JP2005342112A - 人工組織体およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む、in vitroで形成された組織体。
【選択図】 図1
Description
(1)血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む、in vitroで形成された組織体。
(2)基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在する、(1)記載の組織体。
(3)血管層、基底膜層および組織形成細胞層が積層されてなるin vitroで形成された積層組織体であって、3種の層をそれぞれ少なくとも1層含む該積層組織体。
(4)基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、(3)記載の積層組織体。
(5)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を製造する方法であって、
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を培養ベースから剥離して回収する工程を含む、前記製造方法。
(6)(5)記載の方法によって製造された組織体を積層することにより、積層組織体を製造する方法。
(7)以下の(a)〜(d):
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む第1組織体を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第1組織体を製造し、
以下の(e)〜(f):
(e)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(f)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、ならびに
(g)組織形成細胞層および基底膜層を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第2組織体を製造し、
第1組織体および第2組織体を積層することによって、積層組織体を製造する方法。
(8)積層組織体内の血管層に培養液を送液する工程をさらに含む(6)または(7)記載の方法。
(9)細胞接着性変化層が、光触媒および細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層である、(5)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)細胞接着性変化層が、光触媒を含有する光触媒処理層と、該光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有する、(5)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(11)細胞接着性変化パターンが、細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層と光触媒を含有する光触媒含有層とを対向するように配置した後、エネルギー照射することにより形成される、(9)記載の方法。
(12)細胞接着性変化パターンが、ライン状の細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域のスペースとが交互に配置されたパターンであり、細胞接着性良好領域のライン幅が20〜200μmであり、ライン間のスペース幅が100〜1000μmである(5)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13)培養ベースが、細胞を弱い接着力で保持可能な表面を有する(5)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)(1)〜(4)のいずれかに記載の組織体を移植することにより組織を再生する方法。
(15)血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている組織体。
(16)血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている積層組織体であって、3種の層をそれぞれ少なくとも1層含む該積層組織体。
(17)基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、(16)記載の積層組織体。
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む第1組織体を培養ベースから剥離して回収する工程。
(e)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(f)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、ならびに
(g)組織形成細胞層および基底膜層を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって基底膜層および組織形成細胞層を含む第2組織体を製造し、
第1組織体および第2組織体を積層することによって製造できる。
本発明における細胞配列用基材は、基材上に細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有することを特徴とするものである。
本発明の細胞配列用基材の第1実施態様は、基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層を基板上に有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、光触媒と上記細胞接着性変化材料とを有する光触媒含有細胞接着性変化層である点に特徴を有するものである。
本実施態様は、基材上に光触媒含有細胞接着性変化層が形成されている点に特徴を有する。この光触媒含有細胞接着性変化層は、少なくとも光触媒と細胞接着性変化材料とを有するものである。
