図２（ｂ）のように固定化酵素膜が
形成される部分のフォトレジストを除去した。その後、
基板に６０ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、１％グ
ルタルアルデヒドを含む１５％牛血清アルブミン０．６
ミリリットルを３０００ｒｐｍで３０秒間スピン塗布し
た。この際、３−アミノプロピルトリエトキシシランな
ど、基板と固定化酵素膜の接着性を向上させる試薬を基
板に前処理してもよい。その後、２０℃で１時間放置し
て架橋反応を進め、図２（ｃ）のように固定化グルコー
スオキシダーゼ膜２を形成した。最後に基板をアセトン
に浸してフォトレジストを溶解し、水洗して図２（ｄ）
のような細胞培養用基板を得た。
明の細胞培養用基板の作製方法の一実施例を示した作製
工程断面図である。以下に作製工程を順に説明する。ま
ず、直径４インチの石英基板１に図２（ａ）のようにフ
ォトレジスト３（シプレイ製マイクロポジットＭＰ１３
００−３７）を３０００ｒｐｍで３０秒間スピン塗布
し、９０℃で３０分間乾燥させた。この際、ヘキサメチ
ルジシラザンなど、基板とフォトレジストの接着性を向
上させる試薬を基板に前処理してもよい。続いて、この
基板にフォトマスクを通じて水銀ランプを照射し、デペ
ロッパー（シプレイ製マイクロポジットＭＦ−３１２）
で現像処理を行い、図２（ｂ）のように固定化酵素膜が
形成される部分のフォトレジストを除去した。その後、
基板に６０ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、１％グ
ルタルアルデヒドを含む１５％牛血清アルブミン０．６
ミリリットルを３０００ｒｐｍで３０秒間スピン塗布し
た。この際、３−アミノプロピルトリエトキシシランな
ど、基板と固定化酵素膜の接着性を向上させる試薬を基
板に前処理してもよい。その後、２０℃で１時間放置し
て架橋反応を進め、図２（ｃ）のように固定化グルコー
スオキシダーゼ膜２を形成した。最後に基板をアセトン
に浸してフォトレジストを溶解し、水洗して図２（ｄ）
のような細胞培養用基板を得た。
【００２３】（実施例３）本発明の細胞配列形成方法の
一実施例について説明する。細胞培養用基板は大きさ２
０mm×１５mmであり、実施例２と同様の方法で作製し
た。基板表面は半分の１０mm×１５mmに固定化グルコー
スオキシダーゼ膜が形成され、残り半分の１０mm×１５
mmは石英が露出している。基板の細胞接着性を向上させ
るために、前処理として基板を０．０３％コラーゲン水
溶液に１時間浸漬した。
一実施例について説明する。細胞培養用基板は大きさ２
０mm×１５mmであり、実施例２と同様の方法で作製し
た。基板表面は半分の１０mm×１５mmに固定化グルコー
スオキシダーゼ膜が形成され、残り半分の１０mm×１５
mmは石英が露出している。基板の細胞接着性を向上させ
るために、前処理として基板を０．０３％コラーゲン水
溶液に１時間浸漬した。
【００２４】この基板をエタノールに浸漬、乾燥させる
ことによって滅菌した後、底面２０×１５mm、高さ１０
mm、厚さ０．５mmの透明ポリエチレン製角型培養容器の
底面に設置した。この培養容器に森永生化学研究所製の
正常ヒトさい帯血管内皮細胞を播種した。培地には日水
製薬製のＭＣＤＢ１０４液体培地を用い、１０ｎｇ／ｍ
ｌ繊維芽細胞増殖因子を添加して用いた。細胞を播種し
た培養容器は３７℃、５％二酸化炭素、温度飽和雰囲気
のインキュベーターで１２時間培養し、細胞が接着した
基板を顕微鏡で観察した。
ことによって滅菌した後、底面２０×１５mm、高さ１０
mm、厚さ０．５mmの透明ポリエチレン製角型培養容器の
底面に設置した。この培養容器に森永生化学研究所製の
正常ヒトさい帯血管内皮細胞を播種した。培地には日水
製薬製のＭＣＤＢ１０４液体培地を用い、１０ｎｇ／ｍ
ｌ繊維芽細胞増殖因子を添加して用いた。細胞を播種し
た培養容器は３７℃、５％二酸化炭素、温度飽和雰囲気
のインキュベーターで１２時間培養し、細胞が接着した
基板を顕微鏡で観察した。
【００２５】図３（ａ）は、この実施例で得られた基板
表面の顕微鏡写真のイメージ図である。写真の上半分に
固定化グルコースオキシダーゼ膜が形成されており、下
半分は固定化グルコースオキシダーゼ膜が形成されてお
らず石英基板が露出している。細胞は固定化グルコース
オキシダーゼ膜が形成された部分には接着せず、石英基
板が露出した表面上のみに接着した。
表面の顕微鏡写真のイメージ図である。写真の上半分に
固定化グルコースオキシダーゼ膜が形成されており、下
半分は固定化グルコースオキシダーゼ膜が形成されてお
らず石英基板が露出している。細胞は固定化グルコース
オキシダーゼ膜が形成された部分には接着せず、石英基
板が露出した表面上のみに接着した。
【００２６】図３（ｂ）は、固定化グルコースオキシダ
ーゼ膜の代わりにグルコースオキシダーゼを含まないア
ルブミン膜が形成された細胞培養用基板を用いた比較例
の場合の、基板表面の顕微鏡写真のイメージ図である。
写真の上半分にアルブミン膜が形成されており、下半分
は石英基板が露出している。図３（ａ）と異なり、細胞
は全面に接着した。このことより、固定化グルコースオ
キシダーゼ膜が細胞の接着、生育を阻害することがわか
る。
ーゼ膜の代わりにグルコースオキシダーゼを含まないア
