WO2014054538A1 - 細胞培養部材と細胞培養方法 - Google Patents

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田畑　泰彦
奈緒子 小尾
千夏子 住吉
英樹 村上
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日本写真印刷株式会社
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    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture member for culturing cells such as humans and animals in vitro.
  • the present invention also relates to a cell culture method for culturing cells in vitro.
  • a pattern of cell-adhesive surface and non-adhesive surface is formed, thereby controlling two-dimensional cell adhesion and subsequent growth pattern.
  • a cell culture support in which a temperature-responsive polymer is patterned on a substrate with a fine line width, and a cell culture method for culturing cells on the cell culture support (for example, are known) Patent Document 1). Since the cell culture support described above can pattern the cell culture site with the line width of the capillary, the structure of the cultured cells can be controlled two-dimensionally (in the film surface direction).
  • vascular network is a key (essential matter) in order for cells to survive and function in three dimensions.
  • the formation of this vascular network is just an array of three-dimensional vascular cells.
  • the development of cell array control technology close to the tissue structure in the body is an indispensable issue for the future development of cell biology.
  • an object of the present invention is to obtain a cell culture member capable of controlling the structure of cultured cells (aggregates) in a three-dimensional direction.
  • the three-dimensional arrangement of the cells is controlled by utilizing the property that the cells respond to the concentration gradient of the cell growth factor.
  • a hydrogel layer that releases cell growth factors slowly (gradual release) is formed in a two-dimensional pattern on a substrate.
  • a culture site for example, a Matrigel layer
  • cells are seeded on the culture site.
  • a three-dimensional concentration gradient pattern of the cell growth factor is formed in the culture site. Cells move along this three-dimensional pattern. As a result, a cell array is formed in the culture site according to the three-dimensional concentration gradient pattern of the cell growth factor.
  • the present invention has made it possible to arrange cells in three dimensions within the culture site by combining the sustained release of cell growth factors from the hydrogel and the two-dimensional pattern of the hydrogel.
  • the cell culture member according to one aspect of the present invention includes: On the board, Form a pattern-like and layered hydrogel part, In the cell culture member that forms a layered culture site covering the hydrogel site, The surface of the culture site is a first cell type seeding surface, The hydrogel site is infiltrated with cell growth factor, The cell growth factor is gradually released from the hydrogel site to the culture site.
  • the thickness of the hydrogel site is such that cell growth factor is gradually released from the hydrogel site to the culture site for 2 days or more and 21 days or less.
  • the thickness of the hydrogel portion may be 1 ⁇ m or more and 30 mm or less.
  • the cell culture member according to still another preferred embodiment of the present invention includes:
  • the hydrogel part may be made of heat-crosslinked gelatin, and the water content of the hydrogel forming the hydrogel part may be 70% or more and 99% or less.
  • the cell culture method according to the present invention comprises the following steps. I. A step of forming a patterned and layered hydrogel region on the substrate; A step of infiltrating a cell growth factor into the hydrogel site; c. A step of forming a layered culture site covering the hydrogel site to complete a cell culture member; A first cell type seeding step of seeding a first cell type on the surface of the culture site; The first cell type culturing step of placing the cell culture member after the first cell type seeding step under culturing conditions
  • the first cell type used in the first cell type seeding step which is the step D
  • the period during which the cell growth factor is gradually released from the hydrogel site to the culture site can be adjusted by changing the water content of the hydrogel within the range to 70% to 99%. Good.
  • the following steps may be performed. What.
  • the cell culture member according to the present invention has a hydrogel region having a certain thickness infiltrated with a cell growth factor, and since the cell growth factor is gradually released from the hydrogel region, The first cell type in culture moves and proliferates from the surface of the culture site toward the hydrogel site.
  • the two-dimensional structure (surface direction of the substrate) of the cultured cells (aggregates) on the first cell type resulting from the pattern formation of the hydrogel site, but also to the layer thickness direction of the cultured site. You can control the structure to. That is, the three-dimensional structure of cultured cells (aggregates) can be controlled.
  • the three-dimensional structure of cultured cells can be controlled in the same manner as the cell culture member.
  • FIG. 1 is a cross-sectional explanatory view of a cell culture member.
  • 2A and 2B are explanatory views of the cell culture member from which the culture site is removed.
  • FIG. 2A is a cross-sectional explanatory view and
  • FIG. 2B is a plan explanatory view.
  • FIG. 3 is a conceptual explanatory diagram of a cell culture method according to the first cell type, FIG. 3 (a) is immediately after seeding the first cell type, FIG. 3 (b) is the initial stage of the first cell type culture, FIG. (C) is each conceptual explanatory drawing of 1st cell type culture
  • FIG. 4 is a graph showing the evaluation results of the examples.
  • FIG. 1 is a cross-sectional explanatory view of the cell culture member 1
  • FIG. 2 is an explanatory view of the cell culture member 1 with the culture portion 13 removed
  • FIG. 2 (a) is a cross-sectional explanatory view
  • FIG. It is explanatory drawing.
  • the cell culture member 1 is formed by forming a hydrogel region 12 on a substrate 11 and covering the hydrogel region 12 to form a culture region 13.
  • the hydrogel region 12 is a carrier for sustained release of cell growth factor.
  • part 12 is also an adhesion site
  • the shape of the substrate 11 is usually a flat plate, a thin flat plate, or a film.
  • a hydrogel portion 12 is formed in a pattern on the substrate 11, and a cell non-adhesive portion 15 is exposed at a portion without the hydrogel portion 12.
  • the base material 11-1 constituting the substrate 11 is made of a cell non-adhesive material (for example, polydimethylsiloxane (hereinafter referred to as PDMS)), the substrate 11 is made of only the base material 11-1.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the base material 11-1 is made of a cell adhesive material (for example, polyethylene terephthalate (hereinafter referred to as PET)), a cell non-adhesive material is applied in layers on the entire upper surface of the base material 11-1.