本実施態様に用いられる細胞接着性変化材料は、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する材料であれば特に限定されるものではない。細胞の接着性が変化するとは、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性を獲得または増加する材料および細胞接着性が減少又消失する材料の双方が含まれる。
細胞をその表面に接着させるための物理化学的な因子としては、表面自由エネルギーに関する因子と、疎水性相互作用等による因子等が挙げられる。
YnSiX(4−n)
(ここで、Yはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基を示し、Xはアルコキシル基、アセチル基またはハロゲンを示す。nは0〜3までの整数である。)で示されるケイ素化合物の1種または2種以上の加水分解縮合物若しくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでYで示される基の炭素数は1〜20の範囲内であることが好ましく、また、Xで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
CF3(CF2)3CH2CH2Si(OCH3)3;
CF3(CF2)5CH2CH2Si(OCH3)3;
CF3(CF2)7CH2CH2Si(OCH3)3;
CF3(CF2)9CH2CH2Si(OCH3)3;
(CF3)2CF(CF2)4CH2CH2Si(OCH3)3;
(CF3)2CF(CF2)6CH2CH2Si(OCH3)3;
(CF3)2CF(CF2)8CH2CH2Si(OCH3)3;
CF3(C6H4)C2H4Si(OCH3)3;
CF3(CF2)3(C6H4)C2H4Si(OCH3)3;
CF3(CF2)5(C6H4)C2H4Si(OCH3)3;
CF3(CF2)7(C6H4)C2H4Si(OCH3)3;
CF3(CF2)3CH2CH2SiCH3(OCH3)2;
CF3(CF2)5CH2CH2SiCH3(OCH3)2;
CF3(CF2)7CH2CH2SiCH3(OCH3)2;
CF3(CF2)9CH2CH2SiCH3(OCH3)2;
(CF3)2CF(CF2)4CH2CH2SiCH3(OCH3)2;
(CF3)2CF(CF2)6CH2CH2SiCH3(OCH3)2;
(CF3)2CF(CF2)8CH2CH2SiCH3(OCH3)2;
CF3(C6H4)C2H4SiCH3(OCH3)2;
CF3(CF2)3(C6H4)C2H4SiCH3(OCH3)2;
CF3(CF2)5(C6H4)C2H4SiCH3(OCH3)2;
CF3(CF2)7(C6H4)C2H4SiCH3(OCH3)2;
CF3(CF2)3CH2CH2Si(OCH2CH3)3;
CF3(CF2)5CH2CH2Si(OCH2CH3)3;
CF3(CF2)7CH2CH2Si(OCH2CH3)3;
CF3(CF2)9CH2CH2Si(OCH2CH3)3;
CF3(CF2)7SO2N(C2H5)C2H4CH2Si(OCH3)3
細胞をその表面に接着させる為の生物学的な因子としては、多くの細胞種に対して被接着性を有することができる材料、特定の細胞種にのみ被接着性を有する材料がある。前者は例えばコラーゲンI型であり、後者は例えば肝実質細胞を選択的に接着するポリ(N-p-ビニルベンジル-[O-β-D-ガラクトピラノシル-(1→4)-D-グルコンアミド])(以下、PVLA)等がある。PVLAの場合、肝実質細胞が特異認識をするガラクトース基を構造中に有する事により、材料−細胞間の選択的かつ特異的な接着が行われるものと推測される。
本実施態様に用いられる光触媒としては、光半導体として知られる例えば二酸化チタン(TiO2)、酸化亜鉛(ZnO)、酸化スズ(SnO2)、チタン酸ストロンチウム(SrTiO3)、酸化タングステン(WO3)、酸化ビスマス(Bi2O3)、および酸化鉄(Fe2O3)を挙げることができ、これらから選択して1種または2種以上を混合して用いることができる。
本発明の細胞配列用基材に用いられる基材としては、表面に光触媒含有細胞接着性変化層を形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではなく、露光処理による表面処理が可能であればその形態は問わない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチックで代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の形状が挙げられる。
本実施態様においては、上記基材上に上述した光触媒含有細胞接着性変化層を形成し、さらにエネルギーをパターン状に照射することにより、細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
射により活性化された滅菌性を有する光触媒が露出した領域となる。したがって、エネルギー照射部分が細胞接着性阻害領域となる場合は、特に本実施態様の細胞配列用基材を用いて所定の期間培養した場合、パターンが太くなる等の不具合が生じることが無いという利点を有するものである。
本発明の細胞配列用基材の第2実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層とを有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、光触媒を有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、上記細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有することを特徴とするものである。
本実施態様の細胞配列用基材は、基材上に形成された光触媒処理層上に細胞接着性変化材料層が形成される。この細胞接着性変化材料層は、上記第1実施態様で説明した細胞接着性変化材料を用いることにより形成される層を用いることができる。以下、物理化学的細胞接着性変化材料を用いた細胞接着性変化材料層と生物学的細胞接着性変化材料を用いた細胞接着性変化材料層とに分けて説明する。
本実施態様において、物理化学的細胞接着性変化材料により形成される細胞接着性変化材料層は、上記第1実施態様で説明した材料と同様の材料を用いた層とすることができる。このような材料を用いた場合は、光触媒の有無を除き上述したものと同様である。なお、本実施態様においては、原則的には細胞接着性変化材料層内に光触媒を含有する必要性は無いが、感度等の関係で少量含有されたものであってもよい。