ルブミン膜が形成された細胞培養用基板を用いた比較例
の場合の、基板表面の顕微鏡写真のイメージ図である。
写真の上半分にアルブミン膜が形成されており、下半分
は石英基板が露出している。図３（ａ）と異なり、細胞
は全面に接着した。このことより、固定化グルコースオ
キシダーゼ膜が細胞の接着、生育を阻害することがわか
る。
【００２７】固定化グルコースオキシダーゼ膜による細
胞接着、生育の阻害は次の機構で起こると考えられる。
ＭＣＤＢ１０４培地には７２０ｍｇ／ｌのグルコースが
含まれているので、固定化グルコースオキシダーゼ膜が
形成された細胞培養用基板を浸漬すると、膜内でグルコ
ースの酸化反応が進行する。この反応は、細胞の生育に
必要なグルコースと酸素を消費し、細胞の成育を阻害す
る過酸化水素を生成する反応である。そのため、膜表面
の細胞の接着、生育が阻害される。
胞接着、生育の阻害は次の機構で起こると考えられる。
ＭＣＤＢ１０４培地には７２０ｍｇ／ｌのグルコースが
含まれているので、固定化グルコースオキシダーゼ膜が
形成された細胞培養用基板を浸漬すると、膜内でグルコ
ースの酸化反応が進行する。この反応は、細胞の生育に
必要なグルコースと酸素を消費し、細胞の成育を阻害す
る過酸化水素を生成する反応である。そのため、膜表面
の細胞の接着、生育が阻害される。
【００２８】また、本細胞配列形成方法をグルコースを
含まない培地を用いて行うと、培地中にグルコースが含
まれないため細胞接着数は図３（ａ）に比べて少ない
が、細胞は全面に接着した。
含まない培地を用いて行うと、培地中にグルコースが含
まれないため細胞接着数は図３（ａ）に比べて少ない
が、細胞は全面に接着した。
【００２９】本細胞配列形成方法に適用できる細胞は、
固定化酵素膜に含まれる酵素の基質や生成物が配列を得
ようとする細胞の生育に必要であるか、あるいは逆に生
育を阻害する条件をみたすものであればよく、血管内皮
細胞に限らない。本実施例に使用した細胞培養用基板に
形成された固定化グルコースオキシダーゼ膜は、グルコ
ースと酸素を消費するので、大部分の細胞に適用でき
る。一方、ある特定の物質に感受性の高い、あるいは要
求性のある細胞であれば、この物質を消費、あるいは生
成する酵素を用いた細胞培養用基板を用いることによっ
て、この細胞に対する特異性が高い細胞配列形成方法と
なる。
固定化酵素膜に含まれる酵素の基質や生成物が配列を得
ようとする細胞の生育に必要であるか、あるいは逆に生
育を阻害する条件をみたすものであればよく、血管内皮
細胞に限らない。本実施例に使用した細胞培養用基板に
形成された固定化グルコースオキシダーゼ膜は、グルコ
ースと酸素を消費するので、大部分の細胞に適用でき
る。一方、ある特定の物質に感受性の高い、あるいは要
求性のある細胞であれば、この物質を消費、あるいは生
成する酵素を用いた細胞培養用基板を用いることによっ
て、この細胞に対する特異性が高い細胞配列形成方法と
なる。
【００３０】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の細胞培養
用基板を用いれば使用する培地に含まれる基質濃度によ
って基板表面に形成された固定化酵素膜の表面への細胞
接着性を制御することができる。つまり、培地に基質を
入れるかどうかをスイッチとして、固定化酵素膜表面へ
の細胞接着のオンオフを行うことができる。また、本発
明の細胞培養用基板を用いれば、２種類以上の細胞の配
列を得ることができ、培養細胞の人工臓器やバイオセン
サへの応用が容易になる。
用基板を用いれば使用する培地に含まれる基質濃度によ
って基板表面に形成された固定化酵素膜の表面への細胞
接着性を制御することができる。つまり、培地に基質を
入れるかどうかをスイッチとして、固定化酵素膜表面へ
の細胞接着のオンオフを行うことができる。また、本発
明の細胞培養用基板を用いれば、２種類以上の細胞の配
列を得ることができ、培養細胞の人工臓器やバイオセン
サへの応用が容易になる。
【図１】本発明の細胞培養用基板の一実施例を示した平
面図および断面図である。
面図および断面図である。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、本発明の細胞培養用基板の
作製方法の一実施例を示した作製工程断面図である。
作製方法の一実施例を示した作製工程断面図である。
【図３】（ａ）は、本発明の細胞配列形成方法の一実施
例によって得られた基板の顕微鏡写真のイメージ図であ
り、（ｂ）は、アルブミン膜が形成された基板を用いた
比較例の場合の基板の顕微鏡写真のイメージ図である。
例によって得られた基板の顕微鏡写真のイメージ図であ
り、（ｂ）は、アルブミン膜が形成された基板を用いた
比較例の場合の基板の顕微鏡写真のイメージ図である。
１ 石英基板 ２ 固定化グルコースオキシダーゼ膜 ３ フォトレジスト
Claims (4)
- 【請求項１】接着性細胞を接着させ生育させる細胞培養
用基板において、前記基板表面の一部分に固定化酵素膜
が形成されることを特徴とする細胞培養用基板。 - 【請求項２】前記固定化酵素膜に含まれる酵素の基質
が、配列を得ようとする前記細胞の生育に必要な物質で
あるかまたは前記細胞の生育を阻害する物質であるか、
あるいは前記酵素膜に含まれる酵素の反応生成物が、配