  • a non-adhesive layer 11-2 is formed.
  • the non-cell-adhesive layer 11-2 may or may not be present depending on the material, surface properties, etc. of the base material 11-1.
  • the material of the substrate 11-1 is PDMS, PET, glass, silicon, metal (aluminum, stainless steel such as SUS304, gold, silver, etc.), metal oxide (alumina, titanium oxide, ITO, tin oxide), or the like.
  • the material of the cell non-adhesion layer 11-2 is agarose, polyethylene glycol, PDMS or the like.
  • the hydrogel region 12 is formed in a pattern and a layer.
  • the reason for forming the pattern is to control the two-dimensional shape (in the plane direction of the substrate 11) of the cultured cell aggregate relating to the first cell type.
  • part 12 is a linear form in a present Example, and becomes a pattern in which five straight lines were located in a line.
  • the line width (arrow 22) of the hydrogel site formed in a pattern is not particularly limited, but is preferably 10 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the space between the hydrogel sites formed in a pattern (arrow 23) is not particularly limited, but is preferably 50 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the hydrogel region 12 was given a height by being formed into a layer. Since the volume is given to the hydrogel site 12 by giving the height, the cell growth factor solution can be infiltrated into the hydrogel site 12 to allow storage for sustained release of the cell growth factor.
  • the hydrogel region 12 is formed of a hydrogel.
  • the thickness (arrow 21) of the hydrogel portion 12 formed in a layer shape is not particularly limited. It is sufficient that there is a storage amount capable of gradually releasing the cell growth factor for a time and amount sufficient for the seeded cells to move and proliferate in the direction toward the hydrogel region 12.
  • the sustained release period of the cell growth factor can be adjusted.
  • the water content is an index corresponding to the degree of crosslinking of the hydrogel.
  • the degree of crosslinking of the hydrogel is usually from 70% to 99%, preferably from 90% to 99%. When the moisture content is within this range, sufficient cell growth factors are gradually added to direct the growth direction of the proliferating cells on the first cell type over the entire period of the cell culture on the first cell type. Because it continues to be released.
  • the sustained release period of the cell growth factor required for the hydrogel region 12 is preferably 2 days or more and 21 days or less.
  • part 12 is 1 micrometer or more and 3000 micrometers or less, More preferably, they are 20 micrometers or more and 70 micrometers or less. This is because cell growth factors sufficient to direct the growth direction of the cultured cells related to the first cell type continue to be released gradually over the entire period of the cell culture period related to the first cell type.
  • the material of the hydrogel region 12 is gelatin, collagen, hyaluronic acid, fibroonectin, laminin, fibrin, etc., and gelatin is particularly preferable. This is because gelatin can be thermally crosslinked by heating at a relatively low temperature.
  • the hydrogel region 12 is formed by (1) a method of creating a thin layer of a predetermined thickness on a glass plate, etc., cutting it out and placing it on the substrate 11, and (2) a gel using a dispenser. It can be carried out by any method such as a method of placing a material, (3) a method of overprinting by screen printing.
  • the culture site 13 is formed in a layered manner covering the hydrogel site 12. Considering the planar direction of the substrate, the culture site 13 is formed in a planar shape in the planar direction. Since the hydrogel site 12 is surrounded by the cell non-adhesive portion 15 on the substrate 11 and the culture site 13 is formed in a planar shape, the culture site 13 covers the hydrogel site 12 and the cell non-adhesive portion 15. ing.
  • the upper surface of the culture site 13 is a first cell seeding surface 14.
  • the first cell type to be cultured is placed on the first cell type seeding surface 14.
  • the upper surface of the culture site 13 is a surface farther from the substrate 11 out of the two surfaces of the culture site 13 formed in a layered manner.
  • the culture site 13 is a site where the first cell type grows.
  • the culture site 13 is a site where cell growth factors are gradually released from the hydrogel site 12. Furthermore, the culture site 13 is also a site where the second cell type grows.
  • the layer thickness of the culture site 13, that is, the distance from the surface of the hydrogel site 12 to the first cell seeding surface 14 (indicated by the arrow 26) is 10 ⁇ m to 30 mm, preferably 100 ⁇ m to 5 mm. If the layer thickness is in this range, the effect of directing the proliferating cells on the first cell type in the direction of cell growth factor release is obtained, and the structure in the three-dimensional direction (layer thickness direction) is confirmed. Because it can be done.
  • the material of the culture site 13 is matrigel, collagen or the like.
  • the collagen may be a collagen gel or a collagen sponge.
  • ⁇ Cell culture method> Next, a cell culture method for the first cell type will be described. Prior to cell culture, a cell culture member is prepared.
  • the cell culture member is first (1) a step of forming a patterned and layered hydrogel region 12 on the substrate 11, and then (2) a step of infiltrating the cell growth factor into the hydrogel region 12 ( 3) It is completed by a step of forming a layered culture site 13 covering the hydrogel site 12.
  • FIG. 3 is a conceptual explanatory diagram of a cell culture method according to the first cell type
  • FIG. 3 (a) shows a state immediately after seeding the first cell type
  • FIG. 3 (b) shows the first cell type culture. The initial state is shown
  • FIG. 3 (c) shows the state after the first cell type culture.
  • the cultured cells are seeded on the first cell type seeding surface 14 which is the surface of the culture site.
  • An image of a cell related to the seeded first cell type is indicated by reference numeral 31.
  • the first cell type that can suitably carry out the cell culture method of the present invention include normal human umbilical vein endothelial cells (hereinafter referred to as HUVEC), fibroblasts, endothelial cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, vascular smooth muscles Examples include cells, lymphatic endothelial cells, bile duct epithelial cells, epidermal cells and the like.