本実施態様において、生物学的細胞接着性変化材料により形成される細胞接着性変化材料層は、第1実施態様で説明したものと同様のものを使用することができ、例えばコラーゲンI型等を挙げることができる。
次に、本発明に用いられる光触媒処理層について説明する。本発明に用いられる光触媒処理層は、光触媒処理層中の光触媒がその上に形成された細胞接着性変化材料層の細胞接着特性を変化させるような構成であれば、特に限定されるものではなく、光触媒とバインダとから構成されているものであってもよいし、光触媒単体で製膜されたものであってもよい。また、その表面の特性は特に親液性であっても撥液性であってもよいが、この光触媒処理層上に、細胞接着性変化材料層等を形成する都合上、親液性であることが好ましい。
本実施態様に用いられる基材は、上記光触媒処理層を形成可能であれば、特に限定されるものではなく、第1実施態様で説明したものと同様のものを用いることが可能である。
本実施態様においては、上述した細胞接着性変化材料層に、パターン状にエネルギーを照射することにより、光触媒処理層中の光触媒の作用によって、細胞接着性変化材料層表面の細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
本実施態様の細胞配列用基材は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層とを有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、上記細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層であり、上記接着性変化パターンが、光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞接着性変化材料層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギーを照射することにより形成されたものであることを特徴とするものである。
本実施態様の細胞配列用基材は、基材上に細胞接着性変化材料層が形成される。この細胞接着性変化材料層は、上記第2実施態様で説明した材料を用いることにより形成される層と同様である。なお、本実施態様においては、原則的には細胞接着性変化材料層内に光触媒を含有する必要性は無いが、感度等の関係で少量含有されたものであってもよい。
本実施態様に用いられる基材は、上述した細胞接着性変化材料層が形成可能なものであれば、特に限定されるものではなく、第1実施態様で説明したものと同様のものを用いることが可能である。
次に、本実施態様に用いられる光触媒含有層について説明する。本実施態様に用いられる光触媒含有層は、光触媒を含有する層であり、通常はガラス等の基体上に形成されて用いられる。本実施態様においては、このような光触媒含有層を、上述した細胞接着性変化材料層と対向させて配置し、エネルギー照射を行うことにより、光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着性変化材料層の細胞接着性を変化させることができるのである。本実施態様においては、この光触媒含有層を、エネルギー照射の際に所定の位置に配置し、細胞接着性変化パターンを形成することが可能であることから、上記細胞接着性変化材料層中に光触媒を含有させる必要がなく、細胞接着性変化材料層が、経時的に光触媒の作用を受けることのないものとすることができる、という利点を有する。
本実施態様においては、上述した細胞接着性変化材料層に、上記光触媒含有層を用いて、パターン状にエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中の光触媒の作用によって、細胞接着性変化材料層表面の細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
次に、本発明の細胞配列用基材の製造方法について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法には、例えば、上記のような3つの実施態様があるが、いずれの実施態様においても、基材と、その基材上に形成され、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する層とを有するパターン形成体用基材を形成し、このパターン形成体用基材にエネルギーを照射することにより、光触媒を作用させて、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成することを特徴とするものである。
まず、本発明の細胞配列用基材の第1実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法の第1実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、かつ光触媒およびエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記光触媒含有細胞接着性変化層にエネルギーを照射し、上記光触媒含有細胞接着性変化層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
まず、本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程は、基材と、上記基材上に形成され、かつ光触媒およびエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程は、上記光触媒含有細胞接着性変化層にエネルギーを照射し、上記光触媒含有細胞接着性変化層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
次に、本発明の細胞配列用基材の製造方法の第2実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の第2実施態様は、基材と、上記基材上に形成された光触媒を含有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、かつエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記細胞接着性変化材料層にエネルギーを照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