列を得ようとする前記細胞の生育に必要な物質であるか
または前記細胞の生育を阻害する物質であることを特徴
とする請求項１記載の細胞培養用基板。 - 【請求項３】基板にフォトレジストを塗布した後に、露
光および現像を行うことにより前記基板表面の一部分の
フォトレジストを除去する工程と、前記フォトレジスト
除去工程後に前記基板の表面に固定化酵素膜を製膜する
工程と、前記製膜後に前記基板のフォトレジストを除去
する工程を有することを特徴とする細胞培養用基板の作
製方法。 - 【請求項４】基板表面の一部分に固定化酵素膜が形成さ
れた請求項１または請求項２記載の細胞培養用基板を用
い、前記固定化酵素膜に含まれる酵素の基質を一定濃度
含む培地と共に細胞を培養することを特徴とする細胞配
列形成方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6144277A JP2570621B2 (ja) | 1994-06-27 | 1994-06-27 | 細胞培養用基板とその作製方法および細胞配列形成方法 |
| US08/493,415 US5602029A (en) | 1994-06-27 | 1995-06-22 | Method for fabricating substrate for cell culture and method for cell arrangements |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6144277A JP2570621B2 (ja) | 1994-06-27 | 1994-06-27 | 細胞培養用基板とその作製方法および細胞配列形成方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH089960A JPH089960A (ja) | 1996-01-16 |
| JP2570621B2 true JP2570621B2 (ja) | 1997-01-08 |
Family
ID=15358347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6144277A Expired - Fee Related JP2570621B2 (ja) | 1994-06-27 | 1994-06-27 | 細胞培養用基板とその作製方法および細胞配列形成方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5602029A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US6133030A (en) * | 1997-05-14 | 2000-10-17 | The General Hospital Corporation | Co-cultivation of cells in a micropatterned configuration |
| WO1998051785A1 (en) * | 1997-05-14 | 1998-11-19 | The General Hospital Corporation | Co-cultivation of cells in a micropatterned configuration |
| JP3077628B2 (ja) * | 1997-05-27 | 2000-08-14 | 日本電気株式会社 | 細胞毒性試験方法 |
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| US7033819B2 (en) | 2000-11-08 | 2006-04-25 | Surface Logix, Inc. | System for monitoring cell motility in real-time |
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| US6893851B2 (en) | 2000-11-08 | 2005-05-17 | Surface Logix, Inc. | Method for arraying biomolecules and for monitoring cell motility in real-time |
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| JPS60133448A (ja) * | 1983-12-22 | 1985-07-16 | Canon Inc | 記録媒体 |
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- 1994-06-27 JP JP6144277A patent/JP2570621B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-22 US US08/493,415 patent/US5602029A/en not_active Expired - Fee Related
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