  • the cell growth factor used in the cell culture method and cell culture member of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell growth factor having an attribute that promotes cell proliferation and migration of the first cell type.
  • cell growth factor VEGF is selected when culturing HUVEC cells
  • cell growth factor VEGF is selected when culturing lymphatic epithelial cells
  • keratinocyte cell factor (KGF) is selected when culturing epidermal cells. Select and use.
  • the seeded cells 31 relating to the first cell type are subjected to starvation treatment (Starvation treatment) before seeding. This is because movement in the direction of the cell growth factor and proliferation in the direction are further performed.
  • the cell growth factor is gradually released from the hydrogel region 12 toward the culture region 13.
  • An image of the released cell growth factor is indicated by arrow 34.
  • the seeded cells 31 move in the direction of the cell growth factor 34 and proliferate in that direction.
  • an image of the cultured cell aggregate at the initial stage of culture is indicated by reference numeral 32.
  • the first cell type repeatedly moves in the direction of the released cell growth factor and proliferates in that direction.
  • the cultured cell aggregate associated with the first cell type is in a state of connecting the cell seeding surface 14 and the hydrogel region 12.
  • the image of the cultured cell aggregate at the end of the culture is indicated by reference numeral 33 in FIG. In this way, the three-dimensional (layer thickness direction of the culture part 13) structure of the cultured cell aggregate is controlled.
  • the part surrounding the hydrogel part 12 on the substrate 11 is a cell non-adhered part 15, and the cultured cells do not reach the cell non-adhered part 15. In this way, control of the two-dimensional (plane direction of the culture site 13) structure of the cultured cell aggregate is performed.
  • the cultured cell aggregate 33 has a tubular structure.
  • the second cell type is seeded on the cell culture member containing the cultured cell aggregate obtained as described above.
  • the second cell type is seeded at the culture site. Thereafter, the second cell type is grown under the culture condition of the cell culture member.
  • the culture conditions vary depending on the cells used, but known culture methods are used.
  • Examples of the second cell type are liver parenchymal cells, Ito cells, pancreatic parenchymal cells, cardiomyocytes, nerve cells, mesenchymal cells, tumor cells and the like. There is no particular limitation on the combination of the first cell type and the second cell type.
  • a 30% gelatin aqueous solution was coated while heating the glass plate on a hot plate (50 ° C.). After cooling, the gelatin was cut out and placed on the agarose-coated film. Thereafter, the film was cut to obtain a gelatin pattern substrate.
  • the prepared gelatin pattern base material was vacuum-dried at 140 ° C. for 48 hours to crosslink and sterilize the gelatin.
  • the layer thickness of gelatin as a hydrogel site was 50 ⁇ m, the gelatin pattern was one straight line, and the line width was 70 ⁇ m.
  • the prepared gelatin pattern base material was subjected to vacuum heat drying at 140 ° C. for 48 hours to crosslink the gelatin and sterilize the base material.
  • Human 165165 was used as a cell growth factor.
  • the cross-linked gelatin base material was immersed in an aqueous solution of HumanVEGF165 40 ng / ml, and the aqueous VEGF solution was immersed in the gelatin on the base material.
  • a crosslinked gelatin base material was immersed in pure water, and pure water was immersed in gelatin on the base material.
  • HUVEC was used as seeded (cultured) cells. After culturing HUVEC in a predetermined culture solution, the medium was replaced with medium199 + 0.5% FCS (calf serum) + 1% P / S (penicillin streptomycin) one day before culturing. The culture is a starvation treatment. Just before the cell culture experiment, HUVEC was peeled off by collagenase treatment. The obtained HUVEC was fluorescently labeled with PKH26.
  • FCS calf serum
  • P / S penicillin streptomycin
  • a VEGF-impregnated gelatin patterning substrate was allowed to stand at the bottom of the 24-well plate, and a matrigel layer as a culture site was prepared at the top of the 24-well cell culture insert.
  • the concentration of Matrigel was 10 mg / ml.
  • Two types of cell culture members were used, one using 20 ⁇ l of the Matrigel solution and one using 50 ⁇ l. When the Matrigel solution was 20 ⁇ l, the thickness of the Matrigel layer was about 0.7 mm, and when the Matrigel solution was 50 ⁇ l, the thickness of the Matrigel layer was about 1.7 mm.
  • a pure water-impregnated gelatin patterning base material was allowed to stand at the bottom of the 24-well plate, and a matrigel layer as a culture site was similarly prepared at the top of the 24-well cell culture insert.
  • PKH26 fluorescently labeled HUVEC that had been starved was seeded on the surface of the matrigel layer, which is the cell seeding surface.
  • the cells were cultured for 21 hours in a CO 2 incubator.
  • the evaluation results are shown in FIG. Compared with the VEGF non-added group (control group), the fluorescence intensity at the bottom of the cell culture insert increased in the VEGF-impregnated gelatin base group. Thereby, HUVEC moved in the culture site (Matrigel layer) in the direction of VEGF (lower part) by VEGF released from the VEGF-impregnated gelatin patterning substrate.