まず、本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程は、上記基材上に形成された光触媒を含有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、かつエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程は、上記細胞接着性変化材料層にエネルギーを照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
次に、本発明の細胞配列用基材の第3実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法の第3実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記パターン形成体用基材と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着性変化材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
まず、本発明におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本発明におけるパターン形成体用基材形成工程は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における接着性変化パターン形成工程は、上記パターン形成体用基材と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着性変化材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
まず、本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板について説明する。
本実施態様に用いられる光触媒含有層は、少なくとも光触媒を含有するものであり、バインダを有していても、有していなくてもよく、上述した第2実施態様の光触媒処理層と同様である。
本実施態様においては、図3に示すように、光触媒含有層側基板13は、少なくとも基体11とこの基体11上に形成された光触媒含有層12とを有するものである。この際、用いられる基体を構成する材料は、後述するエネルギーの照射方向や、得られる細胞配列用基材が透明性を必要とするか等により適宜選択される。
本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部が形成されたものを用いてもよい。このように光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板を用いることにより、エネルギー照射に際して、フォトマスクを用いたり、レーザ光による描画照射を行う必要がない。したがって、光触媒含有層側基板とフォトマスクとの位置合わせが不要であることから、簡便な工程とすることが可能であり、また描画照射に必要な高価な装置も不必要であることから、コスト的に有利となるという利点を有する。
次に、本実施態様の光触媒含有層側基板に用いられるプライマー層について説明する。本実施態様において、上述したように基体上に光触媒含有層側遮光部をパターン状に形成して、その上に光触媒含有層を形成して光触媒含有層側基板とする場合においては、上記光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成してもよい。
次に、本工程におけるエネルギー照射について説明する。本実施態様においては、上記細胞接着性変化材料層と、上記光触媒含有層側基板における光触媒含有層とを、対向するように配置し、所定の方向からエネルギーを照射することにより、細胞接着性変化材料層の細胞接着性が変化したパターンを形成することができる。
細胞配列用基材において、血管形成細胞は、基材上に細胞接着性の異なる領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する上記の細胞配列用基材の細胞接着性良好領域に接着されている。本発明の細胞配列用基材は、上記のとおり細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域からなる細胞接着性変化パターンを有するものであるから、細胞配列用基材の表面に細胞を均一に播き、一定時間インキュベートすると、細胞接着性良好領域には細胞が接着しているが、細胞接着性阻害領域には細胞が接着していない細胞パターンが形成された細胞接着基材が得られる。この際、インキュベート後の基材を液洗浄する事により、基材に弱く付着している細胞を除去し、より綺麗な細胞パターンが得られる。
2×105個程度で播種する。
フルオロアルキルシランTSL8233(GE東芝シリコーン)1.5g、テトラメトキシシランTSL8114(GE東芝シリコーン)5.0g、5.0×10−3NHCl 2.4gを12時間混合し、これをイソプロピルアルコールで10倍希釈した。
培養細胞として、ウシ頚動脈由来血管内皮細胞(Onodera M, Morita I, Mano Y, Murota S :Differential effects of nitric oxide on the activity of prostaglandin endoperoxide h synthase-1 and-2 in vascular endothelial cells、Prostag Leukotress 62: 161-167, 2000)で継代数5代から20代のものを用いた。
i)マウス肝実質細胞を採取し、市販の96穴NIPAAm(ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド)シャーレ上で培養した。上述の濃度のカルボシアニン蛍光色素(DiO, Invitrogen社)で染色後、5%ウシ胎児血清含有MEM培地に戻した。
ii) i)で作成した肝実質細胞培養シャーレに実施例2で作成した血管内皮細胞が配列された基材を浸漬し、肝実質細胞上の基底膜層と血管内皮細胞とを接触させた。37℃で24時間培養を行い、細胞配列用基材を剥離した。