  • SYMBOLS 1 Cell culture member 11 Substrate 11-1 Base material 11-2 Cell non-adhesion layer 12 Hydrogel site 13 Culture site 14 First cell type seeding surface 15 Cell non-adhesion part 31 Cells seeded on the first cell type ( image) 32 Cultured cell aggregates of the first cell type Early culture (image) 33 Cell culture aggregates of the first cell type Late culture (image) 34 Released cell growth factor (image)

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Abstract

【課題】培養細胞集合体の構造を三次元方向に制御可能な細胞培養部材を得ることを課題とする。 【解決手段】　基板１１の上に、パターン状、かつ層状のハイドロゲル部位１２を形成し、ハイドロゲル部位１２を覆って層状の培養部位１２を形成した細胞培養部材１である。培養部位の表面が第一の細胞種播種面１４である。ハイドロゲル部位１２は細胞成長因子を浸潤していて、ハイドロゲル部位の厚さは、ハイドロゲル部位１２から培養部位１３に細胞成長因子を培養期間に渡り徐放可能な厚さである。

Description

細胞培養部材と細胞培養方法
　本発明は人や動物等の細胞の培養を生体外で行うための細胞培養部材に関する。また、本発明は細胞の培養を生体外で行う細胞培養方法に関する。
　生体内で細胞はある規則をもって三次元的に配列及び配置されている。しかしながら現状の細胞培養では、この細胞の配列・配置に関する技術はきわめて限られている。
　これまで、二次元の細胞配列に関しては報告がある。例えば、細胞接着性表面と非接着性表面というパターンを形成し、それにより細胞の二次元接着、それに続く増殖パターンを制御することが行われている。一例を挙げれば、従来、基材上に温度応答性高分子を微細な線幅でパターニングした細胞培養支持体と、当該細胞培養支持体で細胞を培養する細胞培養方法が知られている（例えば特許文献１参照）。上述の細胞培養支持体は、細胞培養部位を毛細血管の線幅でパターニングできるので、培養細胞の構造を二次元的（膜面方向）に制御することができる。
　これに対して、三次元での細胞配列に対する技術方法論はほとんどない。細胞シートを重ねて細胞の三次元配列を実現する技術が報告されている（例えば特許文献２参照）。しかし、細胞が重層化された内部の構造は必ずしも人為的に制御されているとは言えない。また、従来、細胞を三次元的・立体的に増殖させ塊形状の細胞塊を作る細胞培養法が提案されている。しかしながら、この方法論においても、三次元的での細胞配列は人為的に制御することはできない。
　細胞の三次元・立体培養（塊形状培養）では、しばしば、立体形状内部に位置する細胞への酸素や栄養の供給が悪く、内部細胞の機能低下、あるいは細胞の死滅が生じる。これに対して、生体は細胞の三次元的集合体からできているにもかかわらず、このような問題は生じない。その理由は、三次元細胞集合体中に血管が存在し、立体形状内部の細胞に酸素と栄養をうまく供給しているからである。
　このように三次元で細胞を生存、機能させるためには血管網の形成がKey（必須事項）である。この血管網の形成はまさに三次元の血管細胞の配列である。このような体内の組織構造に近い細胞配列の制御技術の開発が、今後の細胞生物学の発展に必要不可欠な課題となっている。
特開２０１０－９８９７３号公報 特開２００５－３４２１１２号公報
　そこで、本発明は、培養細胞（集合体）の構造を三次元方向に制御可能な細胞培養部材を得ることを課題とする。
　本発明の他の課題は、培養細胞（集合体）の構造を三次元方向に制御可能な細胞培養方法を提供することにある。また、本発明は第一細胞種の培養細胞（集合体）の構造を三次元方向に制御可能とし、さらに第二細胞種を共培養する細胞培養方法を提供することを課題とする。
　本発明では、細胞が細胞成長因子の濃度勾配に応答する性質を利用して、細胞の三次元配列を制御する。まず、基材上に、細胞成長因子を徐放（徐々に放出）するハイドロゲル層を、二次元パターンに形成する。次に、当該パターンを形成した基材上に細胞移動を可能とする培養部位（例えばマトリゲル層）を置き、その培養部位上に細胞を播種する。
　細胞成長因子の放出にともない、培養部位内に細胞成長因子の三次元濃度勾配パターンが形成される。この三次元パターンに沿って細胞が移動する。その結果培養部位内に細胞成長因子の三次元濃度勾配パターンに従った、細胞配列が形成される。
　本発明は、ハイドロゲルからの細胞成長因子の徐放性と、ハイドロゲルの二次元パターンを組み合わせて、培養部位内で三次元での細胞配列を可能とした。
　本発明の一の態様にかかる細胞培養部材は、
　基板の上に、
　パターン状、かつ層状のハイドロゲル部位を形成し、
　前記ハイドロゲル部位を覆って層状の培養部位を形成した細胞培養部材において、
　前記培養部位の表面が第一の細胞種播種面であり、
　前記ハイドロゲル部位は細胞成長因子を浸潤していて、
　前記ハイドロゲル部位から前記培養部位に細胞成長因子を徐放することを特徴とする。
　本発明にかかる細胞培養部材の好ましい実施態様にあって、前記ハイドロゲル部位の厚さが、前記ハイドロゲル部位から前記培養部位に細胞成長因子を２日以上２１日以下徐放する厚さであってもよく、また、前記ハイドロゲル部位の厚さが、１μｍ以上３０ｍｍ以下であってもよい。
　本発明のさらに他の好ましい実施態様にかかる細胞培養部材は、
　前記ハイドロゲル部位が熱架橋ゼラチンからなるものであってもよく、また、前記ハイドロゲル部位を形成するハイドロゲルの含水率が７０％以上９９％以下であってもよい。
　本発明にかかる細胞培養方法は以下の工程からなる。
イ．基板の上に、パターン状、かつ層状のハイドロゲル部位を形成する工程
ロ．前記ハイドロゲル部位に細胞成長因子を浸潤する工程
ハ．前記ハイドロゲル部位を覆って層状の培養部位を形成し、細胞培養部材を完成する工程
ニ．前記培養部位の表面に第一の細胞種を播種する第一細胞種播種工程
ホ．第一細胞種播種工程を終えた細胞培養部材を培養条件下に置く第一細胞種培養工程
　本発明にかかる細胞培養方法の好ましい実施態様にあっては、
　ニの工程である第一細胞種播種工程に使用する第一の細胞種は、播種前に飢餓処理を行った細胞であってもよく、また、前記ハイドロゲル部位を形成するハイドロゲルの含水率を７０％以上９９％以下の範囲とし、ハイドロゲルの含水率を前記範囲内で変更することにより前記ハイドロゲル部位から前記培養部位に細胞成長因子を徐放する期間を調整するものであってもよい。
　本発明にかかる細胞培養方法のその他の好ましい実施態様にあっては、
　ホの工程である第一細胞種培養工程に続いて、以下の工程を行うものであってもよい。
へ．前記培養部位に第二の細胞種を播種する第二細胞種播種工程
ト．第二細胞種播種工程を終えた細胞培養部材を培養条件下に置く第二細胞種培養工程
　以上説明した本発明、本発明の好ましい実施態様、これらに含まれる構成要素は可能な限り組み合わせて実施することができる。
　本発明に係る細胞培養部材は、細胞成長因子を浸潤した一定の厚さを有するハイドロゲル部位を具備し、ハイドロゲル部位から細胞成長因子が徐放されるので、その他の発明特定事項とあわさって、培養中の第一の細胞種が培養部位の表面からハイドロゲル部位へ向かって移動と増殖を行う。この結果、ハイドロゲル部位のパターン形成に起因する第一の細胞種にかかる培養細胞（集合体）の二次元構造（基材の表面方向）を制御できるのみならず、培養部位の層厚さ方向への構造を制御できる。すなわち、培養細胞（集合体）の三次元構造を制御することができる。
　本発明にかかる細胞培養方法にあっても、上記細胞培養部材と同様に培養細胞（集合体）の三次元構造を制御できる。
図１は細胞培養部材の断面説明図である。 図２は培養部位を取り除いた細胞培養部材の説明図であり、図２（ａ）は断面説明図、図２（ｂ）は平面説明図である。 図３は第一の細胞種にかかる細胞培養方法の概念説明図であり、図３（ａ）は第一の細胞種播種直後、図３（ｂ）は第一の細胞種培養初期、図３（ｃ）は第一の細胞種培養後期のそれぞれの概念説明図である。 図４は実施例の評価結果を示すグラフである。
　以下、図面を参照して本発明の実施例にかかる細胞培養部材と細胞培養方法をさらに説明する。本明細書において参照する各図は、本発明の理解を容易にするため、一部の構成要素を誇張して表すなど模式的に表しているものがある。このため、構成要素間の寸法や比率などは実物と異なっている場合がある。また、本発明の実施例に記載した部材や部分の寸法、材質、形状、その相対位置などは、とくに特定的な記載のない限りは、この発明の範囲をそれらのみに限定する趣旨のものではなく、単なる説明例にすぎない。
＜細胞培養部材＞
　図１は細胞培養部材１の断面説明図であり、図２は培養部位１３を取り除いた細胞培養部材１の説明図であり、図２（ａ）は断面説明図、図２（ｂ）は平面説明図である。
　細胞培養部材１は基板１１の上にハイドロゲル部位１２を形成し、ハイドロゲル部位１２を覆って培養部位１３を形成したものである。ハイドロゲル部位１２は細胞成長因子の徐放用担体である。また、ハイドロゲル部位１２は第一の細胞種にかかる増殖細胞の接着部位でもある。
　基板１１の形状は通常、平板、薄い平板、またはフィルム状である。基板１１の上にパターン状にハイドロゲル部位１２が形成されていて、ハイドロゲル部位１２の無い部分は細胞非接着部分１５が露出している。基板１１を構成する基材１１－１が細胞非接着材料（例えばポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳと称する））からなるものであれば、基板１１は基材１１－１のみから構成される。
　基材１１－１が細胞接着材料（例えば、ポリエチレンテレフタレート（以下ＰＥＴと称する））からなるものであれば、基材１１－１の上面の全面に細胞非接着材料を層状に塗布することにより細胞非接着層１１－２を形成する。本発明にあって細胞非接着層１１－２は基材１１－１の材料、表面性質等に応じて、存在が必要であったり、不必要であったりする。
　基材１１－１の材料は、ＰＤＭＳ、ＰＥＴ、ガラス、シリコン、金属（アルミニウム、ＳＵＳ３０４等のステンレススチール、金、銀など）、金属酸化物（アルミナ、酸化チタン、ＩＴＯ、酸化錫）などである。細胞非接着層１１－２の材料は、アガロース、ポリエチレングリコール、ＰＤＭＳなどである。
　ハイドロゲル部位１２は、パターン状、かつ層状に形成される。パターン状に形成する理由は、第一の細胞種にかかる培養細胞集合体の二次元（基板１１の平面方向）形状を制御するためである。図２（ｂ）を参照して、本実施例ではハイドロゲル部位１２は直線状であり、５本の直線が平行に並んだパターンとなっている。パターン状に形成するハイドロゲル部位の線幅（矢印２２）は特に制限は無いが、１０μｍ～５００μｍにすることが好ましい。パターン状に形成するハイドロゲル部位相互間の間隔（矢印２３）は特に制限は無いが、５０μｍ～１０００μｍにすることが好ましい。
　ハイドロゲル部位１２は層状に形成することにより高さを与えた。高さを与えることによりハイドロゲル部位１２に体積が付与されるので、ハイドロゲル部位１２に細胞成長因子溶液を浸潤することにより、細胞成長因子徐放のための貯留が可能となる。
　細胞成長因子を貯留しかつ徐放するために、ハイドロゲル部位１２はハイドロゲルで形成される。
　また、層状に形成されるハイドロゲル部位１２の厚さ（矢印２１）は、特に限定されるものではない。播種した細胞がハイドロゲル部位１２に向かう方向に移動、増殖するに十分な時間と量の細胞成長因子を徐放できる貯留量があればよい。
　ハイドロゲルの架橋度を調整すれば、細胞成長因子の徐放期間は調整可能である。ハイドロゲルの架橋度に対応する指標として含水率がある。ハイドロゲルの架橋度は通常７０％以上９９％以下であり、好ましくは９０％以上９９％以下である。含水率をこの範囲にすれば、第一の細胞種にかかる細胞培養期間中の全ての期間に渡り、第一の細胞種にかかる増殖細胞の増殖方向を方向付けるに十分な細胞成長因子が徐放され続けるからである。
　ハイドロゲル部位１２に要求される細胞成長因子の徐放期間は、好ましくは２日以上２１日以下である。また、ハイドロゲル部位１２の好ましい厚さは１μｍ以上３０００μｍ以下であり、より好ましくは２０μｍ以上７０μｍ以下である。第一の細胞種にかかる細胞培養期間中の全ての期間に渡り、第一の細胞種にかかる殖細胞の増殖方向を方向付けるに十分な細胞成長因子が徐放され続けるからである。