iii) シャーレを約20℃で30分間振とうし、軽くピペッティングした後、形成された組織体をピンセットで剥離した。
iv) 免疫不全マウスを麻酔し、背部を切開し、iii)までで作成した組織体をマウスの肝臓に移植した。移植部を縫合し、1日後および3日後に移植部を再切開し、移植組織を共焦点レーザー顕微鏡で観察した(DiI→励起波長530nm/観察波長590nm、DiO→励起波長480nm/観察波長510nm)。
励起波長480nmにおける観察で移植した肝実質細胞の成育が確認された。また、励起波長530nmにて移植した血管内皮細胞を観察したところ、予め血管内皮細胞をパターニングした通りに、毛細血管が形成されていることが確認された。
実施例1及び2と同様の手順にて血管内皮細胞を細胞配列基材上に配列した。更に実施例3のi)〜iii)部を行い、肝実質細胞,基底膜,血管からなる組織体を作成した。
励起波長480nmにおける観察により移植した肝実質細胞の成育が確認された。また、励起波長530nmにて移植した血管内皮細胞を観察したところ、予め血管内皮細胞をパターニングした通りに、毛細血管が形成されていることが確認された。摘出組織のヘモグロビン量を分析した結果、移植部もマウス肝臓の非移植部とほぼ同等のヘモグロビンが確認された。
実施例3のi)及びiii)の工程により肝実質細胞と基底膜層からなる組織体を形成し、次に作成した組織体を3、5、7枚重ね、積層組織体を作成し、直ちに免疫不全マウスの肝臓に移植した。移植部を縫合し、1日後および3日後に移植部を再切開し、移植組織を観察した。
積層枚数が5枚または7枚になると、励起波長480nmにおける観察で移植した肝実質細胞の壊死が観察された。また、摘出組織のヘモグロビン量を分析した結果、移植部にはヘモグロビンはほとんど観察されなかった。
実施例1及び2と同様の手順にて血管内皮細胞を細胞配列基材上に配列した。更に実施例3のi)〜iii)部を行い、肝実質細胞,基底膜,血管からなる第1組織体を作成した。次に実施例3のi)及びiii)の工程により肝実質細胞と基底膜層からなる第2組織体を形成した。
Claims (17)
- 血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む、in vitroで形成された組織体。
- 基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在する、請求項1記載の組織体。
- 血管層、基底膜層および組織形成細胞層が積層されてなるin vitroで形成された積層組織体であって、3種の層をそれぞれ少なくとも1層含む該積層組織体。
- 基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、請求項3記載の積層組織体。
- 組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を製造する方法であって、
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を培養ベースから剥離して回収する工程を含む、前記製造方法。 - 請求項5記載の方法によって製造された組織体を積層することにより、積層組織体を製造する方法。
- 以下の(a)〜(d):
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む第1組織体を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第1組織体を製造し、
以下の(e)〜(f):
(e)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(f)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、ならびに
(g)組織形成細胞層および基底膜層を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第2組織体を製造し、
第1組織体および第2組織体を積層することによって、積層組織体を製造する方法。 - 積層組織体内の血管層に培養液を送液する工程をさらに含む請求項6または7記載の方法。
- 細胞接着性変化層が、光触媒および細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層である、請求項5〜8のいずれか1項記載の方法。
- 細胞接着性変化層が、光触媒を含有する光触媒処理層と、該光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有する、請求項5〜8のいずれか1項記載の方法。
- 細胞接着性変化パターンが、細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層と光触媒を含有する光触媒含有層とを対向するように配置した後、エネルギー照射することにより形成される、請求項9記載の方法。
- 細胞接着性変化パターンが、ライン状の細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域のスペースとが交互に配置されたパターンであり、細胞接着性良好領域のライン幅が20〜200μmであり、ライン間のスペース幅が100〜1000μmである請求項5〜11のいずれか1項記載の方法。
- 培養ベースが、細胞を弱い接着力で保持可能な表面を有する請求項5〜12のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の組織体を移植することにより組織を再生する方法。
- 血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている組織体。
- 血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている積層組織体であって、3種の層をそれぞれ少なくとも1層含む該積層組織体。
- 基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、請求項16記載の積層組織体。
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