　ハイドロゲル部位１２の材料は、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、ファイブロオネクチン、ラミニン、フィブリンなどであり、ゼラチンが特に好ましい。ゼラチンは比較的低温での加熱により熱架橋できるからである。
　ハイドロゲル部位１２の形成方法は、(1)ガラス板等の上に所定厚さの薄層物を作成し、これを切り出して基板１１上に戴置する方法、(2)ディスペンサーを用いてゲル状材料を戴置する方法、(3)スクリーン印刷で重ね刷りをする方法等任意の方法で行うことができる。
　培養部位１３は、ハイドロゲル部位１２を覆って層状に形成する。基板の平面方向を考えれば、培養部位１３は当該平面方向に面状に形成する。ハイドロゲル部位１２は、基板１１上の細胞非接着部分１５に取り囲まれていて、培養部位１３は面状に形成されているから、培養部位１３はハイドロゲル部位１２と細胞非接着部分１５を覆っている。
　培養部位１３の上面は第一の細胞種播種面１４である。細胞培養部材１にあって、培養対象となる第一の細胞種は第一の細胞種播種面１４に置かれる。培養部位１３の上面は、層状に形成された培養部位１３の２つの面のうち、基板１１から遠い方の面である。
　培養部位１３は第一の細胞種が増殖する部位である。また培養部位１３はハイドロゲル部位１２から細胞成長因子が徐放される部位である。さらに、培養部位１３は第二の細胞種が増殖する部位でもある。
　培養部位１３の層厚さすなわちハイドロゲル部位１２の表面から第一の細胞種播種面１４までの距離（矢印２６で示す）は１０μｍ～３０ｍｍ、好ましくは１００μｍ～５ｍｍである。層厚さがこの範囲であれば、第一の細胞種にかかる増殖細胞が細胞成長因子放出方向に方向付けられる効果が得られ、かつ、三次元方向（層厚さ方向）への構造が確認され得るからである。
　培養部位１３の材料はマトリゲル、コラーゲンなどである。コラーゲンはコラーゲンゲルであってもよく、コラーゲンスポンジでもよい。
＜細胞培養方法＞
　続いて第一の細胞種にかかる細胞培養方法を説明する。細胞の培養に先立ち、細胞培養部材を準備する。
　細胞培養部材は、まず(1)基板１１の上に、パターン状かつ層状のハイドロゲル部位１２を形成する工程、次に(2)ハイドロゲル部位１２に細胞成長因子を浸潤する工程、続いて(3)ハイドロゲル部位１２を覆って層状の培養部位１３を形成する工程により完成する。
　図３は第一の細胞種にかかる細胞培養方法の概念説明図であり、図３（ａ）は第一の細胞種播種直後の状態を示し、図３（ｂ）は第一の細胞種培養初期の状態を示し、図３（ｃ）は第一の細胞種培養後期の状態を示している。
　図３（ａ）を参照し、培養部位の表面である第一の細胞種播種面１４に培養細胞を播種する。播種した第一の細胞種にかかる細胞のイメージを符号３１で示している。本発明の細胞培養方法を好適に実施できる第一の細胞種の例として、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（以下ＨＵＶＥＣと称する）、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞、胆管上皮細胞、表皮細胞等を挙げることができる。
　本発明の細胞培養方法と細胞培養部材に使用する細胞成長因子は、第一の細胞種にかかる細胞の増殖と移動を促す属性を持つ細胞成長因子であれば、特に限定されるものではない。例えば、ＨＵＶＥＣ細胞を培養する場合は細胞成長因子ＶＥＧＦを選択し、リンパ管上皮細胞を培養する場合には細胞成長因子ＶＥＧＦを選択し、表皮細胞を培養する場合にはケラチノサイト細胞因子（ＫＧＦ）を選択して使用する。
　第一の細胞種にかかる播種細胞３１は播種前に飢餓処理（Starvation処理）を行うことが好ましい。細胞成長因子方向への移動と当該方向への増殖がより一層行われるからである。
　図３（ｂ）を参照して、ハイドロゲル部位１２から培養部位１３に向かって細胞成長因子が徐放されている。放出された細胞成長因子のイメージを矢印３４で示している。播種した細胞３１は細胞成長因子３４の方向に移動し、当該方向に増殖する。図３（ｂ）中に培養初期の培養細胞集合体のイメージを符号３２で示している。
　培養期間中に第一の細胞種は放出される細胞成長因子方向への移動と当該方向への増殖を繰り返す。培養終期に至ると第一の細胞種にかかる培養細胞集合体は、細胞播種面１４とハイドロゲル部位１２を連絡する状態となる。図３（ｃ）中に培養終期の培養細胞集合体のイメージを符号３３で示している。このようにして培養細胞集合体の三次元（培養部分１３の層厚さ方向）構造の制御が行われる。
　基板１１上でハイドロゲル部位１２を取り巻く部分は細胞非接着部分１５であり、培養細胞は細胞非接着部分１５に至ることはない。このようにして培養細胞集合体の二次元（培養部位１３の面方向）構造の制御が行われる。
　ＨＵＶＥＣ細胞を培養すると、培養細胞集合体３３は管状構造となる。
　続いて本発明にかかる細胞培養方法の好ましい実施態様を説明する。上述のようにして得た培養細胞集合体を含む細胞培養部材に、第二の細胞種を播種する。第二の細胞種は培養部位に播種する。その後、細胞培養部材を培養条件下において、第二の細胞種を増殖させる。培養条件については、用いる細胞によっても異なるが、公知の培養方法を用いる。
　このようにして、生体内の環境と類似する環境での２種類の細胞の共培養ができる。
　第二の細胞種の例は、肝実質細胞、伊東細胞、膵実質細胞、心筋細胞、神経細胞、間葉系細胞、腫瘍細胞などである。第一の細胞種と第二の細胞種の組み合わせについては特に制限はない。
＜細胞培養部材（培養部位形成前）の作成＞
　ホットプレート（５０℃）上で易接着処理のしてあるＰＥＴフィルム（テイジンテトロンフィルムＧ２７４）上にアガロース水溶液（８０℃、５％）をバーコーティングした。オーブン中で４０℃、３０分間加熱乾燥した。
　ガラス板をホットプレート（５０℃）上で加温しながら３０％ゼラチン水溶液をコーティングした。冷却後にゼラチンを切り出して、上記アガロースコーティング済みフィルム上に載せた。その後当該フィルムを切り分けて、ゼラチンパターン基材を得た。
　作成したゼラチンパターン基材を１４０℃、４８時間真空加熱乾燥することによりゼラチンの架橋及び滅菌を行った。ハイドロゲル部位であるゼラチンの層厚さは５０μｍ、ゼラチンのパターンは１本の直線、線幅は７０μｍであった。作成したゼラチンパターン基材を140℃、48時間、真空加熱乾燥にかけることにより、ゼラチンの架橋及び基材の滅菌を行った。
　細胞成長因子は、HumanVEGF165を使用した。HumanVEGF165　40ng/ml水溶液に架橋済ゼラチン基材を浸し、基材上のゼラチンにVEGF水溶液を浸み込ませた。また、コントロールとして、純水に架橋済ゼラチン基材を浸し、基材上のゼラチンに純水を浸み込ませた。
＜第一の細胞種の準備＞
　播種（培養）細胞はHUVECを使用した。HUVECを所定の培養液で培養後、1日前にmediumをmedium199+0.5%FCS（仔牛血清）+1%P/S (ペニシリンストレプトマイシン)に交換して培養した。当該培養は飢餓処理（starvation処理）である。細胞培養実験直前に、コラゲナーゼ処理によりHUVECをはがした。得られたHUVECをPKH26により蛍光標識した。
＜播種と培養＞
　24well plate下部にVEGF含浸ゼラチンパターニング基材を静置し、24well cell culture insert上部に培養部位であるマトリゲル（matrigel）層を作製した。マトリゲルの濃度は10mg/mlであった。当該マトリゲル溶液を20μl用いたものと、50μl用いたものの２種類の細胞培養部材を使用した。マトリゲル溶液20μlの場合にマトリゲル層の厚さは約0.7mmであり、マトリゲル溶液50μlの場合にマトリゲル層の厚さは約1.7mmであった。コントロールは、24well plate下部に純水含浸ゼラチンパターニング基材を静置し、24well cell culture insert上部に培養部位であるマトリゲル（matrigel）層を同様に作製した。
　細胞播種面であるマトリゲル（matrigel）層表面に飢餓処理済みのPKH26蛍光標識HUVECを播種した。ＣＯ２インキュベーター内で21時間培養した。
＜培養細胞の評価＞
　培養終了後、プレートリーダーでcell culture insert下部の蛍光強度を測定することで、培養部位（マトリゲル層）下部へ移動したHUVEC細胞数を評価した。
　評価結果を図４に示した。VEGF未添加群（コントロール群）と比較して、VEGF含浸ゼラチン基材群では、cell culture insert下部の蛍光強度が増加した。これにより、VEGF含浸ゼラチンパターンニング基材から放出されたVEGFにより、HUVECが培養部位（マトリゲル層）中をＶＥＧＦの方向（下部）へ移動した。
　１　　細胞培養部材
　１１　基板
　１１－１　基材
　１１－２　細胞非接着層
　１２　ハイドロゲル部位
　１３　培養部位
　１４　第一の細胞種播種面
　１５　細胞非接着部分
　３１　第一の細胞種にかかる播種した細胞（イメージ）
　３２　第一の細胞種にかかる培養細胞集合体　培養初期（イメージ）
　３３　第一の細胞種にかかる養細胞集合体　培養後期（イメージ）
　３４　放出された細胞成長因子（イメージ）

Claims (9)

  1. 　基板の上に、
    　パターン状、かつ層状のハイドロゲル部位を形成し、
    　前記ハイドロゲル部位を覆って層状の培養部位を形成した細胞培養部材において、
    　前記培養部位の表面が第一の細胞種播種面であり、
    　前記ハイドロゲル部位は細胞成長因子を浸潤していて、
    　前記ハイドロゲル部位から前記培養部位に細胞成長因子を徐放することを特徴とする細胞培養部材。
  2. 　前記ハイドロゲル部位の厚さは、前記ハイドロゲル部位から前記培養部位に細胞成長因子を２日以上２１日以下徐放する厚さであることを特徴とする請求項１に記載した細胞培養部材。
  3. 　前記ハイドロゲル部位の厚さは、１μｍ以上３０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載した細胞培養部材。
  4. 　前記ハイドロゲル部位は熱架橋ゼラチンからなるものである請求項１乃至３いずれかに記載した細胞培養部材。
  5. 　前記ハイドロゲル部位を形成するハイドロゲルの含水率が７０％以上９９％以下であることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載した細胞培養部材。
  6. 　以下の工程からなる細胞培養方法。
    イ．基板の上に、パターン状、かつ層状のハイドロゲル部位を形成する工程
    ロ．前記ハイドロゲル部位に細胞成長因子を浸潤する工程
    ハ．前記ハイドロゲル部位を覆って層状の培養部位を形成し、細胞培養部材を完成する工程
    ニ．前記培養部位の表面に第一の細胞種を播種する第一細胞種播種工程
    ホ．第一細胞種播種工程を終えた細胞培養部材を培養条件下に置く第一細胞種培養工程
  7. 　請求項６に記載した細胞培養方法において、ニの工程である第一細胞種播種工程に使用する第一の細胞種は、播種前に飢餓処理を行った細胞であることを特徴とする請求項６に記載した細胞培養方法。
  8. 　前記ハイドロゲル部位を形成するハイドロゲルの含水率を７０％以上９９％以下の範囲とし、ハイドロゲルの含水率を前記範囲内で変更することにより前記ハイドロゲル部位から前記培養部位に細胞成長因子を徐放する期間を調整することを特徴とする請求項６又は７いずれかに記載した細胞培養方法。
  9. 　請求項６に記載した細胞培養方法において、
    　ホの工程である第一細胞種培養工程に続いて、以下の工程を行うことを特徴とする細胞培養方法。
    へ．前記培養部位に第二の細胞種を播種する第二細胞種播種工程
    ト．第二細胞種播種工程を終えた細胞培養部材を培養条件下に置く第二細胞種培養工程
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102078602B1 (ko) 2015-07-23 2020-02-19 한국화학연구원 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법
US10000732B2 (en) * 2015-11-20 2018-06-19 National Health Research Institutes Microfluidic dual-well device for highthroughput single-cell capture and culture
JP6678520B2 (ja) * 2016-06-01 2020-04-08 大日本印刷株式会社 細胞集合体の製造方法
WO2019161048A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Hierarchic neural microphysiological system for brain function and disorders
CN109628390A (zh) * 2018-12-30 2019-04-16 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种水凝胶状的细胞培养配方
WO2022028150A1 (zh) * 2020-08-04 2022-02-10 南京凌芯生物科技有限公司 筛选靶细胞或细胞的方法及生物培养芯片
KR102522974B1 (ko) * 2020-11-26 2023-04-19 성균관대학교산학협력단 2차원 세포 및 3차원 세포 이식용 패치

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005342112A (ja) 2004-06-01 2005-12-15 Ikuo Morita 人工組織体およびその製造方法
WO2006090777A1 (ja) * 2005-02-23 2006-08-31 Hi-Lex Corporation 医用材料、人工歯根および医療材料の製造方法
JP2007007414A (ja) * 2005-06-29 2007-01-18 Lifescan Inc 多区画配送システム
JP2009207445A (ja) * 2008-03-05 2009-09-17 Kanazawa Univ 再生組織用細胞内カルシウムイオンモニタリング装置
JP2010098973A (ja) 2008-10-22 2010-05-06 Konica Minolta Holdings Inc 細胞培養支持体並びに細胞培養方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7727550B2 (en) * 2003-02-21 2010-06-01 The Uab Research Foundation Biologically active native biomatrix composition
WO2005030476A1 (en) * 2003-09-23 2005-04-07 Trustees Of Boston University Three-dimensional gels that have microscale features
US20070218554A1 (en) * 2004-04-26 2007-09-20 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Cell Culture Patterning Substrate And Method For Manufacturing The Same
US8129188B2 (en) * 2005-09-29 2012-03-06 Industrial Technology Research Institute Cell culture apparatus and method of fabricating the apparatus
DE102007028423A1 (de) * 2007-06-20 2008-12-24 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Bildung von Aggregaten biologischer Zellen
US9506029B2 (en) * 2010-12-30 2016-11-29 University Of Massachusetts Lowell Responsive cell culture hydrogel
CN102188759A (zh) * 2011-03-11 2011-09-21 西安交通大学 一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005342112A (ja) 2004-06-01 2005-12-15 Ikuo Morita 人工組織体およびその製造方法
WO2006090777A1 (ja) * 2005-02-23 2006-08-31 Hi-Lex Corporation 医用材料、人工歯根および医療材料の製造方法
JP2007007414A (ja) * 2005-06-29 2007-01-18 Lifescan Inc 多区画配送システム
JP2009207445A (ja) * 2008-03-05 2009-09-17 Kanazawa Univ 再生組織用細胞内カルシウムイオンモニタリング装置
JP2010098973A (ja) 2008-10-22 2010-05-06 Konica Minolta Holdings Inc 細胞培養支持体並びに細胞培養方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIHIKO SAITO: "Kekkan Shinsei Inshi no DDS o Mochiita Saibo Ishoku -Jin no Tanpaku Taisha Kino o Daisho suru Saibo Ishoku Ryoho no Kaihatsu o Mezashite", GENE & MEDICINE, vol. 6, no. 3, 2002, pages 415 - 418, XP008178660 *
See also references of EP2905330A4
TAKASHI SAITO: "P2) Tetsu Chelate-zai Johoka Hydrogel ni yoru Soshiki no Teisanso Yudo to Kekkan Shinsei", DAI 41 KAI PREPRINTS OF RESEARCH GROUP ON BIOCHEMICAL POLYMER SYMPOSIUM, 15 June 2012 (2012-06-15), pages 27 - 28, XP008178661 *
YASUHIKO TABATA: "Saibo Seicho Inshi no Hoshutsu Seigyo to Kekkan Shinsei", SOSHIKI BAIYO KOGAKU, vol. 27, no. 10, 2001, pages 372 - 375, XP008178658 *

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